Спосіб визначення глібенкламіду в біологічних об’єктах

Реферат: UA 109315 U UA 109315 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, зокрема до судово-токсикологічних досліджень і стосується способу визначення глібенкламіду в біологічних об’єктах. Антидіабетичний засіб глібенкламід, який належить до класу похідних сульфонілсечовини, є основою сучасної фармакотерапевтичної схеми лікування цукрового діабету 2 типу [1]. Особливостями застосування глібенкламіду є специфічність контингенту (пацієнти похилого віку), доступність через безрецептурний відпуск, поліпрагмазія, побічні дії, зокрема гіпоглікемія при передозуванні викликає порушення функції печінки та інші фактори, що створюють токсикологічну небезпеку [2]. Відомі випадки летальних отруєнь глібенкламідом, переважно при суїцидальному передозуванні [3], які відповідно чинного законодавства мають бути піддані судовотоксикологічним дослідженням з ізолюванням токсиканту з біологічних об’єктів, виявленням та кількісним його визначенням в одержаних вилученнях. Найближчим аналогом до корисної моделі є спосіб визначення антидіабетичних засобів похідних сульфонілсечовини в біологічних об’єктах (печінка) [4], який включає метод ізолювання похідних сульфонілсечовини з тканин печінки триразовим настоюванням ацетоном, трикратну екстракцію токсикантів з кислих водних вилучень (рН 2,0) хлороформом, очищення одержаних екстрактів від співекстрактивних речовин методом ТТТТХ (система розчинників хлороформ ацетон (9:1), елюент етанол, загальні та специфічні проявники), виявлення токсикантів методами ТШХ та УФ-спектрофотометрії, а також кількісне їх визначення методом УФспектрофотометрії. Недоліком даного способу є використання ацетону як екстрагенту для ізолювання токсикантів з біологічних об’єктів, який є прекурсором; відсутність заходів очищення первинного вилучення від органічних домішок; використання загальної для лікарських речовин кислотного характеру системи розчинників хлороформ-ацетон (9:1), яка є не селективною для похідних сульфонілсечовини; використання УФ-спектрофотометричного методу виявлення та кількісного визначення токсикантів в одержаних екстрактах, який характеризується низькою селективністю. Завдання корисної моделі полягає в розробці специфічного способу визначення глібенкламіду в біологічних об’єктах для судово-токсикологічних досліджень направленого характеру, який включає: індивідуальний метод ізолювання глібенкламіду з тканин печінки з використанням доступних екстрагентів; заходи очищення одержаних вилучень від домішок різної природи; виявлення глібенкламіду методами ТШХ та ВЕРХ з використанням селективних систем розчинників, специфічних і високочутливих реагентів; кількісне визначення глібенкламіду селективним та високочутливим методом ВЕРХ. Поставлене завдання вирішується тим, що спосіб визначення глібенкламіду в біологічних об’єктах включає ізолювання глібенкламіду з біологічних об’єктів підкисленим органічним розчинником, очищення одержаних вилучень та екстрактів від домішок різної природи, виявлення та кількісне визначення глібенкламіду в екстрактах, згідно з корисною моделлю ізолювання глібенкламіду з біологічних об’єктів проводять ацетонітрилом, підкисленим 6 М розчином кислоти хлоридної до рН 2,0-2,5 з подальшим фільтруванням, очищенням одержаного вилучення від органічних домішок 2,5 % розчином натрію сульфату та н-гексаном з подальшим екстрагуванням хлороформом; виявлення глібенкламіду в хлороформному екстракті та очищення екстракту від співекстрактивних речовин проводять методом ТШХ з використанням як систем