Спосіб оцінки безпеки промислових металовмісних наноматеріалів із застосуванням біомаркерів

Реферат: Спосіб оцінки безпеки промислових металовмісних наноматеріалів із застосуванням біомаркерів включає визначення їх здатності до біодеградації та ефекту для біоти. У тканині травної залози двостулкового молюска перлівниці клиноподібної Unio tumidus визначають вміст металотіонеїнів (МТ), активність каспази-3 та катепсину Д (загальної, вільної (в), лізосомальної (л)), обраховують їх співвідношення (МТ+Катепсин Д (л))/(Каспаза-3+Катепсин Д (в)). Відповідь організму на дію цинк-вмісного матеріалу класифікують за силою як "адапторна" або "токсична" та за механізмом як "ефект нанорозмірності" або "ефект металу" залежно від величини цього співвідношення і варіабельності абсолютного рівня його складових відносно запропонованих референтних значень. UA 101200 U (12) UA 101200 U UA 101200 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області збереження довкілля, а саме до біомоніторингу забруднення водойм, і може бути використана для оцінки забруднення водних екосистем внаслідок їх експлуатації, прогнозу безпеки промислових металовмісних наночастинок у середовищі, аналізу фізико-хімічного забруднення річок та внесення екологічних оцінок у бізнесплани інвестиційних проектів. Відомий спосіб контролю токсичності наночастинок золота ["Control of the toxicily of gold nanoparticles", US 20110300532 A1, 2010] з використанням культури клітин HeLa та визначенням у ній МТТ-тесту, вмісту ДНК, мітотичного індексу, активностей каспаз 3/7, мітохондріальної дисфункції та рівня активних форм кисню. Недоліками способу є висока собівартість, невідповідність моделі вимогам до умов водного середовища, відсутність конкретних і універсальних рекомендацій та чітких критеріїв оцінки токсичності наночастинок. Відомий спосіб прогнозування негативного впливу наночасток срібла на організм [UA 59442, 2011; автори Мінченко О.Г., Мінченко Д.О., Божко І.В., Зінченко Т.О., Яворський О.І І.], що ґрунтується на виділенні тотальної РНК із легень, головного мозку, сім'яників, серця і нирок щурів після введення в організм наночасток срібла з подальшим проведенням полімеразної ланцюгової реакції комплементарних ДНК (кДНК) та виявлення змін в експресії мРНК 6фосфофрукто-2-кіназа/фруктозо-2,6-бісфосфатази (PFKFB-2) та її альтернативних сплайсваріантів. За змінами рівнів експресії прогнозують негативний вплив наночасток срібла на організм та ймовірність патологічних станів. Пропонований спосіб має низку переваг, зокрема висока точність, специфічність, однак працеємність методологічних підходів (експресія генів, полімеразна ланцюгова реакція в режимі реального часу тощо) та необхідність висококваліфікованих працівників для його реалізації утруднює використання способу державними службами контролю їх рівня. Модель не диференціює впливу нанорозмірного матеріалу та іонів срібла. Відомий "Спосіб оцінки безпеки введення наночастинок міді в організм" [RU 2477485, 2013 p.; автори Сізова О.А., Мірошников C.O., Полякова B.C., Глущепко И.М.], що грунтується на визначенні зміни показника експресії антигену каспази-3 в мікрогліоцитах сепсомоторної зони кори головного мозку після введення наночастинок міді в порівнянні з контрольною групою тварин шляхом підрахунку мікрогліоцитів, які експресують каспазу-3 на умовній одиниці площі ідентичних сенсомоторних зон. Пропонований спосіб дозволяє визначнім допустиму дозу препарату, що вводиться, органи-мішені, вибрати найбільш оптимальний спосіб введення препарату в організм. У технічному рішенні [див. Заявку US № 20090269279, публ. 29.10.2009 р.] запропонований спосіб оцінки рівня токсичності, стресових реакцій, пошкоджень ДНК епітеліальних клітин, нормальних кератипоцигів та фібробластів людини за впливу на них багатошарових карбонових нанотрубок з діаметром від 10 до 50 нм, що використовуються, зокрема, з хіміко-терапевтичною метою в онкології. Для оцінки впливу названих наноматеріалів на зазначені клітинні культури у відомому технічному рішенні використовують тести для вимірювання клітинної проліферації, ступеня апоптозу і некрозу з використанням методу цитофлуориметрії. Відомий також спосіб оцінки впливу наночастинок на клітинні культури [US № 20080295187, публ. 27.11.2008 р.], що полягає в проведенні тестів in vitro на тест-культур і клітин, що містять суспензії тестованих наночастинок, по визначенню впливу наночастинок на продукцію активних форм кисню, утворення апоптотичних і некротичних тілець, порушення функцій мітохондрій з використанням цитологічних флуоресцентних маркерів з подальшим аналізом на проточному цитофлуориметрі. Оцінка впливу наночастинок на клітини тест-культури здійснюється шляхом порівняння отриманих показників з відповідними показниками контрольних зразків клітин тесткультур, що не містять тестовані наночастинки. Найбільш близьким до запропонованого способу є спосіб оцінки впливу наночастинок на життєдіяльність клітинних структур [RU 2460997, автори: Григор'єв А.