Спосіб моделювання внутрішньоутробного інфікування плода та новонародженого як наслідку підгострого інфекційно-запального процесу матері

Реферат: Винахід належить до медицини, а саме до патологічної анатомії, акушерства, гінекології, педіатрії, неонатології, мікробіології, та стосується способу моделювання внутрішньоутробного інфікування плода та новонародженого на фоні інфекційно-запального процесу матері, який включає триразове введення мікроорганізмів Escherichia coli самиці щура, причому наслідок підгострого інфекційно-запального процесу матері відтворюють попередньою сенсибілізацією UA 108806 C2 (12) UA 108806 C2 тварини однократним підшкірним введенням в стегно зависі вбитих нагріванням протягом 1 години при температурі 80 °C клітин референтного штаму Escherichia coli щільністю 1,0 од. за шкалою McFarland з наступним, через 10 діб, виконанням внутрішньочеревного інфікування 9 тварини сумішшю бактеріальної культури Escherichia coli у кількості 1,5х10 в 20 % розчині маніту, при попередньому подразненні очеревини введенням в черевну порожнину тварини м'ясопептонного бульйону, інфікування повторюють ще через 10 та 20 діб при аналогічних умовах, потім самицю запліднюють, а ступінь пошкодження внутрішніх органів потомства оцінюють шляхом морфометричної оцінки. UA 108806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до медицини, а саме до патологічної анатомії, акушерства, гінекології, педіатрії, неонатології, мікробіології, та може бути використаним для моделювання внутрішньоутробного інфікування плода та новонародженого як наслідку підгострого інфекційно-запального процесу матері. За даними літератури, серед вагітних жінок, які стають на облік у жіночу консультацію, в 68,6 % випадків діагностуються інфекційно-запальні захворювання різної локалізації, при цьому в 33,2 % випадків виявляються гострі інфекційно-запальні захворювання, а в 66,8 % випадків підгострі й хронічні процеси. Наявність у вагітної жінки вогнищ підгострого інфекційнозапального процесу будь-якої локалізації є істотною причиною виникнення різних ускладнень під час перебігу вагітності, пологів, широкого спектра перинатальної патології. Відомо, що персистуюча інфекція в організмі у жінки, будь то інфекційні захворювання верхніх дихальних шляхів, шлунково-кишкового тракту, сечовидільної системи, або підгострий інфекційнозапальний процес органів малого таза і статевої системи, відповідальна за ряд таких ускладнень, як передчасне вилиття навколоплідних вод, невиношування вагітності, хоріонамніоніт, внутрішньоутробне інфікування плода, зміна антропометричних показників плода й новонародженого [Ким Е.И. Состояние здоровья детей раннего возраста из группы риска развития внутриутробных инфекций: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.09 / Е.И. Ким; Владивостокский государственный медицинский университет. - Хабаровск, 2007. - 26 с; Перинатальная смертность: причины, факторы риска, пути снижения / В.В. Симрок, Ю.Н. Слепичко, Т.П. Жмурко, А.А. Аверина // Таврический медико-биологический вестник. - 2012. - Т. 15, № 2, ч. 1 (58). - С. 280-282.; Субботина Ю.А. Прогнозирование состояния здоровья детей на основе изучения инфекционной патологии в антенатальном и неонатальном периодах: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.07, 14.00.30 / Ю.А. Субботина; Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова. - Санкт-Петербург, 2001. - 20с; Ткаченко В.А. Ведение беременности у женщин при задержке роста плода инфекционного генеза: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.01 / В.А. Ткаченко; Дальневосточный государственный медицинский университет. - Волгоград, 2009. - 23 с; Цхай В.