розчинників: етилацетату, суміші етилацетат-кислота ацетатна льодяна (49,5:0,5), суміші метиленхлорид-етилацетат-кислота ацетатна льодяна (50:50:1), а також специфічних реагентів: 1 % розчину ваніліну та 5 % розчину хлоралгідрату; виявлення глібенкламіду та кількісне визначення глібенкламіду в екстрактах проводять методом ВЕРХ. Перевагою заявленого способу перед способом-прототипом є застосування індивідуальної методики ізолювання глібенкламіду з тканин печінки підкисленим ацетонітрилом та заходів очищення первинного вилучення від органічних домішок 2,5 % розчином натрію сульфату та нгексаном, а також використання селективних та специфічних умов виявлення та кількісного визначення глібенкламіду високочутливими методами ТШХ та ВЕРХ. Корисна модель ілюструється прикладом. Приклад 1. 50 г подрібненої печінки поміщають у колбу об’ємом 500 мл, додають 3 мл метанолметиленхлоридного (1:1) розчину глібенкламіду, що містить 20,0 мг речовини, перемішують, витримують протягом 24 год. за кімнатної температури, додають 50 мл ацетонітрилу, підкисленого 6 М розчином кислоти хлоридної до рН 2,0-2,5 (за універсальним індикатором), настоюють протягом 30 хв. при періодичному контролі рН середовища та фільтрують через фільтр марки "червона стрічка" у колбу об’ємом 100 мл. Операцію настоювання біологічного матеріалу підкисленим ацетонітрилом проводять тричі. Одержані вилучення об’єднують та 1 UA 109315 U 5 10 15 20 25 переносять у колбу об’ємом 1000 мл, що містить 300 мл 2,5 % розчину натрію сульфату. Вміст колби ретельно перемішують, підкислюють 6 М розчином кислоти хлоридної до рН 2,0-2,5, фільтрують через фільтр марки "червона стрічка" у ділильну колбу та двічі по 100 мл екстрагують н-гексаном по 10 хв. з використанням механічного струшувача. Після розшарування вміст колби переносять у ділильну лійку та відділяють органічний шар, який у подальшому не досліджують. Одержані водно-ацетонітрильні вилучення об’єднують, поміщають у ділильну колбу та тричі по 100 мл екстрагують хлороформом по 10 хв з використанням механічного струшувача. Після розшарування вміст колби переносять у ділильну лійку, органічний шар відділяють, фільтрують через паперовий фільтр з вмістом 5,0 г безводного натрію сульфату. Одержані хлороформні екстракти об’єднують, упарюють в потоці теплого повітря до об’єму 25 мл та використовують для досліджень. Виявлення глібенкламіду в одержаному екстракті проводять методом ТШХ на хроматографічних пластинках Merck silica gel 60 F254 (Німеччина) розміром 1010 см з використанням етилацетату, як загальної для похідних сульфонілсечовини системи розчинників, а також суміші етилацетат-кислота ацетатна льодяна (49,5:0,5) та суміші метиленхлорид-етилацетат-кислота ацетатна льодяна (50:50:1), як індивідуальних для глібенкламіду систем розчинників, а також специфічних реагентів: 1 % розчину ваніліну та 5 % розчину хлоралгідрату. Перед елююванням хроматографічні пластинки попередньо відмивають метанолом та активують в сушильній шафі при температурі 110-120 °C протягом 0,5 год. Висушену хроматографічну пластинку ділять на три частини, на лінію старту якої у вигляді точки в зону 1 та 2 наносять 10 мкл (1 мкг/мл) стандартних розчинів глібенкламіду та кофеїну. У зону 1 3 смугою завтовшки 2 см наносять /4 частини хлороформного екстракту глібенкламіду, одержаного з тканин печінки. При обробці 2-ої та 3-ої зон хроматографічної пластинки 1 % розчином ваніліну або 5 % розчином хлоралгідрату на хроматографічній пластинці візуалізуються індивідуальні плями зі значеннями Rf, співставними зі стандартним зразком глібенкламіду (табл. 1). При цьому, в першому випадку забарвлення плями має бути фіолетовим, а в другому - зелено-коричневим. Таблиця 1 Параметри хроматографічної рухливості досліджуваних речовин Стандартна речовина Хлороформний Кофеїн* глібенкламіду екстракт 0,47 0,46 0,15 Система Етилацетат Етилацетат-кислота ацетатна льодяна (49,5:0,5) Метиленхлорид-етил ацетат-кислота ацетатна льодяна (50:50:1) 30 35 40 45 0,64 0,63 0,23 0,56 0,56 0,26 Примітка: * - хроматографічна система вважається придатною, якщо на хроматограмі чітко видно пляму кофеїну. Очищення екстракту проводять методом ТШХ на хроматографічних пластинках Merck silica gel 60 F254 (Німеччина) розміром 1010 см. Хроматографічну пластинку ділять на три частини, на лінію старту якої у вигляді точки в зону 1 наносять 10 мкл (1 мкг/мл) стандартного розчину 1 глібенкламіду. У зони 2 і 3 смугою завтовшки 2 см наносять /4 частини хлороформного екстракту глібенкламіду, одержаного з тканин печінки. Після хроматографування в етилацетаті пластинку висушують, а зони 1 і 2 обробляють специфічними проявниками: 1 % розчином ваніліну або 5 % розчином хлоралгідрату. У необробленій проявником зоні 3, в області відповідного глібенкламіду значення Rf з пластинки скальпелем знімають шар сорбенту площею 31 см, який поміщають в скляний флакон, що містить 10 мл метилового спирту, струшують протягом 5 хв. і фільтрують через фільтр марки "червона стрічка". Одержаний елюат використовують для ВЕРХ досліджень. Виявлення глібенкламіду в метанольному елюаті та його кількісне визначення проводять методом ВЕРХ з УФ-детектуванням на рідинному хроматографі "Міліхром-А-02" з УФдетектуванням (ЗАТ "Еконова", Новосибірськ). Для розділення речовин використовують обернено-фазову колонку Prontosil-120-5-C18-AQ розміром 275 мм, зерніння 5 мкм ("Bischoff Analysetechnik und Gerate GmbH", Німеччина). Градієнтне елюювання виконують шляхом змішування двох елюентів: елюент А - [0,2М LiClO4-0,005М НСlO4], елюент Б - ацетонітрил кваліфікації "для ВЕРХ". Швидкість рухомої фази - 100 мкл/хв. Температура термостата колонки 2 UA 109315 U 5 10 15 -35 °C. УФ-спектрофотометричне детектування проводять одночасно при 8 довжинах хвиль: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 і 300 нм. Аналіз та обробку хроматограм здійснюють програмою "Аналітика-Chrom". Правильність методики періодично контролюють шляхом хроматографування спеціального контрольного багатокомпонентного розчину, що складається з бромід-іона, уридину, кофеїну, прозерину, м-нітроаніліну, n-нітроаніліну і трифтазину. Виявлення глібенкламіду здійснюють за часом утримування. На фігурах 1 та 2 наведено хроматограми метанольного розчину стандартного зразка глібенкламіду та метанольного елюату, одержаного з тонкого шару. Піки речовин на відповідних хроматограмах мають бути співвідносними за часом утримування (tR-9,99). Для кількісного визначення глібенкламіду будують градуювальний графік (Фіг. 3) залежності площі піку метанольного розчину стандартного зразка глібенкламіду від концентрації (мкг/мл), визначеної за довжини хвилі 230 нм. Лінійність наведеного градуювального графіку в координатах (S, ум. од) - (С, мкг/мл) має бути в інтервалі 0,1-20,0 мкг/мл. Методом лінійної регресії одержано рівняння градуювальної прямої залежності площі піка (Y) від концентрації (X) загального вигляду: у = bх + а. Метрологічні характеристики одержаної градуювальної залежності наведено в таблиці 2. Таблиця 2 Метрологічні характеристики градуювальної залежності площі піку від концентрації R 0,9997 20 25 b 0,0102 а 0,0013 2 S -12 8,380310 S -6 2,89510 