Застосування n-(9-флуореніліден)-n’-ацетогідразиду як протитуберкульозного засобу

Реферат: Винаходом є застосування сполуки флуоренового ряду, а саме: N-(9-флуореніліден)-N'ацетогідразиду як протитуберкульозного засобу. Встановлено, що N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразид активний до штамів мікобактерій туберкульозу, які чутливі і стійкі до ізоніазиду, та перевищує активність аналога за дією ізоніазиду. N H N CH3 O UA 105062 C2 (12) UA 105062 C2 UA 105062 C2 5 10 15 20 25 Винахід належить до фармацевтичної хімії і стосується нової хімічної сполуки флуоренового ряду, а саме: N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразиду, який виявляє протитуберкульозну дію. Туберкульоз - це хронічна інфекційна хвороба, спричинена мікобактеріями туберкульозу. Характеризується утворенням специфічних гранульом в органах і тканинах, поліморфною клінічною картиною; найчастіше уражаються лімфатичні вузли та легені. На даний час туберкульоз спричиняється таким видом збудника, який у процесі багатьох пасажів через людський організм набув стійкості до протитуберкульозних препаратів. В Україні подоланню епідемії туберкульозу надають велику увагу: впроваджуються протитуберкульозні програми, розробляються нові лікарські засоби і оптимальні схеми їх застосування. Однак захворюваність на туберкульоз і смертність від цієї хвороби залишаються загрозливими. Найбільш проблемним питанням сьогодні є поширення мультирезистентної (лікарсько стійкої) форми туберкульозу [1]. Пошук нових ефективніших протитуберкульозних препаратів є надзвичайно актуальним, особливо у період епідемії туберкульозу в Україні. Основним напрямом у пошуку нових туберкулостатиків є модифікація структури молекул відомих протитуберкульозних препаратів з метою отримати активніші і менш токсичні фармакологічні речовини. Найбільший інтерес як потенційні туберкулостатики представляють групи сполук з високою активністю щодо чутливих і стійких штамів Мус. tuberculosis та низькою токсичністю. Найактивнішим і широко вживаним сьогодні у всіх схемах лікування туберкульозу фтизіатри вважають препарат І ряду - ізоніазид. Нами створені на основі флуорену нові сполуки, які за активністю in vitro та in vivo не поступаються ізоніазиду, значно менш токсичні, пригнічують ріст полірезистентних штамів мікобактерій туберкульозу [2]. Технічна задача полягала у розширенні асортименту ефективних протитуберкульозних засобів, які виявляють високу специфічну дію на різні штами мікобактерій туберкульозу і мають низьку токсичність. Поставлену задачу вирішено таким чином, що одержують N-(9-флуореніліден)-N'ацетогідразид формули 1 N H N CH3 O 30 35 40 45 50 . Сполука формули 1 в літературі не описана. Приклад До розчину 90,1 г (0,5 моля) флуоренону-9 у 0,3 л бензолу додають 1 г птолуолсульфокислоти, розчин 37,04 г (0,5 моля) гідразиду оцтової кислоти в 0,1 л абсолютного спирту і кип'ятять до повного припинення виділення води у насадці Діна-Старка (5 год.). Під час кип'ятіння утворюється осад, який відфільтровують з гарячого розчину, промивають дистильованою водою, бензолом. Отримують 100 г (84,6 %) дрібнокристалічного продукту золотисто-жовтого кольору, Тпл. 161-163 °C (з етанолу). N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразид практично не розчинний у воді, легко розчинний у хлороформі, ацетоні, діоксані, ДМФА, ДМСО; розчинний при нагріванні в етанолі і бензолі. C15H12N2O мол.м. 236,261. Знайдено, %: С - 76,37, Н - 5,14, N-12,06. Вирахувано, %: С - 76,25, Н - 5,12, N-11,86. УФ-спектр в етанолі, λмакс. (lgε): 220-240 нм - 223(3,63), 229(3,65); 240-300 нм - 250-256(3,82), 259(3,90), 280-286(3,19), 289(3,21); 290-340 нм - 295(3,28), згин 322 (3,44), 330(3,46). Протитуберкульозну ефективність заявленого N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразиду вивчено in vitro із зависсю культури Мус. tuberculosis hominis H37Rν, мікобактерій, виділених від хворих на вперше виявлений туберкульоз легень і мікобактерій, які чутливі й стійкі до ізоніазиду. 