Гени grg23 та grg51, які надають стійкість до гербіцидів

1. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти, вибрана із групи, яка складається з: a) молекули нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NО: 1, 3 або 5, або комплементарну до такої; b) молекули нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, яка має принаймні 80 % 2 (19) 1 3 92622 4 е) поліпептиду, що кодується нуклеотидною посліє) нуклеотидної послідовності стійкості до гербіцидовністю стійкості до гербіциду вставки ДНК плазду вставки ДНК плазміди, депонованої під Номеміди, депонованою під Номером Доступу NRRL Вром Доступу NRRL В-30888 або NRRL B-30949; 30888 або NRRL В-30949. де вказана нуклеотидна послідовність є функціо8. Поліпептид за п. 7, який додатково містить гетонально зв'язаною із промотором, що керує експрерологічну амінокислотну послідовність. сією кодувальної послідовності, у рослинній кліти9. Рослина, що має стабільно вбудовану в її геном ні. ДНК-конструкцію, що містить нуклеотидну послі10. Рослина за п. 9, де вказаною рослиною є росдовність, яка кодує білок, що має активність стійлинна клітина. кості до гербіциду, де вказана нуклеотидна послі11. Рослина, що має стабільно вбудовану в її гедовність вибрана із групи, яка складається з: ном ДНК-конструкцію, що містить нуклеотидну a) нуклеотидної послідовності SEQ ID NO: 1, 3 або послідовність, яка кодує поліпептид EPSPS, де 5; вказаний поліпептид EPSPS має Km у відношенні b) нуклеотидної послідовності, що має принаймні PEP від приблизно 1 до приблизно 150 мк, і Kі 80 % ідентичність послідовності з нуклеотидною (гліфосат)/Km (PEP) від приблизно 500 до приблипослідовністю SEQ ID NО: 1, 3 або 5, де вказана зно 1000, де вказане рослина проявляє стійкість нуклеотидна послідовність кодує поліпептид, який до гліфосатного гербіциду. має активність стійкості до гербіциду; 12. Рослина за п. 11, де вказаною рослиною є роc) нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпепслина сої. тид, що містить амінокислотну послідовність SEQ 13. Рослина за п. 11, де вказаною рослиною є зерID NО: 2, 4 або 6; нова рослина. d) нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпеп14. Рослина за п. 11, де вказана рослина вибрана тид, що має принаймні 80 % ідентичність амінокиіз групи, яка складається з кукурудзи, сорго звислотної послідовності з амінокислотною послідовчайного, пшениці, соняшника, томату, хрестоцвіністю SEQ ID NО: 2, 4 або 6, де вказаний тих, перців, картоплі, бавовни, рису, сої, цукрового поліпептид має активність стійкості до гербіциду; і, буряка, цукрового очерету, тютюну, ячменю й олійних культур. Галузь техніки Даний винахід розкриває нові гени, що кодують стійкість до гербіцидів, які застосовні в біології рослин, при селекції сільськогосподарських культур і для культур рослинних клітин. Попередній рівень техніки N-фосфонометилгліцин, який звичайно називають гліфосатом, є важливим агрономічним хімікатом. Гліфосат інгібує фермент, що перетворює фосфоєнолпіровиноградну кислоту (PEP) і 3фосфошикимову кислоту (S3P) в 5-єнолпірувіл-3фосфошикимову кислоту. Інгібування цього ферменту (5-єнолпірувілшикимат-3-фосфатсинтаза; яка позначається в даному описі як "EPSPS"), знищує рослинні клітини за допомогою відключення шляху метаболізму шикимату, пригнічуючи в такий спосіб біосинтез ароматичних кислот. Оскільки гербіциди класу гліфосату пригнічують біосинтез ароматичних амінокислот, вони не тільки знищують рослинні клітини, але і є токсичними для бактеріальних клітин. Гліфосат пригнічує багато бактеріальних синтаз EPSP, і в такий спосіб є токсичним для цих бактерій. Однак певні бактеріальні синтази EPSP мають високу стійкість до гліфосату. Рослинні клітини, стійкі до токсичності гліфосату, можуть бути отримані за допомогою трансформування рослинних клітин для експресії гліфосат-стійких бактеріальних EPSP-синтаз. Зокрема, бактеріальний ген зі штаму СР4 Agrobacterium tumefaciens був використаний для надання рослинним клітинам стійкості до гербіцидів після експресії в рослинах. Мутована EPSP-синтаза зі штаму СТ7 Salmonella typhimurium надає стійкість до гліфосату бактеріальним клітинам і надає стійкість до гліфосату рослинним клітинам (Патенти США №№ 4535060; 4769061 і 5094945). Однак існує потреба в інших генах стійкості до гербіцидів. Кінетична активність EPSPS може бути оцінена за допомогою вимірювання вивільнення фосфату. Вивільнення фосфату визначається з використанням спряженого аналізу для флуоресцентного виявлення фосфату на основі утворення N-ацетил-3,7-дигідроксифеноксацину (Amplex Red), як відомо в галузі техніки (Vazquez et al. (2003) Analytical Biochemistry 320: 292-298). Опубліковані умови аналізу можуть привести до насичення аналізу в експериментах, де фосфат вивільняється дуже швидко. Для вимірювання кінетичної активності EPSPS необхідні додаткові способи. Суть винаходу Представлено композиції й способи надання стійкості або толерантності до гербіциду бактеріям, рослинам, рослинним клітинам, тканинам і насінням. Композиції включають молекули нуклеїнових кислот, які кодують поліпептиди стійкості або толерантності до гербіциду, вектори, які містять такі молекули нуклеїнових кислот, і клітинихазяї, які містять вектори. Композиції також включають антитіла до поліпептидів стійкості або толерантності до гербіциду. Як відзначено, нуклеотидні послідовності за винаходом можуть бути використані в конструкціях ДНК або експресійних касетах для трансформації й експресії в організмах, що включають мікроорганізми й рослини. Композиції також містять трансформовані бактерії, рослини, рослинні клітини, тканини й насіння. Крім того, представлені способи одержання поліпептидів, які 5 92622 6 кодуються синтетичними нуклеотидами за винахоСпособи включають трансформацію організмів дом. нуклеотидними послідовностями, що кодують ген Представлено ізольовані молекули нуклеїностійкості до гліфосату за винаходом. Нуклеотидні вих кислот і варіанти таких, які кодують поліпептипослідовності за винаходом придатні для одерди стійкості або толерантності до гербіциду. Додажання рослин, які проявляють підвищену толерантково, охоплені послідовності амінокислоти й тність до гербіцидного гліфосату. Таким чином, варіанти таких, що кодуються полінуклеотидами, представлені трансформовані бактерії, рослини, які надають стійкість або толерантність до гербірослинні клітини, рослинні тканини й насіння. Комциду. Даний винахід представляє молекули ізопозиції включають нуклеїнові кислоти й білки, що льованих нуклеїнових кислот, що містять нуклеомають відношення до толерантності до гербіциду тидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:1, в мікроорганізмах і рослинах, так само як і транс3 або 5, нуклеотидну послідовність, яка кодує аміформовані бактерії, рослини, рослинні тканини й нокислотну послідовність, представлену в SEQ ID насіння. Розкриті нуклеотидні послідовності гена NO:2, 4 або 6, нуклеотидну послідовність стійкості стійкості до гліфосату (grg23 і grg51) і амінокислодо гербіциду, депоновану в бактерії-хазяїні у витні послідовності білків, які кодуються ними. Посгляді номерів доступу NRRL В-30888 або NRRL Bлідовності знаходять застосування в конструюван30949, так само, як і варіанти й фрагменти таких. ні експресійних векторів для наступної Нуклеотидні послідовності, які комплементарні до трансформації рослин, які представляють інтерес, нуклеотидних послідовностей за винаходом, або як зонди для виділення інших генів стійкості до ті, які гібридизуються з послідовностями за винагліфосату, як маркери селекції, і т.п. Таким чином, ходом, також охоплені. під "геном стійкості до гліфосату за винаходом" Також представлені способи вимірювання фемається на увазі нуклеотидна послідовність, наверментативної кінетичної активності із застосувандена в SEQ ID NO:1 або 3, і варіанти й фрагменти ням флуорогенних субстратів. таких (SEQ ID NO:5, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, Опис фігур креслень 28, 30 і 32), які кодують поліпептид стійкості або На Фіг.1 показане вирівнювання GRG23 ORF1 толерантності до гліфосату. Аналогічно, "поліпепамінокислотної послідовності (SEQ ID NO:2) і тид стійкості до гліфосату за винаходом" являє GRG51 (SEQ ID NO:6) з Bacillus clausii (SEQ ID собою поліпептид, який має амінокислотну посліNO:7), Rubrobacer xylanophilus (SEQ ID NO:8), довність, наведену в SEQ ID NO:2 або 4, і варіанти Escherichia coli (SEQ ID SEQ NO:11), штамом СР4 й фрагменти таких (SEQ ID NO:6, 15, 17, 19, 21, Agrobacterium sp. (SEQ ID NO:10) і Zea mays (SEQ 23, 25, 27, 29, 31 і 33), які надають клітині-хазяїнові ID NO:9). стійкості або толерантності до гліфосату. На Фіг.2 показаний графік розсіювання ферПлазміди, що містять нуклеотидні послідовноментативної активності GRG23 (вісь Y) як функції сті стійкості до гербіциду за винаходом, депоноваконцентрації PEP (вісь X) при концентраціях гліні в постійній колекції Колекції Культур Служби фосату 0, 3, 5 і 10 мМ. сільськогосподарських досліджень, Північної РегіНа Фіг.3 показаний графік розсіювання Km ональної Науково-дослідної лабораторії (NRRL) 18 (арр.) (вісь Y) як функції концентрації гліфосату листопада 2005 за номером доступу NRRL B(вісь X). Точка перетину осі X представляє Kі для 30888 (grg23), і 26 червня 2006 за номером достугліфосату. пу NRRL B-30949 (grg51). Це депонування буде Докладний опис підтримуватися відповідно до Будапештського Дані винаходи тепер будуть описані більш доДоговору про Міжнародне Визнання Депонування кладно з посиланням на додані креслення, у яких Мікроорганізмів для цілей Патентної Процедури. представлені деякі, але не всі, варіанти здійснення Це депонування було зроблено для зручності фавинаходів. Дійсно, ці винаходи можуть бути втілені хівців в галузі техніки, і не допускається, що депов багатьох різних формах і не повинні бути розглянування є необхідним за 35 кодексу законів США нуті як обмежені варіантами здійснення, представ§112. леними тут; скоріше ці способи здійснення предПід "гліфосатом" мається на увазі будь-яка геставлені так, щоб це розкриття задовольнило рбіцидна форма N-фосфонометилгліцину (вклюзастосовні законні вимоги. Подібні номери у всій чаючи будь-яку сіль такого) і інші форми, з яких заявці стосуються подібних елементів. отримується аніон гліфосату in planta. "Білок стійБагато модифікацій і інших варіантів здійсненкості до гербіциду" або білок, який є продуктом ня винаходів, представлених тут, будуть зрозумілі експресії "молекули нуклеїнових кислот, що кодує фахівцеві в галузі техніки, до якої ці винаходи настійкість до гербіциду", включає білки, які надають лежать, що мають перевагу ідеї винаходу, предклітині здатність бути толерантною до більш висоставленого в попередніх описах і супутніх крескої концентрації гербіциду, ніж клітини, які не ексленнях. Тому, слід розуміти, що винаходи не пресують білок, або переносити певну концентраповинні бути обмежені конкретними розкритими цію гербіциду протягом більшого проміжку часу, варіантами здійснення, і що модифікації й інших ніж клітини, які не експресують білок. "Білок стійковаріантів здійснення призначені для включення в сті до гліфосату" включає білок, який надає клітині обсяг домагань. Хоча тут використовуються певні здатності залишатися толерантною до більш висотерміни, вони застосовані тільки в типовому й опикої концентрації гліфосату, ніж клітини, які не екссовому змісті, а не з метою обмеження. пресують білок, або бути толерантною до певної Даний винахід стосується композицій і спосоконцентрації гліфосату протягом більш довгого бів регуляції в організмах стійкості до гербіциду, проміжку часу, ніж клітини, які не експресують біособливо в рослинах або рослинних клітинах. лок. Під виразом "бути толерантним" або "толера 7 92622 8 нтність" мається на увазі або виживання, або ви30%, 20%, 10% або 5% (суха вага) білка стійкості конання найважливіших клітинних функцій, таких до не гербіциду (також позначається у даному як синтез білка й дихання, таким способом, який описі як "забруднюючий білок"). важко відрізнити від необроблених клітин. Молекули нуклеїнових кислот, які є фрагменІзольовані молекули нуклеїнових кислот і варітами цих нуклеотидних послідовностей, які кодуанти й фрагменти таких ють стійкість до гербіциду, також входять до обсяОдин аспект винаходу стосується ізольованих гу даного винаходу. Під "фрагментом" розуміється молекул нуклеїнових кислот, які містять нуклеотичастина нуклеотидної послідовності, яка кодує дні послідовності, що кодують білки й поліпептиди білок стійкості до гербіциду. Фрагмент нуклеотидстійкості до гербіциду або біологічно активні часної послідовності може кодувати біологічно активтини таких, так само як і молекули нуклеїнових ну частину білка стійкості до гербіциду, або це мокислот, що підходять для застосування як гібридиже бути фрагмент, який може бути використаний заційні зонди для ідентифікації нуклеїнових кисяк гібридизаційний зонд або ПЛР-праймер з виколот, які кодують стійкість до гербіциду. Як викорисристанням способів, розкритих нижче. Молекули товуються в даному описі, термін "молекула нуклеїнових кислот, які є фрагментами нуклеотиднуклеїнової кислоти" призначений включати моленої послідовності стійкості до гербіциду, містять кули ДНК (наприклад, кДНК або геномної ДНК) і принаймні приблизно 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, молекули РНК (наприклад, мРНК) і аналоги ДНК 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, або РНК, отримані з використанням нуклеотидних 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, аналогів. Молекула нуклеїнової кислоти може бути 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, одноланюцоговою або дволанцюговою. 