Спосіб одержання метаболітів пробіотичних штамів бактерій

Реферат: Спосіб одержання метаболітів пробіотичних штамів бактерій шляхом культивування мікробної суспензії культури мікроорганізму у поживному середовищі, у якому як поживне середовище використовують дезінтеграт власних клітин, отриманий за допомогою ультразвукового генератора. Мікробну суспензію пробіотика вносять у дезінтеграт у співвідношенні 1:9 і після культивування при температурі 37 °C протягом трьох діб, проводять центрифугування при 3000 об/хв впродовж 30 хвилин та фільтрування з використанням мембранних фільтрів з діаметром пор 0,2 мкм. UA 123122 U (12) UA 123122 U UA 123122 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікробіології і може бути використана при одержанні метаболітів пробіотичних штамів. Засоби боротьби з патогенними мікроорганізмами в останні десятиріччя активно поповнюються за рахунок представників нормоценозів різних біологічних ніш людини. Такі бактерії з антагоністичними властивостями належать до препаратів під назвою пробіотики. Фізіологічні функції їх - не тільки діяти проти збудників захворювань, але й підвищувати загальну резистентність макроорганізму, впливати на функції імунокомпетентних клітин, стимулювати та відновлювати корисну мікрофлору та ін. [1, 2]. Аналіз причин не завжди переконливої ефективності клінічного застосування пробіотиків (біологічна несумісність між пробіотичними бактеріями та резидентною мікрофлорою, чутливість до антибіотиків, мінливість біологічних властивостей в бік підвищення патогенного потенціалу та інші) дозволяють зробити висновок, що більш повна реалізація корисних властивостей пробіотичних штамів може бути досягнута при використанні не самих продуцентів, а їх метаболітів, тобто метаболітних препаратів (метабіотиків) [3-5]. Вони містять вже готові активні метаболіти, які являють собою унікальний набір природних біологічно активних компонентів: лізоцим, бактеріоцини, каталази, ферменти, амінокислоти, поліпептиди та ін. [6]. Одержання метаболітів на сьогодні ґрунтується на вирощуванні продуцентів у рідких поживних середовищах з наступним відокремленням мікробних клітин від культуральної рідини та очистки метаболітів від компонентів виробничого поживного середовища [7]. Останній технологічний процес найбільш складний і відповідальний: повністю очистити метаболіти від компонентів поживного середовища неможливо [8]. Внаслідок цього можуть виникати побічні реакції та знижуватись біологічна ефективність застосування препарату, а також утруднюватись його стандартизація. Широко відомим на сьогодні представником метабіотиків є препарат "Актофлор", який позиціонується як аутостимулятор росту. Препарат отримують шляхом послідовної ультрафільтрації та ліофілізації культуральної рідини, відібраної на етапі стаціонарної фази росту Е. coli M-17 в ферментері на глюкозо-мінеральному середовищі М-9. "Актофлор" являє собою низькомолекулярну фракцію екзометаболітів культуральної рідини Е. coli M-17 [9]. Також відомий спосіб отримання препарату "Мікростім", який представлено метаболітами Lactobacillus plantarum 8P-A3. Для цього застосовують культуральну рідину лактобактерій, отриману з бактеріальної суспензії лактобактерій методом ультрафільтрації з використанням порожнистоволоконних розділових апаратів ВПУ-15. Для культивування клітин застосовують поживні середовища: МРС-1; МРС-2; МРС-4; МРС-5; м'ясо-пептонний агар; м'ясо-пептонний бульйон; 0,5 % розчин глюкози [10]. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб отримання біологічного стимулятора за патентом № 2224018 RU, який полягає в приготуванні бактеріальної зависі культури мікроорганізму, вирощеної шляхом глибинного культивування у регламентованих середовищах, її ультрафільтрації з отриманням безклітинного ультрафільтрату з екзометаболітами в кількості 50-75 % від початкового об'єму суспензії, стабілізації ультрафільтрату шляхом термічної обробки при 80-110° С протягом 15-30 хв. Запропонований спосіб дозволяє одночасно отримувати концентрат бактеріальної суспензії для виробництва лікарських форм пробіотика на основі живих мікроорганізмів і безклітинний біологічний стимулятор з широким спектром дії [11]. Однак всі ці препарати отримують з використанням традиційних поживних середовищ, залишки яких, нажаль, завжди присутні в кінцевому продукті. Задача корисної моделі: розробити спосіб одержання метаболітів пробіотичних штамів, який не потребує очистки кінцевого продукту від компонентів поживних середовищ. Поставлена задача вирішується тим, що для одержання метаболітів пробіотичних штамів проводять культивування мікробної суспензії культури мікроорганізму у поживному середовищі, що є дезінтегратом власних клітин, отриманим за допомогою ультразвукового генератора. Для цього мікробну суспензію пробіотика вносять у дезінтеграт у співвідношенні 1:9. Після культивування при температурі 37 °C протягом трьох діб, проводять центрифугування при 3000 об/хв впродовж 30 хвилин та фільтрування з використанням мембранних фільтрів з діаметром пор 0,2 мкм. Технічний результат - оптимізація виробничого процесу отримання метаболітів пробіотичних штамів бактерій. Щоб удосконалити технологію одержання метаболітів пробіотичних штамів та підвищити їх активність проти патогенних бактерій пропонується застосовувати для вирощування продуцентів власні клітинні структури у вигляді дезінтеграту або його супернатанту, які можуть 1 UA 123122 U 5 10 15 20 виконувати дві функції: поживного середовища для пробіотика та проявляти бактерицидну дію по відношенню до збудників захворювань. Як продуцент метаболітів використовували пробіотичні штами Lactobacillus rhamnosus GG (симбіотик PREEMA®, Schonen, Швейцарія) та Lactobacillus plantarum (лікарський засіб Лактобактерин-Біофарма). Культури пробіотичних штамів вирощували протягом 24 годин на середовищі агар MRS для лактобактерій. Мікробну масу тричі відмивали стерильним фізіологічним розчином (рН 7,0) від залишків середовища при 3000 об/хв впродовж 30 хвилин. З осаду готували робочі мікробні суспензії Lactobacillus rhamnosus (L. rhamnosus) або Lactobacillus plantarum (L. plantarum), які мали оптичну щільність 10,0 одиниць за шкалою McFarland (прилад Densi-La-Meter). Здійснювали холодову синхронізацію культур. Для отримання дезінтеграту проводили опромінення клітин лактобактерій за допомогою ультразвукового генератора Г3-109, навантаженого на кільцевий п'єзокерамічний перетворювач-випромінювач типу ЦТС. Опромінення здійснювали у водному середовищі в кільцевому пристрої генератора, тривалість обробки складала 6 годин, оскільки подальше збільшення часу експозиції не призводило до статистично достовірного збільшення кількості загального білка. Ступінь дезінтеграції клітинних структур бактерій контролювали за наступними параметрами: оптична густина мікробної суспензії за шкалою McFarland (McF) (табл. 1); кількість колонієутворюючих одиниць опромінених бактерій (КУО); кількість загального білку за методом Лоурі (визначалась у фільтраті зразків) [12]. Таблиця 1 Оптична густина оброблених ультразвуком мікробних суспензій Тривалість обробки ультразвуком, години 1 2 3 4 5 6 7 25 30 контроль 10 10 10 10 10 10 10 Оптична густина, одиниці McF, (M±m) дослід (L. rhamnosus) дослід (L. plantarum) 10 10 10 10 9,87±0,01 9,86±0,01 9,8±0,02 9,79±0,02 9,53±0,01 9,52±0,02 9,46±0,01 9,46±0,01 9,45±0,01 9,46±0,01 КУО визначалася методом серійних розведень мікробних суспензій: паралельно робили послідовні 10-кратні розведення вихідної та обробленої ультразвуком зависі мікробних культур із подальшим висівом по 0,1 мл на агар MRS для лактобактерій та визначали кількість колоній, що виросли в кінцевому розведенні з урахуванням ступеню розведення. Принцип цього методу полягає в тому, що на поживний агар вносять