Спосіб одержання лабораторної моделі хронічного назального носійства стафілококового генезу у кролів

Реферат: Спосіб одержання лабораторної моделі хронічного назального носійства стафілококового генезу у кролів включає інтраназальне інфікування слизової порожнини носа лабораторних тварин Staphylococcus aurcus та подальше спостереження за тваринами впродовж визначеного строку. Лабораторним тваринам попередньо, дворазово підшкірно вводять стандартизований сенсибілізуючий агент, за який використовують завись вбитих, наприклад нагріванням до температури 80 °С впродовж 1 години, клітин референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 6538-р). Наступне інфікування здійснюють стандартизованою зависсю живих добових клітин вищевказаного референс-штаму після попереднього застосування подразнюючого агента (декстран) тричі: перший раз дозою 1 одиниця густини за шкалою McFarland, другий і третій рази через 7 діб дозою 3 одиниці густини за шкалою McFarland. Термін спостереження визначають 90-100 діб. UA 113116 U (12) UA 113116 U UA 113116 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме до експериментальної мікробіології, і може бути використана в мікробіологічних (бактеріологічних) лабораторіях науково-дослідних інститутів та біотехнологічних виробництвах для дослідження закономірностей формування хронічного стафілококового носійства та оцінки потенційної ефективності способів корекції цих порушень. Шпитальні інфекції стафілококового ґенезу ускладнюють майже 30 % усіх хірургічних втручань, що збільшує тривалість перебування пацієнта в лікувальній установі в середньому на 12-16 діб, та відіграють суттєву роль у летальних випадках в стаціонарах хірургічного й акушерсько-гінекологічного профілю. При цьому найбільш небезпечним джерелом стафілококової інфекції є практично здорові носії. Інтраназальне носійство золотистого стафілококу, за даними статистики, серед медичних працівників може досягати 35 %, що є вельми небезпечним для широкого кола населення. Переважно за рахунок цих осіб відбувається циркуляція і накопичення госпітальних штамів стафілококів, які характеризуються полірезистентністю до антибіотиків. До груп ризику розвитку стафілококової інфекції належать породіллі, новонароджені (особливо недоношені немовлята), особи похилого та старечого віку, пацієнти з імунодефіцитними станами, в тому числі ятрогенними (терапія кортикостероїдами, цитостатиками і т.д.), хворі, які зазнали хірургічних втручань з установкою пластикових катетерів, протезів, дренажів та ін. Вищезазначене зумовлює велику актуальність і соціальну значущість проблеми хронічної назальної інфекції з тривалою персистенцією стафілококів, що привертає увагу не тільки мікробіологів, а й епідеміологів, інфекціоністів, оториноларингологів, акушерів, хірургів, педіатрів, терапевтів і імунологів [1, 2]. Складність санації носіїв Staphylococcus aureus зумовлена різноманіттям етіопатогенетичних механізмів розвитку носійства цих мікроорганізмів в організмі хазяїна. Це обумовлює ряд питань, найбільш актуальним з яких є тестування, особливо на етапі доклінічних досліджень, різноманітних способів та засобів санації в експериментальних умовах, що потребує адекватної та відтворюваної лабораторної моделі. Відомий спосіб моделювання катарального риніту з застосуванням подразнюючого агента (поліглюкин), який закапують у носові ходи щурів по 20 мкл у кожний носовий хід один раз на добу три дні поспіль протягом трьох тижнів [3]. Недоліком зазначеного способу є дистрофічні зміни миготливого епітелію, порушення цитоархетектоніки епітеліальних елементів, відсутність назального хронічного інфекційного процесу бактеріального ґенезу та складність відтворення при повторенні. Відомий спосіб моделювання хронічного катарального риніту (ХКР) у щурів, який здійснюють шляхом введення подразнюючого агента. Спочатку тварині додатково вводять внутрішньочеревинно циклофосфан дозою 40 мг/кг, а після цього на наступну добу в носові ходи інстилюють по 20 мкл 0,1 %-ного розчину декстрану з молекулярною вагою 70000, таку ж інстиляцію повторюють через тиждень, а в подальшому інстиляції 0,1 %-ного розчину декстрину повторюють 1 раз на місяць протягом 2-3 місяців [4]. Відтворення хронічного катарального риніту проведено на 9 лабораторних щурах. У всіх тварин індукували риніт шляхом інсталяції в обидва носові ходи з інтервалом у один тиждень по 20 мкл 0,1 % розчину декстрану (С6Н10O5) Mr~70 000 у розчині NaCl. Закапування починали на наступну добу після внутрішньочеревинного введення щурам розчину циклофосфану у 0,9 %вому розчині NaCl (20 мг/мл) із розрахунку: 40 мг препарату на 1 кг живої ваги. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі модель ХКР, створюють шляхом попереднього зниження місцевого та системного імунітету. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату є значні дистрофічні зміни, руйнування клітин миготливого епітелію та відсутність назального хронічного інфекційного процесу бактеріального ґенезу. Прототипом отримання моделі хронічної стафілококової інфекції є спосіб одержання моделі хронічного тонзиліту (XT) [5] стафілококового генезу шляхом попередньої сенсибілізації з подальшим інфікуванням парамигдаликової клітковини та області верхнього полюсу піднебінних мигдаликів лабораторних тварин штамом Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р) і спостереженням за тваринами впродовж визначеного часу. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі модель хронічної стафілококової інфекції створюють шляхом попередньої сенсибілізації з подальшим інфікуванням лабораторних тварин штамом Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р) і спостереженням за тваринами впродовж визначеного часу. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату є відсутність назального хронічного інфекційного процесу бактеріального ґенезу. 1 UA 113116 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В основу корисної моделі поставлена задача шляхом модифікації схеми застосування подразнюючого агента та модифікації схеми одержання моделі хронічного тонзиліту створення способу отримання моделі хронічного назального носійства стафілококового ґенезу у кролів. Технічний результат, який може бути отриманий при використанні запропонованої моделі полягає у збільшенні стабільності параметрів, що впливають на розвиток тривалої персистенції збудника, що розширює можливості для створення стандартної відтворюваної моделі стафілококового носійства з характерними клінічними та мікробіологічними ознаками хронізації інфекційного процесу, придатної для оцінки способів санації та лікування бактеріоносіїв. Поставлена задача вирішується тим, що попередньо дворазово, з інтервалом в 1 добу, підшкірно вводять лабораторним тваринам стандартизований сенсибілізуючий агент, за який використовують завись вбитих, наприклад, прогріванням до температури 80 °С протягом 60 хвилин, клітин референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р), після чого здійснюють подразнення слизової оболонки порожнини носа за допомогою 0,1 %-ного розчину декстрану з молекулярною вагою 50 000-70 000, який закапують у носові ходи тварин по 30 мкл у кожній носовий хід один раз з наступним, через добу, інтраназальним інфікуванням кролів стандартизованою зависсю живих добових клітин референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р) тричі: перший раз в кількості 0,1 мл дозою 1 одиниця густини за шкалою McFarland, другий раз через 7 діб в кількості 0,1 мл дозою 3 одиниці густини за шкалою McFarland і третій раз через 7 діб в кількості 0,1 мл дозою 3 одиниці густини за шкалою McFarland, при цьому термін спостереження визначають 90-100 діб. Запропонована корисна модель відрізняється від прототипу тим, що попередньо дворазово підшкірно лабораторним тваринам вводять стандартизований сенсибілізуючий агент, за який використовують вбиті, наприклад, нагріванням до температури 80 °С протягом 60 хвилин, клітини референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-3 8-р), а наступне інфікування здійснюють після застосування подразнюючого агента (декстран) інтраназально зависсю живих добових клітин вищезазначеного штаму тричі: перший раз дозою 1 одиниця густини за шкалою McFarland, другий і третій рази дозою 3 одиниці густини за шкалою McFarland, при цьому строк сростереження визначають 90-100 діб. Між суттєвими ознаками запропонованої корисної моделі і технічним результатом, який