Спосіб стандартизації трави ельшольції стаунтона (elsholtzia stauntonii benth) в багатокомпонентних рослинних сумішах

Реферат: Спосіб стандартизації трави ельшольції Стаунтона (Elsholtzia Stauntonii Benth) в багатокомпонентних рослинних сумішах з використанням методу ВЕРХ, причому трава ельшольції Стаунтона в рослинних сумішах, що містять в своєму складі траву ельшольції, листя кропиви, трави кропиви собачої, плодів шипшини, зерен вівса посівного, коренів цикорію звичайного, трави споришу, плодів глоду, коренів кульбаби лікарської та насіння льону, визначають хроматографуванням в градієнтному режимі з використанням водноацетонітрильних рухомих фаз та оберненофазної колонки, з попередньою очисткою проби, з застосуванням твердофазної екстракції за наявністю та вмістом розмаринової кислоти, вміст якої повинен бути не менше ніж 1,2 % у перерахунку на висушену сировину. UA 100673 U (12) UA 100673 U UA 100673 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі фармації, зокрема до фітохімії, і може бути використана для стандартизації лікарської рослинної сировини та рослинних сумішей. Серед рослин, багатих на розмаринову кислоту, найбільш характерними є рослини родин ясноткових, бурачникових і селерових [3]. Представником таких рослин є вид азіатського походження роду Elsholtzia (Lamiaceae) ельшольція Стаунтона. Відомо, що лікарську сировину ельшольції Стаунтона застосовують в народній медицині при грипі, кашлі, головному болю, корі, фурункульозі, туберкульозі легень, астмі, бронхіті, жовтяниці, нирковокам'яній хворобі, геморої, запаленні лімфатичних вузлів, при проносах і спазмах в черевній порожнині, при болях в селезінці та сечовому міхурі, для збудження апетиту, при маткових кровотечах, дисменореї, кровохарканні, кривавому калі тощо [6]. Даній лікарській сировині притаманний широкий спектр біологічної дії, зокрема жарознижуюча, знеболююча, антибактеріальна, сечогінна, потогінна, кровоспинна і заспокоююча нервову систему дія [4, 5], що широко використовується для виготовлення полікомпонентних фітозасобів, які представлені на фармацевтичному ринку України [1]. За літературними даними антиоксидантна дія трави ельшольції Стаунтона пов'язана з високим вмістом похідних гідроксикоричної кислоти [5]. Виходячи з того, що мажоритарним представником гідроксикоричних кислот в траві ельшольції є розмаринова кислота [4], вважалось за доцільне дослідити можливість використання цієї сполуки як маркер для визначення ельшольції в рослинних сумішах. За прототип було прийнято методику кількісного визначення суми гідроксикоричних кислот в фармакопейній статті Європейської фармакопеї "Листя розмарину лікарського", якій стандартизація сировини розмарину проводиться за кількісним вмістом суми гідроксикоричних кислот, в перерахунку на розмаринову кислоту методом УФ-спектрофотометрії, де адсорбція після комплексоутворення вимірюється за довжини хвилі 505 нм [8]. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу ідентифікації сировини трави ельшольції Стаунтона в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входять трава ельшольції Стаунтона, листя кропиви, трави кропиви собачої, плодів шипшини, зерен вівса посівного, коренів цикорію звичайного, трави споришу, плодів глоду, коренів кульбаби лікарської та насіння льону, шляхом підтвердження наявності фенілпропаноїда розмаринової кислоти та визначення її вмісту. Поставлена задача вирішується тим, що нами запропонована ідентифікація та кількісне визначення розмаринової кислоти як компонента трави ельшольції Стаунтона за допомогою методу високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) в присутності біологічно активних речовин інших рослин. Це досягається застосуванням твердофазної екстракції для очищення досліджуваних розчинів від заважаючих речовин. При цьому використовується градієнтне елюювання з використанням водно-ацетонітрильної рухомої фази з додаванням трифтороцтової кислоти, застосування якої дозволяє добитися розділення піків розмаринової кислоти трави ельшольції Стаунтона та біологічно активних речовин інших рослин. Ідентифікація та кількісне визначення фенілпропаноїда розмаринової кислоти, як компонента сировини трави ельшольції Стаунтона в багатокомпонентних рослинних сумішах, полягає в знаходженні умов для хроматографічного розділення розмаринової кислоти як компонента трави ельшольції Стаунтона та біологічно активних речовин інших рослин. Нами було розроблено методику визначення розмаринової кислоти в сировині трави ельшольції Стаунтона з застосуванням методу ВЕРХ. З використанням розробленої методики було проаналізовано три серії сировини трави ельшольції Стаунтона, зібраної за період вересень-жовтень 2014 року на території Національного ботанічного саду ім. М.