Спосіб визначення мутагенної активності радіаційно забруднених територій

Реферат: Спосіб визначення мутагенної активності радіаційно забруднених територій включає вирощування рослинної тест-системи на досліджуваних територіях та визначення частоти видимих індукованих мутацій. Як рослинну тест-систему використовують пшеницю м'яку озиму. Кількісний показник частоти видимих індукованих мутацій підраховують у поколіннях М 2 і М3 в процесі візуального огляду та на основі обліку кількості мутантних рослин та спектра типів мутацій, які порівнюють з величиною спонтанного мутаційного рівня, і за збільшенням величини отриманого показника визначають рівень мутагенної активності територій з радіаційним забрудненням. UA 118243 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ МУТАГЕННОЇ АКТИВНОСТІ РАДІАЦІЙНО ЗАБРУДНЕНИХ ТЕРИТОРІЙ UA 118243 U UA 118243 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біомоніторингу мутагенного забруднення навколишнього середовища на основі підходів мутаційної генетики, а саме до способів контролю екологічного стану територій за показниками мутаційної мінливості рослин, і може бути використана для визначення мутагенного ефекту дії хронічного іонізуючого випромінювання в низьких дозах на біоту територій з радіаційним забрудненням. При вивченні екологічного стану ґрунту радіаційно забруднених територій особливої уваги потребує оцінка рівня мутаційної мінливості організмів, що на них проживають. Облік цитогенетичних порушень є одним з ефективних та швидких методів оцінювання мутагенної небезпеки навколишнього середовища. На думку деяких дослідників, результати цитогенетичного аналізу при оцінці мутаційного процесу є порівнянними з результатами, отриманими методом електрофоретичного аналізу ізоферментів. Однак, у клітині під дією хронічного радіаційного опромінення, крім значних хромосомних перебудов, виникають мікроструктури і зміни - мікроделеції, мікродуплікації, інверсії, частота яких, на думку Густафсона, у 15-20 разів вища за частоту генних мутацій, але виявити їх цитологічними методами неможливо. Тому визначення генетичної активності радіаційно забруднених територій може бути повним тільки за умов аналізу мутацій у поколіннях, а вивчення спадкових морфо-фізіологічних змін робить можливим реєстрацію та кількісну оцінку невеликих за розмірами змін ДНК. Роль рослин як об'єктів генетичних досліджень не можна недооцінювати, оскільки лише завдяки ним були встановлені закони генетики та цитогенетики. Ще більше зростає їх роль при перевірці факторів навколишнього середовища на генотоксичність. Використовуючи метод аналізу ембріональних летальних та хлорофільних мутацій у лабораторній рослині арабідопсису (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) можна проводити облік мутацій, індукованих фізичними та хімічними мутагенами, а також здійснювати контроль забруднення навколишнього середовища мутагенами (Усманов П.Д., Мюллер А. Применение эмбрион-теста для анализа эмбриональных леталей, индуцированных облучением пыльцевых зёрен Arabidopsis thaliana (L) Heynh // Генетика. - 1970. - Т. 6, № 7. - С. 50-60). Недоліком даного способу є потреба у додатковому оптичному обладнанні, аналіз мутагенної активності забруднень ґрунту в лабораторних умовах, що обмежує врахування впливу інших природних факторів середовища. Рівень генетичних порушень, індукованих забрудненням ґрунту природними радіонуклідами, пропонується також вивчати методом обліку летальних мутацій у популяціях мишачого горошку (Vicia cracca L.) (Попова О.Н., Шершунова В.И., Коданева Р.П., Таскаев А.И. Изменчивость популяций V. cracca L. на территории, имитирующей урано-радиевое загрязнение: Научн. докл. Коми филиала АН СССР. 1985. № 127. Сыктывкар, 34 с). Недоліком даного способу є територіальна обмеженість поширення виду та облік лише вузького спектра генетичних змін. Було також запропоновано спосіб визначення частоти генних мутацій в опромінених популяціях сосни звичайної (Pinus sylvestris L.) за використання ізоферментів як маркерів генів та обліку видимих спадкових змін у її сіяна (Кальченко В.