Б. Перинатальные аспекты хронической фето-плацентарной недостаточности при внутриутробном инфицировании: автореф. дис. … док. мед. наук: 14.00.01 / В.Б. Цхай; Красноярская государственная медицинская академия. - Томск, 2000. - 36 с]. Необхідність оцінки морфологічних змін органів та систем плода та новонародженого під впливом внутрішньоутробного інфікування обумовлює необхідність відтворення ситуації в умовах експерименту. Для вирішення даної задачі використовують лабораторних тварин, яким вводять пошкоджуючі агенти різним способом та в різні місця з наступною оцінкою морфофункціональних змін в організмі потомків цих тварин. Так, наприклад, відомий спосіб моделювання внутрішньоутробного інфікування плода лабораторних тварин, зокрема, морської свинки, який включає одноразове внутрішньоочеревинне введення 0,05 мл вірусовмісного матеріалу, наприклад, взятого з герпетичних пухирців хворої людини. При цьому має місце ураження інфекційним агентом внутрішніх органів тварини, зокрема, серця, печінки, селезінки, нирок, судин [Саркисов Д.С., Ремезов П.И. Воспроизведение болезней человека в эксперименте. - М.: Московская правда, 1960-780 с]. Відомий також спосіб моделювання внутрішньоутробного інфікування морської свинки, який включає одноразове внутрішньоочеревинне введення 0,05 мл вірусовмісного матеріалу з додатковим попереднім введенням 1 % масляного розчину фетанолу в дозі 0,05 мг/кг у нижній відділ черевної порожнини впродовж 2-3 тижнів вагітності через день [Пат. № 5557, UA, МПК G09B 23/28. Спосіб моделювання внутрішньоутробного інфікування плоду / Гнатюк М.С., Данилевич Ю.О.; Тернопільська державна медична академія імені І.Я. Горбачевского. - З. № 20040705470; заявл. 07.07.2004; опубл. 15.03.2005, Бюл. № 3]. Відоме моделювання експериментальної пролонгованої імунізації плодів, суть якого полягає у введенні плодам, які отримані від лабораторних щурів-самиць лінії Вістар, на 18-ту добу після запліднення шляхом лапаротомії, черезматково, черезоболонково, в навколоплідні води 0,05 мл антигену, а саме суспензії сальмонел черевного тифу [Карзов М.В. Закономерности строения и морфогенеза лимфоидных бляшек тонкой кишки человека и лабораторных животных в антенатальном и постнатальном периодах онтогенеза, при иммунизации и после введения биологически активных веществ тимуса: автореф. дис. … д. мед. н. - Київ, 1991. - 32 с] або інактивованої (вбитої) спліт-вакцини Ваксігрип 2009/2010 у розведенні 1:1 фізіологічним розчином [Пат. № 63020, UA, МПК G09B 23/28. Спосіб моделювання внутрішньоутробної дії антигенів / Волошин М.А., Матвєйшина Т.М., Грінівецька Н.В., Бурега Ю.О., Таланова О.С.; 1 UA 108806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Запорізький державний медичний університет. - З. № u201102218; заявл. 25.02.2011; опубл. 26.09.2011, Бюл. № 18]. Відомий спосіб моделювання внутрішньоутробної кандидозної інфекції шляхом 7 внутрішньовенного введення лабораторній тварині 10 клітин грибкових штамів Candida albicans [Therapeutic Activity of an Engineered Synthetic Killer Antiidiotypic Antibody Fragment against Experimental Mucosal and Systemic Candidiasis / L. Polonelli, W. Magliani, S. Conti et al. // American Society for Microbiology Infect. Immun. - 2003. - Vol. 71. - № 11. - P. 6205-6212], або послідовного 7 введення самиці миші естрогену внутрішньовенно, затим всередину піхви 10 клітин грибкових штамів Candida albicans [Therapeutic Activity of an Engineered Synthetic Killer Antiidiotypic Antibody Fragment against Experimental Mucosal and Systemic Candidiasis / L. Polonelli, W. Magliani, S. Conti et al. // American Society for Microbiology Infect. Immun. - 2003. - Vol.71. - № 11. - P. 62055 6212], або шляхом введення в піхву 5×10 клітин Candida albicans в 20 мл стерильного фосфатного буферу із