М. Гришка НАН України. Згідно з отриманими даними, в усіх пробах було ідентифіковано та кількісно визначено розмаринову кислоту. Її вміст в досліджуваній сировині становив 1,442±0,067 % у перерахунку на висушену сировину. Приклади конкретного виконання. Приклад 1. Приготування досліджуваного розчину: 1г рослинної суміші наступного складу: трави ельшольції Стаунтона - 1 г, листя кропиви дводомної - 1 г, трави кропиви собачої - 1 г, плодів шипшини - 1 г, зерен вівса посівного – 1 г, трави споришу - 1г, плодів глоду - 1 г, коренів кульбаби лікарської - 1 г, коренів цикорію звичайного - 1 г, насіння льону -1 г, вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього, екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого 1 UA 100673 U 5 10 розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 15 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердофазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 15 % етилового спирту. Пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. По 5 мкл досліджуваного розчину та розчину достовірного зразку розмаринової кислоти поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі, обладнаному УФ-детектором в наступних умовах: колонка Synergy 4U Fusion RP, розміром 250 мм х 4,6 мм, розмір частинок 5 мкм; температура колонки - 35 °C; довжина хвилі детектування - 330 нм; швидкість потоку рухомої фази – 1 мл/хв. Рухома фаза: Час хроматографування (хв) 0-5 5-30 30-40 40-45 45-60 15 20 Елюент А, % 95 95→60 60→50 50 95 Елюент Б, % 5 5→40 40→50 50 5 Елюент А: 0,05 % розчин трифтороцтової кислоти в воді; Елюент Б: 0,05 % розчин трифтороцтової кислоти в ацетонітрилі. Вміст розмаринової кислоти в досліджуваній багатокомпонентній рослинній суміші (в %) обчислюється за наступною формулою: A пр * С ст * 100 * 100 * 100 X A ст * mпр * 100  W  , A де пр - площина піку розмаринової кислоти на хроматограмі досліджуваного розчину; A ст - площина піку розмаринової кислоти на хроматограмі розчину порівняння розмаринової кислоти; С ст - концентрація розмаринової кислоти в розчині порівняння розмаринової кислоти, г/мл; mпр 25 30 35 40 45 50 - наважка досліджуваної суміші, г; W - втрата в масі при висушуванні досліджуваної рослинної суміші. Приготування розчину порівняння розмаринової кислоти: 0,025 г (точна наважка) достовірного зразку розмаринової кислоти вміщують в мірну колбу місткістю 50 мл, розчиняють в 30 мл 50 % етилового спирту, доводять до мітки тим же розчинником та перемішують. На хроматограмі досліджуваного розчину повинен бути присутній пік, час виходу якого відповідає часу виходу піку розмаринової кислоти на хроматограмі розчину порівняння розмаринової кислоти. На підставі експериментальних даних для сировини трави ельшольції Стаунтона нами рекомендований наступний граничний вміст розмаринової кислоти: не менше 1,2 % в перерахунку на висушену сировину. За вказаних вище умов було проаналізовано досліджувані розчини, приготовлені наступним чином: Приклад 2. Приготування модельної суміші без вмісту трави ельшольції Стаунтона: листя кропиви дводомної - 1 г, трави кропиви собачої - 1 г, плодів шипшини - 1 г, зерен вівса посівного -1г, трави споришу - 1 г, плодів глоду - 1 г, коренів кульбаби лікарської - 1 г, коренів цикорію звичайного - 1 г, насіння льону - 1 г, вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 15 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердофазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 15 % етилового спирту. Пробу із патрона вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. 2 UA 100673 U 5 10 15 20 25 30 Приклад 3. Приготування екстракту трави ельшольції Стаунтона: 0,5 г трави ельшольції стаунтона вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього, екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 15 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердофазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 15 % етилового спирту. Пробу із патрона вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Хроматограми розчину порівняння розмаринової кислоти, екстракту трави ельшольції Стаунтона, досліджуваного розчину та модельної суміші без вмісту трави ельшольції Стаунтона представлені на фіг. 1, фіг. 2, фіг. 3 та фіг. 4 відповідно. За даних умов аналізу пік розмаринової кислоти має час виходу