Спосіб селективного спектрофотометричного визначення рутину у присутності флавоноїдів

Реферат: В способі селективного спектрофотометричного визначення рутину у присутності супутніх флаваноїдів з використанням іонів осмію (IV) після пробопідготовки готують розчин об'ємом 25,0 мл жовто-зеленої сполуки аналіту з реагентом та натрію хлоридом, доводять його рН розведеними розчинами хлоридної кислоти та натрію гідоксиду і вимірюють світлопоглинання. Готують пробу препарату рутину до аналізу у межах концентрацій 5-80 мкг/мл у присутності супутніх флавоноїдів при кратності рутин:флавоноїди = 1:40, концентрація іонів Os(IV) -5 становить 4,0·10 М, при цьому рН середовища доводять до 3,0 та вимірюють світлопоглинання через 15-20 хв на фотоколориметрі (=400 нм) чи спектрофотометрі (=420 нм) з l=1-3 см. UA 100133 U (12) UA 100133 U UA 100133 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі аналітичної хімії і може використовуватися при визначенні рутину - 3-рутозид кверцетину, С27Н30О16 у присутності деяких супутніх флавоноїдів кверцетину, морину, лютеоліну і ін. у лікарських формах, таких як оральні краплі "Урохолум", сироп "Пертусин", "Настоянка пустирника". Відомий спосіб фотометричного визначення флавонів з алюмінію хлоридом у лікарській формі [Вишневська Л.І. Валідація методики кількісного визначення флавоноїдів в оральних краплях урохол /Л.І. Вишневська, М.С. Вишневська, К.О. Хохлова //Управління, економіка та забезпечення якості в фармації. - 2010. - №. 3(11). - С. 18-23], суть якого полягає в отриманні забарвленої комплексної сполуки флавонів з алюмінію хлоридом у кислому середовищі, що дає змогу визначати їх сумарний вміст у перерахунку на вміст рутину. Проте цей спосіб не є селективним щодо інших флавонів, які утворюють подібні комплексні сполуки з реагентом. Відомий спосіб фотометричного визначення рутину з алюмінію хлоридом [Саламаха В.В. Розробка методів виділення рутину і кверцетину із квіток софори японської /В.В. Саламаха, О.О. Протункевич, К.О. Присяжнюк //Праці Одес. нац. політехн. ун-ту. - 2012. - Вип. 1(38). - С. 286-290], суть якого полягає в отриманні забарвленої сполуки рутину з алюмінію хлоридом у середовищі хлоридної кислоти через 20 хв. після змішування реагентів, максимальне поглинання якої спостерігається у діапазоні 365-400 нм. Проте цей спосіб не є селективним відносно інших флавоноїдів, які також утворюють комплекси із алюмінію хлоридом. Відомий спосіб визначення рутину з використанням хроматографії [Алексеева М.А. Определение полифенольных компонентов хмеля с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ Алексеева М.А., Эллер К.И., Арзамасцев А.П. //Химико-фармацевтический журнал. - 2004. - № 12. - С. 39-41], що ґрунтується на хроматографі ванни отриманих водно-спиртових екстрактів рослинної сировини з використанням попередньо підібраних розчинників. Недоліком способу є складність і тривалість процедури аналізу, а також використання дорогої апаратури. Відомий спосіб визначення кверцетину, який належить до групи флавоноїдів за допомогою іонів ocmho(IV) [Михалина Г.М. Спектрофотометричне визначення кварцетину у гранулах кварцетину /Г.М. Михалина, Т.Я. Врублевська, О.