стаціонарного культурального середовища, повторення процедури 4 інфікування через 4 тижні при вмісті у буфері 5×10 клітин Candida albicans та одночасного введення естрогену внутрішньовенно, при цьому наявність інфекції перевіряють за вмістом збудника в сироватці крові і змивах піхви миші [Candida-Specific Antibodies during Experimental Vaginal Candidiasis in Mice / Karen L. Wozniak, Floyd L., Wormley, Jr., and Paul L. Fidel, Jr. Microbiology Infect. Immun. - 2002. - Vol.70. - № 10. - P. 5790-5799.], або введенням вагітним самицям наркотичної речовини, яка застосовується при внутрішньопорожнинних операціях, з наступним виконанням розрізу черевної стінки в області матки та введенням в плаценту 6 кожного плода не менше 0,5×10 клітин збудника кандидозної інфекції в ізотонічному розчині. Затим черевну стінку зашивають [Пат. № 2289853, RU, МПК G09B23/28. Способ моделирования кандидозной инфекции у экспериментальных животных / Надеев А.П., Шкурупий В.А.; Государственное учреждение Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. - З. № 2005106030/14; заявл. 03.03.2005; опубл. 20.12.2006]. Відомий спосіб моделювання внутрішньоутробного інфікування на фоні інфекції сечовивідних шляхів, який включає триразове введення зависі мікроорганізмів Escherichia coli штаму Об в сечовий міхур вагітної самиці щура у кількості 0,1 мл в концентрації 1107 КОЕ/мл на кожні 100 г маси тварини [Пат. № 2197750, RU, МПК G09B 23/28. Способ моделирования внутриутробного инфицирования на фоне инфекции мочевыводящих путей / Домрачева М.Я., Панина Е.В., Савченков Ю.И., Волков Н.А.; Красноярская государственная медицинская академия. - З. № 99127560/14; заявл. 22.12.1999; опубл. 27.01.2003]. Даний спосіб моделювання внутрішньоутробного інфікування плода та новонародженого на фоні інфекційно-запального процесу матері є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю і результатом, який може бути досягнутим, тому його обрано за прототип. Основною властивістю відомих способів моделювання внутрішньоутробного інфікування плода та новонародженого на фоні інфекційно-запального процесу матері є те, що вони викликають гострі інфекційні запалення. Тобто, кожна із названих моделей не в змозі відтворити вплив підгострого материнського запалення на плід та новонародженого. У зв'язку з вищевикладеним, в основу винаходу поставлено задачу розробити модель внутрішньоутробного інфікування плода та новонародженого як наслідку підгострого інфекційно-запального процесу матері. Задачу, яку поставлено в основу винаходу, вирішують тим, що у відомому способі моделювання внутрішньоутробного інфікування плода та новонародженого на фоні інфекційнозапального процесу матері, який включає триразове введення мікроорганізмів Escherichia coli самиці щура, згідно з винаходом, наслідок підгострого інфекційно-запального процесу матері відтворюють попередньою сенсибілізацією тварини однократним підшкірним введенням в стегно зависі вбитих нагріванням протягом 1 години при температурі 80 °C клітин референтного штаму Escherichia coli щільністю 1,0 од. за шкалою McFarland з наступним, через 10 діб, виконанням внутрішньочеревного інфікування тварини сумішшю бактеріальної культури 9 Escherichia coli у кількості 1,5×10 в 20 % розчині маніту, при попередньому подразненні очеревини введенням в черевну порожнину тварини м'ясопептонного бульйону, інфікування повторюють ще через 10 та 20 діб при аналогічних умовах, потім самицю запліднюють, а ступінь пошкодження внутрішніх органів потомства оцінюють шляхом морфометричної оцінки. Технічний ефект винаходу обумовлений тим, що спосіб реалізований на тваринах, які мають максимально близьку з людським подібність гістоморфологічних параметрів плацентарного бар'єра, що