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 послідовних Нуклеотидні послідовності, які кодують білки нуклеотидів, або до числа нуклеотидів, присутніх у за даним винаходом, включають послідовності, повнорозмірній нуклеотидній послідовності, яка наведені в SEQ ID NO:1, 3 і 5, нуклеотидну послікодує стійкість до гербіциду, розкритій в даному довність стійкості до гербіциду, введену в бактеріописі (наприклад, 1892 нуклеотидів для SEQ ID ального хазяїна під номерами доступу NRRL ВNO:1, 1259 нуклеотидів для SEQ ID NO:3, і 1242 30888 і NRRL В-30949, і варіанти, фрагменти, і нуклеотидів для SEQ ID NO:5). Під "послідовними" комплементарні до таких. Під терміном "компленуклеотидами маються на увазі нуклеотидні залиментарний" мається на увазі нуклеотидна послідошки, які є безпосередньо прилеглими один до одвність, яка достатньо комплементарна до даної ного. нуклеотидної послідовності таким чином, що вона Фрагменти нуклеотидних послідовностей за може гібридизуватися з даною нуклеотидною посданим винаходом головним чином будуть кодувалідовністю, утворюючи, таким чином, стійкий дупти фрагменти білка, які зберігають біологічну актилекс. Відповідна амінокислотна послідовність для вність повнорозмірного білка стійкості до гліфосабілка стійкості до гербіциду, яка кодується цими ту; тобто, активність стійкості до гербіциду. Під нуклеотидними послідовностями, наведена в SEQ виразом "зберігає активність стійкості до гербіциID NO:2, 4 або 6. Винахід також охоплює молекули ду", мається на увазі, що фрагмент буде мати нуклеїнових кислот, які містять нуклеотидні посліпринаймні приблизно 30%, принаймні приблизно довності, що кодують неповнорозмірні білки стій50%, принаймні приблизно 70% або принаймні кості до гербіциду, і комплементарні до таких. приблизно 80% активності стійкості до гербіциду "Ізольована" або "очищена" молекула нуклеїповнорозмірних білків стійкості до гліфосату, які нової кислоти або білка або біологічно активна розкриті в даному описі як SEQ ID NO:2, 4 або 6. частина такої, є по суті вільною від іншого клітинСпособи вимірювання активності стійкості до герного матеріалу або культурального середовища, біциду відомі в галузі техніки. Див., наприклад, якщо виробляється за допомогою рекомбінантних Патенти США №№ 4535060 і 5188642, кожний з методик, або є по суті вільною від хімічних попеяких включений у даний опис повністю за допоморедників або інших хімічних реагентів, якщо синтегою посилання. зується хімічно. Переважно, "ізольована" нуклеїФрагмент нуклеотидної послідовності, яка конова кислота вільна від послідовностей дує стійкість до гербіциду, що кодує біологічно (переважно послідовностей, які кодують білок), які активну частину білка за винаходом, буде кодував природі примикають до нуклеїнової кислоти ти принаймні приблизно 15, 25, 30, 50, 75, 100, (тобто, послідовності, розташовані на 5' і 3' кінцях 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 послідовних нуклеїнової кислоти) у геномній ДНК організму, з амінокислот, або аж до загального числа амінокиякого отримана нуклеїнова кислота. Для винаходу, слот у повнорозмірному білку стійкості до гербіцитермін "ізольована" застосовно до молекул нукледу за даним винаходом (наприклад, 436 амінокисїнових кислот, виключає ізольовані хромосоми. лот для SEQ ID NO:2, 413 амінокислот для SEQ ID Наприклад, у різних варіантах здійснення, ізольоNO:4 і 413 амінокислот для SEQ ID NO:6). вана молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує стійБілки стійкості до гербіциду за даним винахокість до гліфосату, може містити менше, ніж прибдом кодуються нуклеотидною послідовністю, дослизно 5 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 2 т.п.н., 1 т.п.н., 0,5 татньо ідентичною до нуклеотидної послідовності т.п.н. або 0,1 т.п.н. нуклеотидної послідовності, що SEQ ID NO:1, 3 або 5. Під терміном "достатньо у природі примикає до молекули нуклеїнової кисідентична" мають на увазі амінокислотну або нуклоти в геномній ДНК клітини, з якої отримана нуклеотидну послідовність, яка має принаймні приблеїнова кислота. Білок стійкості до гербіциду, який лизно 60% або 65% ідентичність послідовності, по суті не містить клітинного матеріалу, включає приблизно 70% або 75% ідентичність послідовносодержання білка, що має менше, ніж приблизно ті, приблизно 80% або 85% ідентичність послідов 9 92622 10 ності, приблизно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, може надати дані про консервативність послідов96%, 97%, 98% або 99% ідентичність послідовносності всієї амінокислотної послідовності. Алгоритм ті при зіставленні з послідовністю порівняння з ClustalW використовуються в декількох комерційно використанням однієї із програм вирівнювання, доступних пакетах програм для аналізу описаних у даному описі, з використанням стандаДНК/амінокислот, таких як модуль ALIGNX Набір ртних параметрів. Кваліфікований фахівець у цій Програми Vector NTI (Корпорація Invitrogen, галузі техніки визнає, що ці значення можуть бути Carlsbad, СА). Після вирівнювання амінокислотних підходящим чином пристосовані для визначення послідовностей ClustalW може бути визначений відповідних ідентичностей білків, які кодуються відсоток амінокислотної ідентичності. Необмежудвома нуклеотидними послідовностями за доповальним прикладом програми, придатної для анамогою прийняття в увагу виродженості кодонів, лізу вирівнювань ClustalW, є GeneDoc . подібності амінокислот, розташування рамки зчиGenedoc (Karl Nicholas) дозволяє оцінювати амітування, і т.п. нокислотну подібність (або ДНК) і ідентичність між Щоб визначити відсоток ідентичності двох подекількома білками. Іншим необмежувальним прислідовностей амінокислот або двох нуклеїнових кладом математичного алгоритму, який викорискислот, послідовності вирівнюють із метою оптитовують для порівняння послідовностей, є алгомального порівняння. Відсоток ідентичності між ритм Myers і Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Такий двома послідовностями є функцією числа ідентичалгоритм включений у програму ALIGN (версія них положень, які є загальними для послідовнос2.0), що є частиною пакета програм для вирівнютей (тобто, відсоток ідентичності = число ідентичвання послідовності GCG (доступний від Accelrys, них положень/загальна кількість положень Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія). Використовуючи про(наприклад, положення, які перекриваються) граму ALIGN для порівняння амінокислотних пос100). В одному варіанті здійснення дві послідовнолідовностей, можуть бути застосовані таблиця сті мають однакову довжину. Відсоток ідентичності ваги залишків РАМ12 0, штраф довжини розриву між двома послідовностями може бути визначений 12 і штраф розриву 4. з використанням методик, подібних до описаних Якщо не вказано інакше, Версія 10 GAP, яка нижче, з або без допущення пропусків. При обчисвикористовує алгоритм Needleman і Wunsch (1970) ленні відсотка ідентичності, як правило, підрахоJ. Mol. Віоl. 48 (3):443-453, буде використана для вують точні співпадіння. визначення ідентичності послідовності або подібВизначення ідентичності відсотка між двома ності з використанням наступних параметрів: % послідовностями може бути досягнуте з викорисідентичності й % подібності для нуклеотидноі постанням математичного алгоритму. Необмежувальлідовності з використанням GAP Weight 50 і Length ним прикладом математичного алгоритму, який Weight 3 і nwsgapdna.cmp матриці очок; % ідентивикористовують для порівняння двох послідовносчності або % подібності для амінокислотної послітей, є алгоритм Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl довності з використанням GAP Weight і Length Acad. Sci. USA 87:2264-2268, змінений як в Karlin Weight 2, і програма нарахування очок BLOSUM62. and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Також можуть бути використані еквівалентні про90:5873-5877. Такий алгоритм включений в грами. Під "еквівалентною програмою" мають на BLASTN і програми BLASTX від Altschul et al. увазі будь-яку програму порівняння послідовності, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST нуклеотидні яка для будь-яких двох розглянутих послідовноспошуки можуть бути виконані програмою BLASTN, тей, робить вирівнювання, що має ідентичні співчисло очок = 100, довжина слова = 12, для одерпадіння нуклеотидних залишків і ідентичний відсожання нуклеотидних послідовностей, гомологічних ток ідентичності послідовностей у порівнянні з до GDC-подібних молекул нуклеїнових кислот за відповідним вирівнюванням, зробленим за доповинаходом. BLAST пошуки білка можуть бути вимогою GAP Версії 10. конані програмою BLASTX, число очок = 50, довВинахід також охоплює молекули варіантів нужина слова = 3, для одержання амінокислотних клеїнової кислоти. "Варіанти" нуклеотидних посліпослідовностей, гомологічних до молекул білка довностей, які кодують стійкість до гербіциду, стійкості до гербіциду за винаходом. Щоб одержавключають ті послідовності, які кодують білок стійти, з метою порівняння, вирівнювання з розривакості до гербіциду, розкритий у даному описі, але ми, може бути використаний Gapped BLAST, як який консервативно відрізняється через вироджеописано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acid Res. ність генетичного коду, так само, як і ті, які досить 25:3389-3402. Як альтернатива, для виконання ідентичні, як обговорено вище (наприклад, SEQ ID повторного пошуку, який виявляє віддалені подібNO:5, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 і 32 є ності між молекулами, може бути застосований варіантами SEQ ID NO:1). Природні алельні варіаPSI-Blast. Див. Altschul et al. (1997) вище. При винти можуть бути ідентифіковані з використанням користанні BLAST, Gapped BLAST і PSI-BLAST відомих методів молекулярної біології, таких як програм, можна використовувати параметри за полімеразна ланцюгова реакція (PCR) і методи замовчуванням відповідних програм (наприклад, гібридизації, як викладено загалом нижче. ВаріанBLASTX і BLASTN). Див. www.ncbi.nlm.nih.gov. тні нуклеотидні послідовності також включають Іншим необмежувальним прикладом математичносинтетично отримані нуклеотидні послідовності, які го алгоритму, який використовують для порівняння були отримані, наприклад, з використанням сайтпослідовностей, є алгоритм ClustalW (Higgins et al. спрямованого мутагенезу, але які усе ще кодують (1994) Nucleic Acid Res. 22:4673-4680). ClustalW білки стійкості до гербіциду, розкриті в даному випорівнює послідовності й вирівнює амінокислотні наході, як обговорено нижче. або ДНК-послідовності повністю, і в такий спосіб 11 92622 12 Варіантні білки, охоплені даним винаходом, є ки зрозумів би, що функціональні варіанти можуть біологічно активними, якщо вони зберігають бажамати малі консервативні або неконсервативні зміну біологічну активність природного білка, тобто, ни в консервативних залишках. активність стійкості до гербіциду. Під "зберігає Lys-22, Arg-124, Asp-313, Arg-344, Arg-386 і активність стійкості до гербіциду" розуміють, що Lys-411 є консервативними залишками EPSPваріант буде мати принаймні приблизно 30%, присинтази з Ε. coli (Schonbrunn et al. (2001) Proc. наймні приблизно 50%, принаймні приблизно 70% Natl. Acad. Sci. USA 98:1376-1380). Консервативні або принаймні приблизно 80% активності стійкості залишки, важливі для EPSP-синтазної активності до гербіциду природного білка. Способи вимірютакож включають Arg-100, Asp-242 і Asp-384 вання активності стійкості до гербіциду добре ві(Selvapandiyan et al. (1995) FEBS Letters 374:253домі в галузі техніки. Див., наприклад, Патенти 256). Arg-27 зв'язується з S3P (Shuttleworth et al. США №№ 4535060 і 5188642, кожний з яких вклю(1999) Biochemistry 38:296-302). чений у даний винахід повністю за допомогою поЯк альтернатива, варіантні нуклеотидні послісилання. довності можуть бути отримані за допомогою ввеКваліфікований фахівець надалі оцінить, що в дення мутацій випадковим чином уздовж всієї або нуклеотидні послідовності за винаходом можуть частини кодувальної послідовності, наприклад, за бути введені зміни за допомогою мутації, у такий допомогою мутагенезу насичення, і отримані муспосіб приводять до змін в амінокислотній послітанти можуть бути перевірені на здатність забездовності кодованих білків стійкості до гербіциду, печувати активність стійкості до гербіциду для ідебез зміни біологічної активності білків. Таким чинтифікації мутантів, які зберігають активність. ном, ізольовані варіантні молекули нуклеїнових Після мутагенезу, кодований білок може бути екскислот можуть бути створені за допомогою ввепресований рекомбінантним способом, і активність дення однієї або декількох нуклеотидних замін, білка може бути визначена з використанням стандодавань або делецій у відповідну нуклеотидну дартних методів тестування. послідовність, розкриту в даному описі, таким чиВикористовуючи способи, такі як ПЛР, гібридином, що в кодований білок будуть введені одна зація й т.п., можуть бути ідентифіковані відповідні або декілька амінокислотних замін, додавань або послідовності стійкості до гербіциду, такі послідовделецій. Мутації можуть бути введені за допомоності, які мають істотну ідентичність із послідовногою стандартних методик, таких як сайтстями за винаходом. Див., наприклад, Sambrook і спрямований мутагенез і ПЛР-опосередкований Russell (2001) Molecular Cloning: Laboratory Manual мутагенез. Такі варіантні нуклеотидні послідовнос(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring ті також входять до обсягу даного винаходу. Harbor, NY) і Innis, et al. (1990) PCR PRotocols: A Наприклад, консервативні амінокислотні заміGuide to Methods and Applications (Academic Press, ни можуть бути зроблені в одному або декількох St.