Спосіб визначення генетично модифікованої сої

Реферат: Спосіб визначення генетично модифікованої сої, що включає взяття мазків із прямої кишки свиней для кількісного визначення кишкової палички Е. Соlі, причому оцінка інтенсивності росту кишкової палички Е. Соlі проводиться в умовах in vitro при наявності в поживному середовищі Ендо водної витяжки генетично модифікованої сої порівняно з середовищем із застосуванням водної витяжки негенетично модифікованої сої. UA 109941 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ГЕНЕТИЧНО МОДИФІКОВАНОЇ СОЇ UA 109941 U UA 109941 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільськогосподарського виробництва для визначення генетично модифікованої сої перед використанням її в продуктах харчування чи купівлі або реалізації на ринку. Використання різних сільськогосподарських генетично модифікованих (ГМ) культур як продуктів харчування людей є проблемним питанням для багатьох країн світу. Це пояснюється різними поглядами і результатами досліджень щодо впливу ГМ продуктів на обмін речовин у лабораторних тварин. Так, у дослідах на щурах було виявлено, що ГМ картопля із геном лектину цибулини підсніжника пригнічує імунну систему, викликає патологію печінки, щитовидної залози і селезінки [26]. При згодовуванні мишам ГМ сої були встановлені патологічні зміни в печінці, підшлунковій залозі та сім'яниках [21, 22, 30]. Поряд із патологічними змінами внутрішніх органів (печінка, сім'яники і нирки) встановлено порушення репродуктивних функцій у щурів, зміни гормонального балансу і безпліддя в наступних поколіннях [1, 2, 4, 9, 10]. Горох (ГМ) призводить до змін в імунній системі, а також запаленню легень у мишей [25]. Тому в усіх випадках оцінки харчової продукції з ГМ організмів існує певна вірогідність невиявлення будь-якого токсину або біологічно активних сполук, які можуть бути небезпечними для здоров'я людей [5]. Відносно чужорідних вставок - плазмід, то кільцева форма ДНК робить її більш стійкою до руйнування. Генетично модифіковані вставки були виявлені в мікрофлорі кишечнику. При проведенні досліджень групою британських генетиків на чолі з Гаррі Гілбертом було виявлено, що ДНК з клітин генетично модифікованої їжі потрапляє до мікрофлори кишечнику людей [3]. Про захват генів і плазмід мікрофлорою кишечнику вказувалося і в роботах інших дослідників. Трансгенні вставки були виявлені в слині і мікрофлорі кишечнику людини, в крові і клітинах різних органів мишей та їх потомства (кишечник, селезінка, статеві органи, серце, мозок, шкіра та ін.). Було показано, що ці вставки можуть попадати в статеві клітини людини і тварин. Після запліднення з "трансформованих" яйцеклітин буде з'являтися потомство з генами від інших видів і класів тварин або рослин, тобто з'являться генетичні "химери", більшість з яких, до того ж, будуть безплідними [16, 17, 24, 27, 28]. Результати досліджень, проведених Російською загальнонаціональною асоціацією генетичної безпеки сумісно з Інститутом проблем екології і еволюції їм. А.Н. Северцова РАН в період 2008-2010 pp., свідчать про значний негативний вплив кормів, які містять ГМ компоненти, на репродуктивні функції і здоров'я лабораторних тварин [11]. Основним результатом дії ГМ корму була відсутність третього покоління від тварин експериментальних груп. В окремих випадках вдалося отримати хом'яків третього покоління, але у них було виявлено в роті волосся, яке росло [11]. Незалежні дослідження впливу споживання ГМ корму на тваринах проводились в Інституті вищої нервової діяльності та нейрофізіології РАН (2005 p.), а також Університеті Каена (Франція, 2006). Досліди проводились на популяції хом'яків Кемпбелла (Phodopus campbelli), взятих тому, що у них відбувається швидка зміна поколінь, що дозволяє відстежувати віддалену післядію. З одновікових статевозрілих особин сформували сімейні пари, які розбили на 4 групи по 5 репродуктивних пар в кожній. Перша група (Соя-0) отримувала віварний корм з добавкою чистої нетрансгенної сої, друга (ГМ соя-1) і третя (ГМ соя-2). Контрольна група отримувала віварний корм без добавок. В результаті проведених експериментальних досліджень упродовж трьох поколінь хом'яків Кембела груп ГМ соя-1 і ГМ соя-2 було встановлено: відставання в рості і розвитку; порушення співвідношення статей у виводках із збільшенням частки самок; зменшення кількості потомства, аж до його повної відсутності у другому поколінні тварин груп ГМ соя-1 і ГМ соя-2 порівняно з контрольною групою - чистою соєю [11]. Інститутом кормів та сільського господарства Поділля НААН [8] також було встановлено, що довготривале згодовування поросятам із раннього віку трансгенної сої негативно впливає на їхню репродуктивну здатність і зумовлює токсичну дію на нирки ще не ідентифікованих сполук ГМ сої і залишку гліфосату в ній. Питання безпеки продуктів харчування є важливим фактором виробництва сільськогосподарської продукції. Існують стандарти Російської Федерації, ДСТУ України на визначення ГМ компонентів у продуктах харчування: ГОСТ Р 52173:2003, ГОСТ Р 52174:2003, ДСТУ ISO 21569:2008, ДСТУ ISO 21570:2008, ДСТУ ISO 21571:2008, ДСТУ ISO 224276:2008, ДСТУ CEN/TS 15568:2008, ДСТУ ISO/ TS 21586:2008, ДСТУ ISO 24276:2008, ДСТУ 5021.1:2008, ДСТУ ISO 5021.2:2008. Відомі способи кількісного і якісного визначення сільськогосподарських ГМО культур на основі аналізу нуклеїнових кислот білків, які базуються на виділенні ДНК із використанням сорбенту Silica, детергенту СТАВ, полімеразно ланцюгової реакції ("цепочной реакции - ПНР") в 1 UA 109941 U 5 10 15 "реальному часі", ідентифікації ГМО із застосуванням біологічного мікрочіпа (ГОСТ52174-2003) [6, 12, 13,15]. Використання цих методів потребує придбання високовартісного лабораторного обладнання, реактивів і підготовки висококваліфікованих фахівців. Крім того, ГМ компоненти визначають у готових продуктах харчування або напівфабрикатах, а не у рослинній сировині, до якої, в першу чергу, належить соя. Переважна більшість зарубіжних публікацій, висвітлюють вплив генетично модифікованих кормів на фізіологічний стан організму тварин в цілому, а також їх продуктивність за умов згодовування трансгенних кормів, зокрема кукурудзи [29], сої [19, 23] пшениці [20]. Незалежні дослідники повідомляли про нефротоксичний та гепатотоксичений ефекти які викликає використання ГМ кукурудзи [31]. Ушкодження гістоструктури печінки також було виявлено іншими авторами, які використовували ГМ сою у годівлі щурів [7]. За іншими даними, фрагменти трансгенних генів фуражної кукурудзи (Zein, Sh-2) були виявлені у крові, печінці, селезінці та нирках поросят, яких 35 діб годували кормом з генетично модифікованими інгредієнтами (ГМІ). Крім того, було знайдено фрагмент гену Cry1A (b), який є елементом трансгенної конструкції ГМ кукурудзи MON810 [18]. За прототип нами взяті дослідження впливу ГМ кормів на стан мікробіоценозу каудальної частини кишечнику свиней при згодовуванні звичайної та трансгенної сої згідно з наведеною схемою (табл.) [14]. 20 Загальна схема дослідів Кількість повножирової Кількість екструдованої сої у раціоні, % тварин, гол. Основний раціон (ОР) + звичайна соя 12 10 повножирова екструдована (8♀+4♂) ОР + ГМ-соя повножирова 12 10 екструдована (8♀+4♂) Групи тварин Умови годівлі піддослідних підсвинків І контрольна II дослідна 25 30 35 40 45 50 Якісний та кількісний аналіз сої, на вміст генетично модифікованих інгредієнтів проводився з використанням комерційних ПЛР-тест наборів, згідно з чинними нормативними документами на методи досліджень: ДСТУ ISO 21569.2008, ДСТУ ISO 21570:2008, ДСТУ ISO 21571.2008. Для визначення наявності ГМ-дії проводили виділення ДНК з об'єктів рослинного походження (соя) з використанням комерційного набору "сорб-ГМО-Б" ("Синтол", Росія) згідно з інструкцією виробника. Зразки для аналізу мікрофлори відбиралися шляхом взяття мазків з прямої кишки у 4 піддослідних свинок з кожної групи. Мікробіологічні дослідження проводили в лабораторії інфекційних захворювань Інституту свинарства