може бути одержаний при її використанні, існує такий причинно-наслідковий зв'язок. Попереднє дворазове підшкірне введення лабораторним тваринам стандартизованої зависі вбитих клітин референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р), подразнення слизових оболонок носа за допомогою декстрану та інтраназальне інфікування тварин стандартизованою зависсю живих клітин того ж штаму дозволяють виконувати сенсибілізацію тварин до інфекційного агента та збільшують стабільність параметрів, що впливають на розвиток хвороби, а використання інтраназального інфікування тричі з інтервалом 7 діб і спостереження за тваринами протягом 90-100 діб - достатній строк для проявлення ознак стандартної моделі з характерними клінічними і мікробіологічними ознаками хронічної назальної інфекції, придатної для оцінки ефектів, способів та засобів лікування хронічного назального носійства стафілококового генезу. Спосіб здійснюють наступним чином. Усіх тварин попередньо мікробіологічно обстежують на наявність золотистого стафілококу в слизовій порожнині носа. У дослід беруть тільки тварин з негативним результатом. Лабораторним тваринам - кролям - дворазово, з інтервалом в 1 добу, підшкірно в область стегна вводять стандартизовану завись вбитих, наприклад, нагріванням клітин референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-3 8-р), за добу до інфікування подразнюють слизові оболонки порожнини носа 0,1 % розчином декстрану (С6Н10O5) Mr~70 000 у розчині NaCl та тричі, з інтервалом в 7 діб, інтраназально вводять стандартизовану завись референт-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р). Референс-штам Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р) використовується для моделювання гнійно-запальних і хронічних процесів, зокрема ендокардиту, остеомієліту, тонзиліту, ендофтальміту в різних країнах світу [6-8], оскільки є в багатьох колекціях мікроорганізмів і має сталі біологічні властивості. Термін спостереження за тваринами вибрано відповідно до задачі дослідження: 90-100 діб. Кратність введення та доза інфікування підбирались експериментальним шляхом таким чином, щоб забезпечити у кролів нульовий показник летальності та септичного стану при мінімальному відсотку тварин, у яких хронічна назальна інфекція не розвивається внаслідок виникнення назального гострого гнійно-запального процесу. Зменшення дози інфекційного агента призводить до підвищення відсотку тварин, у яких не розвивається хронічне назальне носійство. Збільшення дози може призвести до гострого назального гнійно-запального процесу 2 UA 113116 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 з подальшим виникненням септичного стану та летальності серед експериментальних тварин. Зміна типу лабораторних тварин потребує індивідуального підбору. дози, щоб забезпечити бажаний технічний результат. Приклад: Кролям породи "Шиншила" вагою 2,0-2,5 кг дворазово, з інтервалом в 1 добу, підшкірно в область стегна вводили 0,1 мл зависі вбитих нагріванням протягом 60 хвилин при 80 °С клітин штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р) густиною 3 одиниці за шкалою McFarland з наступним, одноразовим, подразненням слизової оболонки порожнини носа декстраном та подальшим, через добу, інтраназальним інфікуванням зависсю живої добової культури референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65- · 38-р) тричі: перший раз кількістю 0,1 мл дозою 1 одиниця густини за шкалою McFarland, другий раз через 7 діб кількістю 0,1 мл дозою 3 одиниці густини за шкалою McFarland і третій раз через 7 діб кількістю 0,1 мл дозою 3 одиниці густини за шкалою McFarland. Термин спостереження визначався 90-100 діб. У таблиці наведені результати мікробіологічних досліджень на золотистий стафілокок поверхні слизових оболонок порожнини носа у кролів, які були рандомізовані в одну з шести груп; -І група (n=10) кролів інтраназально інфікованих триразово, після підразнення дектраном слизової носа, з інтервалом у 7 діб, 0,1 мл зависі живої добової культури штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р), густиною 1 одиниця за шкалою McFarland; - II група (n=10) кролів сенсибілізованих одноразово підшкірно 0,1 мл зависі вбитих нагріванням протягом 60 