-Louis, MO). передбачених несуттєвих амінокислотних залишУ способі гібридизації вся або частина нуклеоках. "Несуттєвим" амінокислотним залишком є тидної послідовності стійкості до гербіциду може залишок, який може бути змінений у послідовності бути використана для скрикування кДНК або генобілка дикого типу стійкості до гербіциду без змін мних бібліотек. Способи створення таких кДНК і біологічної активності, тоді як "істотний" амінокисгеномних бібліотек є загальновідомими в галузі лотний залишок необхідний для біологічної активтехніки й розкриті в Sambrook and Russell (2001) ності. "Консервативна амінокислотна заміна" є вище. Так звані гібридизаційні зонди можуть бути такою, у якій амінокислотний залишок заміщений фрагментами геномної ДНК, фрагментами кДНК, на амінокислотний залишок, який має подібний фрагментами РНК або іншими олігонуклеотидами, боковий ланцюг. Сімейства амінокислотних залиі можуть бути помічені групою, яка виявляється, шків, що мають подібні бокові ланцюги, були витакою як 32Р або будь-яким іншим маркером, який значені в галузі техніки. Ці сімейства включають виявляється, таким як інші радіоізотопи, флуоресамінокислоти з основними боковими ланцюгами центна сполука, фермент або кофактор ферменту. (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислими бокоЗонди длягібридизації можуть бути отримані за вими ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислодопомогою мічення синтетичних олігонуклеотидів, та, глутамінова кислота), незарядженими полярґрунтуючись на відомій(их) нуклеотидній(их) посними боковими ланцюгами (наприклад, гліцин, лідовності(ях), що кодує(ють) стійкість до гербіциаспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цисду, розкритої(их) у даному описі. Додатково мотеїн), неполярними боковими ланцюгами (наприжуть бути використані вироджені праймери, клад, аланін, валін, лейцин, ізолецин, пролін, фесконструйовані на основі консервативних нуклеонілаланін, метіонін, триптофан), бетатидів або амінокислотних залишків у нуклеотидній розгалуженими боковими ланцюгами (наприклад, послідовності або кодованій амінокислотній послітреонін, валін, ізолейцин) і ароматичними боковидовності. Зонд, як правило, містить ділянку нуклеми ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, отидної послідовності, яка гібридизується в жорсттриптофан, гістидин). Амінокислотні заміни можуть ких умовах із принаймні приблизно 12, принаймні бути зроблені в неконсервативних ділянках, які приблизно 25, принаймні приблизно 50, 75, 100, зберігають функцію. Головним чином, такі заміни 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, не були б зроблені для консервативних амінокис700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600 або 1800 лотних залишків або для амінокислотних залишків, послідовними куклеотидами нуклеотидної посліщо знаходяться у межах консервативного мотиву, довності(ей), що кодує стійкість до гербіциду за де такі залишки є істотними для активності білка. винаходом, або фрагмента або варіанта таких. Однак, кваліфікований фахівець у цій галузі техніСпособи для одержання зондів для гібридизації є 13 92622 14 загальновідомими в галузі техніки й розкриті в ому формаміді, 1,0 Μ NaCl, 1%-ому SDS при 37°C, Sambrook and Russell (2001) вище, і Sambrook et і промивання в 0,5Х-1Х SSC при 55-60°C. Ілюстраal. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual тивні умови високої жорсткості включають гібриди(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold зацію в 50%-ому формаміді, 1 Μ NaCl, 1%-ому Spring Harbor, NY), кожний з яких включений у даSDS при 37°С, і промивання в 0,1Х SSC при 60ний опис за допомогою посилання. б5°С. Необов'язково, буфери для промивання моНаприклад, повна послідовність стійкості до жуть містити від приблизно 0.1% до приблизно 1% гербіциду, розкрита в даному описі, або одна або SDS. Тривалість гібридизації становить звичайно більше частин такої, можуть бути використані як менше ніж приблизно 24 години, звичайно від призонд, здатний специфічно гібридизуватися з відпоблизно 4 до приблизно 12 годин. відними послідовностями стійкості до гербіциду й з Специфічність, як правило, є функцією постгіматричними РНК. Для досягнення специфічної бридизаційних промивань, критичними факторами гібридизації при різних умовах, такі зонди включає іонна сила й температура розчину для заключноють послідовності, які є унікальними і являють сого промивання. Для ДНК-ДНК гібридів, Тm може бою принаймні приблизно 10 нуклеотидів у довжибути наближена до рівняння Meinkoth and Wahl ну й принаймні приблизно 20 нуклеотидів у (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + довжину. Такі зонди можуть бути використані для 16,6 (log M), + 0,41 (%GC) - 0,61 (% форм.) - 500/L; ампліфікації відповідних послідовностей стійкості де М є молярністю одновалентних катіонів, %GC до гербіциду з вибраного організму за допомогою відсоток нуклеотидів гуанозину й цитозину в ДНК, ПЛР. Ця методика може бути використана для % форм. - відсоток формаміду в розчині гібридивиділення додаткових кодувальних послідовносзації, і L - довжина гібриду в парах азотистих остей, з бажаного організму або як діагностичний нов. Тm є температурою (при певній іонній силі й тест для визначення присутності кодувальних посрН), при якій 50% комплементарної послідовностілідовностей, в організмі. Методи гібридизації мішені гібридизується з ідеально відповідною провключають гібридизаційное скринування висіяних бою. Tm зменшується приблизно на 1°С з кожним на чашки бібліотек ДНК (або бляшок, або колоній; 1% невідповідності; таким чином, Tm, гібридизація див., наприклад, Sambrook et al. (1989) Molecular та/або умови промивання можуть бути відрегульоCloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring вані для гібридизації з послідовностями бажаної Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). ідентичності. Наприклад, якщо потрібно знайти Гібридизація таких послідовностей може бути послідовності з 90%-ою ідентичністю, Tm може виконана в жорстких умовах. Під "жорсткими умобути зменшена на 10°С. Звичайно жорсткі умови вами" або "жорсткими умовами гібридизації" мавибираються, щоб бути приблизно на 5°C нижче, ють на увазі умови, у яких зонд гібридизується зі ніж температура точки плавлення (Tm) для специсвоєю послідовністю-мішенню в детектовано біфічної послідовності й комплементарної до неї при льшому ступені, ніж з іншими послідовностями певній іонній силі та рН. Однак, при дуже жорстких (наприклад, принаймні з 2-кратним перевищенням умовах гібридизація та/або промивання можуть фону). Жорсткі умови є залежними від послідовнопроводитися при 1, 2, 3 або 4°C нижче, ніж темпесті й будуть різні при різних обставинах. За допоратура точки плавлення (Tm); при помірно жорстмогою керування жорсткістю гібридизації та/або ких умовах гібридизація та/або промивання моумовами промивання, послідовності-мішені, які на жуть проводитися при 6, 7, 8, 9, або 10°C нижче 100% комплементарні до зонду, можуть бути іденніж температура точки плавлення (Tm); в умовах тифіковані (homologous probing). Як альтернатива, низької жорсткості гібридизація та/або промивання жорсткі умови можуть бути відрегульовані для доможуть проводитися при 11, 12, 13, 14, 15 або зволення деякої невідповідності в послідовностях 20°C нижче ніж температура точки плавлення (Tm). так, щоб були виявлені більш низькі ступені подібЗастосовуючи рівняння, гібридизацію й склади ності (heterologous probing). Звичайно, зонд станопромивання й бажану Tm, середньому фахівцеві вить у довжину менше, ніж приблизно 1000 нуклезрозуміло, що розмаїтість у жорсткості гібридизації отидів, або менше, ніж приблизно 500 нуклеотидів та/або розчинів промивання по суті описано. Якщо у довжину. бажаний ступінь невідповідності приводить до Tm Як правило, жорсткими умовами будуть такі, менше, ніж 45°С (водний розчин) або 32°С (розчин при яких концентрація солі менше, ніж приблизно формаміду), переважно збільшити концентрацію 1,5 Μ іон Na, як правило, від приблизно 0,01 до 1,0 SSC так, щоб можна було використати більш висоΜ концентрації іона Na (або інших солей) при рН ку температуру. Великий посібник з гібридизації від 7,0 до 8,3 і температурі принаймні приблизно нуклеїнових кислот знайдено в Tijssen (1993) 30°C для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular нуклеотидів) і принаймні приблизно 60°C для довBiology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part гих зондів (наприклад, більше, ніж 50 нуклеотидів). I, Chapter 2 (Elsevier, New York); і Ausubel et al., Жорсткі умови можуть також бути досягнуті додаeds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, ванням агентів для дестабілізації, таких як форChapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, мамід. Ілюстративні умови низької жорсткості New York). Див. Sarabrook et al. (1989) Molecular включають гібридизацію в буферному розчині Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring 30%-35%-ого формаміду, 1 Μ NaCl, 1%-ий SDS Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). (натрію додецилсульфат) при 37°С, і промивання в Ізольовані білки й варіанти й фрагменти таких 1Х-2Х SSC (20X SSC = 3,0 Μ NaCl/0,3 M тринатрію Білки стійкості до гербіциду також охоплені обцитрат) при 50-55°C. Ілюстративні умови помірної сягом даного винаходу. Під "білком стійкості до жорсткості включають гібридизацію в 40%-45%гербіциду" або "білком толерантності до гербіциду" 15 92622 16 мають на увазі білок, який має амінокислотну постіоніну може привести до утворення варіантів лідовність, представлену в SEQ ID NO:2, 4 або 6. grg23 або grg51, які мають стійкість до гербіциду. Фрагменти, біологічно активні частини й варіанти Ці білки стійкості до гербіциду входять до обсягу таких також представлені й можуть бути викорисданого винаходу й можуть бути використані в спотані для здійснення на практиці способів за даним собах за даним винаходом. винаходом. Також охоплені антитіла до поліпептидів за "Фрагменти" або "біологічно активні частини" даним винаходом, або до варіантів або фрагменвключають поліпептидні фрагменти, що містять тів таких. Способи одержання антитіл добре відомі частину амінокислотної послідовності, яка кодує в галузі техніки (див., наприклад, Harlow and Lane білок стійкості до гербіциду, як наведено в SEQ ID (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring NO:2, 4, або 6, і які зберігають активність стійкості Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY); Патент до гербіциду. Біологічно активна частина білка США № 4196265). стійкості до гербіциду може бути поліпептидом, Змінені або поліпшені варіанти що, наприклад, має 10, 25, 50, 100 або більше аміВизнано, що послідовність ДНК grg23 або нокислот у довжину. Такі біологічно активні частиgrg51 може бути змінена за допомогою різних спони можуть бути отримані за допомогою рекомбінасобів, і що ці зміни можуть привести до ДНК послінтних методик і оцінені на активність стійкості до довностей, які кодують білки з амінокислотними гербіциду. Способи вимірювання активності стійпослідовностями, відмінними від тих, які кодуються кості до гербіциду добре відомі в галузі техніки. grg23 або grg51. Цей білок може бути змінений Див., наприклад, Патенти США №№ 4535060 і різними шляхами, включаючи амінокислотні замі5188642, кожний з яких включений у даний опис ни, делеції, усікання й інсерції. Способи таких маповністю за допомогою посилання. Як використоніпуляцій є загальновідомими в галузі техніки. Навуються в даному описі, фрагмент містить приприклад, варіанти амінокислотної послідовності наймні 8 послідовних амінокислот SEQ ID NO:2, 4 білка GRG23 або GRG51 можуть бути отримані за або б. Однак винахід охоплює інші фрагменти, такі допомогою мутацій у ДНК. Це також може бути як, наприклад, будь-який фрагмент у білку, більдосягнуте за допомогою однієї з декількох форм ший, ніж приблизно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, мутагенезу та/або за допомогою спрямованої ево250, 300, 350 або 400 амінокислот. люції. У деяких аспектах, зміни, які кодуються в Під "варіантами" маються на увазі білки або амінокислотній послідовності, не будуть по суті поліпептиди, що мають амінокислотну послідоввпливати на функцію білка. Такі варіанти будуть ність, яка принаймні приблизно на 60%, 65%, примати бажану активність стійкості до гербіциду. наймні приблизно на 70%, 75%, принаймні прибОднак, зрозуміло, що здатність GRG23 або GRG51 лизно на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, надавати стійкість до гербіциду може бути поліп95%, 96%, 97%, 98% або 99%, ідентична до аміношена за допомогою використання таких методик у кислотної послідовності SEQ ID NO:2, 4, або б (накомпозиціях за даним винаходом. Наприклад, приклад, SEQ ID NO:6, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, GRG23 або GRG51 можуть експресуватися в клі29, 31 і 33 є варіантами SEQ ID NO:2). Варіанти тинах-хазяїнах, які проявляють високі рівні помилтакож включають поліпептиди, які кодуються мокового включення під час реплікації ДНК, таких як лекулою нуклеїнової кислоти, що гібридизується з XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Після відтвомолекулою нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:1, 3 рення в таких штамах, ДНК grg23 або grg51 може або 5, або комплементарна до таких, у жорстких бути ізольована (наприклад, за допомогою одерумовах. Варіанти включають поліпептиди, які віджання плазмідної ДНК або за допомогою ПЛРрізняються за амінокислотною послідовністю внаампліфікації й клонування ПЛР-фрагмента, який слідок мутагенезу. Варіантні білки, охоплені даним отримують, у