Спосіб стандартизації деревію звичайного (achillea millefolium l.) в багатокомпонентних рослинних сумішах

Спосіб стандартизації деревію звичайного (Achillea millefolium L.) в багатокомпонентних рос 3 58468 Т3ОВ «Чиста флора» (дата виробництва 26.07.2010)). Вміст апігеніну в траві деревію звичайного різних вітчизняних виробників представлений в табл.1. Згідно даних, представлених в таблиці, в усіх пробах було ідентифіковано та кількісно визначено флавоноїд апігенін. Його вміст в досліджуваній сировині лежить в межах від 0,0101±0,0006 % до 4 0,0166±0,0013 % в перерахунку на висушену сировину. Процес ідентифікації та кількісного визначення апігеніну як компонента сировини деревію звичайного в багатокомпонентних рослинних сумішах полягає в знаходженні умов для хроматографічного розділення апігеніну як компонента деревію звичайного та біологічно активних речовин інших рослин. Таблиця 1 Вміст апігеніну в досліджуваних препаратах деревію звичайного № п/п Препарат трави деревію звичайного 1 Трава деревію в пачках по 50 г 2 Трава деревію в пачках по 50 г 3 Трава деревію в пачках по 50 г 4 Трава деревію в пачках по 50 г 5 Трава деревію в пачках по 50 г 6 Трава деревію в пачках по 75 г Виробник, № серії КП «Фармфацевтична фабрика», серія 20709 КП «Фармфацевтична фабрика», серія 10208 ЗАТ «Ліктрави», серія 40310 ЗАТ «Ліктрави», серія 50310 ЗАТ «Ліктрави», серія 70510 ТзОВ «Чиста флора» дата виробництва 26.07.2010 В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити ідентифікацію сировини трави деревію звичайного в багатокомпонентних рослинних сумішах шляхом підтвердження наявності апігеніну та визначення його вмісту, і таким чином забезпечити можливість стандартизації багатокомпонентних рослинних сумішей, до складу яких входить сировина трави деревію звичайного. Поставлена задача вирішується тим, що запропонована ідентифікація та кількісне визначення апігеніну як компонента деревію звичайного за допомогою методу ВЕРХ в присутності біологічно активних речовин інших рослин. Це досягається застосуванням твердофазної екстракції для очищення досліджуваних розчинів від заважаючих речовин. При цьому використовується градієнтне елюювання з використанням водноацетонітрильної рухомої фази, застосування якої дозволяє добитися розділення піків апігеніну деревію звичайного та біологічно активних речовин інших рослин. Приклад 1: Приготування досліджуваного розчину: 5 г (точна наважка) подрібненої суміші лікарських рослин наступного складу: трави деревію звичайного - 1 г, плодів глоду колючого - 1 г, листя кропиви дводомної - 1 г, шишок хмелю -1 г, коренів цикорію дикого -1г, квіток бузини - 1 г, квіток нагідок лікарських -1 г, плодів шипшини -1 г, коренів кульбаби лікарської - 1 г, трави звіробою 1 г, насіння льону - 1 г вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію Вміст апігеніну (в %) в перерахунку на висушену сировину 0,0164±0,0016 0,0166±0,0013 0,0109±0,0010 0,0141+0,0011 0,0139±0,0008 0,0101 ±0,0006 проводять ще раз, та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 25 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 25 % етилового спирту. Пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. По 5 мкл досліджуваного розчину та розчину стандарту апігеніну поперемінно хроматографують в наступних умовах: колонка С18 X-Тегга, розміром 150 мм х 4,6 мм, розмір часток 5 мкм; рухома фаза: 0-10 хв: ізократичне елюювання 80 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та 20 % суміші ацетонітрил -5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 1016 хв: градієнтне елюювання від 80 % до 74 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та від 20 % до 26 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 16-30 хв: ізократичне елюювання 74 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та 26 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 30-35 хв: градієнтне елюювання від 74 % до 10 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та від 26 % до 90 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 35-40 хв: ізократичне елюювання 10 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та 5 90 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 40-55 хв: ізократичне елюювання 80 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та 20 % суміші ацетонітрил -5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об) температура колонки 34 °С; довжина хвилі детектування 350 нм; швидкість потоку рухомої фази 1 мл / хв. Вміст апігеніну в досліджуваній багатокомпонентній рослинній суміші (в %) обчислюється за наступною формулою: Aпр * Сст * 100 * 100 * 100 X ; А ст * mпр * (100  W ) де A п р - площина піку апігеніну на хроматограмі досліджуваного розчину; Аст - площина піку апігеніну на хроматограмі стандартного розчину апігеніну; Cст - концентрація апігеніну в стандартному розчині апігеніну, г/мл; mпр - наважка досліджуваної суміші, г; W - втрата в масі при висушуванні досліджуваної рослинної суміші. Приготування стандартного розчину апігеніну: 0,005 г (точна наважка) достовірного стандарту апігеніну вміщують в мірну колбу місткістю 25 мл, розчиняють в 15 мл метанолу, доводять метанолом до мітки та перемішують. 