хвилин при 80 °С клітин штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р) густиною 3 одиниці за шкалою McFarland та через добу після підразнення слизової носа, інтраназально інфікованих одноразово 0,1 мл зависі живої добової культури штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р), густиною 1 одиниця за шкалою McFarland; - III група (n=10) кролів сенсибілізованих одноразово підшкірно 0,1 мл зависі вбитих нагріванням протягом 60 хвилин при 80 °С клітин штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р) густиною 3 одиниці за шкалою McFarland, з проведенням подразнення слизових оболонок порожнини носа за допомогою дектрану та інтраназально інфікованих дворазово: через добу 0,1 мл зависі живої добової культури штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р), густиною 1 одиниця за шкалою McFarland і другий раз через 7 діб кількістю 0,1 мл дозою 3 одиниці густини за шкалою McFarland; - IV група (n=10) кролів сенсибілізованих одноразово підшкірно 0,1 мл зависі вбитих нагріванням протягом 60 хвилин при 80 °С клітин штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р) густиною 3 одиниці за шкалою McFarland та інтраназально інфікованих, після подразнення дектраном слизової порожнини носа, тричі: через добу одноразово 0,1 мл зависі живої добової культури штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р), густиною 1 одиниця за шкалою McFarland і другий і третій раз, відповідно, через 7 діб кількістю 0,1 мл дозою 3 одиниці густини за шкалою McFarland; - V група (n=10) кролів сенсибілізованих дворазово підшкірно 0,1 мл зависі вбитих нагріванням протягом 60 хвилин при 80 °С клітин штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р) густиною 3 одиниці за шкалою McFarland та інтраназально інфікованих, після підразнення дектраном слизової порожнини носа, тричі: через добу одноразово 0,1 мл зависі живої добової культури штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 65-38-р), густиною 1 одиниця за шкалою McFarland і другий і третій раз, відповідно, через 7 діб кількістю 0,1 мл дозою 3 одиниці густини за шкалою McFarland; - VI група (n=7) інтактних кролів. Таблиця Результати мікробіологічних досліджень на золотистий стафілокок поверхні слизових оболонок порожнини носа дослідних тварин Група тварин І, (n=10) II, (n=10) III, (n=10) IV, (n=10) V, (n=10) VI, (n=7) Ступінь заселення поверхні слизових оболонок носа дослідних тварин золотистим стафілококом (lg КУО/г) у дні спостереження, (М±m) 25-30 діб 40-45 діб 60-65 діб 90-100 діб розвиток сепсису у 80 % тварин 4,3±0,7 не вилучались не вилучались не вилучались 5,1±0,5 не вилучались не вилучались не вилучались 5,3±0,4 3,0±0,5 не вилучались не вилучались 6,1±0,5 4,1±0,3 3,8±0,4 3,1±0,2 не вилучались не вилучались не вилучались не вилучались 3 UA 113116 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Дослідження довели, що у І групі тварин в 80 % відбувався розвиток гострого назального гнійно-запального процесу з переходом у септичний стан з подальшим летальним кінцем, що не забезпечує бажаний технічний результат. У кролів II-IV груп через 25-30 діб відбувалась хронізація гнійно-запального процесу, з поступовою елімінацією збудника з поверхні слизових оболонок носа. Таким чином визначено, що носійство збудника було не тривалим, максимум 40-45 діб, що також не забезпечує бажаний технічний результат. Експериментально встановлено, що у лабораторних тварин V групи, які були сенсибілізовані двічі та тричі інтраназально інфіковані після подразнення дектраном слизової порожнини носа, через 25-30 діб розвивається мікробіологічна картина хронічного назального інфекційного процесу стафілококової етіології з тривалою, протягом 90-100 діб, персистенцією збудника, що відповідає мікробіологічним критеріям бактерієносійства. Вищевказані ознаки мали місце у 100 % тварин, що свідчить про відтворюваність і адекватність процесу розвитку хронічного носійства стафілококового генезу. Результати патоморфологічних досліджень через 100 діб спостереження тварин II-IV груп не виявили ознак пошкодження та запалення тканин. У кролів V групи, через 100 діб спостереження, спостерігався спектр гістопатололічних змін: порушувалась щільність клітин, що формують респіраторний епітелій, на певних ділянках були відмічені дистрофічні зміни миготливого епітелію з набряком війок та їх склеюванням, зниження кількості бокаловідних клітин. Субепітеліально виявлялись розширені кровоносні судини з екстравазацією та розрихленням прилеглих тканин з помірно вираженою клітинною інфільтрацією з лімфоїдними елементами (17-22 в полі зору). Вищевказані ознаки мали місце у 100 % тварин, що свідчить про відтворюваність і адекватність процесу розвитку хронічного запалення бактеріального генезу слизової оболонки порожнини носа. Джерела інформації: 1. Чанышева, Р.