вектор) і культивуватися в немутавинаходом, є біологічно активними, так що вони генних штамах. Клони, що містять мутації в grg23 продовжують мати бажану біологічну активність або grg51, можуть бути ідентифіковані за допомовихідного білка, тобто, зберігають активність стійгою вимірювання поліпшеної стійкості до гербіцикості до гербіциду. Способи вимірювання активноду, такому як гліфосат, наприклад, за допомогою сті стійкості до гербіциду добре відомі в галузі техвирощування клітин на зростаючих концентраціях ніки. Див., наприклад, Патенти США №№ 4535060 гліфосату й тестування для пошуку клонів, які маі 5188642, кожний з яких включений у даний опис ють толерантність до зростаючих концентрацій повністю за допомогою посилання. гліфосату. Бактеріальні гени, такі як ген grg23 або grg51 Як альтернатива, можуть бути зроблені зміни з за даним винаходом, досить часто мають множинпослідовністю білка багатьох білків з аміно- або ні ініціюючі кодони метіоніну поблизу початку відккарбокси-кінця, по суті не впливаючи на активритої рамки зчитування. Часте ініціювання трансність. Ці зміни можуть включати інсерції, делеції ляції в одному або декількох із цих старт-кодонів або зміни, що вводять за допомогою сучасних моприведе до утворення функціонального білка. Ці лекулярні способів, таких як ПЛР, включаючи ПЛРстарт-кодони можуть включати ATG-кодони. Одампліфікацію, що змінює або подовжує послідовнак, бактерії, такі як Bacillus sp., також впізнають ність, яка кодує білок, за допомогою включення кодон GTG як старт-кодон, і білки, які починають послідовностей, які кодують амінокислоти в оліготранслюватися в кодонах GTG, містять метіонін у нуклеотидах, що використовують при ПЛРпершій амінокислоті. Крім того, це не часто визнаампліфікації. Як альтернатива, додані послідовночається a priori, які із цих кодонів використовуютьсті білка можуть включати повні послідовності, які ся в природі в бактерії. Таким чином, зрозуміло, кодують білок, такі як ті, які звичайно застосовущо використання одного з додаткових кодонів меються в галузі техніки для одержання гібридних 17 92622 18 білків. Такі гібридні білки часто застосовуються ність нуклеїнової кислоти, яка функціонує, щоб для (1) збільшення експресії білка, який представнаправити транскрипцію розташованої далі за наляє інтерес; (2) введення зв'язувального домену, прямом кодувальної послідовності. Промотор, раферментативної активності або епітопу для полезом з іншими послідовностями нуклеїнової кислогшення або очищення білка, або виявлення білка ти, які регулюють транскрипцію й трансляцію (які або інших експериментальних застосувань, відотакож називаються "регуляторні послідовності"), мих в галузі техніки; або, (3) адресній секреції або необхідний для експресії послідовності ДНК, яка трансляції білка в субклітинну органелу, таку як представляє інтерес. периплазматичний простір грамнегативних бактеТрансформація бактеріальних клітин здійснюрій або ендоплазматична сітка еукаріотичних кліється за допомогою однієї з декількох методик, тин, остання з яких часто приводить до глікозилувідомих в галузі техніки, включаючи, але не обмевання білка. жуючись електропорацією або хімічною трансфоВаріантні нуклеотидні й амінокислотні послірмацією (Див., наприклад, Ausubel (ed.) (1994) довності за даним винаходом також охоплюють Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley послідовності, отримані за допомогою мутагенних і and Sons, Inc., Indianapolis, IN)). Маркери, що нерекомбінантних процедур, таких як перетасування суть стійкість до токсичних речовин, застосовуДНК. За допомогою такої процедури одна або деються для ідентифікації трансформованих клітин кілька різних кодувальних ділянок, білків стійкості (які захопили і експресують тестовану ДНК) від до гербіциду може бути використана для створеннетрансформованих клітин (тих, які не містять або ня нового білка стійкості до гербіциду, який має не експресують тестовану ДНК). В одному аспекті бажані властивості. Таким чином, бібліотеки рековинаходу, ген grg23 або grg51 застосовується як мбінантних полінуклеотидів формуються із числа маркерний ген для оцінки трансформації бактеріаспоріднених полінуклеотидних послідовностей, що льних або рослинних клітин. включають ділянки послідовності, які мають істотТрансформація рослинних клітин може здійсну ідентичність послідовності й можуть бути гомонюватися подібним способом. Під "рослиною" малогічно рекомбіновані in vitro або in vivo. Наприють на увазі цілі рослини, органи рослини (наприклад, застосовуючи цей підхід, фрагменти клад, листи, стебла, корінь, і т.д.), насіння, послідовності, яка кодує домен, що представляє рослинні клітини, пагони, ембріони й потомство інтерес, можуть бути перетасовані між геном стійтакої. Рослинні клітини можуть бути диференційокості до гербіциду за винаходом й іншими відомиваними або недиференційованими (наприклад, ми генами стійкості до гербіциду для одержання калюс, суспензійні культури клітин, протопласти, нового гена, що кодує білок з поліпшеною властиклітини листя, клітини кореня, клітини флоеми, вістю, яка представляє інтерес, такою як збільшепилок). "Трансгенні рослини" або "трансформовані на активність стійкості до гліфосату. Стратегії для рослини" або "стабільно трансформовані" рослитакого перетасування ДНК відомі в галузі техніки. ни, клітини або тканини належать до рослин, які Див., наприклад, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. увібрали або інтегрували послідовності екзогенної Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature нуклеїнової кислоти або фрагменти ДНК у рослин370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. ну клітину. Під "стабільною трансформацією" ма15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336ють на увазі, що нуклеотидна конструкція, введена 347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA в рослину, інтегрує в геном рослини й здатна до 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288того, щоб бути успадкованою потомством такої. 291; і Патенти США №№ 5605793 і 5837458. Ген grg23 або grg51 за винаходом може бути Трансформація бактеріальних або рослинних модифікований для одержання або посилення клітин експресії в рослинних клітинах. Послідовності стійПредставлене в даному описі є новими ізокості до гербіциду за винаходом можуть бути льованими генами, які надають стійкість до гербіпредставлені в експресійних касетах для експресії циду. Також представлене є амінокислотними пов рослині, що представляє інтерес. "Касета для слідовностями білків GRG23 і GRG51. Білок, який експресії в рослині" включає конструкції ДНК, які утворюється при трансляції цього гена, дозволяє здатні приводити до експресії білка з відкритої клітинам функціонувати в присутності концентрарамки зчитування в рослинній клітині. Касета буде цій гербіциду, які інакше були б токсичні для клівключати в 5'-3' напрямку транскрипції, ділянку тин, включаючи рослинні клітини й бактеріальні ініціації транскрипції (тобто, промотор), функціоклітини. нально зв'язану з послідовністю ДНК за винахоВ одному аспекті винаходу, ген grg23 або дом, і ділянку термінації транскрипції й трансляції grg51 застосовний як маркерний ген для оцінки (тобто, ділянку термінації), які функціонують у ространсформації бактеріальних або рослинних клілинах. Касета може додатково містити принаймні тин. один додатковий ген для котрансформації в оргаЗа допомогою конструювання grg23 або grg51 нізм, такий як ген маркера селекції. Як альтернадля (1) експресії з бактеріальним промотором, що тива, додатковий ген(и) може бути представлений стимулює транскрипцію в тестованому організмі, у декількох касетах для експресії. Така касета для (2) правильної трансляції для утворення незмінеекспресії представлена з багатьма рестриктними ного пептиду GRG23 або GRG51, і (3) переміщенсайтами для інсерції послідовності стійкості до ня клітин в іншу токсичну концентрацію гербіциду, гербіциду під транскрипційною регуляцією регуляможуть бути ідентифіковані клітини, які були транторних ділянок. сформовані ДНК за допомогою їх стійкості до герПромотор може бути нативним або аналогічбіциду. Під "промотором" мають на увазі послідовним, або стороннім або гетерологічним, до росли 19 92622 20 ни-хазяїна та/або до послідовності ДНК за винахопослідовність, розташовану проти ходу трансткридом. Додатково, промотор може бути послідовніспції кодувальної послідовності. тю, що зустрічається в природі, або, на противагу, Інші розташовані проти ходу транскрипції або синтетичною послідовністю. Якщо промотор є "наза ходом транскрипції нетрансльовані елементи тивним" або "гомологічним" до рослини-хазяїна, це включають енхансери. Енхансерами є нуклеотидні означає, що промотор походить із нативної рослипослідовності, які приводять до збільшення ексни, у яку введений промотор. Якщо промотор є пресії промоторної ділянки. Енхансери відомі в "стороннім" або "гетерологічним" до послідовності галузі техніки й включають, але не обмежені, діляДНК за винаходом, це означає, що промотор не нкою енхансера SV40 і енхансерним елементом походить або не є промотором, що зустрічається в 35S. природі, функціонально зв'язаним з послідовністю Ділянка термінації може бути нативною по відДНК за винаходом. "Гетерологічний" звичайно стоношенню до ділянки ініціації транскрипції, може сується послідовностей нуклеїнової кислоти, які не бути нативною по відношенню до послідовності є ендогенними для клітини або частиною нативностійкості до гербіциду за даним винаходом, або го геному, у якому вони знаходяться, і були додані може бути отримана з іншого джерела. Зручні дідо клітини за допомогою інфекції, трансфекції, лянки термінації доступні з Ті-плазміди A. мікроін'єкції, електропорації, мікропроекції, або т.п. tumefaciens, такі як ділянки термінації октопінсинПід "функціонально зв'язаний" мають на увазі футази й нопалінсинтази. Див. також Guerineau et al. нкціональний зв'язок між промотором і другою по(1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot слідовністю, якщо послідовність промотору ініціює (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes й опосередковує транскрипцію з послідовності Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell ДНК, що відповідає другій послідовності. Звичай2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; но, "функціонально зв'язаний" означає, що зв'язані Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; послідовності нуклеїнової кислоти є послідовними і Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 25 15:9627й, при необхідності приєднання двох послідовних 9639. ділянок, що кодують білок, послідовні в одній і тій За необхідності, ген(и) може бути оптимізовані же самій рамці зчитування. для збільшення експресії в трансформованій кліЧасто такі конструкції будуть також містити 5' і тині-хазяїні. Таким чином, гени можуть бути синте3' нетрансльовані ділянки. Такі конструкції можуть зовані, застосовуючи кодони, переважні для клітимістити "сигнальну послідовність" або "лідерну ни-хазяїна, для поліпшеної експресії, або можуть послідовність" для полегшення котрансляції або бути синтезовані, застосовуючи кодони, переважні посттрансляційного транспорту пептиду, що преддля хазяїна, використовуючи повтори. Звичайно, ставляє інтерес, у певні внутрішньоклітинні струкGC вміст гена буде збільшено. Див., наприклад, тури, такі як хлоропласт (або інший пластид), енCampbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 доплазматична сітка або апарат Гольджи, або для обговорення кодонів, переважних для хазяїна. бути секретованим. Наприклад, ген може в реСпособи синтезування генів, переважних для хазязультаті конструювання містити сигнальний пептид їна, є широко відомими в галузі техніки. Див., надля полегшення передачі пептиду в ендоплазмаприклад, Патенти США №№ 6320100; 6075185; тичну сітку. Під "сигнальною послідовністю" мають 5380831 і 5436391, Опубліковані заявки США №№ на увазі послідовність, яка відома або, як вважа20040005600 і 20010003849, і Murray et al. (1989) ють, приведе до котрансляційного або посттрансNucleic Acids Res. 17:477-498, включені в даний ляційного транспорту пептиду через клітинну мемопис за допомогою посилання. брану. В еукаріот цей транспорт звичайно задіює В одному варіанті здійснення, нуклеїнові киссекрецію в апарат Гольджи, з деяким глікозилулоти, що представляють інтерес, націлені для ексванням. Під "лідерною послідовністю" розуміють пресії в хлоропласт. У даному способі, якщо нуклебудь-яку послідовність, яка при трансляції привоїнова кислота, що представляє інтерес, дить до амінокислотної послідовності, достатньої безпосередньо не вставлена в хлоропласт, касета для запуску котрансляційного транспорту пептиддля експресії буде додатково містити нуклеїнову ного ланцюга в субклітинну органелу. Таким чикислоту, яка кодує транзитний пептид для напрямном, вказане вище включає транспорт, спрямоваку генетичного продукту, що представляє інтерес, ний лідерною послідовністю, та/або у хлоропласти. Такі транзитні пептиди відомі в глікозилування за допомогою проходу в ендоплагалузі техніки. Див., наприклад, Von Heijne et al. зматичну сітку, проходів до вакуоль, пластид, (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. включаючи хлоропласти, мітохондрії, і т.п. Касета (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa для експресії в рослині може також бути складена et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. таким чином, щоб містити інтрон, процесинг мРНК (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414якого необхідний для експресії. 