Спосіб визначення карбофурану (фурадану) в біологічних об’єктах

Винахід, що передбачається, відноситься до ветеринарної токсикології, а саме до виявлення карбофурану (фурадану) на тонкошарових хроматограмах, і може бути використаний для експрес-визначення його залишкових кількостей в продуктах тваринного походження і патологічному матеріалі та при діагностиці отруєнь тварин цим пестицидом. У практиці агроіндустрії використовується велика кількість різноманітних пестицидів, у тому числі з групи карбаматів. Одним із представників цієї групи є карбофуран (фурадан). Карбофуран (фурадан) - являє собою безбарвні (білі) тверді кристали, чистотою 97-98%. Фірма-виробник: FMC США. Карбофуран (фурадан) добре розчинний у органічних розчинниках, стабільний у кислому і нестабільний у лужному середовищі. Карбофуран (фурадан) - системний інсектицид, нематоцид, акарицид, фунгіцид та родентицид. Випускається в різних концентраціях світовими виробниками під різними товарними назвами, наприклад, Адифур, ф. Адіка, Італія; Брифур, ф. Брикіма, Італія; Дайфуран, ф. Іточу, Японія; Фурадан, ф. ФМС, США; Карбосан, Ф. Доу Агросайенсис, США; Ялтокс, Куратор та інші. Молекулярна формула: С12Н5NО3. Молекулярна масса: 221.26. Хімічна назва - 2,3-дигідро-2,2-диметил-7бензофураніл метилкарбамат. Структурна формула: (CH 3)2 O C NH CH3 O Цей препарат багатофункціональної дії, широко використовується у сучасному рослинництві в країнах Західної Європи та в Україні, тому надзвичайно актуальною стала задача контролю залишкових кількостей останніх в продуктах рослинного і тваринного походження. Це потребує розробки високочутливих методів визначення пестицидів. Одним із таких методів є тонкошарова хроматографія. Існує спосіб визначення фурадану (карбофурану) (Оськина В.Н. Определение фурадана и его метаболитов в биосредах методом хроматографии в тонком слое //Гигиена и санитария. -1982.- №7.- С.45-46). В лабораторіях ветеринарної медицини зараз використовують "Методичні вказівки щодо визначення фурадану (карбофурану) у м'ясі методом тонкошарової хроматографії" (затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини від 26.07.2000 №15-14/127). Ці методичні вказівки можуть бути прототипом. Однак, вони мають ряд недоліків. Так, для проведення аналізу за цими методичними вказівками потрібна велика кількість дослідного матеріалу, хімічних реактивів, які дорого коштують. Ці методичні вказівки використовуються тільки для визначення карбофурану (фурадану) у м'ясі. Екстракти недостатньо можна очистити від коекстрактивних речовин, що заважає визначенню дослідного препарату. Недоліком є також відсутність колонково-розподільної хроматографії, яка дає змогу отримувати досить очищений екстракт, придатний для ідентифікації карбофурану (фурадану) засобом тонкошарової хроматографії. Пластинки "Силуфол" перед використанням промивають дистильованою водою, що займає більше часу. Суміш системи подвійних розчинників у хроматографічній камері - гексан-ацетон (3:2) також займає більше часу. При використанні проявляючого реагенту - розчин солі діазонію в ацетоні, за цим способом, недостатньо чітко помітна різниця між кольорами основного фону пластинки та проби, що досліджувалась. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб визначення карбофурану (фурадану) в біологічних об'єктах, що базується на ідентифікації його методом тонкошарової хроматографії і досягається шляхом екстракції препарату кислотно-спиртовим розчином, очищення екстракту гексаном та реекстракції його в 30см3 хлороформу, використання колонково-розподільної хроматографії, системи подвійних розчинників в хроматографічній камері - бензол-етилацетат у співвідношенні 2:1 та проявляючого реагенту - 0,02% розчин солі діазонію (міцний червоний В) в етанолі, щоб забезпечити