і агропромислового виробництва НААН України. Для визначення видового складу мікробіоценозу піддослідних свиней використовували поживні середовища: Ендо, агар Сабуро, м'ясо-пептонний бульйон (МПБ), м'ясо-пептонний агар (МПА) та середовище Кітт-Тароцці. Результати досліджень показали, що використання ГМ-сої вплинуло на мікробіоценоз шлунково-кишкового тракту: після згодовування впродовж 35 днів корму, до складу якого входила трансгенна соя, ріст Е. Соlі зменшився з 96,25±1,25 % до 35,00±2,04 %, тобто у 2,75 рази. Недоліком прототипу є довготривалий період проведення досліджень на тваринах одного зразка генетично модифікованої сої, а якщо брати для досліджень декілька варіантів сої, то необхідно збільшувати аналогічно і таку ж кількість груп тварин. В основу поставлено задачу розробити спосіб визначення ГМ сої, який за рахунок використання водних витяжок ГМ сої та не ГМ сої в поживному середовищі Ендо в умовах in vitro забезпечив би визначення зміни росту кишкової палички Е. Соlі і таким чином спростив би сам процес визначення ГМ сої. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення генетично модифікованої сої, який включає взяття мазків із прямої кишки свиней для кількісного визначення кишкової палички Е. Соlі, згідно з корисною моделлю, оцінка інтенсивності росту кишкової палички Е. Соlі проводиться в умовах in vitro при наявності в поживному середовищі Ендо водної витяжки генетично модифікованої сої порівняно з середовищем із застосуванням водної витяжки не генетично модифікованої сої. 2 UA 109941 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний спосіб дає можливість досить переконливо і з мінімальними матеріально технічними затратами визначити наявність генномодифікованої сої та попередити її використання в продуктах насамперед дитячого харчування. Суть пояснюється таким прикладом. В Інституті кормів та сільського господарства Поділля і мікробіологічній лабораторії Вінницького національного аграрного університету провели дослідження. У лабораторних умовах брали сухе поживне середовище Ендо згідно з зазначеною дозою на етикетці упаковки для приготування 100 мл середовища. Відважену дозу переносили в колбу і додавали водну витяжку ГМ сої (рН 7,2) до об'єму 100 мл і кип'ятили 3-5 хвилин до повного розварювання агару, а потім фільтрували крізь ватно-марлевий фільтр. Одержаний фільтрат поживного середовища стерилізували при температурі 120±1 °C упродовж 15 хвилин в автоклаві та після охолодження до температури 40-50 °C живильне середовище розливали в асептичних умовах у стерильні чашки Петрі по 20 мл. Через 7-10 хвилин, як правило, проходило застигання середовища, на яке проводили посів суспензії мікробних тіл Е. Соlі (перше дослідне середовище). Друге дослідне середовище готували як вищенаведене, але водна витяжка була не ГМ сої. Контролем слугувало середовище Ендо виготовлене по загальноприйнятій методиці. Для одержання водної витяжки ГМ і не ГМ сої відважували по 50 г бобів обох варіантів і засипали в термостійкі скляні стакани, а потім додавали по 300 мл дистильованої води, нагрівали до кипіння і кип'ятили 30 хвилин. Мета - інактивація уреази, антитрипсину, антихімотрипсину та інших антипоживних і біологічно активних речовин. Після кип'ятіння відвар фільтрували крізь нейлонову тканину і таким чином одержували водну витяжку ГМ і не ГМ сої. Для перевірки інтенсивності росту Е. Соlі на контрольному та запропонованих середовищах використовували тест-штами культур Е. Соlі (К. 12). З отриманих культур на м'ясо-пептонному агарі проводили змив 1 мл мікробних тіл, а після цього проводили його розведення 1: 100 і це служило як дослідна посівна суспензія. Посівну суспензію висівали на приготовлені дослідні поживні середовища та контрольне за загальноприйнятою методикою. Посіви інкубували в термостаті при температурі 36±1 °C. Підрахунок колоній проводили через кожну добу впродовж 5 діб. Дослідження проводили в 3-й кратних повторностях. За результатами досліджень встановлено, що