1421; і Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Під "3' нетрансльованою ділянкою" мають на Нуклеїнові кислоти, що представляють інтеувазі нуклеотидну послідовність, розташовану за рес, які будуть націлені в хлоропласт, можуть бути ходом транскрипції кодувальної послідовності. оптимізовані для експресії в хлоропласті, беручи Послідовності сигналу поліаденілування та інші до уваги відмінності у використанні кодонів між послідовності, що кодують регуляторні сигнали, ядром рослини й цією органелою. Таким чином, здатні впливати на додавання поліаденіловокиснуклеїнові кислоти, що представляють інтерес, лих хвостів до 3-кінця попередника мРНК, є 3' неможуть бути синтезовані, застосовуючи кодони, трансльованими ділянками. Під "5' нетрансльовапереважні для хлоропласта. Див., наприклад, Паною ділянкою" розуміють нуклеотидну 21 92622 22 тент США № 5380831, включений у даний опис за за допомогою інших способів, таких як мікропроекдопомогою посилання. тування, мікроін'єкція, електропорація, поліетиленЯк правило, дана "касета для експресії в росгліколь, і т.д. лині" буде вставлена в "вектор для трансформації Трансформація рослини рослини". Під "вектором для трансформації" маСпособи за винаходом стосуються введення ють на увазі молекулу ДНК, що необхідна для нуклеотидної конструкції в рослину. Під "введенефективної трансформації клітини. Така молекула ням" мають на увазі надання рослині нуклеотидної може складатися з однієї або декількох касет для конструкції таким чином, що конструкція одержує експресії, і може бути організована в більше ніж доступ усередину клітини рослини. Способи за одну "векторну" молекулу ДНК. Наприклад, повинаходом не вимагають використання конкретнодвійні вектори є векторами для трансформації го способу введення рослині нуклеотидної консрослини, які використовують два непослідовні трукції, якщо нуклеотидна конструкція одержує ДНК-вектори для кодування всіх необхідних цис- і доступ принаймні усередину однієї клітини рослитранс-діючих функцій для трансформації рослинни. Способи введення нуклеотидних конструкцій у них клітин (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in рослини відомі в галузі техніки, включаючи, але не Plant Science 5:446-451). "Вектор" стосується консобмежуючись способами стабільної трансформатрукції нуклеїнової кислоти, сконструйованої для ції, способами тимчасової трансформації й віруспередачі між різними клітинами-хазяями. "Вектор опосередкованими способів. для експресії" стосується вектора, який здатний Загалом, способи трансформації рослин стовбудовуватися, інтегрувати й експресувати гетесуються перенесення гетерологічної ДНК у росрологічні послідовності ДНК або фрагменти в чулинні клітини-мішені (наприклад, незрілі або зрілі жорідній клітині. ембріони, суспензійні культури, недиференційоваЦей вектор для трансформації рослини може ний калюс, протопласти, і т.д.), після чого за доповключати один або декілька ДНК-векторів, необмогою застосування максимального граничного хідних для досягнення трансформації рослини. рівня підходящої селекції (залежно від гена марНаприклад, звичайною практикою в галузі техніки кера селекції й у цьому випадку "гліфосату") відє використання векторів для трансформації росновлюють трансформовані рослинні клітини із грулини, які складаються з більше ніж одного посліпи нетрансформованої клітинної маси. довного ДНК-сегмента. Ці вектори часто згадуютьЕксплантати, як правило, переносяться для свіжося в галузі техніки як "подвійні вектори". Подвійні го доступу того ж самого середовища й культивувектори так само, як і вектори з допоміжними плаються звичайним способом. Згодом, трансформозмідами найчастіше застосовуються для вані клітини диференціюються в пагони після Agrobacterium-опосередкованої трансформації, переміщення в середовище для регенерації, допоколи необхідні досить великий розмір і складність внене максимальним граничним рівнем речовини сегментів ДНК для досягнення ефективної трансселекції (наприклад, "гліфосат"). Пагони потім пеформації, і вигідно розділити функції між окремими реносять у селективне середовище для вирощумолекулами ДНК. Подвійні вектори, як правило, вання рослин для відновлення кореневих пагонів містять плазмідний вектор, що містить цис-діючі або саджанців. Трансгенний саджанець далі виропослідовності, необхідні для Т-ДНК переміщення стає в зрілі рослини й робить родючі насіння (на(як, наприклад, ліву границю й праву границю), приклад, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271маркер селекції, що сконструйований так, щоб 282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology бути здатним до експресії в рослинній клітині, і ген, 14:745-750). Експлантати, як правило, переносять який представляє інтерес (ген, сконструйований свіжими в те ж саме середовище й культивують так, щоб бути здатним до експресії в рослинній звичайним способом. Загальний опис методів і клітині, для якої бажане утворення трансгенних способів одержання трансгенних рослин знайдено рослин). Також на цьому плазмідному векторі прив Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant сутні послідовності, необхідні для реплікації в бакScience 13:219-239 і Bommineni and Jauhar (1997) терії. Цис-діючі послідовності влаштовані таким Maydica 42:107-120. Оскільки трансформований чином, щоб забезпечувати ефективну передачу в матеріал містить багато клітин; і трансформовані й рослинні клітини й експресію в них. Наприклад, ген нетрансформовані клітини присутні в будь-якій маркера селекції й ген, що представляє інтерес, частині обробленого калюсу-мішені або тканини, розташовані між лівою й правою границями. Часто або групи клітин. Здатність знищувати нетрансфодругий плазмідний вектор містить транс-діючі факрмовані клітини й дозволяти трансформованим тори, які опосередковують Т-ДНК передачу від клітинам розмножуватися дає культури трансфорAgrobacterium до рослинних клітин. Ця плазміда мованих рослин. Часто, здатність видалити нетрачасто містить фактори вірулентності (Vir-гени), які нсформовані клітини є обмеженням для швидкого дозволяють інфікувати рослинні клітини за доповідновлення трансформованих рослинних клітин і могою Agrobacterium, і перенесення ДНК за допоуспішного утворення трансгенних рослин. Для підмогою розрізування в послідовностях границі й virтвердження присутності інтегрованого гетерологіопосередкований перенос ДНК, як це розуміють в чного гена, що представляє інтерес, у геномі трангалузі техніки (Hellens and Mullineaux (2000) Trends сгенної рослини можуть бути застосовані in Plant Science, 5:446-451). Кілька типів штамів молекулярні й біохімічні способи. Agrobacterium (наприклад, LBA4404, GV3101, Одержання трансгенних рослин може бути виEHA101, ЕНА105, і т.д.), можуть бути використані конане за допомогою одного з декількох способів, для трансформації рослини. Другий плазмідний включаючи, але не обмежуючись введенням гетевектор не є необхідним для трансформації рослин рологічної ДНК за допомогою Agrobacterium у рос 23 92622 24 линні клітини (Agrobacterium-опосередкована тралізу субстрату EPSPS (наприклад, PEP і S3P) з нсформація), бомбардування рослинних клітин одержанням наступного продукту реакції (напригетерологічною чужорідною ДНК, прикріпленою до клад, 5-єнолпірувіл-3-фосфошикимової кислоти), частинок, і різними іншими спрямованими спосовикористовуючи флуоресцентний тест, описаний бами без частинок (наприклад, Hiei et al. (1994) Vazquez et al. (2003) Anal. Biochem. 320 (2):292The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) 298. Цей тест заснований на окисленні нефлуореNature Biotechnology 14:745-750; Ayres and Park сцентної сполуки N-ацетил-3,7(1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239; дигідроксифеноксацину (Amplex Red, Invitrogen, Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120), Carlsbad, CA) у флуоресцентну сполуку резоруфидля перенесення ДНК. ну за допомогою перекису водню (Zhou і PanchukСпособи трансформації хлоропластів добре Voloshina (1997) Anal. Biochem. 253:169-174). Реавідомі в галузі техніки. Див., наприклад, Svab et al. кція ґрунтується на використанні фосфату пурин(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; нуклеозидфосфорилази (PNP), ксантиноксидази Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (XOD) і пероксидази хрону (HRP). Вивільнення 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. фосфату зв'язане з рівнем флюоресценції, що 12:601-606. Спосіб заснований на доставці за доутворюється при перетворенні Amplex Red у репомогою "рушниці" ДНК-частинок, що містять марзоруфин. Флюоресценцію можна виміряти, наприкер селекції, що адресує ДНК до геному пластид клад, використовуючи флуориметровий фільтр, за допомогою гомологічної рекомбінації. Крім цьоспектрофотометр для зчитування планшетів, спекго, трансформація пластид може бути досягнута трофлуориметр, спектрофотометр або подібні, за допомогою трансактивації мовчазного трансгезастосовуючи способи, добре відомі в галузі техніна в пластиді за допомогою тканино-переважної ки. Флюоресценція, яка утворилася за допомогою експресії РНК полімерази, кодованої в ядрі й реакції, може бути виявлена, застосовуючи флюоспрямованої в пластиди. Така система була згадариметричну установку зі збудженням у діапазоні на в McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA від приблизно 530 до приблизно 560 нм і емісією 90:5873-5877. приблизно 590 нм. Поглинання можна вимірювати Клітини, які були трансформовані, можуть бути (наприклад, застосовуючи спектрофотометр або вирощені в рослини відповідно до загальноприйспектрофотометр для зчитування планшетів) принятих способів. Див., наприклад, McCormick et al. близно при 565 нм. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Ці рослини потім В одному варіанті здійснення даний винахід можуть бути вирощені, і опилені або тим же самим охоплює зміну раніше вказаних умов тесту для трансформованим штамом, або відмінними штарозширення динамічного діапазону тесту для примами, і отриманий гібрид має конститутивну ексстосування до більш широкого діапазону концентпресію бажаної ідентифікованої фенотипової осорацій субстрату. Зміна включає концентрацію XOD бливості. Два або декілька поколінь можуть бути принаймні 1 O/мл, приблизно 1 до приблизно 1,25 вирощені для впевненості в тому, що експресія О/мл, від приблизно 1,25 до приблизно 1,5 O/мл, бажаної фенотипової особливості стабільно підтвід приблизно 1,5 до приблизно 2 O/мл, або більримується й успадковується, а потім збирають ше ніж 2 O/мл; концентрацію ΡΝΡ більше ніж 0,1 насіння для підтвердження, що експресія бажаної O/мл, від приблизно 0,1 до приблизно 0,5 O/мл, від фенотипової особливості була досягнута. Таким приблизно 0,5 до приблизно 1 O/мл, від приблизно чином, даний винахід надає трансформовані на1 до приблизно 1,5 O/мл, від приблизно 1,5 до сіння (які також називаються "трансгенне насінприблизно 2 O/мл, або більше ніж 2 O/мл; і конценя"), які мають нуклеотидну конструкцію за винантрацію Amplex Red більше ніж 100 мкМ, від ходом, наприклад, касету для експресії за приблизно 100 до приблизно 200 мкМ, від прибливинаходом, стабільно включену в їх геном. зно 200 до приблизно 300 мкМ, від приблизно 300 Вимірювання EPSPS-активності до приблизно 400 мкМ, від приблизно 400 до приВ одному варіанті здійснення даного винаходу близно 500 мкМ, від приблизно 500 до приблизно EPSPS-фермент стійкості до гліфосату має Km для 600 мкМ, від приблизно 700 до приблизно 800 фосфоєнолпірувату (PEP) між приблизно 1 і прибмкМ, від приблизно 800 до приблизно 900 мкМ, від лизно 150 мкМ, включаючи приблизно 2 мкМ, приприблизно 900 до приблизно 1000 мкМ, або більблизно 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, ше ніж приблизно 1000 мкМ. Ця модифікація може 80, 90, 100, 110, 120, 130 або приблизно 140 мкМ, і бути застосована до тестів, що вимірюють кінетиKі (гліфосат)/Km (PEP) між приблизно 500 і прибличну активність будь-якого ферменту, у якому фосзно 1000, приблизно 550, приблизно 600, 650, 700, фат вивільняється під час реакції, яка каталізуєть750, 800, 850, 900, 950 або до приблизно 1000. Як ся за допомогою ферменту. використовуються в даному описі, Km і Kі виміряні Рослини в умовах, у яких фермент підкоряється кінетиці Даний винахід може бути використаний для Міхаеліса-Ментена, рН приблизно 7. В одній неотрансформації будь-яких різновидів рослин, вклюбмежувальній методиці вимірювання використочаючи, але не обмежуючись однодольними й двовуються фермент в очищеному вигляді в хлориді дольними. Приклади рослин, що цікавлять, вклюкалію й буфері HEPES при рН 7 при кімнатній темчають, але не обмежені зерновими (кукурудза), пературі й використовуються концентрація гліфосорго, пшеницею, соняшником, томатом, хрестоцсату від 0 до 10 мМ. вітими, перцями, картоплею, бавовником, рисом, Кінетична активність EPSPS може бути вимісоєю, цукровим буряком, цукровим очеретом, тюряна, наприклад, за допомогою вимірювання вивітюном, ячменем, і олійними культурами, Brassica льнення фосфату, який утворюється під час катаsp., люцерною, житом, просом, сафлором, арахі 25 92622 26 сом, бататом, касавою, кавою, кокосовим горіхом, Для визначення наявності білка, кодованого ананасом, цитрусовими деревами, какао, чаєм, геном стійкості до гербіциду за допомогою стандабананом, авокадо, інжиром, гуавою, манго, маслиртних методик, на трансгенних рослинах можуть нами, папайєю, горіхом кешью, макадамією, мигбути виконані вестерн-блотинг і біохімічні тести й далем, вівсом, овочами, декоративними рослинат.