1 UA 105062 C2 5 10 15 20 За еталон порівняння специфічної протитуберкульозної дії взято найактивніший лікарський засіб - туберкулостатик ізоніазид. Найближчим структурним аналогом заявленої сполуки визначено синтезований нами N-(9флуореніліден)-N'-капроноїлгідразин, який описаний в авторському свідоцтві на винахід. Структурний аналог виявляє противірусну активність щодо вірусу простого герпесу І типу [3]. У мікробіологічному експерименті використано традиційний метод серійних розведень на густому середовищі Льовенштейна-Єнсена: у кожну дослідну і контрольні пробірки засівали по 0,2 мл суспензії мікобактерій за стандартом оптичної мутності. Через 14, 30 і 45 діб інкубації з осаду готували мазки для бактеріологічного дослідження. Забарвлення проведені за ЦільНільсеном. Результати бактеріологічних досліджень оцінювали через 14, 30, 45 діб від моменту посіву матеріалу. Відлік починався з часу, коли в контрольних пробірках (без проти бактерійних препаратів) спостерігався ріст колоній мікобактерій туберкульозу. Встановлено, що нова сполука N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразид активна щодо штамів мікобактерій туберкульозу, які чутливі і стійкі до ізоніазиду, та перевищує активність аналога за дією - ізоніазиду. Порівняльна ефективність заявленої речовини N-(9-флуореніліден)-N'ацетогідразиду та ізоніазиду на Мус. tuberculosis hominis H37R подана в таблицях 1-3 (відповідно на 14, 30 і 45 доби експерименту). З таблиці 1 видно, що на 14 добу експерименту заявлена сполука ефективна щодо: штаму мікобактерій туберкульозу H37R у концентрації 1,25 мкг/мл; штаму мікобактерій туберкульозу, стійкого до ізоніазиду, - в концентрації 2,5 мкг/мл; штаму мікобактерій туберкульозу, чутливого до ізоніазиду, - в концентрації 1,25 мкг/мл. Таблиця 1 Чутливість Мус. Tuberculosis hominis H37R, виділених від хворих на вперше виявлений туберкульоз легень, до заявленого N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразиду та ізоніазиду на 14 день Досліджені Штами сполуки МБТ 20 N-(9флуореніліден)- МБТ H37R N'Стійкий до ацетогідразид ізоніазиду Чутливий до ізоніазиду К. Культури +++ Стійкий до Ізоніазид ізоніазиду Чутливий до ізоніазиду К. Культури +++ 25 30 10 Термін росту на поживному середовищі Концентрація сполук мкг/мл 5 2,5 1,25 0,625 0,313 0,156 ++ + + 0,078 ++ + + + ++ ++ ++ + + + + ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Таким чином, нова сполука вигідно відрізняється від ефективності ізоніазиду щодо штаму мікобактерій туберкульозу, стійкого до ізоніазиду, який у даному випадку ефективний лише у концентрації 20 мкг/мл. З таблиці 2 видно, що на 30 добу експерименту заявлена сполука ефективна щодо: штаму мікобактерій туберкульозу H37R у концентрації 5,0 мкг/мл; штаму мікобактерій туберкульозу, стійкого до ізоніазиду, - в концентрації 10,0 мкг/мл; штаму мікобактерій туберкульозу, чутливого до ізоніазиду, - в концентрації 2,5 мкг/мл; Таким чином, ефективність заявленої сполуки на 30 добу експерименту вигідно відрізняється від дії ізоніазиду щодо штаму мікобактерій туберкульозу, стійкого до ізоніазиду, який ефективний у концентрації 20 мкг/мл. 35 2 UA 105062 C2 Таблиця 2 Чутливість Мус. tuberculosis hominis H37R, виділених від хворих на вперше виявлений туберкульоз легень, до заявленого N-9-флуореніліден)-N'-ацетогідразиду та ізоніазиду на 30 день Досліджені сполуки Штами МБТ 20 МБТ N-(9H R флуореніліден)- 37 Стійкий до N'ізоніазиду ацетогідразид Чутливий до ізоніазиду К. +++ Культури Стійкий до ізоніазиду Ізоніазид Чутливий до ізоніазиду К. ++++ Культури 10 Термін росту на поживному середовищі Концентрація сполук мкг/мл 5 2,5 1,25 0,625 0,313 0,156 0,078 + + ++ ++ +++ +++ + + ++ ++ +++ +++ +++ + + + ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ ++++ +++ + ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ З таблиці 3 видно, що на 45 добу