А. Генетические эффекты облучения популяций растений при радиоактивном загрязнении среды: Автореферат диссертации доктора биологических наук. 03.00.15. - генетика. - М.: 1998. - 142 с; Кальченко В.А., Федотов И.С. Генетические эффекты острого и хронического воздействия ионизирующих излучений на Pinus sylvestris L., произрастающих в зоне отчуждения Чернобыльской АЭС // Генетика. 2001. Том 37. № 4. с. 437-447). Недоліком способу є відсутність адаптації під конкретні регіональні умови, де бажано враховувати флористичну репрезентативність та наявність видів-індикаторів, а також складність і високу вартість проведення ізоферментного аналізу. Найбільш близьким до заявленої корисної моделі аналогом за технічною суттю та ефектом, що досягається, є спосіб визначення мутагенного ефекту на основі обліку хлорофільних мутацій у рослин ячменю (Hordeum vulgare L.) лінії waxy (Гераськин С.А., Фесенко С.В., Алексахин P.M. Воздействие аварийного выброса Чернобыльской АЭС на биоту // Радиационная биология. Радиоэкология. 2006. - Т. 46, № 2. - С. 213-224). При цьому облік хлорофільних мутацій здійснюють за класифікатором Ю. Калам і Т. Орав (1974) (Калам Ю., Орав Т. Хлорофильная мутация. Таллин: Валгус, 1974. 60 с). Недоліком способу-прототипу є те, що він передбачає застосування виключно лінії ячменю waxy, не передбачає обліку хромосомних і геномних мутацій (які є більш значущими для оцінки мутагенного ефекту), крім того, його інформативність щодо частоти генних мутацій за морфологічними та фізіолого-біохімічними ознаками є недостатньою. В основу корисної моделі поставлена задача розробки універсального та ефективного способу визначення мутагенної активності радіаційного забруднення територій. При цьому використовувані у способі тест-рослини пшениці характеризуються високою чутливістю до різного характеру генетичних порушень, що забезпечує регіональну універсальність способу, 1 UA 118243 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 підвищену ефективність визначення та інформативність для територій, де біота зазнає впливу хронічного іонізуючого випромінювання в низьких дозах. Особливою перевагою запропонованого способу визначення є те, що він не потребує додаткового обладнання. Поставлена задача вирішується за рахунок того, що облік видимих мутацій у рослин м'якої пшениці покоління М1, які зазнали впливу хронічного опромінення на радіаційно забруднених територіях, проводять у поколіннях М2 і М3 за візуально виявленими кількісними показниками морфологічних спадкових змін, що включають підрахунок особин з видимими мутаціями, спектр цих мутацій, і на основі порівняння з контролем узагальнених даних, оброблених за статистичними методами, та за збільшенням величини отриманих показників визначають мутагенну активність радіаційно забрудненої території. Спосіб здійснюють наступним чином: на досліджуваній території висівають м'яку пшеницю озиму екологічно пластичних сортів за мінімального об’єму насіння не менше 1000 шт. для створення помірно загущених посівів. Після завершення вегетації здійснюють збір насіння для посіву в М2 та/або в М3. Відбір рослин для посіву в поколінні М1 проводиться в залежності від способу посіву в М2, який може бути суцільним і за родинами. 1) Суцільний посів. Відбираються усі рослини і проводиться загальне обмолочування. Насіння з мінімальною кількістю - 0,8-1,0 кг висівається широкорядним способом із зниженою нормою висіву. Розрахунок частоти мутацій за даного способу посіву проводиться за кількістю змінених рослин відносно загальної кількості рослин у відповідному варіанті досліду. 