дозволяє з достатньою впевненістю екстраполювати результати досліду на людський організм; тривалість вагітності щурів в 21-22 дні дозволяє здійснювати експерименти у відносно нетривалий термін; відтворення первинного джерела інфекційно-запального процесу 2 UA 108806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в очеревині материнського організму має реальну порівнянність із проблемою внутрішньоутробного інфікування для людини; розвиток процесу внутрішньоутробного підгострого інфікування в експерименті протікає подібно тому, як й у людини. Головною відміною способу є те, що вперше одержаний підгострий інфекційно-запальний процес у експериментальної тварини, який можливо ідентифікувати з підгострим інфекційнозапальним процесом у жінки, яка вагітна і плід та новонароджений якої страждають від впливу цієї інфекції, на що вказують морфофункціональні дослідження органів потомства самиці щура. Спосіб виконують наступним чином: тварину попередньо сенсибілізують однократним підшкірним введенням в стегно зависі вбитих нагріванням в перебігу 1 години при температурі 80 °C клітин референтного штаму Escherichia coli щільністю 1,0 од. за шкалою McFarland, затим через 10 діб після цього виконують внутрішньочеревне інфікування тварини сумішшю 9 бактеріальної культури Escherichia coli в кількості 1,5×10 при попередньому подразненні очеревини введенням в черевну порожнину м'ясопептонного бульйону, а бактеріальну культуру вводять в 20 % розчині маніту, інфікування повторюють при аналогічних умовах ще через 10 та 20 діб, затим самицю запліднюють, а ступінь пошкодження внутрішніх органів потомства оцінюють шляхом морфологічної оцінки. Теоретичною передумовою способу стало те, що у класифікації запалення враховують характер перебігу процесу і морфологічні форми залежно від переваги ексудативної або проліферативної фази запалення. За характером перебігу виділяють гостре, підгостре і хронічне запалення. За перевагою ексудативної або проліферативної фази запальної реакції ексудативне і проліферативне (продуктивне) запалення. Запалення, що характеризується коротким перебігом (7-10 днів) і великою інтенсивністю запальних явищ, називається гострим. Звичайно в ньому переважають судинно-ексудативні процеси. Гостре запалення - частіше переважно альтеративне і ексудативне, рідко продуктивне. Головним клітинним елементом є нейтрофільний лейкоцит. Запалення, що перебігає довгостроково (від 6 місяців і більше), зі слабко вираженими явищами, називають хронічним. Найчастіше в ньому переважають проліферативні явища. Хронічне - частіше продуктивне або проліферативне. При неактивному хронічному запаленні відсутні нейтрофіли, домінують лімфоцити й макрофаги. При активних формах хронічного запалення поряд з гістіоцитами і лімфоцитами є нейтрофіли. Середнє місце між гострим і хронічним запаленням займає підгостре, або тривале гостре (до 6 місяців). Підгостре - частіше виражається в змішаному виді запалення - ексудативно-продуктивне. Серед клітинних елементів залишаються нейтрофіли, але вже з'являються лімфоцити й макрофаги. Свого роду підгостре запалення є передстадією розвитку хронічного запалення [А.И. Струков, В.В. Серов. Патологическая анатомия: Учебник. - М.: Медицина, 1995. - 688 с; Альперн Д.Е. Патологическая физиология. - М: Медицина, 1965. - 436 с. Патофизиология: учебник: в 2 т. / под ред. В.В. Новицкого, Е.Д. Гольдберга, О.И. Уразовой.