експерименту заявлена сполука ефективна щодо: штаму мікобактерій туберкульозу H37R у концентрації 5,0 мкг/мл; 5 Таблиця 3 Чутливість Мус. tuberculosis hominis H37R, виділених від хворих на вперше виявлений туберкульоз легень, до заявленого N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразиду та ізоніазиду на 45 день Досліджені сполуки Штами МБТ 20 МБТ H37R Стійкий до N-(9-флуоре- ізоніазиду ніліден)-N'Чутливий ацетогідразид до ізоніазиду К. +++ Культури Стійкий до ізоніазиду Чутливий Ізоніазид до ізоніазиду К. ++++ Культури 10 Термін росту на поживному середовищі Концентрація сполук мкг/мл 5 2,5 1,25 0,625 0,313 0,156 + ++ ++ ++ +++ 0,078 ++++ + + ++ +++ ++++ ++++ ++++ + ++ ++ +++ ++++ ++++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ ++++ +++ + ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ штаму мікобактерій туберкульозу, стійкого до ізоніазиду, - в концентрації 10,0 мкг/мл; штаму мікобактерій туберкульозу, чутливого до ізоніазиду, - в концентрації 5,0 мкг/мл. 3 UA 105062 C2 5 10 15 Отже, ефективність заявленої сполуки N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразид на 45 добу експерименту вигідно відрізняється від дії ізоніазиду щодо штаму мікобактерій туберкульозу, стійкого до ізоніазиду, який діє у концентрації 20 мкг/мл. Заявлена сполука N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразид на 14, 30 і 45 добу експерименту стабільно ефективна відповідно в концентрації 1,25 мкг/мл; 5,0 мкг/мл; 5,0 мкг/мл. Ізоніазид, як видно з таблиць 1-3, діє виключно на штами мікобактерій туберкульозу, які чутливі до нього, і не активний до стійкого штаму МБТ. Результати експерименту показали перевагу заявленої сполуки над ізоніазидом саме по відношенню до штаму МБТ, стійкого до ізоніазиду. N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразид виявляє низьку токсичність в експерименті in vivo на білих безпородних мишах при внутрішньочеревному способі введення. Визначення гострої токсичності нової сполуки N-(9-флуореншден)-N'-ацетогідразиду проведено відповідно до "Вимог щодо вивчення загальнотоксичної дії нових фармакологічних речовин" Фармакологічного комітету МОЗ України (1993р.). Розрахункова доза ЛД 50 для білих безпородних мишей при внутрішньочеревному способі введення становить 1058 мг/кг маси тварини. Нова сполука належить до мало небезпечних (таблиця 4). Таблиця 4 Порівняльні дані гострої токсичності N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразиду та ізоніазиду Препарати Шлях введення внутрішньовенно підшкірно внутрішньочеревинно Ізоніазид N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразид 20 25 30 ЛД50, мг/кг 150 160 1058 З таблиці 4 видно, що заявлена сполука менш токсична (за співвідношенням ЛД50 приблизно у 7 разів), порівняно з ізоніазидом. Таким чином, N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразид формули І вигідно відрізняється від ізоніазиду ефективністю дії на штам мікобактерій туберкульозу, який стійкий до ізоніазиду. Запропонована речовина класу флуоренів представляє інтерес як потенційний протитуберкульозний засіб для впровадження у медичну практику. Джерела інформації: 1. Фещенко Ю.І., Черенько С.О. Туберкульоз в Україні: сучасний стан, проблеми та перспективи розвитку. - Київ: Здоров'я України, №2 (14), 2011. - С. 8-9. 2. Петрух Л.І. Актуальність створення і впровадження у промислове виробництво нових лікарських засобів. 3б. описів винаходів / За ред. Петрух Л.І., Петрух В.М. - Львів, ЛвЦНТЕІ, 2003. - 198 с 3. Флуореніліденгідразид капронової кислоти, який проявляє активність до вірусу простого герпесу І типу /SU №1385542 А1, пріор. 16.12.85; опубл. 01.12.87// Маслова Л.І., Зіменковський Б.С., Любачівський В.І. та ін. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 Застосування N-(9-флуореніліден)-N'-ацетогідразиду формули N H N CH3 O як протитуберкульозного засобу. 4 UA 105062 C2 Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5