посівний матеріал певного об'єму з таким розрахунком, щоб колонії, які утворюються кожною бактеріальною клітиною, знаходились на певній відстані одна від одної. За кількістю колоній визначають кількість живих мікроорганізмів у дослідній суспензії. Результати визначення КУО виражають через десятковий логарифм (lg). Таблиця 2 Показники збереженості мікробних клітин до та після обробки ультразвуком Параметр Контроль (вихідна суспензія) Дослід (оброблена суспензія) тривалість обробки ультразвуком, години 5 L. rhamnosus lg КУО/мл, (M±m) Середні показники концентрації білку, мг/мл, (М±т) L. plantaram lg КУО/мл, (М±т) 6 7 8,31±0,11 7,55±0,09 6,96±0,02* 6,91±0,02* 0,006±0,0004 1,36±0,03 1,66±0,03 1,68±0,03 8,45±0,11 7,38±0,1 6,96±0,02 6,87±0,03 2 UA 123122 U Продовження таблицы 2 Середні показники концентрації білку, мг/мл, (М±т) 0,007±0,0006 1,41±0,04 1,65±0,03 1,68±0,02 Примітка. * різниця достовірна в порівнянні з контролем, Р=0,05 5 10 15 Дезінтеграт, що містить клітинні структури лактобактерій, концентрували за допомогою випарювання при 56 °C протягом 30 хвилин та прогрівали концентрат при 80 °C протягом 40 хвилин для стабілізації активності. Супернатант отримували шляхом центрифугування ультразвукового дезінтеграту при 3000 об/хв впродовж 15 хвилин. Для отримання метаболітів в ультразвуковий дезінтеграт або його супернатант, що містить клітинні структури L. rhamnosus або L. plantarum, вносили відповідні мікробні суспензії, з оптичною щільністю 10 одиниць за шкалою McF у співвідношенні 9:1. Культивування здійснювали при температурі 37 °C протягом трьох діб. Потім проводили центрифугування при 3000 об/хв впродовж 30 хвилин та фільтрування супернатанту з використанням мембранних фільтрів "Владіпор" МФАС-Б № 4 з діаметром пор 0,2 мкм. Фільтровані препарати зберігались в побутовому холодильнику при температурі (0-+4)°С впродовж 1-2 діб або заморожувались при температурі -23 °C для більш тривалого зберігання. Ступінь наростання біомаси мікробних клітин L. rhamnosus або L. plantarum контролювали за КУО, кількістю загального білку (методом Лоурі) та рівнем рН одразу після внесення мікробних клітин в ультразвуковий дезінтеграт або його супернатант та після культивування протягом 3 діб (табл. 3). Таблиця 3 Показники наростання біомаси мікробних клітин при культивуванні на ультразвуковому дезінтеграті одразу після після культивування внесення мікробних протягом 3 діб клітин Параметр L. rhamnosus lg КУО/мл, (M±m) Середні показники концентрації білку, мг/мл, (М±m) Рівень рН, (М±m) L. plantarum lg КУО/мл, (М±m) Середні показники концентрації білку, мг/мл, (М±m) Рівень рН, (М±m) 6,96±0,05 6,37±0,03 5,8±0,08 10,94±0,02 13,32±0,04 4,68±0,05 7,24±0,1 6,42±0,05 5,9±0,06 10,81±0,08 12,87±0,2 4,7±0,05 20 25 30 Протимікробні властивості метаболітів, отриманих запропонованим методом, вивчали на тест-штамах культур Staphylococcus aureus ATCC 25923 та циркулюючих штамах Staphylococcus epidermidis № 558, Neisseria mucosa № 69, Klebsiella pneumonia № 32, Corynebacterium xerosis № 41. В якості контролю використовували метаболіти, отримані за загальноприйнятою методикою: центрифугування та фільтрація культуральної рідини лактобактерій після їх культивування в 1 % цукровому бульйоні протягом трьох діб. Суспензію тест-штаму з оптичною густиною 1,0 за шкалою McF вносили у співвідношенні 1:9 у фільтрат з метаболітами. Контролем служили суспензії тест-штамів у цукровому бульйоні та у 0 фізіологічному розчині. Експозиція тест-штаму у досліджуваному фільтраті при температурі 37 С становила 2, 24 та 48 годин. Із рідкого середовища здійснювали висів на тверде поживне середовище в залежності від виду тест-культури. 