п. (Sambrook and Russell (2001) вище), застосоми й хвойними. вуючи антитіла, які зв'язуються з одним або декіОвочі включають, але не обмежені, томатами, лькома епітопами, присутніми в білку стійкості до салатом, зеленими бобами, лімськими бобами, гербіциду. горохом, і членами роду Curcumis, такими як огіНаступні приклади пропонуються як ілюстрарок, мускусна диня й диня мускусу. Декоративні ція, а не як обмеження. рослини включають, але не обмежені азалією, Експериментальна частина гортензією, гібіскусом, трояндами, тюльпанами, Приклад 1: Одержання АТХ213 0 8 нарцисами, петуніями, гвоздиками, молочаєм і АТХ 21308 був виділений за допомогою висіхризантемою. Переважно, рослинами за даним вання зразків ґрунту на Збагачене Мінімальне Живинаходом є хлібні злаки (наприклад, кукурудза, вильне 3 середовище (EMM3), що містить фосфасорго, пшениця, соняшник, помідор, хрестоцвіті, ти й 50 мМ гліфосату. Оскільки EMM3 не містить перці, картопля, бавовник, рис, соя, цукровий буніяких ароматичних амінокислот, штам повинен ряк, цукровий очерет, тютюн, ячмінь, олійні кульбути стійким до гліфосату, щоб рости на цьому тури, і т.д.). живильному середовищі. Цей винахід є особливо підходящим для будьПриблизно один грам ґрунту був розчинений якого члена однодольного сімейства рослин, приблизно в 10 мл води й перемішаний на вортеквключаючи, але не обмежуючись кукурудзою, рисі протягом 5 секунд. 100 мкл цієї суспензії додані сом, ячменем, вівсом, пшеницею, сорго, житом, до 1 мл EMM3 з фосфатом, але без гліфосату. цукровим очеретом, ананасом, бататом, цибулею, EMM3 містить (на літр, рН 7,0): 10 г сахарози, 1 г бананом, кокосовим горіхом і фініками. NH4Cl, 0,2 г MgSO4·7H2O, 0,01 г FeSO4·7Н2О, 0,007 Оцінка трансформації рослини г MnSO4·Н2O та 10 мл розчину фосфату, що місПісля введення гетерологічної чужорідної ДНК тить (на літр, рН 7,0) 210 г Na2HPO4 та 90 г у рослинні клітини, трансформація або інтеграція NaH2PO4. Культуру збовтують в барабані для ткагетерологічного гена в геном рослини підтверджунинних культур, що крутиться, при 21°С протягом ється за допомогою різних способів, таких як ананочі та потім висівають на агар EMM3, що містить ліз нуклеїнових кислот, білків і метаболітів, зв'яза50 мМ гліфосату. Через три дні ізолят висівають них із вбудованим геном. на агар Luria Bertani (LB) для підтвердження єдноПЛР-аналіз є швидким методом для скринінгу сті морфології. Після шести днів одиничну колонію трансформованих клітин, тканини або пагонів на переносять на агар EMM3, що містить 50 мМ глінаявність введеного гена на більш ранній стадії фосату. Ізолят вирощують протягом ночі на чашперед пересаджуванням у ґрунт (Sambrook and ках з 50 мМ гліфосатом. Один специфічний штам, Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory позначений як АТХ21308, був вибраний внаслідок Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold його здатності до росту в присутності високих конSpring Harbor, NY)). ПЛР виконується з викорисцентрацій гліфосату. Цей штам перевірений на танням олігонуклеотидних праймерів, специфічних здатність к росту в присутності гліфосату в рідкій для гена, що представляє інтерес, або для вектокультурі та здатний до вирощування при приблизра Agrobacterium як фон, і т.д. но 300 мМ гліфосату при відпрацьованих умовах. Трансформація рослини може бути підтверПриклад 2. Підготовка й скринування космідджена за допомогою Саузерн-блот аналізу геномних бібліотек ної ДНК (Sambrook and Russell (2001) вище). ЗагаПовна ДНК була одержана з культури лом, загальна ДНК екстрагується із АТХ21308 з використанням способів, широко відотрансформанту, розщеплюється відповідними ремих в галузі техніки. ДНК була частково розщепстриктуючими ферментами, фракціонується в агалена ферментом рестрикції Sau3A1 і лігована з розному гелі й переноситься на нейлонову мемвекторним фрагментом SuperCos (Stratagene) відбрану або нітроцелюлозу. Мембрана або "блот" повідно до вказівок виробника. Продукти літування можуть далі бути досліджені, наприклад, фрагменбули упаковані у фагові частинки з використанням том ДНК-мішені, міченим радіоактивним ізотопом пакувального екстракту GigaPack XL (Stratagene), 32 Р, для підтвердження інтеграції введеного гена в трансфіковані в клітини Ε. coli і висіяні на агарі LB, геном рослини відповідно до стандартних методик що містить 50 мкг/мл канаміцину для відбору ко(Sambrook і Russell, 2001, вище). лоній, що містять косміди. При Нозерн-аналізі з певних тканин трансфоІндивідуальні колонії були переколені в 384рманту виділяють РНК, фракціонують в агарознолункові планшети, що містять бульйон LB і 50 му формальдегідному гелі й переносять на нейломкг/мл канаміцину, і вирощувалися до насичення. новий фільтр відповідно до стандартних методик, Клітини цих культур були розведені 1:10, потім які звичайно використовуються в галузі техніки прикріплені на агарові чашки М63, що містять 50 (Sambrook and Russell (2001) вище). За допомогою мкг/мл канаміцину й або 0 мМ, 10 мМ, 20 мМ або гібридизації фільтра з радіоактивним зондом, 50 мМ гліфосату. [Агарове середовище М63 100 отриманим з GDC за допомогою способів, відомих мМ KН2РО4, 15 мМ (NH4)2SO4, 50 мкМ СаСl2, 1 мкМ в галузі техніки, перевіряють експресію РНК, яка FeSO4, 50 мкМ МgСl2, 55 мМ глюкози, 25 мг/літр Lкодується grg23 або grg51 (Sambrook and Russell проліну, 10 мг/л тіаміну HCl, достатньо NaOH для (2001) вище). доведення рН до 7,0, і 15 г/л агару]. Трансформа 27 92622 28 нти з більш швидким ростом при більш високих Аналіз ділянки ДНК, що оточує grg23, припусконцентраціях гліфосату, були ізольовані й розщекає, що ORF2 передує ділянці зв'язування рибоплені рестриктуючим ферментом EcoRI для іденсоми, тоді як не очевидно, що ділянка зв'язування тифікації космід з подібним малюнком рестрикції. рибосоми передує початку трансляції ORF1. Крім Були ідентифіковані декілька клонів, які ростуть у того, вирівнювання обох відкритих рамок зчитуприсутності гліфосату й мають подібні EcoRI мавання з репрезентативними EPSPS-ферментами люнки рестрикції. Один із цих космідних клонів, показує, що деякі EPSPS-ферменти містять дане рАХ1924, був вибраний для подальших експериN-кінцеве подовження, кодоване в межах ORF1. ментів. Таким чином, функціональний ORF, кодований Приклад 3. Ідентифікація grg23 у косміді grg23 у бактеріях, є ORF2. Тому, як використовурАХ1924 ються в даному описі, GRG23 стосується того, що Для ідентифікації гена(ів), відповідального за кодується ORF2 (нуклеотиди 178-1419 SEQ ID стійкість до гліфосату, продемонстровану косміNO:1). Проте, відомо в галузі техніки, що EPSPSдою рАХ1924, ДНК із цього клону мутагенізували ферменти є досить толерантними до додаткових рухомими елементами. У цьому способі ідентифіамінокислот на їх N-кінці. Тому, експресія ORF1 кували клони, які піддалися інсерціям транспозону (нуклеотиди 109-1419 з SEQ ID NO:1) повинна й втратили здатність надавати стійкість до гліфотакож приводити до EPSPS, що має стійкість до сату. Місце розташування інсерцій транспозону гліфосату. встановлює відкриту рамку зчитування, відповідаДля перевірки здатності ORF2 функціонувати льну за фенотип стійкості до гліфосату. як EPSPS і мати стійкість до гліфосату в клітині, ця Косміда рАХІ924 in vitro була піддана мутагевідкрита рамка зчитування може бути субклонованезу транспозоном з використанням EZ::TN на й експресована в Е. coli. Insertion Kit (Epicentre, Madison, WI) відповідно до Приклад 4. Субклонування grg23 у вектори протоколу виробника. За цим способом фрагмент для експресії в Е. coli. транспозону рандомізовано вставляється в косміГен, що кодує GRG23 ORF2 (який починається дну ДНК і в такий спосіб рандомізовано руйнує з ATG (положення 178-180 з SEQ ID NO:1), який функцію генів у косміді. Цей транспозон містить експресує білок з 413 амінокислот), був субклоноген, що кодує стійкості до триметоприму, таким ваний в pUC18 і pRSF1b, застосовуючи ту ж саму чином, клони з інсерцією транспозону можуть бути стратегію клонування, викладену загалом вище. вибрані за допомогою здатності до росту в присутБув синтезований ПЛР-праймер [5' ності цього антибіотика. Місця розташування інсеCAGGGATCCGGCATGGAAACTGATCGACTAGTG рцій транспозону можуть бути визначені за допо3'], що додає сайт BamHI, за яким розташований могою складання генетичної карти фрагмента GGC (5'-GGATCCGGC-3') безпосередньо з 5' від рестрикції або за допомогою секвенування із старт-ділянки. Був синтезований 2-ий праймер праймерів, які відпалюються на транспозоні. Клони [5'ATTGGCGCGCCCTAGCCGGGGAGCGTAAG 3'], рАХ1924 із вставками транспозону висівали на що додавав сайт AscI безпосередньо з 3' від стопживильне середовище M63, що містить гліфосат. послідовності (5'-GGCGCGCC-3'). Кодувальну діБуло ідентифіковано багато клонів, що містять лянку grg23, ампліфікували за допомогою ПЛР, транспозон, які загубили здатність до росту в призастосовуючи PFUULTRA ДНК-полімеразу сутності гліфосату, вказуючи, що транспозон зруй(Stratagene). Після ПЛР-ампліфікації grg23, застонував ген, відповідальний за стійкість. совуючи дані праймери й розщеплення рестриктаПослідовність ДНК визначали для ділянки зами BamHI/AscI, ПЛР-продукт був лігований в рах1924, що містить інсерції транспозону, застосоpUC19 (розщеплений BamHI і AscI) і pRSF1b (розвуючи способи секвенування, добре відомі в галузі щеплений BamHI і AscI), і були отримані колонії, техніки. Використовуючи цю інформацію про посщо містять вставку. Клон pUC18-grg23 (позначелідовності, синтезували ДНК-праймери й викорисний у даному описі як рАХ1927) був підтверджений товували для визначення послідовності ДНК за допомогою розрізування рестриктазами й за рАХ1924 ділянки, що вміщає інсерції транспозону. допомогою секвенування ДНК. Аналіз отриманих послідовностей ДНК показує, що Подібним чином, вектор для експресії ця ділянка містить зв'язувальний ген. Цей ген позрАХ1909 був розщеплений ВатНІ і AscI, і вектор, начений у даному описі як grg23. Аналіз grg23 пощо містить фрагмент, був виділений з гелю за доказує, що він здатний до утворення двох можливих помогою способів, широко відомих в галузі техніки. білків у бактеріальних клітинах через наявність рАХ1909 є похідним PRSF-1b (Novagen, Sanпотенційних додаткових ділянок старту трансляції. Diego, СА), змінений так, щоб містити ділянку ВатПерший ORF (ORF1) починається зі старт-кодону НІ безпосередньо з 3' ділянки, що кодує збагачеGTG у положеннях 109-111 з SEQ ID NO:1, і закінний гістидином "His-Tag". Таким чином, білки, клочується стоп-кодом TAG біля нуклеотидів 1417новані в рАХ1909, є гібридами в одній рамці, які 1419 з SEQ ID NO:1. Другий ORF (ORF2) починамістять додаткові амінокислоти MAHHHHHHGSG. ється зі старт-кодону ATG біля нуклеотидів 178Вектори, такі як рАХ1909, як правило, розроблені 180 з SEQ ID NO:1, і закінчується стоп-кодоном для експресії й очищення білків, і ці способи широTAG біля нуклеотидів 1417-1419 з SEQ ID NO:1. ко відомі в галузі техніки. Трансляція ORF1 приводить до амінокислотної Розщеплений ПЛР-продукт, отриманий вище, послідовності, наведеної в SEQ ID NO:2. Транслябув лігований у розщеплений вектор рАХ1909, і ція ORF2 приводить до амінокислотної послідовбули отримані колонії, що містять вставку. Клон ності, наведеної в SEQ ID NO:4. pAX1909-grg23 (позначений у даному описі як рАХІ926) був підтверджений за допомогою розщеп 29 92622 30 лення рестриктазами й за допомогою секвенуванПриклад 5. grs23 надає стійкість до високих ріня ДНК. Властивість конструкції рАХ1926 така, що внів гліфосату передбачений продукт трансляції GRG23 містить Конструкцію pUC18-Grg23 (рАХ1927) трансамінокінцеве подовження, що складається з формували в Е. coli штам DH5 і висівали на чашМАНННННН. Це N-кінцеве подовження включає ки з агаром LB, доповнені карбеніциліном (0,1 'гістидинову мітку' або мітку 'six-His', яка застосомг/мл). Були вибрані дві колонії, ресуспендовані в вується для полегшення очищення білка GRG23, стерилізованій воді й висіяні на чашки M63, що що також широко відомо в галузі техніки. містять або 0 мМ, 25 мМ, 50 мМ або 100 мМ гліПлазміда рАХ1926, що містить grg23 ORF2, фосату. Ізопропіл-В-D-тіогалактопіранозид (IPTG; була депонована в Колекції культур служби сіль0,1 мМ), був також доданий на чашки. Як контроль, ськогосподарських досліджень (NRRL) 18 листоклітини, що містять тільки один вектор pUC18, бупада 2005, і їй присвоєний номер доступу NRRL Вли трансформовані й висіяні на чашки із гліфоса30888. том. Після 2 днів росту, ці чашки були перевірені на ріст (Таблиця 1). Таблиця 1 Конструкція pUC18 pUC18-Grg23 (рАХ1927) 0 мМ гліфосату + + 25 мМ гліфосату ++ Цей результат підтверджує, що експресія grg23 з утворенням GRG23-ORF2 надає стійкості до гліфосату в Е. coli до принаймні 100 мМ. Додатково, ріст Е. coli, що містять рАХ1927, більше виражений у присутності гліфосату, ніж за відсутності гліфосату. Приклад 6. Гомологія GRG23 з іншими білками Виведена амінокислотна послідовність GRG23 має гомологію з EPSPS-ферментами, вказуючи, що grg23 кодує EPSPS. Вивчення виведеної амінокислотної послідовності GRG-ORF2 (SEQ ID NO:4) показує, що в ній не міститься чотирьох доменів, типових для II Класу EPSPS-ферментів. У такий спосіб вона є новою, що не належить до класу II, EPSPS стійкості до гліфосату. Пошук публічно доступних білкових баз даних, таких як SWISSPROT, показує, що в GRG23 є амінокислотна подібність із широким класом EPSPSферментів. Однак, жоден білок у всіх базах даних не має більше ніж 50%-ної гомології з амінокислотною послідовністю GRG23. Репрезентативне вирівнювання GRG23 з іншими EPSPS-ферментами показано на Фігурі 1. Приклад 7. Очищення GRG23 Конструкцію pRSF1b-grg23 (рАХ1926) експресували в Е. coli після індукції IPTG і очищали в одну стадію, застосовуючи кобальтову хроматографічну колонку, як відомо в галузі техніки. Після елюції з колонки, очищений GRG23 був діалізований проти 50 мМ HEPES/100 мМ KCl, рН 7,0. Білок був більше ніж на 95% чистий за оцінкою за допомогою PAGE. Кількість GRG23 була визначена кількісно, застосовуючи спосіб Бредфорда, як це відомо в галузі техніки (Bradford (1976) Anal. Biochem. 