Спосіб визначення штамів стрептококів для створення еталонних зразків пробіотичних препаратів

Спосіб визначення штамів стрептококів для створення еталонних зразків, що включає виділення стрептококів із пробіотичних препаратів, їх ідентифікацію, валідацію їх властивостей - культурально-морфологічних, біохімічних, антагоністичних та інших, який відрізняється тим, що контроль автентичності та активності пробіотичних препаратів і ефективність ростових властивостей поживних середовищ культивування проводять у відповідності із виділеними та визначеними стрептококами. (19) (21) u201001093 (22) 03.02.2010 (24) 11.10.2010 (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) МОЙСЕЄВА ГАННА В'ЯЧЕСЛАВІВНА, НАСТОЯЩА НІНА ІВАНІВНА, САХНЮК ОКСАНА МИКОЛАЇВНА, КРИВОШЛИК МАРИНА ОЛЕКСАНДРІВНА (73) ДЕРЖАВНЕ ПІДПРИЄМСТВО "ЦЕНТР ІМУНОБІОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ" 3 53338 4. Валідації методу оцінки ефективності ростових властивостей поживних середовищ культивування ізолятів штамів стрептококів; 5. Визначення умов зберігання еталонних зразків стрептококів; 6. Оцінки стабільності властивостей еталонних зразків протягом 17 місяців. Перший етап визначення штамів стрептококів для створення еталонних зразків пробіотичних препаратів - це виділення штамів із бактерієвмісних препаратів: "Йогурт", виробництва ТОВ "ТРИ", Україна та "Йогурт", виробництва "Фармасайнс Інк.", Канада. Бактерієвмісні препарати розчиняють в пептонно-фосфатному буфері, потім за методом серійних десятикратних розведень роблять висіви на селективні поживні середовища із розведень 106 або 108 (в залежності від активності препарату, що досліджують): для виділення стрептококів використовують тверді поживні середовища М-17 та MRS та напіврідке середовище MRS. Інкубацію здійснюють при температурі 37 °С протягом 48 год. Далі, використовуючи набір морфологічних, культуральних і біохімічних, а якщо необхідно, і інших тестів, проводять видову ідентифікацію ізольованих культур. Для визначення морфологічних та культуральних властивостей ізоляти штамів стрептококів (1-2 колонії, відібрані за допомогою бактеріологічної петлі), суспендують у стерильному фізіологічному 0,9 %-розчині натрію хлориду або в дистильованій воді, готують мазки, фарбують за Грамом і досліджують клітини молочнокислих бактерій бактеріоскопічно. Після бактеріоскопічного підтвердження роблять висів на селективне тверде середовище М-17. Культивування здійснюють в анаеробних умовах з використанням газ-пакетів. Вивчають ріст культур при температурі інкубації 37, 41 °С та роблять опис колоній за їх зовнішнім виглядом. Стрептококи, виділені із комерційних пробіотичних препаратів, та вивчені за морфологічними і культуральними ознаками, ідентифікують до виду 4 за біохімічними властивостями. Біохімічні властивості вивчають на рідких середовищах та планшетах "Ентеротест" для визначення ферментативної активності штамів. Ідентифікацію стрептококів здійснюють також за допомогою системи тестування АРІ 20 виробництва "Bio Merieux", Франція. Посіви анаеробно інкубують при температурі 37 °С впродовж 7 діб. Облік проводять щоденно, починаючи з 24-ої години росту кожної культури, а також за зміною забарвлення середовища (з фіолетового на жовтий). Розкодування систем тестування здійснюють за допомогою програмного забезпечення. Таким чином, в результаті ідентифікації ізольованих штамів до виду, відбирають перші біологічні матеріали для створення еталонних штамів (робочих еталонних зразків) стрептококів пробіотичних препаратів: - Streptococcus thermophilus CT/1 із препарату "Йогурт", виробництва ТОВ "ТРИ", Україна; - Streptococcus thermophilus СТ/2 із препарату "Йогурт", виробництва "Фармасайнс Інк.", Канада. З метою валідації морфологічних та культуральних властивостей опис клітин та колоній ізолятів стрептококів з різних середовищ культивування досліджують щонайменше тричі. Визначення видової приналежності стрептококів, що входять до складу іноземних та вітчизняних пробіотичних препаратів, надає можливість в подальшому провести їх валідацію за антагоністичними властивостями, яка проявляється в здатності подавляти ріст патогенної та опортуністичної мікрофлори, продукувати антибіотичні речовини, вітаміни, органічні кислоти. Перевірку антагоністичних властивостей стрептококів здійснюють на чашках Петрі з середовищем М-17 методом відстроченого антагонізму по відношенню до тест-культур Esherihia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pnevmoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa (табл. 1). Таблиця 1 Антагоністична активність штамів ентерококів до тест-культур № п/п 1 2 3 4 5 Тест-культури Esherihia coli 0111 Klebsiella pnevmoniae Staphylococcus aureus 049065 Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgaris 160209 Зони затримки росту тест-культур S. thermophilus етаS. thermophilus еталонний зразок "ЙоS. thermophilus лонний зразок "Йогурт", виробництва виробничий штам гурт", виробництва "Фармасайнс Інк.", ДІСК* ТОВ "ТРИ", Україна Канада 10,0±2,5 10,7±2,5 9,4±1,2 8,4±1,0 11,5±1,0 18,4±1,1 19,2±1,2 17,0±1,0 10,4±1,0 11,8±1,2 11,9±1,0 14,5±1,0 14,5±1,0 14,7±1,4 * Державний інститут стандартизації та контролю ім. Л. Тарасевича, м. Москва, РФ. З даних таблиці 