2) Посів за родинами. Проводиться індивідуальний відбір колосів з усіх рослин та їх обмолочування. Мінімальна кількість колосів, відібраних в одному варіанті, - 500 шт. Рослини, вирощені з одного колоса, складають родину. Сівалковий широкорядний посів за родинами проводять на 2-метрових ділянках: колос - ряд. Розрахунок частоти мутацій за даного способу посіву проводиться за кількістю родин із зміненими рослинами відносно загальної кількості родин у відповідному варіанті досліду. Виявлення та облік мутацій здійснюють в процесі візуального огляду рослин пшениці на всіх фазах росту та розвитку. М2 або М3 за їх частотою і спектром. Отримані усереднені результати порівнюють з величиною спонтанного мутаційного рівня та за збільшенням величини визначають радіаційну мутагенну небезпеку території. Запропонований у відповідності з корисною моделлю спосіб далі пояснюється конкретними прикладами реалізації способу. Приклад 1 У 2011 році проводили дослідження з визначення мутагенної активності радіаційних забруднень в ближній зоні відчуження Чорнобильської АЕС. Пшеницю м'яку сортів Альбатрос одеський та Зимоярка вирощували в районі сіл Чистогалівка (за 6 км від ЧАЕС) та Копачі (за 4 км від ЧАЕС), де потужність експозиційних доз залежно від забрудненості радіонуклідами -12 -12 становила 7,210 -34,510 А/кг. Перше покоління рослин (М1) вирощували суцільним посівом. Рослини поколінь М2 і М3 вирощували родинами в умовах природного радіаційного фону -12 (смт. Глеваха Васильківського р-ну Київської обл.) з потужністю експозиційної дози 0,9310 А/кг. Частоту і спектр мутантних форм обліковували з покоління М3 після перевірки успадкування змінених ознак за співвідношенням кількості родин із мутантними рослинами до вивчених родин покоління М2. Спектр типів мутацій визначали за класифікатором Моргуна В.В. і Логвиненко В.Ф. (1995) (Моргун В.В., Логвиненко В.Ф. Мутационная селекция пшеницы. - К.: Наукова думка, 1995. - 624 с). Проводили статистичну обробку даних (Доспехов Б.А. Методика нолевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). - М.: Агропромиздат, 1985. - 351 с). Отримані результати відображені у Табл. 1 та 2. Таблиця 1 Видимі мутації рослин пшениці м'якої сорту Альбатрос одеський, індуковані у ближній зоні ЧАЕС Територія дослідження смт Глеваха (контроль) с. Чистогалівка с. Копачі Частота мутантних родин, % **Типи мутацій, % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 0,81±0,40 24,7 0,0 0,0 75,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 12,03±2,10* 0,0 10 10 7,44±1,18* 20 8,6 4,2 4,2 1,4 5,7 7,2 0,0 2,9 1,4 0,0 1,4 1,4 0,0 4,2 5,7 1,4 2,9 1,4 2,9 2,9 7,0 4,2 12,6 22,4 16,8 5,6 1,5 4,2 5,6 0,0 2,8 1,5 0,0 1,5 0,0 1,5 1,5 7,0 2,8 0,0 0,0 0,0 1,5 0,0 * Різниця відносно контролю статистично достовірна за р0,01. **1) ранньостигла, 2) інтенсивний ріст, 3) пізньостигла, 4) високоросла, 5) низькоросла, 6) довгий колос, 7) короткий колос, 8) крупний колос, 9) щільний колос, 10) нещільний колос, 11) циліндричний колос, 12) скверхедний колос, 13) спельтоїдний колос, 14) еректоїдний колос, 15) напівстерильний колос, 16) безостий колос, 17) напівостистий колос, 18) сизий колос, 19) антоціанові ості, 20) червоні пиляки, 21) широкий листок, 22) вузький листок, 23) антоціановий листок, 24) світло-зелений листок. 2 UA 118243 U Таблиця 2 Видимі мутації рослин пшениці м'якої сорту Зимоярка, індуковані у ближній зоні ЧАЕС Територія дослідження смт Глеваха (контроль) с. Чистогалівка с. Копачі Частота мутантних родин, % 0,58±0,33 **Типи мутацій, % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0,0 33,3 0,0 33,3 33,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 7,02±1,26* 7,0 4,7 11,6 16,4 18,6 20,9 0,0 0,0 2,3 9,3 2,3 2,3 0,0 2,3 2,3 0.0 4,64±1,13* 12,2 0,0 12,2 2,4 2,4 17,1 2,4 7,3 0,0 19,5 2,4 4,9 7,3 0,0 4,9 4,9 *Різниця відносно контролю статистично достовірна за р  0,01. **1) ранньостигла, 2) середньорання, 3) інтенсивний ріст, 4) пізньостигла, 5) високоросла, 6) низькоросла, 7) довгий колос, 8) короткий колос, 9) крупний колос, 10) щільний колос, 11) нещільний колос, 12) циліндричний колос, 13) скверхедний колос, 14) напівстерильний колос, 15) напівостистий колос, 16) відсутність воскової поволоки. 