І. та ін.], який включає інкубацію первинних культур мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин, що виділяються з стромально-васкулярної фракції жирової тканини людини і мононуклеарних клітин лімфоцитів периферичної крові людини з суспензіями наночастинок. Після завершення інкубації визначають вплив наночастинок на продукцію активних форм кисню, на утворення апоптотичних і некротичних клітин, на функції мітохондрій, на стан лізосомального компартменту, а також оцінюють внутрішньоклітинне накопичення аналізованих наночастинок. Отримані показники порівнюють з відповідними показниками контрольних зразків досліджуваних клітин. Промислові або синтетичні наночастинки виготовляють для застосування у різноманітних сферах техніки, медицини та побуту. Серед промислових наноматеріалів, з якими найбільш ймовірно контактують живі організми, належать наноформи оксидів металів (ТіО 2, ZnO, CuO), 1 UA 101200 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 простих речовин металів (срібла, золота) та карбону (одностінні та багатостінні карбонові нанотрубки, С60-фулурени). На підставі розрахованих концентрацій у довкіллі вважають, що нанотрубки та наносрібло несуть мінімальний ризик, тоді як до найбільш небезпечних потенційно належать нано-оксиди титану та цинку (Johnston et al., 2010). Наноформа цинк оксиду (н-ZnO) широко використовується у складі зубної пасти, косметичних продуктів, сонцезахисних кремів, харчовій промисловості тощо. Паралельно із збільшенням обсягів виробництва та галузей використання наноматеріалів все більша їх кількість потрапляє в навколишнє середовище і становить потенційну небезпеку для біоти через високу реакційну здатність і біодоступність. Це зумовлює необхідність розробки нових методологічних підходів оцінки їх екологічного ризику для тварин та ефективної екстраполяції результатів для визначення рівня небезпеки для людини. Проаналізувавши наведені вище способи та технічні рішення, можна дійти висновку, що системи тестів, яка здатна оцінити біологічну активність, токсичність і безпеку наноматеріалів та наночастинок цинку, як одних з найбільш використовуваних у народному господарстві, по відношенню до живих організмів не існує. Розробники, в основному, пропонують вузькоспеціалізовані і недостатньо стандартизовані методики і тести з використанням клітинних культур, які не повною мірою відображають ефекти пошкоджуючих речовин на біологічні системи. Прояви токсичності металовмісних наноматеріалів здебільшого пов'язують із впливом іонів металів, що вивільняються за умов біодеградації цих комплексів у клітинах чи позаклітинному середовищі. Відтак, внутрішньоклітинні термостабільні білки металотіонеїни, які індукуються у присутності підвищених концентрацій іонів металів (Roesijadi, 2000), належать до найбільш ймовірних молекулярних мішеней їх впливу. Лізосоми - це субклітинні структури, що володіють високо специфічними системами транспорту частинок. Зменшення стабільності лізосомальних мембран вважається індикатором запільного фізіологічного стрес). Згідно з рекомендаціями UNEP/RAMOG, цей тест разом із показниками оксидативного стресу складають перший етап виявлення токсичності оточуючого середовища (Viarengo et al., 2007). В основу корисної моделі поставлено задачу створення способу оцінки стабільності цинквмісних матеріалів та їх ефекту для біоти на підставі визначення мінімального набору біохімічних показників у травній залозі молюска. Для реалізації способу з досліджуваної водойми виловлюють 6 екземплярів двостулкового молюска роду Unionidae перлівниці клиноподібної Unio tumidus. Обраний індикаторний вид безхребетних тварин володіє низкою переваг для біоіндикації: його використання не потребує дозвільних документів офіційних служб та біоетичних комісій, широко розповсюджений та належить до пасивних фільтраторів води у водоймах, що сприяє концентруванню в його тканинах забруднювачів водного середовища, зокрема іонів металів, поліхлорбіфенілів, поліароматичних вуглеводнів тощо. Відповідно, у двостулок активно функціонують молекулярні системи детоксикації (включно з металотіонеїнами та лізосомами) та знищення пошкоджених клітин шляхом апоптозу. У тканині травної залози тварин визначають вміст металотіонеїнів (МТ), активність ензимів апоптозу каспази-3 (цитозоль) та катепсину Д (лізосоми, вільний). Дія пошкоджуючого чинника класифікується за силою як "адапторна" або "токсична" та за механізмом як "ефект нанорозмірності" або "ефект металу". Поєднане визначення цих показників та обчислення їх співвідношення (МТ + Катепсин Д (л))/(Каспаза-3 + Катепсин Д (в)) становить важливий діагностичний інструмент для прогнозування стабільності цинк-вмісних матеріалів та їх ефектів для біоти. Вміст МТ у 30 % гомогенаті тканини в 20 мМ тріс-сахарозному буфері визначають за методом A. Viarengo та співавт. (1997) за взаємодією із 5,5'-дитіо-біс-2-нітробензойною кислотою (ДТНБ) після хлороформ-етанольної екстракції МТ. Для цього приготований гомогенат центрифугують протягом 45 хв при 12000 g, 4 °C. Екстракцію супернатанту проводять сумішшю 0,5 мл охолодженого етанолу (до -20 °C) та 0,04 мл хлороформу з наступним центрифугуванням при 6000×g протягом 10 хв. До супернатанту додають 3 мл охолодженого етанолу, змішують протягом 15 с і переносять пробу на 1 год. в морозильну камеру. Після цього до суміші додають 1 мл 0,2 М фосфатного буферу рН 8,0 і пробу центрифугують протягом 12 хв при 6000 g. Супернатант декантують, а осад промивають 2 мл 20 мМ тріс-буферного розчину в етанолі, що містить 1 % хлороформу та 0,5 мМ сахарози та знову центрифугують протягом 20 хв при 3000 g, 4 °C. Після цього супернатант знову декантують, а осад ресуспендують в 0,3 мл 5 мМ тріс-ЕДТА буферу, після чого додають 4,2 мл 0,43 мМ розчину ДТНБ в 0,2 М фосфатному буфері рН 8,0 і центрифугують 10 хв при 3000 g, 4 °C. Вимірюють світлопоглинання проби при 412 нм. 2 UA 101200 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Вміст МТ у пробі визначають за калібрувальною кривою, побудованою на глутатіоні та обчислюють, вважаючи, що в 1 молі МТ міститься така ж кількість SH-груп, як і в 20 молях глутатіону і виражають в мкг/г вологої тканини. Загальну активність катепсину Д [КФ 3.4.23.5] визначають спектрофотометрично за кількістю утвореного тирозину у 50 % гомогенаті тканини травної залози за модифікованим методом Dingle J. Т. (1971) (Falfushynska et al., 2014 c). Метод ґрунтується на спектрофотометричному визначенні кислоторозчинних продуктів ферментативного гідролізу гемоглобіну при довжині хвилі 280 нм. Інкубацію проб проводили при 37 °C протягом 30 хв. Ферментну реакцію зупиняють додаванням 10 % розчину трихлороацетатної кислоти з наступним центрифугуванням за 4000 об/хв протягом 10 хв. Для визначення загальної активності катепсину Д проби попередньо обробляють 1 % розчином тритону Х-100 при 37 °C протягом 10 хв, а вільну активність катепсину Д визначають за відсутності денатуруючого агента. Лізосомальну активність катепсину Д визначають за різницею між загальною та вільною активністю ензиму. Активність виражають у нмоль тирозину /(хвмг білка). Для визначення активності каспази-3 травну залозу молюска гомогенізують у К-фосфатному буфері, центрифугують при 10,000×g, 4 °C (Bonomini et al., 2004, Falfushynska el al., 2014a, b). Одержану суспензію клітин змішують з лізуючим буфером у співвідношенні 1:3 (4 % Тритон Х100, 5 мМ 1-ДТА, 5 мМ дитіотреітолу, 5 мМ MgCl2 та інкубують протягом 10 хв. на льоду. Центрифугують протягом 5 хв, 12 000 об/хв. До аліквоти супернатанту, що містить 100 мкг білка додаємо 50 мкл буферу та 10 мкл 2 мМ розчину синтетичного тетрапептиду ацетил-Асп-ГлуВал-Асп п-нітроаніліду та інкубуємо протягом 2 год. при 37 °C. Визначають інтенсивність світлопоглинання при 405 нм, яка прямо пропорційна продукту гідролізу ацетил-Асп-Глу-ВалАсп п-нітроаніліду каспазою 3-п-нітроаніліну (εmM=10.5). Для молюска референтні значення становлять відповідно для вмісту металотіонеїнів 18,22,5 мкг/г тканини, загальної активності катепсину Д - 0,64±0,09 пмоль /(хв.мг білка), вільної активності катепсину Д - 0,32±0,07 пмоль/(хв.мг білка), каспази-3-75,9±10,7 пмоль/(хв.мг білка). Кваліфікують дію цинк-вмісного наноматеріалу за реакцією організму як: "Ефект нанорозмірності" - Цинк-вмісні препарати акумулюються у лізосомах, не піддаються біодеградації" - загальна активність катепсину Д у травній залозі молюска 1,0 пмоль /(хвмг білка), а лізосомальна активність катепсину Д перевищує 0,75 пмоль /(хвмг білка); "Ефект металу" - Цинк-вмісні препарати піддаються біодеградації, цинк акумулюється у складі металотіонеїнів" - загальна активність катепсину 0,95 пмоль /(хвмг білка), вміст металотіонеїнів на 30-50 % вищий за значення показників контрольної групи; активність каспази-3 більш ніж на 50 % вища за референтні значення, а відношення (МТ+Катепсин Д (л))/(Каспаза-3+Катепсин Д (в))