Ф. Оптимизация технологий борьбы со стафилококковыми инфекциями /Римма Фанильевна Чанышева //ареф. к.мед.н. 14.02.02 - эпидемиология, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации. - Нижний Новгород, 2014. - 22 с. 2. Пономаренко, С.В. Біологічні властивості Staphylococcus aureus, ізольованих із різних осередків вегетування та оптимізація лабораторної діагностики стафілококової інфекції /Світлана Володимірівна Пономаренко //ареф. к.мед.н. 03.00.07 - мікробіологія, ДУ "ІМІНАМН". Харків, 2015. - 26 с. 3. Патент UA 47856 А 6 А61К31/721 /Спосіб моделювання катарального риніту. Заявник: Інститут отоларингології ім. проф. О.С. Коломійченка АМН України. Автори: Заболотний Д.І., Мельников О.Ф., Тимченко С.В., Калиновська Л.П., Тимченко М.Д., Заболотна Д.Д. Патентовлисник: Інститут отоларингології ім. проф. О.С. Коломійченка АМН України. Номер заявки: 20041210130. Дата подання заявки: 11.10.2001. Дата публікації: 15.07.2002, Бюл. № 7, 2002. 4. Патент UA 6846 U 7 А61К31/721 /Спосіб моделювання хронічного катарального риніту у щурів. Заявник: Інститут отоларингології ім. проф. О.С Коломійченка АМН України. Автори: Заболотний Д.І., Мельников О.Ф., Тимченко М.Д., Калиновська Л.П., Тимченко С.В. Патентовлисник: Інститут отоларингології ім. проф. О.С. Коломійченка АМН України. Номер заявки: 20041210130. Дата подання заявки: 09.12.2004. Дата публікації: 16.05.2005, Бюл. № 5, 2005. 5. Патент UA 70957 U G09B 23/28 /Спосіб одержання моделі хронічного тонзиліту. Власники: Журавльов А.С, Мані Хане, Скляр Н.І., Калініченко С.В. Номер заявки: u201200081. Дата подання заявки: 03.01.2012. Дата публікації: 25.06.2012, Бюл. № 12, 2012. 6. Kane, A. Penetration of Ocular Tissues and Fluids by Moxalactam in Rabbits with Staphylococcal Endophthalmitis [Electronic resource] /A. Kane, M. Barza, J. Baum. //Antimicrobial agents and chemotherapy. 1981. Vol. 20, № 5. P. 595-599 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC181758/pdf/aac00011-0039.pdf 7. O'Reilly T. Rat model of bacterial osteomyelitis of the tibia [Text] /O'Reilly Т., Mader J.T. //O. Zak, M.A. Sande (ed.) Handbook of animal models of infection, experimental model in antimicrobial chemotherapy. - Academic Press.: San Diego, Calif. Academic Press; 1st edition, 1999. - P. 560-575. 8. Andes, D.R. Pharmacodynamics of fluoroquinolones in experimental models of endocarditis [Electronic resource] /D.R. Andes, W.A. Craig //Clin Infect Dis. 1998. Vol. 27, № 1. P. 47-50. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9675448. 60 4 UA 113116 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб одержання лабораторної моделі хронічного назального носійства стафілококового генезу у кролів, що включає інтраназальне інфікування слизової порожнини носа лабораторних тварин Staphylococcus aurcus та подальше спостереження за тваринами впродовж визначеного строку, який відрізняється тим, що лабораторним тваринам попередньо, дворазово підшкірно, вводять стандартизований сенсибілізуючий агент, за який використовують завись вбитих, наприклад нагріванням до температури 80 °С впродовж 1 години, клітин референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 6538-р), а наступне інфікування здійснюють стандартизованою зависсю живих добових клітин вищевказаного референс-штаму після попереднього застосування подразнюючого агента (декстран) тричі: перший раз дозою 1 одиниця густини за шкалою McFarland, другий і третій рази через 7 діб дозою 3 одиниці густини за шкалою McFarland, при цьому термін спостереження визначають 90-100 діб. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5