72:248-254). Приклад 8 Кінетичні тести на активність GRG23 Зразки очищених білків аналізували на активність EPSPS, використовуючи кінетичний тест, що включає інкубацію PEP (Sigma, St. Louis, MO) і S3P у буфері, що містить хлорид калію й HEPES при рН 7.0. Вивільнення фосфату детектували, використовуючи подвійний тест для флуоресцентної детекції фосфату на основі утворення Amplex Red, 50 мМ гліфосату ++ 100 мМ гліфосату ++ як це відомо в галузі техніки (Vazquez et al., (2003) Anal. Biochem. 320:292-298). Опубліковані умови аналізу можуть привести до насичення аналізованого в експериментах, у яких фосфат вивільняється дуже швидко. Це насичення трохи обмежує динамічний діапазон аналізованого, і вимагає певного діапазону концентрацій ферменту. Було визначено, що кінетичне обмеження флуоресцентного тесту для фосфату очевидно через комбінацію факторів, включаючи обмеження інозину й PNP. У даному винаході умови тесту були розроблені таким чином, що привели до значного поліпшення динамічного діапазону й дозволяють застосовувати більш широкий діапазон концентрацій ферменту й субстрату. Умови тесту, які були значно змінені, включають концентрації пуриннуклеозидфосфорилази (PNP), ксантиноксидаза (XOD), AMPLEX Red і інозину, для кожного з яких були збільшені концентрації в тесті для пристосування до більш високої швидкості обороту фосфату. Цей тест був застосований для вимірювання активності EPSPS в 96-лунковому форматі з наступними поліпшеннями: Таблиця 2 Поліпшений флуоресцентний тест Поліпшений Vazquez et al., тест 2003 XOD 1 ,4 PNP 2 ,02 Інозин 2,25 1,5 HRP 1 1 Amp Red 1,100 50 Hepes 26,25 KCl 26,25 pH 7 7,4 Tris 50 Одиниці МО/мл МО/мл мM МО/мл мкМ мM мM мM Ферментативні тести проводилися в 96лункових планшетах у загальному об'ємі 50 мкл. Реакції проводилися при кімнатній температурі при рН 7,0. Усе компоненти тесту крім PEP, 31 92622 32 EPSPS і S3P були об'єднані в Master Mix і розфаГеномна ДНК була отримана зі штаму совані у окремі пробірки в 96-лунковий планшет, АТХ21313, і отримана ДНК частково була розщепзастосовуючи багатоканальну піпетку. У кожну лена ферментом рестрикції Sau3A1 для одержанлунку потім були додані підходящі концентрації ня фрагментів ДНК із розміром приблизно 5 тисяч PEP. Свіжі розведення EPSPS були приготовлені й пар нуклеотидів. Ці молекули ДНК були відібрані додані у відповідні лунки. Кожний тест починали за за розміром на агарозному гелі, виділені й ліговані допомогою додавання S3P. в "плечі" LAMBDA ZAP вектора, який попередньо Дані зі швидкості були нанесені на діаграму, і розщеплювали ВатНІ. Ліговані "плечі" далі були кінетичні параметри Km і Kcat були визначені за упаковані у фагові частинки, і були визначені титри допомогою застосування Рівняння Міхаелісабактеріофага, як відомо в галузі техніки. Отримані Ментена, застосовуючи програму для обробки бібліотеки ампліфікували за допомогою способів, нелінійної кривої (KALEID AGRAPH , Synergy відомих в галузі техніки, для одержання бібліотечSofware). Значення Kі були визначені за допомоного титру між 3 107 і 3 108 БУО/мл. Для кожної гою вимірювання Km (арр) при множинних конценнезалежної бібліотеки, Е. coli (XL1 Blue MRF') була траціях гліфосату, і була складена діаграма Km потім котрансфікована бактеріофагом з ампліфі(арр) як функція концентрації інгібітора. кованої бібліотеки так само, як і М13 фагомпомічником для забезпечення масового вирізання Таблиця 3 бібліотеки у вигляді інфекційної, кільцевої олДНК, як відомо в галузі техніки (Short et al. (1988) Nucleic Вплив гліфосату на Km (app) GRG23 Acids Research 16:7583-7600). Після центрифугування коінфікованих клітин, супернатант, що місКонцентрація гліфосату (мкМ) Km (арр) тить бактеріофаг, нагрівали до 65-70°С протягом 15-20 хвилин для інактивації залишкових часток 0 10, 95 фага лямбди. Розведення отриманої олДНК плаз3000 18,89 мідної бібліотеки трансфікували у свіжу культуру 5000 20,67 компетентних Е. coli клітин XL1 Blue MRF', a також 1000 25,23 клітин XL-Blue MRF' ( aro) (XL1 Blue MRF'). Отримані трасфіковані клітини висівали на чашки М63, За допомогою побудови графіка Km (app) як що містять канаміцин, 0,1 мкМ IPTG і або 0 мМ, 20 функції концентрації гліфосату, може бути отримМ або 50 мМ гліфосату. Цей спосіб скринування мане лінійне представлення стійкості GRG23 до дозволяє ідентифікувати клони, що містять толегліфосату. Точка перетину отриманої лінії з віссю рантні до гліфосату EPSP-синтази, так само, як і X є -Kі. Побудова цієї лінії за даними з Таблиці 3 клони, що несуть толерантність до гліфосату. Коприводить до наступних значень: лонії, що ростуть на 20 мМ або 50 мМ гліфосату в штамі аrо або XL-Blue MRF', були переколені, і їх Таблиця 4 плазміди проаналізовані за допомогою рестриктного розрізування для ідентифікації плазмід із заКінетичні значення для GRG23 гальним малюнком рестрикції. Окремі плазміди секвенували за допомогою способів, відомих в Відношення -1 Фермент Km (мкМ) Кі (мкМ) Kcat (c ) галузі техніки, з перевагою, відданою плазмідам, Kі/Km які проявляли стійкість до 50 мМ гліфосату. Grg23 10,95 9525 8,2 869 Використовуючи цей підхід, який іноді модифікували для кожної бібліотеки, як відомо й цінуєтьGRG23 дуже стійкий до гліфосату, з Kі більше ся в галузі техніки, були пізнані клони бібліотеки, ніж 9 мМ, і відношенням Kі/Km більше ніж 800. що містять гени EPSP-синтази. Приклад 9: Виділення АТХ21308 Послідовності ділянок отриманих клонів були Для штаму АТХ 21313 приблизно один грам ідентифіковані як ділянки EPSP-синтази. ґрунту суспендували в 10 мл води, і були викорисПриклад 11. ДНК і білкова послідовності тані 100 мкл інокуляції 1 мл культури в мінеральEPSP-синтаз них живильних солей середовище A (MSMA) без Послідовність ДНК EPSP-синтази, стійкої до гліфосату. MSMA містить (на 1 літр, рН 7,0) 1г гліфосату, була визначена для рАХ1967 за допоNH4Cl, 10 г сахарози, 0,2 г MgSO4·7Н2О, 0,01 г могою способів, відомих в галузі техніки. ПослідоFeSO4·7H2O, 0,007 г MnSO4·Н2О, доповнене фосвність ДНК grg51 представлена в даному описі як фатами. Після нічної інкубації культура була висіSEQ ID NO:5. Передбачений продукт трансляції яна на тверде середовище, що містить MSMA та grg51 (GRG51) представлений у даному описі як 50 мМ гліфосату, інкубована протягом декількох SEQ ID NO:6. GRG51 демонструє 97% амінокислоднів, та інокульована на агарові чашки Luria тну ідентичність із GRG23 (SEQ ID NO:2). Bertani для підтвердження єдиного типа колоній. Плазміда рАХ1926, що містить grg23 ORF2, Ріст в присутності 50 мМ гліфосату був рекоменбула депонована в Колекції культур служби сільдований після повторного вирощування на MSMA, ськогосподарських досліджень (NRRL) 18 листо50 мМ агарових чашках. Цей спосіб виділення пада 2005, і їй присвоєний номер доступу NRRL Впривів до штаму АТХ21313, який був здатний доб30949. ре рости в таких умовах. Таблиця 5 підсумує гомологію GRG23 і GRG51 Приклад 10. Клонування стійких до гліфосату з іншими EPSP-синтазними ферментами. EPSP-синтаз 33 92622 34 у вектор pRSF1b для створення бібліотеки мутоТаблиця 5 ваних syngrg23. Бібліотеки мутованих syngrg23 були трансфоАмінокислотна ідентичність GRG23-ORF1 і GRG51 рмовані в Е. Соlі штам BL21*DE3 star (Invitrogen). з репрезентативними Фермент-EPSPS-ферментам Після трансформації окремі колонії були висіяні на середовище 1 М63, що містить 150 мм гліфосату % ідентичності з % ідентичності з для відбору клонів, які зберегли ферментативну EPSPS GRG23 GRG51 активність і стійкість росту. Приклад 15. Скринування на стійкість до гліGRG23 92% фосату на чашках GRG51 92% Бібліотечні літування були трансформовані в В_Clausii 36% 35% компетентні клітини Е.coli BL21*DE3 (Invitrogen). R_xylanophilus 39% 38% Трансформації були виконані відповідно до інструΕ_coli 32% 32% кцій виробника з наступними модифікаціями. Після CP4 20% 21% інкубації протягом 1 години при 37°C у середовищі Zea_maize 32% 32% SOC, клітини були осаджені центрифугуванням (5 хвилин, 1000 g, 4°C). Клітини промивали 1 мл Приклад 12. Клонування нових стійких до гліМ63+, знову центрифугували, і видаляли супернафосату EPSP-синтаз в Е. coli вектор для експресії тант. Клітини промивали в другий раз 1 мл М63+ і Ген grg51, що міститься в рАХ1967, був субкповторно ресуспендували в 200 мкл М63+. лонований в Е. coli вектор для експресії pRSF1b Для відбору мутантних ферментів GRG23, що (Invitrogen). Отримані клони були підтверджені за надають стійкість до гліфосату в Е. coli, клітини допомогою ДНК секвенування, і застосовані для були висіяні на агарові чашки із середовищем індукції експресії grg51 в Е. coli. Експресований М63+, що містять 150 мМ гліфосату, 0,05 мМ IPTG His-теговий білок був потім очищений, як відомо в (ізопропіл-бета-D-тіогалактопіранозид) і 50 мкг/мл галузі техніки. канаміцину. Середовище М63+ 100 мМ KН2РО4, 15 Приклад 13. Стійкість до гліфосату EPSPмМ (NH4)2SO4, 50 мкМ СаСl2, 1 мкМ FeSO4, 50 мкМ синтаз МgСl2, 55 мМ глюкози, 25 мг/літр L-проліну, 10 мг/л Клітини, що містять рАХ1967, були висіяні на тіаміну HCl, достатньо NaOH для доведення рН до M63 + чашки, що містять антибіотик і або 0 мМ або 7,0, і 15 г/л агару. Чашки інкубували протягом 36 20 мМ гліфосату. Ріст був оцінений після двох днів годин при 37°C. вирощування при 37°C. Спостерігали, що GRG51 Окремі колонії були переколені, висіяні в 384надавав клітинам Е. coli стійкість до 20 мМ гліфолункові планшети. Таким чином, були створені два сату (Таблиця 6). 384-лункових планшети. Третій планшет з 384 клонами був зібраний з колоній, які росли на чашТаблиця 6 ках без гліфосату. Приклад 16. Ізоляція й аналіз варіантів Гліфосатний скринінг GRG23, стійких до гліфосату Клітини BL21*DE3, трансформовані мутагеніEPSPS Плазмідний клон Ріст на 20 мМ гліфосату зованими syngrg23 і/або варіантами grg23, були Вектор ідентифіковані за допомогою росту на чашках із GRG51 рАХ1967 ++ гліфосатом. Екстракти мутагенізованих syngrg23 і варіантів grgr23 були приготовлені й протестовані Приклад 14. Конструювання syngrg23 і експрена поліпшення ферментативної активності. Колосія нії, ідентифіковані на чашках із гліфосатом, були Послідовність нового гена, що кодує білок прикріплені в 96-лункові блоки, що містять сереGRG23 (SEQ ID NO:2; Заявка на Патент США № довище LB, і були вирощені до O.D. приблизно 0,6. 60/741166, зареєстрована 1 грудня 2005), була Потім був доданий IPTG (0,5 мм), і блоки інкубувасконструйована й синтезована. Ця послідовність ли протягом ночі при 20°C для індукції експресії представлена як SEQ ID NO:12. Ця відкрита рамка білка. Екстракти білка були приготовлені з осадів зчитування, сконструйована в даному описі як клітин, застосовуючи реактив для культур POP "syngrg23", була клонована у вектор для експресії (Novagen) і Lysonase (Novagen), і ферментативна pRSF1b (Invitrogen) за допомогою способів, відоактивність у неочищених лізатах була виміряна мих в галузі техніки. після нагрівання екстрактів протягом 30 хвилин Ген Syngrg23, що кодує GRG23, був клоновапри 37°C. Екстракти з активністю, більшою, ніж два ний у вектор pUC19 для створення рАХ748. Для стандартні відхилення вище за середнє з ряду ампліфікації syngrg23 з рАХ748 з використанням екстрактів, що містять відповідний контрольний MUTAZYME II системи (Stratagene) для введення білок (наприклад, GRG23), були вибрані для подавипадкових мутацій в syngrg23, що кодує ділянку, льшого аналізу. були застосовані ПЛР-праймери, які фланкували Клони, що показують підвищену активність піsyngrg23 у цьому векторі. Матриця була розведена сля інкубації як неочищені екстракти, були виро1:50 у підданій помилкам реакції ПЛР, і ампліфікащені в 250 мл культури LB, і експресія білка була ція виконувалася протягом 30 циклів. Отриманий викликана IPTG. Після індукції мутантний білок ПЛР-продукт був розщеплений ферментами рестGRG23 був очищений з кожної культури за допорикції ВатНІ і Sgsl, очищений від гелю й лігований могою афінної хроматографії з використанням кобальтової смоли (Novagen). Далі очищені білки 35 92622 36 були перевірені на ферментативну активність пісописано в Заявці на Патент США № 60/741166, ля нагрівання протягом 0, 2, 4 і приблизно 16 гозареєстрованої 1 грудня 2005, включеної в даний дин при 37°C. опис повністю за допомогою посилання. ТестуванПриклад 17. Поліпшені варіанти GRG23 ня були проведені в сумарному об'ємі 50 мкл, що З бібліотеки ДНК мутагенізованого syngrg23 містить 0,5 мМ шикимат-3-фосфату, 200 мкМ фобуло ідентифіковано декілька клонів з поліпшеною сфоєнолпірувату (PEP), 1 О/мл ксантиноксидази, 2 активністю. Були визначені послідовності ДНК О/мл нуклеозидфосфорилази, 2,25 мМ інозину, 1 клонів, що відповідають цим екстрактам. У Таблиці О/мл пероксидази хрони, 0-2 мМ гліфосату, 50 мМ 7 показані амінокислотні заміни, ідентифіковані в HEPES/KOH рН 7,0, 100 мМ KCl і AMPLEX Red шести варіантах GRG23, які зберігали стійкість до (Invitrogen) відповідно до інструкцій виробника. гліфосату: grg23 (L3P1.В20) (SEQ ID NO:26), що Екстракти інкубували з усіма компонентами тесту кодує амінокислотну послідовність GRG23 крім шикимат-3-фосфату протягом 5 хвилин при (L3P1.B20) (SEQ ID NO:27); grg23 (L3P1.