1 видно, що стрептококи характеризуються значними зонами затримки росту до патогенних еталонних штамів - показники антаго ністичної активності експериментальних еталонних штамів відповідають показникам виробничих 5 53338 штамів, що використовуються в лікувальних препаратах. З ізольованих штамів стрептококів, що пройшли валідацію за культурально-морфологічними, біохімічними та антагоністичними властивостями, створюють робочі еталонні зразки, у відповідності з якими перевіряють бактерієвмісні препарати за автентичністю, специфічною активністю, та здійснюють оцінку ефективності ростових властивостей поживних середовищ культивування молочнокислих бактерій. Еталонні зразки стрептококів використовують за двома умовами зберігання: 1. Еталонні зразки штамів стрептококів короткотривалого зберігання - на поживних середовищах культивування під вазеліновим маслом при температурі 4-8 °С протягом 2 місяців. 2. Еталонні зразки стрептококів довготривалого зберігання - у висушеному стані. Ліофілізовані еталонні зразки штамів стрептококів виготовляють із концентрованої суспензії бактеріальних клітин 6 кожного штаму еталонного зразку за кількістю живих бактерій 107-108 КУО (колонієутворюючих одиниць), що змішують із захисним середовищем у співвідношенні 1:1 та ліофілізують. В якості захисного середовища використовують 10 %- розчин відновленого знежиреного молока та 20 %- розчин сахарози, змішані у співвідношенні 4:1 за об'ємом. Ліофілізовану суміш в ампулах запаюють в полум'ї газової горілки під тиском. Ліофілізовані еталонні зразки молочнокислих бактерій випробовують за терміном зберігання при різних температурах та за різних умов протягом 17 місяців. Оцінку стабільності властивостей розроблених та стандартизованих еталонних зразків пробіотиків здійснюють за тестами: специфічна активність (вміст живих молочнокислих бактерій), контамінація сторонньою мікрофлорою, кислотоутворення, визначення рН через 6, 12 та 17 місяців від моменту виготовлення (табл. 2). Таблиця 2 Стабільність валідації властивостей еталонних зразків стрептококів Тест валідації Специфічна активність Контамінація сторонньою мікрофлорою Кислотоутворення Визначення рН Дата виготовлення 2 109 Відсутня Через 6 міс. 2 109 Відсутня Через 12 міс. 5 108 Відсутня Через 17 міс. 8 108 Відсутня 133±3 °Т 5,2±0,4 134±2,5 °Т 5,2±0,4 124 °Т 5,2±0,4 129 °Т 5,2±0,4 Висновок Еталонні зразки штамів стрептококів, що пройшли валідацію, можуть бути використані для контролю якості бактерієвмісних препаратів за двома способами: 1. Культуру штамів стрептококів, що зберігають на відповідних поживних середовищах під вазеліновим маслом при температурі 4-8 °С протягом 2 місяців використовують: а) для визначення автентичності пробіотичного препарату бактеріоскопічним методом - фарбування за Грамом випробовуваного та еталонного зразку, і порівняння їх культурально-морфологічних властивостей. б) для оцінки ростових властивостей поживних середовищ культивування за методом приготування бактеріальної суспензії із культури стрептококів у логарифмічній фазі росту у відповідності із стандартом мутності 10 МО (міжнародних одиниць) та висіву еквіваленту 100 КУО, отриманого методом серійних розведень. 2. Бактеріальний концентрат стрептококів у ліофілізованому стані, що зберігають при температурі 4-8 °С протягом 15 місяців використовують: а) для перевірки автентичності пробіотичного препарату: розведення ліофілізованого еталонного зразка стрептококів та випробовуваного препарату дистильованою водою, фарбування за Грамом і порівняння їх культурально-морфологічних властивостей. б) для визначення специфічної активності пробіотичного препарату - визначення кількості живих стрептококів паралельно з випробовуваним зразком пробіотичного препарату за методом серійних десятикратних розведень у пептоннофосфатно-буферному або фізіологічному розчині, та висіву на поживні середовища культивування молочнокислих бактерій. в) для оцінки ростових властивостей поживних середовищ - культивування за методом приготування бактеріальної суспензії із культури молочнокислих бактерій у логарифмічній фазі росту у відповідності із стандартом мутності 10 МО та висіву еквіваленту 100 КУО, отриманого методом серійних розведень. Джерела інформації: 1. Евлашкина В. Ф. Специфическая активность бифидосодержащих моно- и комплексних препаратов и усовершенствование методов их контроля. Автореф. Дис. на соиск. уч. ст.. к.б.н., Москва, 2009 г. 2. Качество препаратов из нормальной микрофлоры кишечника человека // Сб. Научн. Тр. Ташкентського НИИВС "Медицина", 1988 - С. 7479. 3. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. - М., 1980, с. 7. 4. Керівні вказівки для національних органів щодо забезпечення якості біологічних препаратів, Серія технічних доповідей ВООЗ № 822. 7 53338 5. Т. М. Лясковский, В. С. Подгорский. Оценка пробиотиков, согласно рекомендациям международных организаций // Мікробіологічний журнал. 2005. - 65. - 6. - С. 104-111. Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 8 6. Г. Мойсеева, Н. Настояща, В. Задорожна "Підходи до стандартизації медичних імунобіологічних препаратів" // Вісник фармакології та фармації. – 2007 - № 10. - С. 56-60. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601