1 мл отриманого розчину вміщують в мірну колбу місткістю 100 мл, доводять до мітки метанолом та перемішують. На хроматограмі досліджуваного розчину повинен бути присутній пік, час виходу якого відповідає часу виходу піку апігеніну на хроматограмі стандартного розчину апігеніну. На підставі експериментальних даних для сировини трави деревію звичайного нами рекомендований наступний граничний вміст апігеніну: не менше 0,008 % в перерахунку на висушену сировину. За вказаних вище умов було проаналізовано досліджувані розчини, приготовлені наступним чином: Модельна суміш без вмісту деревію звичайного. 5 г (точна наважка) подрібненої суміші лікарських рослин наступного складу: плодів глоду колючого - 1 г, листя кропиви двудомної - 1 г, шишок хмелю -1 г, коренів цикорію дикого - 1г, квіток бузини - 1 г, квіток нагідок лікарських - 1 г, плодів шипшини - 1 г, коренів кульбаби лікарської - 1 г, трави звіробою 1 г, насіння льону - 1 г вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 25%, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 58468 6 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 25 % етилового спирту. Пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Екстракт трави деревію звичайного. 1 г (точна наважка) подрібненої сировини трави деревію звичайного вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 25 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 25 % етилового спирту. Пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Хроматограми стандартного розчину апігеніну, екстракту трави деревію звичайного, досліджуваного розчину та модельної суміші без вмісту трави деревію звичайного представлені на фіг.1, фіг. 2, фіг. 3 та фіг.4 відповідно. За даних умов аналізу пік апігеніну має час виходу біля 26,5 хвилин (фіг. 1). На хроматограмах екстракту трави деревію звичайного та досліджуваного розчину присутній пік апігеніну (фіг. 2 та фіг. 3 відповідно), на хроматограмі модельної суміші без вмісту трави деревію (фіг. 4) - даний пік відсутній. На підставі отриманих даних зроблено висновок, що у рослинній суміші, до складу якої входять трава деревію звичайного, плоди глоду колючого, листя кропиви дводомної, шишки хмелю, корені цикорію дикого, квітки бузини, квітки нагідок лікарських, плоди шипшини, корені кульбаби лікарської, трава звіробою та насіння льону, присутність та вміст трави деревію звичайного можна визначати за наявністю та кількісним вмістом флавоноїду апігеніну. Корисна модель обумовлює можливість ідентифікації та визначення кількісного вмісту сировини трави деревію звичайного в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входить трава деревію звичайного, плоди глоду колючого, листя кропиви дводомної, шишки хмелю, корені цикорію дикого, квітки бузини, квітки нагідок лікарських, плоди шипшини, корені кульбаби лікарської, трава звіробою та насіння льону за наявністю та вмістом апігеніну як фізіологічно активного компонента, що присутній в траві деревію звичайного. Порівняння способів ідентифікації у прототипі та винаході наведено в таблиці 2. 7 58468 8 Таблиця 2 Характеристика способів стандартизації трави деревію звичайного № п/п Об'єкт 1 Найближчий аналог 2 Корисна модель Компонент Об'єкти дослідження Метод визначення Метод УФ- спектрофотомесума політрії Можливість кількісної фенольних Моносировина трави деревію зви- стандартизації моно сиросполук, в перечайного вини трави деревію звичайрахунку на піного; рогалол неспецифічне визначення Багатокомпонентні рослинні суміші, до складу яких входять: трава деМетод ВЕРХ Можливість ревію звичайного, плоди глоду кокількісної стандартизації лючого, листя кропиви дводомної, сировини та багатокомпоАпігенін шишки хмелю, корені цикорію диконентних рослинних сумішей го, квітки бузини, квітки нагідок літрави деревію звичайного; карських, плоди шипшини, корені специфічне визначення кульбаби лікарської, трава звіробою та насіння льону Джерела інформації: 1) Куцик Р.В., Зузук Б.М. Тысячелистник обыкновенный. Achillea millefolium L. (Аналитический© бзор) // Провизор. - 2002. - № 14. -С. 28-33. 2) Куцик Р.В., Зузук Б.М. Тысячелистник обыкновенный. Achillea millefolium L. (Аналитический© бзор) // Провизор. - 2002. - № 15. -С. 34-38. 3) Компендиум. Лекарственные препараты 2007: т. 1. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К: Моріон, 2007. - 1128 с. 4) Компендиум. Лекарственные препараты 2007: т. 2. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К: Моріон, 2007. - 1126 с. 5) Shukla S, Gupta S. Apigenin: a promising molecule for cancer prevention // Pharm Res. - 2010. - Vol. 27(6). - P. 962-978. 6) Cameiro C, Amorim J., Cadena S., Noleto G., Di Mascio P., Rocha M., Martinez G. Effect of flavonoids on 2'-deoxyguanosine and DNA oxidation caused by singlet molecular oxygen // Food Chem Toxicol. -2010. -Vol. 48.-P. 2380-2387. 7) Said A., Tundis R., Hawas U. W., El-Kousy S. M., Rashed K., Menichini F., Bonesi M., Huefner A., Loizzo M. R., Menichinib F. In vitro antioxidant and antiproliferative activities of flavonoids from Ailanthus excelsa (Roxb.) (Simaroubaceae) leaves // Z. Naturforsch. С -2010.-Vol. 65. P.180-186. 8) Державна Фармакопея України / ДП «Науково-експертний фармакопейний центр». - 1-е вид. - Доповнення 2. - X.: ДП «Науково-експертний фармакопейний центр», 2008. - 620 с. 9 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 58468 Підписне 10 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601