5 10 15 20 25 30 35 Наведені усереднені дані тестування в таблиці 1 і 2 свідчать про те, що в районі с. Чистогалівка і с. Копачі показники мутаційної мінливості рослин пшениці м'якої перевищують спонтанний рівень відповідно в 14,9 та 9,2 разу у сорті Альбатрос одеський і 12,1 та 8,0 рази у сорту Зимоярка. Радіоактивне забруднення території с. Чистогалівка, де показник потужності експозиційної дози в 4,8 разу перевищує такий на території с. Копачі, індукує в 1,5-1,6 разу вищу частоту мутацій. Таким чином, було однозначно продемонстровано, що рівень мутагенної активності визначається інтенсивністю радіоактивно забруднення територій та зростає з підвищенням потужності експозиційної дози. Спектр мутацій, спричинених хронічним опроміненням, включав 12-20 типів і залежав як від потужності експозиційної дози опромінення, так і від генотипу рослин пшениці м'якої. Переважно виникали мутації за тривалістю вегетаційного періоду, довжиною стебла, морфологією колоса, наявністю чи відсутністю його остистості. Мутації короткий, нещільний, напівстерильний колос в більшості випадків виникали за умов хронічного опромінення рослин на території з найвищою потужністю експозиційної дози, статистично достовірне зростання частоти мутації довгий колос зафіксовано за умов найменшої її потужності - с. Копачі. Це вказує на те, що рівень мутаційної мінливості пшениці м'якої в ближній зоні ЧАЕС навіть через 25 років після аварії перевищує контрольні показники та свідчить про мутагенну небезпеку радіаційно забруднених територій. В міру поступового зниження рівня потужності експозиційної дози можна і в подальшому очікувати збереження високого мутагенного ефекту опромінення. Таким чином, отримані дані свідчать про те, що запропонований спосіб визначення може використовуватися для ефективної оцінки мутагенної активності радіаційно забруднених територій. Приклад 2. Як об'єкти дослідження було вибрано території підприємств уранодобувної промисловості: промислові зони Смолінської та Інгульської шахт ДП «Східний гірничо-збагачувальний комбінат» і хвостосховище «Сухачівське, секція 1» ВО «Придніпровський хімічний завод». Потужності експозиційних доз поблизу відвалів шахт, біля шляхів транспортування уранової -12 -12 -12 руди та на території хвостосховища становили відповідно 7,1710 - 35,8510 А/кг, 5,0210 -12 -12 -12 7,1710 А/кг, 10,0410 -12,9110 А/кг. Для вивчення мутагенної активності забруднень територій природними радіонуклідами використовували пшеницю м'яку сорту Зимоярка. Облік мутацій рослин проводили так, як було описано у Прикладі 1. Отримані результати представлені у Табл. 3. 3 UA 118243 U Таблиця 3 Видимі мутації рослин пшениці м’якої сорту Зимоярка, індуковані на території підприємств уранодобувної промисловості Територія дослідження Частота мутантних родин, % **Типи мутацій, % 1 2 смт Глеваха 0,67±0,47 0,0 0,0 (контроль) Промзона 6,45±1,09* 11,7 9,4 Смолінської шахти Промзона 3,31±1,15* 15,4 15,4 Інгульської шахти Хвостосховище «Сухачівське, секція 6,56±2,59* 22,2 11,1 1» 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0,0 0,0 50,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 50,0 0,0 13,9 23,3 13,9 4,6 4,6 4,6 0,0 2,4 2,4 4,6 4,6 15,4 23,0 15,4 0,0 0,0 0,0 15,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 33,4 0,0 0,0 0,0 0,0 11,1 11,1 0,0 11,1 *Різниця відносно контролю статистично достовірна за р  0,05. **1) середньорання, 2) пізньостигла, 3) інтенсивний ріст, 4) високоросла, 5) низькоросла, 6) довгий колос, 7) короткий колос, 8) щільний колос, 9) циліндричний колос, 10) скверхедний колос, 11) спельтоїдний колос, 12) напівостистий колос, 13) остистий колос. 