близько 37 хвилин (фіг. 1). На хроматограмах екстракту трави ельшольції Стаунтона та досліджуваного розчину присутній пік розмаринової кислоти (фіг. 2 та фіг. 3 відповідно), на хроматограмі модельної суміші без вмісту трави ельшольції стаунтона (фіг. 4) - даний пік відсутній. На підставі отриманих даних зроблено висновок, що у рослинній суміші, до складу якої входять трава ельшольції Стаунтона, листя кропиви, трави кропиви собачої, плодів шипшини, зерен вівса посівного, коренів цикорію звичайного, трави споришу, плодів глоду, коренів кульбаби лікарської та насіння льону, присутність та вміст трави ельшольції Стаунтона можна визначати за наявністю та кількісним вмістом фенілпропаноїду розмаринової кислоти. Корисна модель обумовлює можливість ідентифікації та визначення кількісного вмісту сировини трави ельшольції Стаунтона в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входять трава ельшольції Стаунтона, листя кропиви, трави кропиви собачої, плодів шипшини, зерен вівса посівного, коренів цикорію звичайного, трави споришу, плодів глоду, коренів кульбаби лікарської та насіння льону за наявністю та вмістом фенілпропаноїду розмаринової кислоти як фізіологічно активного компонента, що присутній в траві ельшольції Стаунтона. Порівняння способів ідентифікації у прототипі та корисній моделі наведено в таблиці 1. Таблиця 1 Характеристика способів стандартизації листя розмарину лікарського № п/п 1 2 Об'єкт Компонент Сума гідроксикорич-них Найближчий кислот в аналог перерахунку на розмаринову кислоту Корисна модель Розмаринова кислота Об'єкт дослідження Моносировина трава ельшольції Стаунтона Багатокомпонентні рослинні суміші, до складу яких входять: трава ельшольції Стаунтона, листя кропиви, трави кропиви собачої, плодів шипшини, зерен вівса посівного, коренів цикорію звичайного, трави споришу, плодів глоду, коренів кульбаби лікарської та насіння льону 35 3 Метод визначення Метод УФспектрофотометрії Можливість кількісної стандартизації моносировини трави ельшольції Стаунтона; неспецифічне визначення Метод ВЕРХ Можливість кількісної стандартизації сировини та багатокомпонентних рослинних сумішей трави ельшольції Стаунтона; специфічне визначення UA 100673 U 5 10 15 Джерела інформації: 1. Компендиум 2009 - Лекарственные препараты /под ред. В.Н. Коваленко, А.П. Вікторова. – К.: Морион, 2009. - 2224 с. 2. Довідник лікарських засобів, зареєстрованих на Україні станом на 01.01.2011 //www.Pharma-center.kiev.ua. 3. Modnicki D. Potential sources of rosmarinic acid. /D. Modnicki, I. Matlawska //Herba Polonica. 2007. - Vol. 53, № 2. - P. 165-166. 4. Xiangping Liu, Jia Jia, Lei Yang, Fengjian Yang. Evaluation of Antioxidant Activities of Aqueous Extracts and Fractionation of Different Parts of Elsholtzia ciliata/ Molecules 2012, 17, 5430-5441; 5. Yan Xing, Hong-yun Peng. Caffeic acid product from the highly copper-tolerant plant Elsholtzia splendens post-phytoremediation: its extraction, purification, and identification/ J Zhejiang Univ-Sci В (Biomed & Biotechnol) 2012 13(6):487-493 6. Zhiqin Guo, Zizhen Liu, Xiaohong Wang, Weirui Liu, Rui Jiang, Ruiyang Cheng and Gaimei She. Elsholtzia: phytochemistry and biological activities /Chemistry Central Journal 2012, 6:147 7. Mulinacci N., Innocenti M., Bellumori M., Giaccherini C, Martini V., Michelozzi M. Storage method, drying processes and extraction procedures strongly affect the phenolic fraction of rosemary leaves: an UPLC/DAD/MS study /Talanta. - 2011. - N. 85(1). - P. 167-176. 8. European Pharmacopoeia. - 6 th ed. - Strasbourg: European Department for the Quality of Medicines, 2008. - Vol. 2. - 3308 p. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб стандартизації трави ельшольції Стаунтона (Elsholtzia Stauntonii Benth) в багатокомпонентних рослинних сумішах з використанням методу ВЕРХ, який відрізняється тим, що трава ельшольції Стаунтона в рослинних сумішах, що містять в своєму складі траву ельшольції, листя кропиви, трави кропиви собачої, плодів шипшини, зерен вівса посівного, коренів цикорію звичайного, трави споришу, плодів глоду, коренів кульбаби лікарської та насіння льону, визначають хроматографуванням в градієнтному режимі з використанням водноацетонітрильних рухомих фаз та оберненофазної колонки, з попередньою очисткою проби, з застосуванням твердофазної екстракції за наявністю та вмістом розмаринової кислоти, вміст якої повинен бути не менше ніж 1,2 % у перерахунку на висушену сировину. 4 UA 100673 U Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5