-4-е изд., перераб. и доп. - ГЭОТАРМедиа, 2009. - Т. 1. - 848 с]. Ефективність способу доказана експериментально. У якості піддослідних тварин використовували щурів лінії WAG, тому що щури мають максимально близький до людини тип взаємин материнського і фетального кровообігу, гемохоріальний характер плацентації і дискоїдний тип плаценти одночасно, тобто морфофункціональна будова плаценти і плацентарного бар'єру при зовні непорівнянній різниці між організмами щура та людини дуже близькі до ідентичності. Отже, використання щурів в якості лабораторних тварин дозволило проводити екстраполяцію результатів експерименту на людський організм. При утриманні експериментальних тварин, а також при виведенні їх з експерименту, дотримувалися міжнародних норм GLP, а також правил Європейської конвенції з захисту тварин (18 березня 1986 p.). Для фіксування щура-самиці клали долоню на її спину і охоплювали верхню частину її грудної клітини великим і вказівним пальцями, склавши та схрестивши її передні лапи під нижньою щелепою. Фіксовану самицю щура опускали вниз головою. Шкіру живота каудальніше пупка брали у складку й у його основи проколювали черевну стінку, тримаючи голку перпендикулярно. Надалі проводили голку за ходом складки й виконували ін'єкцію. Узяття черевної стінки живота в складку й введення голки за напрямком складки охороняє внутрішні органи від ушкодження голкою. Експеримент включав наступні етапи. Проводили сенсибілізацію тварин. Щурів дослідних груп сенсибілізували одноразово підшкірно (область стегна) 0,1 мл зависі вбитих нагріванням (1 година при 80 °C) клітин референтного штаму Е. соlі щільністю 1,0 од. за шкалою McFarland. 3 UA 108806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Через 10 діб проводили інфікування тварин внутрішньочеревно. З метою подразнення очеревини перед введенням суміші бактеріальних культур в черевну порожнину вводили м'ясопептонний бульйон. Для запобігання швидкої резорбції мікробної суспензії з черевної порожнини та загибелі тварини бактеріальну культуру вводили в 20 % розчині маніту, в результаті чого сповільнюється всмоктування бактерій в кров, превалюють місцеві зміни в очеревині. Через 10 діб п'ять тварин виводили з експерименту з наступним морфологічним дослідженням очеревини, тонкої кишки, брижі тонкої кишки та великого сальника, лімфатичних вузлів брижі тонкої кишки та великого сальника. Макроскопічно: очеревина гладка, дещо тьмяна; органи черевної порожнини зовнішньо не змінені. Мікроскопічно: очеревина - потовщена, дифузно густо інфільтрована лімфолейкоцитарними клітинними елементами з перевагою нейтрофільних лейкоцитів; тонка кишка - дифузна виражена лімфолейкоцитарна інфільтрація з перевагою нейтрофільних лейкоцитів в субсерозних відділах стінки, виражений набряк тканини та повнокров'я судин усіх шарів, виражена гіперплазія лімфоїдних фолікулів; брижа тонкої кишки та великий сальник - дифузна виражена лімфолейкоцитарна інфільтрація з перевагою нейтрофільних лейкоцитів, виражений набряк тканини та повнокров'я судин; лімфатичні вузли брижі тонкої кишки та великого сальника - виражена гіперплазія. Двадцяти тваринам проводили повторне інфікування за такою ж схемою. Через 10 діб п'ять тварин виводили з експерименту з наступним морфологічним дослідженням очеревини, тонкої кишки, брижі тонкої кишки та великого сальника, лімфатичних вузлів брижі тонкої кишки та великого сальника: Макроскопічно: очеревина гладка, дещо тьмяна; органи черевної порожнини зовнішньо не змінені. Мікроскопічно: очеревина потовщена, дифузно помірно інфільтрована лімфолейкоцитарними клітинними елементами зі значною домішкою нейтрофільних лейкоцитів; тонка кишка - дифузна помірна лімфолейкоцитарна інфільтрація зі значною домішкою нейтрофільних лейкоцитів в субсерозних відділах стінки, помірний набряк тканини та повнокров'я судин усіх шарів, виражена гіперплазія лімфоїдних фолікулів; брижа тонкої кишки та великий сальник - дифузна помірна лімфолейкоцитарна інфільтрація зі значною домішкою нейтрофільних лейкоцитів, помірний набряк тканини та повнокров'я