Спосіб визначення штамів біфідобактерій для створення еталонних зразків пробіотичних препаратів

Спосіб визначення штамів біфідобактерій для створення еталонних зразків, що включає виді 3 53337 4. Валідації методу оцінки ефективності ростових властивостей поживних середовищ культивування ізолятів штамів біфідобактерій; 5. Визначення умов зберігання еталонних зразків біфідобактерій; 6. Оцінки стабільності властивостей еталонних зразків протягом 17 місяців. Перший етап визначення штамів біфідобактерій для створення еталонних зразків пробіотичних препаратів - це виділення штамів із бактерієвмісних препаратів: "Лінекс" та "Біфідумбактерин". Бактерієвмісні препарати розчиняють в пептоннофосфатному буфері, потім за методом серійних десятикратних розведень роблять висіви на селективні поживні середовища із розведень 106 чи 108 (в залежності від активності препарату, що досліджується): для виділення біфідобактерій використовують напіврідке біфідумсередовище (або середовище Блаурок). Інкубацію здійснюють при температурі 37°С протягом 48-72 год. Далі використовують набір морфологічних, культуральних і біохімічних, а якщо необхідно, і інших тестів, проводять видову ідентифікацію ізольованих культур. Для визначення морфологічних та культуральних властивостей ізоляти штамів біфідобактерій (1-2 колонії, відібрані за допомогою бактеріологічної петлі), суспендують у стерильному фізіологічному 0,9 %-розчині натрію хлориду або в дистильованій воді, готують мазки, фарбують за Грамом і досліджують клітини молочнокислих бактерій бактеріоскопічно. Після бактеріоскопічного підтвердження роблять висів на селективне біфідумсередовище, напіврідке середовище Блаурока та селективне тверде середовище МРС-5. Культивування здійснюють в анаеробних умовах з використанням газпакетів. Вивчають ріст культур при температурі інкубації 37,41°С та роблять опис колоній за їх зовнішнім виглядом. Біфідобактерії, виділені із комерційних пробіотичних препаратів, та вивчені за морфологічними і культуральними ознаками, ідентифікують до виду 4 за біохімічними властивостями. Біохімічні властивості вивчають на рідких середовищах та планшетах "Ентеротест" для визначення ферментативної активності штамів. Ідентифікацію біфідобактерій та вивчення біохімічних властивостей здійснюють також за допомогою системи тестування АРІ 50 виробництва "Bio Merieux", Франція. Посіви анаеробно інкубують при температурі 37°С впродовж 7 діб. Облік проводять щоденно, починаючи з 24-ої години росту кожної культури, а також за зміною забарвлення середовища (з фіолетового на жовтий). Розкодування систем тестування здійснюють за допомогою програмного забезпечення. Таким чином, в результаті ідентифікації ізольованих штамів до виду, були відібрані перші біологічні матеріали для створення еталонних штамів (робочих еталонних зразків) біфідобактерій пробіотичних препаратів: - Bifidumbacterium bifidum ББ/1-7 із препарату "Біфідумбактерин", - В. infantis Л/1-3 із препарату "Лінекс". З метою валідації морфологічних та культуральних властивостей опис клітин та колоній ізолятів біфідобактерій з різних середовищ культивування досліджують щонайменше тричі. Визначення видової приналежності біфідобактерій, що входять до складу іноземних та вітчизняних пробіотичних препаратів, надає можливість в подальшому провести їх валідацію за антагоністичними властивостями, яка проявляється в здатності подавляти ріст патогенної та опортуністичної мікрофлори, продукувати антибіотичні речовини, вітаміни, органічні кислоти. Перевірку антагоністичних властивостей біфідобактерій здійснюють на чашках Петрі на твердому поживному середовищі МРС-5 методом відстроченого антагонізму по відношенню до тесткультур Esherihia coli, Klebsiella pnevmoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa (табл. 1). Таблиця 1 Антагоністична активність штамів біфідобактерій до тест-культур Зони затримки росту тест-культур № п/п 1 2 3 4 5 Тест-культури Esherihia coli 0111 Klebsiella pnevmoniae Staphylococcus aureus 049065 Enterococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa В. infantis (5) В. bifidum (1) 10,4±2,2 30,4±1,8 15,7±3,1 10,1±1,4 18,5±2,5 З даних таблиці 1 видно, що біфідобактерії характеризуються значними зонами затримки росту до патогенних тестових штамів -показники антагоністичної активності експериментальних еталонних штамів відповідають показникам виробничих штамів, що використовуються в лікувальних препаратах. З ізольованих штамів біфідобактерій, що пройшли валідацію за культурально В. bifidum (ГСЗ) 11,6±2,5 37,5±3,8 9,0±1,9 6,9±1,4 11,7±3,4 6,8±0,5 25,0±1,3 18,8±0,8 7,1±0,5 9,5±2,0 морфологічними, біохімічними та антагоністичними властивостями, створюють робочі еталонні зразки, у відповідності з якими перевіряють бактерієвмісні препарати за автентичністю, специфічною активністю, та здійснюють оцінку ефективності ростових властивостей поживних середовищ культивування молочнокислих бактерій. Еталонні зразки біфідобактерій використовують за двома умовами зберігання: 5 53337 1. Еталонні зразки штамів біфідобактерій короткотривалого зберігання - на поживних середовищах культивування під вазеліновим маслом при температурі 4-8°С протягом 2 місяців. 