ріст тест-штамів Е. Соlі (К. 12) був отриманий як на контрольному, так і на дослідних середовищах. На першому дослідному середовищі ріст колоній був пригнічений. На другому дослідному та контрольному середовищі колонії Е. Соlі були червоного кольору та мали металевий блиск. Установлено, що кількість колоній на першому дослідному середовищі була на 37,0±1,5 % меншою в порівнянні до контролю, тоді як у порівнянні з другим дослідним середовищем цей показник становив 3,5±0,4 %. Виходить, що водна витяжка ГМ сої пригнічує на 37,0 % ріст клітин кишкової палички Е. Соlі порівняно до середовища без сої і на 33,5 % їх ріст на середовищі з не ГМ соєю. Джерела інформації:, взяті до уваги при описі 1. Ермакова И.В. Генетически модифицированная соя приводит к снижению веса и увеличению смертности крысят первого поколения. Предварительные исследования // Экоинформ, 2006. - № 1. 2. Ермакова И.В. Влияние сои с геном EPSPS CP4 на физиологическое состояние и репродуктивные функции крыс в первых двух поколениях // Современные проблемы науки и образования.-2009. - № 5. - С. 15-21. 3. Ермакова И.В. Что мы едим? Воздействие на человека ГМО и способы защиты / 2-е изд. М.: Амрита, 2011.-64 с. 4. Ермакова И.В., Барское И.В. Изучение физиологических и морфологических параметров у крыс и их потомства при использовании диетыё содержащей сою с трансгеном EPSPS CP4 // Современные проблемы науки и образования. Биологические науки.-2008. - № 6. - С. 19-20. 5. Закревский В.В. Генетически модифицированные источники пищи растительного происхождения. Практическое руководство по санитарно-эпидемиологическому надзору. Санкт-Петербург: Диалект, 2006.-152 с. 6. Кверчи М. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов / Маддалена Кверчи, Марко Джермини, Ги Ван ден Эде // Практическое руководство.-2006. 7. Колоусова Н.Г. Патоморфологические изменения в печени крыс при употреблении генномодифицированной сои // Н.Г. Колоусова, Г.И. Губина-Вакулик, Т.А. Иваненко и др. / Актуальні проблеми онкоморфології: матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю та 3 конференції Українського дивізіону інтернаціональної академії патології, 12-13 травня 2011 p., Харків, Україна / Харківський нац. мед. університет. - Харків, 2011. - С. 100. 3 UA 109941 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8. Кулик М.Ф. Репродуктивна здатність та фізіологічний стан печінки і нирок свиней за довготривалого згодовування раундапостійкої ГМ сої / Кулик М.Ф., Кулик Я.М., Корнійчук О.В., Хіміч О.В., Стасюк О.К., Обертюх Ю.В., Чорнолата Л.П., Лілик Т.В. // Вісник аграрної науки.2013. - Спеціальний випуск, вересень. - С. 88-92. 9. Малыгин А.Г. Влияние соевой диеты на репродуктивные функции мышей // Современные проблемы науки и образования. Биологические науки.-2008. - № 6.- С. 23. 10. Малыгин А.Г. Соевая диета подавляет репродуктивные функции грызунов / А.Г. Малыгин, И.В. Ермакова // Современные проблемы науки и образования. Биологические науки.2008. - № 6. - С. 26. 11. Михайлов В.Г. Навіщо нам трансгенна соя? / В.Г. Михайлов, О.3. Щербина / Посібник українського хлібороба: науково-практичний збірник. - К.: ТОВ "АКАДЕМПРЕС", 2013. - Т. 2. - С 165-168. 12. Панюшкин А.И. Разработка и совершенствование методов определения ГМО в сырье, продуктах и кормах на основе ДНК-и иммунодиагностики: автореф. дис. канд. ветеринарных наук.-2010. - С. 1-8. 13. Ребриков Д.В. ПЦР "В реальном времени" / Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов и др. под ред. д.б.н. Д.В. Ребрикова - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009.-223 с. 14. Семенов С.О. Динаміка мікробіоценозу кишечнику у свиней за умов використання трансгенної сої / С.О. Семенов, С.Г. Зінов'єв, О.А. Біндюг, С.М. Корінний, Т.М. Цивенко // Свинарство. Міжвід. темат. наук. зб. - Полтава ТОВ "Фірма "Техсервіс", 2013. - Вип. 63. - С. 6976. 15. Чмиленко Ф.А. Определение ГМО в продуктах питания. Сравнение методик выделения ДНК / Ф.А. Чмиленко, Н.Л. Минаева, Л.