Δb -4 1,17510 Δа -4 9,44010 Методом найменших квадратів розраховані коефіцієнти регресії градуювального графіка: S = 0,0102C+0,00133, де S - площа піку, ум. од.; С - концентрація речовини, мкг/мл. Встановлено, що вільний член рівняння градуювального графіка при визначенні значущості істотно не відрізняється від нуля. Це обумовлює перехід рівняння до вигляду: у = bх. Тому, для визначення концентрації глібенкламіду в об’єктах дослідження застосовують рівняння вигляду: S = 0,0102С. Результати кількісного визначення глібенкламіду в екстрактах, одержаних з тканин печінки, наведено в таблиці 3. Таблиця 3 Метрологічні характеристики ізолювання глібенкламіду з тканин печінки (n = 5, Р = 0,95) x 8,86 S 0,73 Sx 3,29×10 x 0,91 -1 ε 10,31 RSD, % 8,31 30 35 40 45 Таким чином, заявлений спосіб визначення глібенкламіду в біологічних об’єктах є більш специфічним для систематичних судово-токсикологічних досліджень направленого характеру при отруєнні даною речовиною, який включає: індивідуальний метод ізолювання глібенкламіду з тканин печінки доступним екстрагентом ацетонітрилом; заходи очищення первинних вилучень від домішок різної природи 2,5 % розчином натрію сульфату та н-гексаном; виявлення глібенкламіду методами ТШХ та ВЕРХ з використанням селективних для токсиканту систем розчинників: етилацетату, суміші етилацетат-кислота ацетатна льодяна (49,5:0,5) та суміші метиленхлорид-етилацетат-кислота ацетатна льодяна (50:50:1), а також специфічних і високочутливих реагентів: 1 % розчину ваніліну та 5 % розчину хлоралгідрату; кількісне визначення глібенкламіду селективним та високочутливим методом ВЕРХ. Джерела інформації: 1. Панькив В.И. Глибенкламид в XXI веке: хорошо не забытое старое / В.И. Панькив // International journal of endocrinology. - 2010. - № 7 (31). - С. 63-70. 2. Решедько Г.К. Клиническое применение глибенкламида: вопросы безопасности и эффективности / Г.К. Решедько, Е.В. Хайкина // Проблемы эндокринологии. - 2012. -№3. - С. 6569. 3 UA 109315 U 5 3. Usage the analytical screening of glibenclamide for chemical-toxicological analysis / T.V. Kucher, S.I. Merzlikin // Actual questions of development of new drugs. - X.: НФаУ, 2014. - С. 68. 4. Ибрагимова М.М. К вопросу химико-токсикологического анализа гликлазида и метформина при их совместном применении // Астана медициналык, журналы. - 2014. - № 2. С. 152-158. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 Спосіб визначення глібенкламіду в біологічних об'єктах включає ізолювання глібенкламіду з біологічних об'єктів підкисленим органічним розчинником, очищення одержаних вилучень та екстрактів від домішок різної природи, виявлення та кількісне визначення глібенкламіду в екстрактах, який відрізняється тим, що ізолювання глібенкламіду з біологічних об'єктів проводять ацетонітрилом, підкисленим 6 М розчином кислоти хлоридної до рН 2,0-2,5 з подальшим фільтруванням, очищенням одержаного вилучення від органічних домішок 2,5 % розчином натрію сульфату та н-гексаном з подальшим екстрагуванням хлороформом; виявлення глібенкламіду в хлороформному екстракті та очищення екстракту від співекстрактивних речовин проводять методом ТШХ з використанням як систем розчинників: етилацетату, суміші етилацетат-кислота ацетатна льодяна (49.5:0.5), суміші метиленхлоридетилацетат-кислота ацетатна льодяна (50:50:1), а також специфічних реагентів: 1 % розчину ваніліну та 5 % розчину хлоралгідрату; виявлення глібенкламіду та кількісне визначення глібенкламіду в екстрактах проводять методом ВЕРХ. 4 UA 109315 U Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5