5 10 15 20 25 30 35 Наведені усереднені дані тестування, приведені у Таблиці 3, свідчать про те, що частота видимих мутацій перевищує спонтанні показники в 4,9-9,8 разу. Найвищий рівень мутаційної мінливості зафіксовано на території хвостосховища «Сухачівське, секція 1». Перевищення частоти мутацій в умовах промислової зони Смолінської шахти вдвічі, порівняно з Інгульскою, може бути пов'язане з більшою в 2,2 разу концентрацією урану в радіоактивному пилу основного чинника забруднення досліджуваних ділянок промислової зони. Спектр типів мутацій переважно представлений спадковими змінами за тривалістю вегетаційного періоду і довжиною стебла. З високою частотою траплялись середньоранні (11,722,2 %), пізньостиглі (9,4-15,4 %) й низькорослі (23,0-33,4 %) форми. Виявлено широкий спектр мутацій за морфологією колоса: довгий, короткий, щільний, циліндричний, частка яких складала 4,6-15,4 %. Характерними генетичними наслідками радіонуклідних забруднень Смолінської шахти і хвостосховища «Сухачівське, секція 1» є поява різких мутацій скверхедний та спельтоїдний колоси, причинами виникнення яких є делеції, дуплікації, транслокації, мікроаберації в локусі Q п'ятої хромосоми геному А чи трисомія за цією ж хромосомою (Эйгес Н.С. Коллекция хемомутантов озимой пшеницы // Природа. - 1997. - № 1. - С. 26-35). Це свідчить про те, що стан досліджуваних територій - промзони Смолінської та Інгульської шахт, хвостосховище «Сухачівське, секція 1» є небезпечними з точки зору радіаційної мутагенної небезпеки. Високий рівень мутаційної мінливості та широкий спектр мутацій, індукованих забрудненням уранодобувної промисловості, вказує на ризик виникнення різного характеру генетичних порушень в організмів, які мешкають на забрудненій природними радіонуклідами території. Таким чином, сукупність істотних ознак запропонованого способу визначення мутагенної активності радіаційно забруднених територій, а саме визначення частоти видимих мутацій як наслідок фенотипного прояву генетичних порушень у рослин пшениці м'якої озимої, є необхідною і достатньою для досягнення забезпечуваного винаходом технічного результату розробки нового способу для визначення рівня мутагенної ефективності радіаційного забруднення, що має технічну простоту та високу інформативність щодо визначення мутагенної активності радіаційно забруднених територій. Показники частоти і спектра типів видимих мутацій рослин пшениці м'якої озимої характеризують стабільність генетичного матеріалу, прямо корелюють дозовим навантаженням на рослину, відображають характер і важкість генетичних уражень та є одними з найбільш інформативних показників для визначення мутагенної активності іонізуючих випромінювань на радіонуклідно забруднених територіях. Завдяки використанню запропонованого способу підвищується чутливість, інформативність та ефективність визначення мутагенної активності радіаційного опромінювання на радіонуклідно забруднених територіях. 4 UA 118243 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб визначення мутагенної активності радіаційно забруднених територій, який включає вирощування рослинної тест-системи на досліджуваних територіях та визначення частоти видимих індукованих мутацій, який відрізняється тим, що як рослинну тест-систему використовують пшеницю м'яку озиму, при цьому кількісний показник частоти видимих індукованих мутацій підраховують у поколіннях М2 і М3 в процесі візуального огляду та на основі обліку кількості мутантних рослин та спектра типів мутацій, які порівнюють з величиною спонтанного мутаційного рівня, і за збільшенням величини отриманого показника визначають рівень мутагенної активності територій з радіаційним забрудненням. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5