2. Еталонні зразки біфідобактерій довготривалого зберігання - у висушеному стані. Ліофілізовані еталонні зразки штамів біфідобактерій виготовляють із концентрованої суспензії бактеріальних клітин кожного штаму еталонного зразку за кількістю живих бактерій 1010-1011 КУО (колонієутворюючих одиниць), що змішують із захисним середовищем у співвідношенні 1:1 та ліофілізують. В якості захисного середовища використовують 10 %розчин відновленого знежиреного молока та 20 % 6 розчин сахарози, змішані у співвідношенні 4:1 за об'ємом. Ліофілізовану суміш в ампулах запаюють в полум'ї газової горілки під тиском. Ліофілізовані еталонні зразки молочнокислих бактерій випробовують за терміном зберігання при різних температурах та за різних умов протягом 17 місяців. Оцінку стабільності властивостей розроблених та стандартизованих еталонних зразків пробіотиків здійснюють за тестами: специфічна активність (вміст живих молочнокислих бактерій), контамінація сторонньою мікрофлорою, кислотоутворення, визначення рН через 6, 12 та 17 місяців від моменту виготовлення (табл. 2). Таблиця 2 Стабільність валідації властивостей еталонних зразків біфідобактерій Тест валідації Дата виготовлення Специфічна активність 2×1011 Контамінація сторонВідсутня ньою мікрофлорою Кислотоутворення 167±3°Т Визначення рН 5,2±0,4 Через 6 міс. 2×1011 Через 12 міс. 5×1010 Через 17 міс. 8×109 Відсутня Відсутня Відсутня 167±2,5°Т 5,2±0,4 144°Т 5,2±0,4 131°Т 5,2±0,4 Висновок. Еталонні зразки штамів біфідобактерій, що пройшли валідацію, можуть бути використані для контролю якості бактерієвмісних препаратів за двома способами: 1. Культуру штамів біфідобактерій, що зберігають на відповідних поживних середовищах під вазеліновим маслом при температурі 4-8°С протягом 2 місяців використовують : а) для визначення автентичності пробіотичного препарату бактеріоскопічним методом - фарбування за Грамом випробовуваного та еталонного зразку, і порівняння їх культуральноморфологічних властивостей. б) для оцінки ростових властивостей поживних середовищ культивування за методом приготування бактеріальної суспензії із культури біфідобактерій у логарифмічній фазі росту у відповідності із стандартом мутності 10 МО (міжнародних одиниць) та висіву еквіваленту 100 КУО, отриманого методом серійних розведень. 2. Бактеріальний концентрат біфідобактерій у ліофілізованому стані, що зберігають при температурі 4-8°С протягом 15 місяців використовують: а) для перевірки автентичності пробіотичного препарату: розведення ліофілізованого еталонного зразка біфідобактерій та випробовуваного препарату дистильованою водою, фарбування за Грамом і порівняння їх культуральноморфологічних властивостей. б) для визначення специфічної активності пробіотичного препарату - визначення кількості живих біфідобактерій паралельно з випробовуваним зразком пробіотичного препарату за методом серійних десятикратних розведень у пептонно фосфатно-буферному або фізіологічному розчині, та висіву на поживні середовища культивування молочнокислих бактерій. в) для оцінки ростових властивостей поживних середовищ - культивування за методом приготування бактеріальної суспензії із культури молочнокислих бактерій у логарифмічній фазі росту у відповідності із стандартом мутності 10 МО та висіву еквіваленту 100 КУО, отриманого методом серійних розведень. Використана література: 1. Евлашкина В.Ф. Специфическая активность бифидосодержащих моно- и комплексних препаратов и усовершенствование методов их контроля. Автореф. дис.на соиск. уч. ст.. к.б.н., Москва, 2009 г. 2. Качество препаратов из нормальной микрофлори кишечника человека // Сб. Научн. Тр. Ташкентського НИИВС "Медицина", 1988 - с. 7479. 3. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. - М., 1980, с.7. 4. Керівні вказівки для національних органів щодо забезпечення якості біологічних препаратів, Серія технічних доповідей ВООЗ № 822. 5. Т.М. Лясковский, В.С. Подгорский. Оценка пробиотиков, согласно рекомендациям международных организаций // Мікробіологічний журнал. 2005. - 65. - 6. - с. 104-111. 6. Г. Мойсеева, Н. Настояща, В. Задорожна "Підходи до стандартизації медичних імунобіологічних препаратів" // Вісник фармакології та фармації. - 2007 - № 10. - с. 56-60. 7 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 53337 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601