судин; лімфатичні вузли брижі тонкої кишки та великого сальника - виражена гіперплазія. П'ятнадцяти тваринам проводили повторне інфікування за такою ж схемою. Через 10 діб п'ять тварин виводили з експерименту з наступним морфологічним дослідженням очеревини, тонкої кишки, брижі тонкої кишки та великого сальника, лімфатичних вузлів брижі тонкої кишки та великого сальника: Макроскопічно: очеревина гладка, дещо тьмяна; органи черевної порожнини зовнішньо не змінені. Мікроскопічно: очеревина - дещо потовщена, дифузно помірно інфільтрована лімфогістіоцитарними клітинними елементами з домішкою поодиноких нейтрофільних лейкоцитів; тонка кишка - дифузна помірна лімфогістіоцитарна інфільтрація з домішкою поодиноких нейтрофільних лейкоцитів в субсерозних відділах стінки, помірний набряк тканини та повнокров'я судин усіх шарів, помірно виражена гіперплазія лімфоїдних фолікулів; брижа тонкої кишки та великий сальник - дифузна помірна лімфогістіоцитарна інфільтрація з домішкою поодиноких нейтрофільних лейкоцитів, помірний набряк тканини та повнокров'я судин; лімфатичні вузли брижі тонкої кишки та великого сальника - у частині лімфоїдних утворень помірно виражена гіперплазія, у частині - їх редукція. До десяти щурів-самиць підсаджували самців, самиці вагітніли, з них: п'ять самиць народжували (проводили морфологічне дослідження плаценти та органів новонародженого); п'ять вагітних самиць виводили з експерименту на пізніх термінах гестації з подальшим вивченням плацент та органів плода. Плацента: макроскопічно - вага, об'єм, товщина дещо зменшені; мікроскопічно помірно виражені інволютивно-дистрофічні та дисциркуляторні зміни. У децидуальній оболонці серед фібриноїдної субстанції виявляється фокальна запальна інфільтрація, представлена переважно лімфоцитами та плазматичними клітинами та поодинокими нейтрофільними гранулоцитами. Антропометричні параметри плодів та новонароджених не відповідають терміну гестації (зменшені). Мікроскопічно в органах плодів та новонароджених відмічаються помірно виражені дисциркуляторні та дистрофічні зміни. 4 UA 108806 C2 5 Одержані дані свідчать про те, що плоди та новонароджені щурів постраждали від впливу підгострого інфекційно-запального процесу їх матерів. Таким чином, переваги способу, що заявляється, дозволяють вважати його адекватною моделлю процесу внутрішньоутробного підгострого інфікування, що має місце у людини. Експериментальне дослідження патогенезу внутрішньоутробного інфікування за способом, що заявляється, дозволить визначати напрямки корекції й профілактики патології вагітності з метою попередження народження неповноцінного потомства. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 20 Спосіб моделювання внутрішньоутробного інфікування плода та новонародженого на фоні інфекційно-запального процесу матері, який включає триразове введення мікроорганізмів Escherichia coli самиці щура, який відрізняється тим, що наслідок підгострого інфекційнозапального процесу матері відтворюють попередньою сенсибілізацією тварини однократним підшкірним введенням в стегно зависі вбитих нагріванням протягом 1 години при температурі 80 °C клітин референтного штаму Escherichia coli щільністю 1,0 од. за шкалою McFarland з наступним, через 10 діб, виконанням внутрішньочеревного інфікування тварини сумішшю 9 бактеріальної культури Escherichia coli у кількості 1,5х10 в 20 % розчині маніту, при попередньому подразненні очеревини введенням в черевну порожнину тварини м'ясопептонного бульйону, інфікування повторюють ще через 10 та 20 діб при аналогічних умовах, потім самицю запліднюють, а ступінь пошкодження внутрішніх органів потомства оцінюють шляхом морфометричної оцінки. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5