Л. Сидорова // Методы и объекты химического анализа.2011. - т. 6, № 1. 16. Coghlan A. GM crop DNA found in human gut bugs. NewScientist. 2002. 17. Doerfler W. The insertion of foreign DNA into mammalian genomes and its consequences: a concept in oncogenesis. Adv Cancer Res., 1995, 66, 313-44. 18. Jeffrey M.S. Genetic Roulette. The documented health risks of genetically engineered foods / Jeffrey M. Smith // Fairfield: Yes Books.-2007.-319 p. 19. Magaca-Gymez J.A. Pancreatic response of rats fed genetically modified soybean / MagacaGymez J. A., Lypez Cervantes G., Yepiz-Plascencia G., Calderyn de la Barca A. M. // J Appl Toxicol.2008. - v. 28. - P. 217-226. 20. Magaca-Gymez J.A. Risk assessment of genetically modified crops for nutrition and health / Magaca-Gymez J.A., Calderyn de la Barca A. M. // Nutrition Reviews.-2008. - v. 67. - № 1. - P. 1-16. 21. Malatesta M. Ultrastructural, morphometrical and immunocytochemical analysis of hepatocyte nuclei from mice fed on genetically modified soybean / M. Malatesta, С Caporalony, S. Gavaudan, M. B. L. Rocchi, С Tiberi, G. Gazzanelli // Cell Struct. Funct, 2002, 27, 173-180. 22. Malatesta M. Fine structural analyses of pancreatic acinar cell nuclei from mice fed on GM soybean / M. Malatesta, M. Biggiogera, E. Manuali, M. B. L. Rocchi, B. Baldelli, G. Gazzanelli // Eur. J. Histochem., 2003, 47, 385-388. 23. Malatesta M. Reversibility of hepatocyte nuclear modifications in mice fed on genetically modified soybean / Malatesta M., Tiberi C, Baldelli B. et al. // Eur. J. Histochem.-2005. - v. 49. - P. 237-242. 24. Mercer D.K. Fate of free DNA and transformation of oral bacterium Streptococcus gordonii DL1 plasmid DNA in human saliva / D.K. Mercer, K.P. Scott, W.A. Bruce-Johnson, L.A. Glover, H.J. Flint // Aplied and Environmental Microbiology, 1999, 65, 6-10. 25. Prescott V.E. Transgenic expression of bean alpha-amylase in peas results in altered structure and immunogenicity / V.E. Prescott, P.M. Campbell, A. Moore, J. Mattes, M.E. Rothenberg, P.S. Foster, T. J. V. Higgins, S. P. Hogan // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2005, 53, 9023-9030. 26. Pusztai A. Report of project coordinator on data produced at the Rowett Research Institute. SOAEFD flexible Fund Project Ro 818. 22 October 1998. 27. Schubbert R. Ingested foreign (phage M13) DNA survives transiently in the gastrointestinal tract and enters the blood stream of mice / R. Schubbert, C. Lettmann, W. Doerfler // Molecules, Genes and Genetics, 1994, 242, 495-504. 28. Schubbert R. On the fate of orally ingested foreign DNA in mice: chromosomal association and placental transmission in the fetus / R. Schubbert, U. Hohlweg, D. Renz, W. Doerfler // Molecules, Genes and Genetics, 1998, 259, 569-576. 4 UA 109941 U 5 29. Seralini Gilles-Eric New analysis of a rat feeding study with a genetically modified maize reveals signs of hepatorenal toxicity / Gilles-Eric Seralini, Dominigue Cellier, Joel Spiroux de Vendomois // Aech. Environ. Contam. Toxicol.-2007. - v. 52. - P. 596-602. 30. Vecchio L. Ultrastructural analysis of testes from mice fed on genetically modified soybean / L. Vecchio, B. Cisterna, M. Malatesta, T. E. Martin, B. Biggiogera II Eur. J. Histochem., 2003, 48, 449453. 31. Vendomois de G. S. A comparison of the effects of three GM Corn varieties on mammalian health / G. S. de Vendomois, F. Roullier, D. Cellier et al. // Int. J. Biol. Sci.-2009. - № 5(7). - P. 706726. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Спосіб визначення генетично модифікованої сої, що включає взяття мазків із прямої кишки свиней для кількісного визначення кишкової палички Е. Соlі, який відрізняється тим, що оцінка інтенсивності росту кишкової палички Е. Соlі проводиться в умовах in vitro при наявності в поживному середовищі Ендо водної витяжки генетично модифікованої сої порівняно з середовищем із застосуванням водної витяжки негенетично модифікованої сої. Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5