Я. Коркуна //Фармаком. - 2009. - № 4. - С. 5054], за яким після змішування розчинів натрію хлориду, Os(IV) і кварцетину встановлюють кислотність середовища одержаного розчину рН=10,0 на рН-метрі та доводять до мітки вибраного об'єму дистильованою водою, 3 хв. нагрівають розчини на киплячій водяній бані (98±1 °C), охолоджують їх до кімнатної температури, після чого вимірюють світлопоглинання одержаної забарвленої сполуки осмію (IV) з кверцетином при довжині хвилі 440 нм навпроти розчину порівняння на фотоколориметрі чи спектрофотометрі, використовуючи кювети l=1-5 см. Такий спосіб є достатньо простим і не вимагає складної пробопідготовки та дорогої апаратури, проте ним визначається лише кверцетин у лужному середовищі. Відомий спосіб визначення вмісту суми Р-активних флавоноїдів у рослинній сировині, екстрактів із плодово-ягідної сировини, нетрадиційних екстрактів із гілок та листя, а також відомих фармпрепаратів на вміст вітаміну Р [Лобанова А.А. Исследование биологически активних флавоноидов в екстрактах из растительного сырья А.А. Лобанова, В.В. Будаева, Г.В. Сакович //Химия растительного сырья. - 2004. - № 1. - С. 47-52], суть якого полягає в отриманні забарвленої сполуки суми флавоноїдів з ферум(III) хлоридом, одержані комплекси зеленого або коричневого кольору (λ=408-616 нм), або алюмінію хлоридом, максимальне світлопоглинання сполуки - 415-424 нм. Проте цей спосіб не є селективним щодо визначення рутину у присутності інших флавоноїдів. Найближчим аналогом є спосіб визначення рутину за допомогою іонів осмію (IV) [Врублевська Т.Я. Спосіб спектрофотометричного визначення рутину Врублевська Т.Я., Мандзюк Г.М., Коркуна О.Я. //Патент на корисну модель. Г201400008 26.05.2014 р., Бюл. № 10. С. 1-4], за яким готують розчин жовто-зеленої сполуки аналіту з реагентом - осмієм (IV) та натрію хлоридом, доводять його рН на рН-метрі до 3,5 чи 5,0 та вимірюють світлопоглинання розчинів через 15-20 хв. на фотоколориметрі (=400 нм) чи спектрофотометрі (=420 нм) з l=1-3 см. Такий спосіб є достатньо простим і не вимагає складної пробопідготовки та дорогої апаратури та дає можливість визначити рутин в кислому середовищі. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб селективного спектрофотометричного визначення рутину у присутності флаваноїдів за допомогою 1 UA 100133 U 5 10 15 20 25 30 35 використання іонів осмію (IV) у кислому середовищі, що дасть змогу спростити, здешевити та визначати його експресно. Поставлена задача вирішується тим, що: готують розчин об'ємом 25 мл жовто-зеленої сполуки аналіту з реагентом - осмієм (IV) та натрію хлоридом, гідроксиду і вимірюють світлопоглинання розчину, де як аналіт використовують розчин рутину в межах концентрації 5,0-5 80,0 мкг/мл, а концентрація іонів Os(IV) становить 4,0·10 М, у присутності супутніх флавоноїдів (морину, кварцитину, лютеоліну) у певних кратних відношеннях, при цьому рН доводять до значення 3,0 та вимірюють світлопоглинання через 15-20 хв на фотоколориметрі (=400 нм) чи спектрофотометрі (=420 нм) з l=1-3 см. Спосіб визначення рутину у лікарських формах містить пробопідготовку досліджуваного об'єкта. Флавоноїди - це обширна група фенольних сполук рослинного походження, яким властива спільна дифеніл пропанова структура, які мають капіляроутворюючу (Р-вітамінну) активність. Успішне використання Р-вітамінних препаратів при лікуванні та профілактиці цілого ряду захворювань привернуло увагу багатьох дослідників до пошуку нових джерел сировини, розробки технології препаратів та методик їх аналізу. Із літературних джерел відомо про використання іонів осмію(ІУ) як спектрофотометричного реагенту для визначення морину та кверцетину [Михалина Г.М. Спектрофотометрія флавоноїдів морину, кверцетину та лютеоліну з деякими платиноїдами: дис. на здобуття к.х.