3 UA 123122 U Таблиця 4 Протимікробні властивості ультразвукового дезінтеграту та метаболітів бактерій по відношенню до тест-культур Метаболіти, Метаболіти, отримані на отримані на Час Цукров ультразвуковому цукровому Фізіол експоз ий дезінтеграті бульйоні Тест-культури огічний иції, буль розчин L. L. L. L. L. L. год. йон rhamnosu plantaru rhamnosu plantaru rhamnosu plantaru s m s m s m 2 + + + + Staphylococcus 24 + + epidermidis 48 + + 2 + + + + + + + + Staphylococcus 24 + + aureus 48 + + 2 + + + + + + + + Neisseria 24 + + mucosa 48 + + 2 + + + + Klebsiella 24 + + pneumoniae 48 + + 2 + + Corynebacteriu 24 + + m xerosis 48 + + Дезінтеграт, що містить клітинні структури Примітка: + наявний ріст культури, протимікробний ефект відсутній; - відсутній ріст культури, протимікробний ефект наявний 5 10 15 20 25 Таким чином, приведені дані свідчать, що метаболіти, отримані за допомогою запропонованого способу, за показниками протимікробної активності не поступаються метаболітам, виділеним при використанні загальноприйнятого поживного середовища. Джерела інформації: 1. Волков М.Ю., Тухбатов И.А. Влияние нового пробиотика на обменные процессы и показатели иммунитета// Нива Урала, 2006. - № 7. - С. 14-15. 2. Зайков С.В. Імунотропні властивості пробіотиків, вітамінів та мікроелементів// Клінічна імунологія. Алергологія. Інфектологія", 2014. - № 8 (77). С. 21-28. 3. Shenderov B.A. Metabiotics: novel idea or natural development of probiotic conception. Microbial Ecology in Health & Disease 2013, 24: 29. 4. Асташкина А.П. Современные взгляды на биологическую роль бифидо- и лактобактерий// Вестник ВГУ, серия: Химия. Биология. Фармация, 2010. - № 1. - С. 133-139. 5. Калмыкова А.И., Селятицкая В.Г., Пальчикова Н.А., Бгатова Н.П. Клеточные и системные механизмы действия пробиотиков. - Новосибирск, 2007. - 280 с. 6. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 3. Пробиотики и функциональное питание. - М.: Изд-во "Грантъ", 2001. - 287 с. 7. Щербаков П.Л. "Нарушения микробиоценоза кишечника у детей и его коррекция". Лечащий врач, 2015. - № 9. 8. Кулакова Ю.В. Разработка поликомпонентного метаболитного пробиотика для наружного применения на основе лактобацилл [Текст]: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.01.06, 03.02.03/ Ю.В. Кулакова; Моск. НИИ эпидемиологии и микробиологии. - М.: 2013. - 26 с. 9. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Бондаренко В.М. Концепция пробиотического препарата, содержащего оригинальные микробные метаболиты// Журн. микробиол. - 2005. - № 5. - С. 108114. 10. Сорокина, Ю.В. Антибактериальное действие концентрата культурапьнои жидкости лактобактерий/ Ю.В. Сорокина, Е.И. Молохова// Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: Материалы конференции. - Пермь, 2007. - С. 103-105. 4 UA 123122 U 5 11. Пат. 2224018 RU, МПК C12N 1/20, А61К 35/74, C12N 1/20, C12R 1/25 C12N 1/20, A61K 35/74, C12N 1/20, C12R1/25. Способ получения биологического стимулятора [Електронний ресурс]/ Несчисляев В.А., Чистохина Л.П. (RU); заявник і патентовласник ФГУП "НПО по медицинским иммунологическим препаратам "Микроген" (RU). - № 2001131538/13; заявл. 21.11.2001; опубл. 20.02.2004. - Режим доступу: www.fips.ru. 12. Lowry О.Н. Protein measurement with the folin phenol reagent/ О.Н. Rosebrough, N.J. Fair, A.L. Randall R [et al.]/ J Biol Chem. - 1951 - № 193. - P. 265-275. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 1. Спосіб одержання метаболітів пробіотичних штамів бактерій шляхом культивування мікробної суспензії культури мікроорганізму у поживному середовищі, який відрізняється тим, що як поживне середовище використовують дезінтеграт власних клітин, отриманий за допомогою ультразвукового генератора. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що мікробну суспензію пробіотика вносять у дезінтеграт у співвідношенні 1:9 і після культивування при температурі 37 °C протягом трьох діб, проводять центрифугування при 3000 об/хв впродовж 30 хвилин та фільтрування з використанням мембранних фільтрів з діаметром пор 0,2 мкм. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5