ВЗ) (SEQ кімнатній температурі, і тестування було почато за ID NO:28) що кодує амінокислотну послідовність допомогою додавання шикимат-3-фосфату. EPSPGRG23 (L3P1.B3) (SEQ ID NO:29); grg23 синтазна активність була виміряна з використан(L3P1.F18) (SEQ ID NO:30), що кодує амінокислотням флуоресцентного спектрометру Spectramax ну послідовність GRG23 (L3P1.F18) (SEQ ID Gemini XPS (Molecular Dynamics, збудження: 555 NO:31); і grg23 (L3P1.023) SEQ ID NO:31 SEQ, що нм; емісія: 590 нм). кодує амінокислотну послідовність GRG23 Дотримуючись повного визначення, кінетичні (L3P1.023) SEQ ID NO:32). параметри були виконані на очищеному білку, як описано раніше (Заявка на Патент США № Таблиця 7 60/741166, зареєстрована 1 грудня 2005), доводячи кількість білка, визначену за допомогою методу Мутації, ідентифіковані Бредфорда, як відомо в галузі техніки. Для будьв стійкі до гліфосату варіантах GRG23 якої однієї концентрації гліфосату, EPSP-синтазна активність була виміряна як функція широкого діаКлон Амінокислота (АА) в GRG23 пазону концентрацій PEP. Дані укладалися в рівняння Міхаеліса-Ментена з використанням проL3P1B20 V206 I грамного забезпечення KALEIDAGRAPH L3P1B3 D75 H, E217 K (Synergy Software), для визначення Km (гадана Km) L3P1F18 Т274 І EPSP-синтази при тій концентрації гліфосату. УявL3P1O23 R5 H ні значення Km були визначені при не менше ніж 4 концентраціях гліфосату, і Kі EPSPS для гліфосату Клони були вирощені в 250 мл культури LB, і були обчислені за графіком уявних Km у порівнянні була викликана експресія білка, і білок був виділез концентрацією гліфосату, використовуючи рівний, як описано вище. Очищені білки потім були няння (мл*х/(m2+x); m1=1; m2=1), як відомо в галупротестовані на ферментативну активність після зі техніки. нагрівання протягом 0, 2 і 4 і приблизно 16 годин при 37°C. Виявилося, один із клонів, позначений Таблиця 9 "М5", мав збільшене співвідношення його ферментативної активності після тривалої інкубації при Кінетика GRG23 (АСЕ1) у порівнянні з GRG23 37°C (Таблиця 8). Була визначена послідовність ДНК даного клону, і ген визначається в даному V max описі як grg23 (acel) (SEQ ID NO:14). Білок, ексKm (мкМ) Кі (мкМ) (нМ/хв/мкг) пресований з grg23 (acel), позначений GRG23 GRG23 12,2 13800 14,77 (АСЕ1) (SEQ ID NO:15). GRG23 (ACE1) 9,7 14620 13,73 Таблиця 8 Час напівжиття GRG23 (АСЕ1) у порівнянні з GRG23 при підвищеній температурі Білок GRG23 GRG23 (АСЕ1) Час напівжиття при 37°C (год) 7 15,5 GRG23 (АСЕ1) містить 2 амінокислотні заміни в порівнянні з білком GRG23 дикого типу: А49 Т і S276 Т. Вектор pRSF1b, що містить цей ген, позначений рАХ3801. На Фігурі 1 представлена відносна стійкість GRG23 (АСЕ1) у порівнянні з GRG23 при підвищених температурах. Приклад 18. Визначення EPSPS-активності варіантів GRG-23 Екстракти, що містять варіантні білки GRG23, були протестовані на синтазну активність EPSP, як Приклад 19. Ідентифікація grg23 (ace2). GRG23 (ACE1) містить дві амінокислотні заміни в порівнянні з GRG23. Щоб визначити, чи могли додаткові заміни в цих положеннях далі поліпшити активність, була отримана ДНК бібліотека, що привела до клонів, які експресують білки, які були переважно мутовані в обох положеннях 49 і 276 GRG23. Клони, що несуть стійкість до гліфосату, були вибрані за допомогою росту на чашках із гліфосатом, і вирощені й протестовані на кінетичні властивості, як було описано. Дивно, один клон, позначений у даному описі grg23 (ace2) (SEQ ID NO:16), що кодує GRG23 (ACE2) білок (SEQ ID NO:17), був ідентифікований як такий, що має поліпшену термостабільність. Послідовність ДНК grg23 (ace2) показала, що GRG23 (АСЕ2) містить єдину амінокислотну заміну (залишок 276 GRG23 на аргінін). 37 92622 38 Приклад 20. Порівняння GRG23 і GRG51, і муТаблиця 11 тагенез різних залишків Для оцінки пермутацій амінокислотних посліКінетика поліпшених варіантів довностей, імовірних з порівняння амінокислотних послідовностей GRG23 і GRG51, були отримані дві V max Km (мкМ) Ki (мкМ) бібліотеки. Перша бібліотека вводила розмаїтість (нМ/хв/мкг) із амінокислотної послідовності GRG51 в кодуваGRG23 14 10800 13 льну ділянку grg23 (ace2). Друга бібліотека вводиGRG51 15 21048 13 ла розмаїтість із амінокислотної послідовності GRG23 (АСЕ1) 10 14620 14 GRG23 (АСЕ2) у кодувальну ділянку grg51. GRG23 (ACE2) 11 18104 15 Клони отриманих бібліотек були протестовані GRG51.4 19 26610 17 на (1) здатність надавати клітині стійкість до гліGRG23 (ACE3) 15 20000 17 фосату, і (2) активність після тривалої інкубації при GRG23 (L5P2.J2) 15 2500 23 37°C. У цілому десять клонів були секвеновані й GRG23 (АСЕ1) 14 5010 24 проаналізовані більш докладно. Один конкретний клон, який визначається у даному описі як grg51.4 (SEQ ID NO:18), що кодує білок GRG51.4 (SEQ ID NO:19), містить декілька амінокислотних замін і відносно GRG23 (ACE2) і відносно GRG51. Амінокислотні заміни, які присутні в GRG51.4 відносно GRG23 (ACE2), були згодом введені в ген grg23 (ace2) для одержання grg23 (ace3) (SEQ ID NO:20), що кодує білок GRG23 (ACE3) (SEQ ID NO:21). GRG23 (ACE3) проявляє найвищу активність і термостабільність у порівнянні з GRG23 і GRG23 (АСЕ2). GRG23 (асе1) був мутагенізований, і клони були протестовані для ідентифікації клонів, які експресують варіанти з поліпшеною термостабільністю та/або активністю. Один клон, grg23 (L5P2.J2) (SEQ ID NO:22), що кодує GRG23 (L5P2.J2) (SEQ ID NO:23), був ідентифікований на основі його поліпшених кінетичних властивостей. GRG23 (L5P2. J2), містить три амінокислотні заміни відносно GRG23 (ACE1), як показано в наступній Таблиці 10. Таблиця 10 Амінокислотні заміни в GRG23 (L5P2.J2) Амінокислота (АА) в GRG23 (L5P2. J2) відносно GRG23 (ACE1) V101 F A213 S D284 N Для створення клонів, які містять кожну ідентифіковану амінокислотну заміну GRG23 (L5P2.J2) в кодувальній ділянці grg23 (ace3) був застосований мутагенез олігонуклеотидами. Клон був ідентифікований як клон, що кодує білок, який має поліпшені кінетичні властивості в порівнянні з GRG23 (ACE3), і позначений як grg23 (ace4) (SEQ ID NO:24). Білок, кодований grg23 (ace4), позначений як GRG23 (ACE4) (SEQ ID NO:25), містить єдину амінокислотну заміну відносно GRG23 (ACE3) (Валін 101 на фенілаланін). На основі цих результатів, був виконаний окремий мутагенез олігонуклеотидами, щоб проаналізувати кінетику кожних можливих амінокислотних замін у положенні 101. Жодна з амінокислотних замін не привела до додаткового поліпшення кінетичних властивостей у порівнянні з GRG23 (АСЕ4). Приклад 21. Конструювання grg23 або grg51 для трансформації рослини Відкрита рамка зчитування (ORF) grg23 або grg51 була ампліфікована за допомогою ПЛР із повнорозмірної кДНК матриці. Рестриктні сайти Hindlll були додані до кожного кінця ORF під час ПЛР. Додатково, нуклеотидна послідовність АСС була додана відразу з 5' від старт-кодону гена для збільшення ефективності трансляції (Kozak (1987) Nucleic Acid Research 15:8125-8148; Joshi (1987) Nucleic Acid Research 15:6643-6653). Продукт ПЛР був клонований і секвенований, застосовуючи способи, відомі в галузі техніки, для підтвердження того, що ніякі мутації не введені під час ПЛР. Плазміда, що містить grg23 або grg51 продукту ПЛР, була розщеплена Hindll, і фрагмент, що містить інтактну ORF, був ізольований. Цей фрагмент був клонований у рестриктні сайти Hindlll плазміди рАХ200, вектор для експресії в рослинах, що містить промотор актину рису (McElroy et al. (1991) Molec. Gen. Genet. 231:150-160) і термінатор Pinll (An et al. (1989) The Plant Cell 1:115-122). Фрагмент промотор-ген-термінатор із цієї проміжної плазміди субклонували в плазміду pSB11 (Japan Tobacco, Inc) для утворення підсумкової плазміди, наприклад, pSB11GRG23. pSB11GRG23 була організована таким чином, що 3,91 т.п.н. фрагмент ДНК, що містить конструкцію промотор-grg23термінатор може бути розщеплений за допомогою подвійного розщеплення KpnІ і Pmel і використаний для трансформації рослин за допомогою аерозольної променевої ін'єкції. Структура PSB11GRG23 була перевірена за допомогою рестрикційного розрізування й електрофорезу в гелі, і за допомогою секвенування через різні зв'язки для клонування. Плазміда була перенесена в Agrobacterium tumefaciens, штам LBA4404, що також несе плазміду pSB1 (Japan Tobacco, Inc), використовуючи процедури трибатьківського схрещування, добре відомі в галузі техніки, і висіваючи в середовище, що містить спектиноміцин. Плазміда pSB11GRG23 несе стійкість до сектиноміцину, але є плазмідою вузького кола хазяїв і не може розмножуватися в Agrobacterium. Колонії, стійкі до спектиноміцину, з'являються, коли pSB11GRG23 вбудовується в плазміду широкого кола хазяїв pSB1 за допомогою гомологічної рекомбінації. Продукт коінтеграту pSB1 і pSB11GRG23 перевірений за допомогою гібридизації за Саузерном. Штам Agrobacterium, 39 92622 40 що несе коінтеграт, використовуються для трансні рослини з використанням каталізатора променю формації кукурудзи за допомогою способу аерозолю, застосовуючи по суті умови, як описано Purelntro (Japan Tobacco). в Публікації РСТ № WO/0138514. Після опроміПриклад 22. Трансформація grs23 або grg51 у нення ембріони інкубували протягом 30 хвилин в рослинні клітини осмотичних середовищах і поміщали в інкубаційні Качани кукурудзи збирали через 8-12 днів піссередовища на ніч при 25°C у темряві. Для того, ля запилення. З качанів виділяли ембріони, і дані щоб уникнути надмірного ушкодження опромінеембріони, розміром 0,8-1,5 мм, застосовували для них експлантатів, їх інкубували протягом принаймтрансформації. Ембріони висівали на чашки стоні 24 годин до переміщення в відновлювальне сероною шийного щитка наверх у підходящому середовище. Ембріони потім розподіляли в редовищі для інкубації, такому як середовище середовище для відновлення протягом 5 днів при DN62A5S (3,98 г/л Солфі N6; 1 мл/л (1000х базо25°С у темряві, потім переносили в селекційне вого розчину) Вітамінів N6; 800 мг/л L-аспарагіну; середовище. Експлантати культивували в селек100 мг/л Муо-інозитолу 1,4 г/л L-проліну; 100 мг/л тивному середовищі аж до восьми тижнів, залежно казамінових кислот; 50 г/л сахарози; 1 мл/л (1 від природи й особливостей конкретно застосовумг/мл базового розчину) 2,4-D). Однак, середовиваної селекції. Після періоду селекції отриманий ща й солі, відмінні від DN62A5S, є підходящими й калюс переносили на середовище для дозрівання загальновідомі в галузі техніки. Ембріони інкубуембріонів доти, поки не спостерігалося утворення вали протягом ночі при 25°С у темряві. зрілих соматичних ембріонів. Отримані зрілі сомаОтримані експлантати переносили у квадратні тичні ембріони далі поміщали під слабке освітленлунки (30-40 на чашці), переносили в осмотичні ня, і запускали процес регенерації за допомогою середовища протягом 30-45 хвилин, потім переноспособів, відомих в галузі техніки. Отриманим пасили на променеву чашку (див., наприклад, Публігонам дозволяли вкоренитися в середовищі для кацію РСТ № WO/0138514 і Патент США № вирощування рослин, і отримані рослини перено5240842). сили в горщики розплідника й розмножували як ДНК-конструкції, сконструйовані для експресії трансгенні рослини. GRG23 у рослинних клітинах, переносили в тканиМатеріали Середовище DN62A5S Компоненти Chus's N6 суміш основних солей (Prod. No. С 426) Chus's N6 розчин вітаміну (Prod. No. С 149) L-Аспарагін Муо-інозитол L-пролін Казамінові кислоти Сахароза 2, 4-D (Prod. No. D-7299) Доводять pH розчину до pH 5,8 IN KОН/1N KCl, додають Gelrite (Sigma) до 3 г/л і автоклавують. Після охолодження до 50°C, доводять до 2 мл/л 5 м/мл базовим розчином нітрату срібла (Phytotechnology Labs). Рецепт розрахований приблизно на 20 чашок. Приклад 23. Трансформація grs23 або grg51 у рослинні клітини кукурудзи за допомогою Agrobacterium-опосередкованої трансформації. Качани збирали через 8-12 днів після запилення. З качанів виділяли ембріони, і ці ембріони, розміром 0,8-1,5 мм, застосовували для трансформації. Ембріони висівали на чашки стороною шийного щитка наверх у підходящому середовищі для інкубації протягом ночі при 25°C у темряві. Однак, по суті не обов'язково культивувати ембріони протягом ночі. Ембріони, які контактують зі штамом Agrobacterium, що містить відповідні вектори для плазміди Ті-опосередкованої передачі протягом 5-10 хвилин, потім висівають на чашки із середовищем для спільного культивування протягом 3 днів (при 25°C у темряві). Після спільного культивування експлантати переносили в середовище для періоду відновлення протягом п'яти днів (в 25°C у темряві). Експлантати інкубу На літр 3,98 г/л 1 мл/л (з 1000х стоку) 800 мг/л 100 мг/л 1,4 г/л 100 мг/л 50 г/л 1 мл/л (з 1 мг/мл стоку) Джерело Phytotechnology Labs Phytotechnology Labs Phytotechnology Labs Sigma Phytotechnology Labs Fisher Scientific Phytotechnology Labs Sigma вали на селективному середовищі аж до восьми тижнів залежно від природи й особливостей конкретного способу селекції. Після періоду селекції, отриманий калюс переносили в середовище для дозрівання ембріона доти, поки не спостерігається утворення зрілих соматичних ембріонів. Отримані зрілі соматичні ембріони далі поміщали під слабке освітлення, і запускали процес регенерації за допомогою способів, відомих в галузі техніки. Отриманим пагонам дозволяли вкоренитися в середовищі для вирощування рослин, і отримані рослини переносили в горщики розплідника й розмножували як трансгенні рослини. Всі публікації й заявки на патенти, згадані в описі, указують на рівень досвіду фахівців в галузі техніки, до якої належить даний винахід. Всі публікації й заявки на патенти включені в даний опис за допомогою посилання в тому ступені, як якби конкретно й окремо вказано, що кожна окрема публікація або заявка на патент включені за допомогою посилання. Хоча попередній винахід був описаний докладно за допомогою ілюстрації й прикладу для переважного розуміння, очевидно, що певні зміни 41 92622 42 й модифікації можуть бути здійснені в рамках доданої формули винаходу. 43 92622 44 45 92622 46 47 92622 48 49 92622 50 51 92622 52 53 92622 54 55 92622 56 57 92622 58 59 92622 60