н. /Михалина Галина Мирославівна. - Львів, 2012. - 207 с.]. Автори вперше використали іони осмію(ІУ) для спектрофотометричного визначення рутину, що дозволяє проводити аналіз об'єктів, які містять великі кількості інших флавоноїдів, зокрема морину та кварцетину, а використання запропонованих операцій дає змогу спростити процес аналізу та підвищити селективність визначення рутину. Концентраційна залежність рутину у присутності морину, кверцетину та лютеоліну при -5 -2 рН=3,0; Срут.:Сфл. = від 1:2,5 до (1:40); COS(IV)=4,2·10 М, CNaCl=4,0·10 М ΔA=400 нм, l=3 см показана на кресленні. Авторами досліджено селективне визначення рутину на фоні супутніх флавонів у межах кратних відношень рут.:фл. від 2,5 до 40. Дослідження проводилося в оптимальних умовах -5 -2 визначення рутину у реакції його взаємодії з Os(IV): COs(IV)=4,2-5,2·10 М, CNaCl=4,0·10 М, рН=3,0, =400 нм, l=3 см. Супутні флавони практично не впливають на ΔA визначення рутину, їх значення ΔA знаходиться на межі значень оптичних густин "холостої проби". Тому, щоб усунути їх вплив, пропонуємо при розробці методик вимірювання аналітичного сигналу аналіту визначення рутину проводити до "холостої проби", яка повинна містити еквівалентні кількості стандартних розчинів супутніх флавонів, оптимальну концентрацію Os(IV), або способом добавок. Метрологічні характеристики способу спектрофотометричного визначення рутину у присутності супутніх флавоноїдів наведено у таблиці 1. Таблиця 1 Метрологічні характеристики спектрофотометричного визначення рутину на фоні супутніх флавоноїдів: n=3; Р=0,95. Межі лінійності, мкг/мл 9,8-73,2 Рівняння графіка, Срут, мкг/мл Сн, мкг/мл R А400=0,132+0,0025·Срут 9,0 0,999 40 45 50 Встановлено, що у порівнянні із іншими флавоноїдами осмій (IV) вступає у взаємодію лише з рутином в оптимальних умовах визначення (рН=2,5-3,0). Отримані результати досліджень, наведені у таблиці, підтверджують переваги запропонованого способу при аналізі лікарських форм - оральних крапель "Урохолум", сиропу "Пертусин" і настоянки пустирника. Дані лікарські форми - комплексні фармпрепарати, що містять активні компоненти рослинного походження, серед них є флавоноїди. Автори провели визначення рутину у вказаних препаратах, використовуючи пропонований спосіб. Спосіб можна проілюструвати наступними прикладами після таких послідовних операцій: пробовідбір та пробопідготовка аналізованого зразка; відбір аліквоти досліджуваного зразка; для створення сталої іонної сили розчину додають розчин натрію хлориду; додають розчин 2 UA 100133 U 5 10 15 20 Os(IV); доводять рН розчинів до 3,0. Вимірювання оптичної густини проводять на спектрофотометрі SPECORD M40 (=420 нм) чи фотоколориметрі КФК-2 (=400 нм). Спосіб аналітичного визначення рутину у лікарських формах включає відбір проби препаратів та їх підготовку до аналізу. У випадку оральних крапель "Урохолум" відбирають 8 мл препарату, зважують у скляному стакані на аналітичних терезах та кількісно переносять у мірну колбу ємністю 25,0 мл 70 %-ним розчином етилового спирту до риски. Отриманий розчин фільтрують через фільтрувальний папір "біла стрічка". При аналізі сиропу "Пертусин" чи настойки пустирника відбирають по 20,0 мл препарату, зважують у скляному стакані на аналітичних терезах та кількісно переносять у мірну колбу ємністю 50,0 мл 70 %-ним розчином етилового спирту до мітки. Спосіб власне визначення рутину у підготованих препаратах: 1,0-5,0 мл одержаних прозорих розчинів поміщають у мірну колбу місткістю 25,0 