визначення карбофурану (фурадану) в біологічних об'єктах. Порівняльний аналіз з прототипом дає змогу зробити висновок, що рішення, яке пропонується, відповідає критерію “новизна”. Спосіб виконується таким чином: вилучають карбофуран (фурадан) з аналізуємої проби, осаджують коекстрактивні речовини з кислотно-спиртового розчину на холоду, очищують екстракт гексаном, реекстрагують хлороформом і доочищають реекстракт використовуючи колонково-розподільну хроматографію на оксиді алюмінію та силікагелі АСК, використовуючи елювання і ідентифікацію препарату засобом тонкошарової хроматографії. Метрологічна характеристика способу вказана в таблиці. Це досягається шляхом хроматографування його в суміші бензол-етилацетат (2:1) і проявлення за допомогою водно-спиртового розчину гідроокисукалію - 15% і спиртового розчину солі діазонію – 0,02% (міцний червоний В). Приклад 1 Для виявлення карбофурану (фурадану) використовували хроматографічні пластинки з закріпленим шаром силікагелю. Перед використанням на пластинках проводили розмітку за загальними правилами хроматографічних досліджень: лінія старту на 1,2-1,5см від нижнього краю пластинки, відстань між точками нанесення - 2см. В першу точку наносили 2мкг карбофурану (фурадану), у другу - 1мкг, у третю - 0,5мкг карбофурану (фурадану) зі стандартного розчину з концентрацією препарату 10мкг/мл. Хроматографування проводили в системі рухливого розчинника - бензол: етилацетат у співвідношенні 2:1. Після чого пластинку обробляли 15% водно-спиртовим розчином гідроокису калію, підсушували на повітрі і далі пластинку обробляли 0,02% спиртовим розчином міцного червоного В. Карбофуран (фурадан) виявлявся у вигляді плям округлої форми з чіткими межами бузкового кольору. Rf складало 0,66-0,70. Мінімальна кількість препарату, яку визначали, дорівнювала 0,5мкг (Фіг.). Приклад 2 Хроматографічну пластинку приготували за методичними вказівками, які використовуються як прототип. В три точки також нанесли 2, 1, 0,5мкг карбофурану (фурадану), зі стандартного розчину з концентрацією препарату 10мкг/мл. Хроматографування проводили в системі рухливого розчинника - гексан: ацетон (3:2). Після чого приготували проявляючі розчини, як описано за методикою: 1) 15% водно-спиртовий розчин гідроокису калію; 2) 0,01% ацетоновий розчин солі діазонію (міцний синій Б). Цими розчинами обробили пластинку. Карбофуран (фурадан) проявився у вигляді слабо помітних плям червоного кольору на фіолетовому фоні. Rf склало 0,3-0,33. Мінімальна кількість препарату, яка визначалась, дорівнювала 1мкг. Приклад 3 Кількість препарату в дослідних об'єктах визначали за виведеною нами формулою: A ´ S2 X= S1 ´ m ´ K1 ´ K2 , де X - кількість препарату в дослідних об’єктах, мг/кг, A - кількість препарату, нанесеного на пластинку, зі стандартного розчину, S 1 - площа п'ятна стандартної проби, мм2, S 2 - площа п'ятна дослідної проби, мм2, M - маса проби, що досліджувалась, г, K 1 - коефіцієнт, що враховує кількість екстракту, який досліджували, від загального об'єму - 1/2, K 2 – коефіцієнт, що враховує погрішності виявлення препарату при підготовці проби до аналізу та його розрахунку, %. Спосіб виявлення карбофурану (фурадану) на тонкошарових хроматограмах, що пропонується, є ефективним. Його використання спрощує процедуру аналізу, підвищує точність визначення і є економічно вигідним. Таблиця Спосіб визначення карбофурану (фурадану) в біологічних об’єктах Статистичні показники Межа визначення, мг/кг К-сть паралельних проб Розмах варіювання, % М ± m, % Стандартне відхилення, % Медіана, % м'ясо 0,05 5 83,3-95,8 88,3 ± 2,43 5,4 87,5 Аналізуємі об’єкти внутрішні органи молоко 0,1 0,1 5 5 80-95 82,6-100 89 ± 2,91 92,2 ± 3,48 6,52 7,8 90 91,3 жир 0,1 5 73,7-100 89,5 ± 5,00 11,2 89,5 яйця 0,1 5 89,5-100 92,6 ± 2,10 4,7 89,5