мл, додають 2,0 мл розчину осмію -3 (IV) 1,0·10 М, вносять 1,0 мл 1 М розчину натрію хлориду. Доводять кислотність середовища отриманого розчину на рН-метрі за допомогою розведених розчинів хлоридної кислоти та натрію гідроксиду до рН=3,0. Розчин переносять у мірну колбу (25 мл), доливають до риски дистильовану воду і перемішують. Вимірюють інтенсивність світлопоглинання досліджуваних розчинів відносно розчину порівняння - "холостої проби" на фотоколориметрі (=400 нм) чи спектрофотометрі (=420 нм), використовуючи кювети з l=1-3 см. Підготовку "холостої проби" проводять аналогічно за відсутності іонів Os(IV). Вміст рутину знаходять за попередньо збудованим градуйованим графіком або способом добавок. Отримані результати аналізу наведені в таблицях 2, 3, 4. Таблиця 2 Результати спектрофотометричного визначення рутину у фармпрепараті "Урохолум"; n=3; Р=0,95; =400 нм. № п/п Маса препарату, г Маса аліквоти, г 1 7,8032 0,3129 3,0 2 7,8032 0,6242 3,0 3 7,8043 0,9364 Вміст рутину, мг/г; X 0,085 0,086 0,083 0,079 0,081 0,084 0,081 0,083 0,085 рн 3,0 X X S  t n , мг/г s r, % 0,085 0,085±0,003 1,9 0,081 0,081±0,005 3,0 0,083 0,08310,004 2,4 Таблиця 3 Результати спектрофотометричного визначення рутину у фармпрепараті "Пертусин"; n=3; Р=0,95; =400 нм. № п/п Маса препарату, г Маса аліквоти, г рН 1 24,223 0,9689 3,0 2 24,223 1,9378 3,0 3 24,223 2,9068 3,0 4 ВЕРХ* Вміст рутину, мг/г; X 0,054 0,056 0,053 0,049 0,050 0,051 0,057 0,055 0,051 0,048 * метод високоефективної рідинної хроматографії; 3 X X S  t n , мг/г s r, % 0,054 0,05410,003 2,9 0,050 0,05010,002 2,0 0,054 0,054+0,006 5,7 UA 100133 U Таблиця 4 Результати спектрофотометричного визначення рутину у фармпрепараті "Настойка пустирника"; n=3; Р=0,95; =400 нм. № п/п Маса препарату, г Маса аліквоти, г рн 1 17,928 0,7171 3,0 2 17,928 1,4342 3,0 3 17,928 2,1514 3,0 4 ВЕРХ* Вміст рутину, мг/г; X 0,034 0,028 0,029 0,035 0,033 0,030 0,029 0,035 0,031 0,030 X X S  t n мг/г s r, % 0,030 0,030±0,006 10,6 0,033 0,033±0,005 7,9 0,032 0,03210,006 9,6 * метод високоефективної рідинної хроматографії; 5 У випадку аналізу настоянки іноді спостерігалась незначна опалесценція, тоді визначення проводилось методом добавок (в режимі - нефелометрія). Проведені аналізи підтверджують можливість селективного визначення рутину у складних лікарських формах, отримані результати добре корелюють з результатами аналізу одержаними хроматографічним способом, що підтверджує достовірність способу спектрофотометричного визначення рутину (табл. 2, 3, 4) у складних об'єктах. Наведені результати підтверджують отримання передбачуваного технічного результату. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб селективного спектрофотометричного визначення рутину у присутності супутніх флаваноїдів з використанням іонів осмію (IV), за яким після пробопідготовки готують розчин об'ємом 25,0 мл жовто-зеленої сполуки аналіту з реагентом та натрію хлоридом, доводять його рН розведеними розчинами хлоридної кислоти та натрію гідоксиду і вимірюють світлопоглинання, який відрізняється тим, що готують пробу препарату рутину до аналізу у межах концентрацій 5-80 мкг/мл у присутності супутніх флавоноїдів при кратності -5 рутин:флавоноїди = 1:40, концентрація іонів Os(IV) становить 4,0·10 М, при цьому рН середовища доводять до 3,0 та вимірюють світлопоглинання через 15-20 хв на фотоколориметрі (=400 нм) чи спектрофотометрі (=420 нм) з l=1-3 см. 4 UA 100133 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5