Спосіб визначення штамів ентерококів для створення еталонних зразків пробіотичних препаратів

Спосіб визначення штамів ентерококів для створення еталонних зразків, що включає виділення ентерококів із пробіотичних препаратів, їх ідентифікацію, валідацію їх властивостей - культурально-морфологічних, біохімічних, антагоністичних та інших, який відрізняється тим, що контроль автентичності та активності пробіотичних препаратів і ефективність ростових властивостей поживних середовищ культивування проводять у відповідності із виділеними та визначеними ентерококами. (19) (21) u201001090 (22) 03.02.2010 (24) 11.10.2010 (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) МОЙСЕЄВА ГАННА В'ЯЧЕСЛАВІВНА, НАСТОЯЩА НІНА ІВАНІВНА, САХНЮК ОКСАНА МИКОЛАЇВНА, КРИВОШЛИК МАРИНА ОЛЕКСАНДРІВНА (73) ДЕРЖАВНЕ ПІДПРИЄМСТВО "ЦЕНТР ІМУНОБІОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ" 3 53335 4. Валідації методу оцінки ефективності ростових властивостей поживних середовищ культивування ізолятів штамів ентерококів; 5. Визначення умов зберігання еталонних зразків ентерококів; 6. Оцінки стабільності властивостей еталонних зразків протягом 17 місяців. Перший етап визначення штамів ентерококів для створення еталонних зразків пробіотичних препаратів - це виділення штамів із бактерієвмісних препаратів: "Лінекс", "Біфі-форм" та "Вагілак". Бактерієвмісні препарати розчиняють в пептоннофосфатному буфері, потім за методом серійних десятикратних розведень роблять висіви на селективні поживні середовища із розведень 106 чи 108 (в залежності від активності препарату, що досліджувався): для виділення ентерококів використовують тверде поживне селективне середовище М17. Інкубацію здійснюють при температурі 37 °С протягом 48-72 год. Далі, використовуючи набір морфологічних, культуральних і біохімічних, а якщо необхідно, і інших тестів, проводять видову ідентифікацію ізольованих культур. Для визначення морфологічних та культуральних властивостей ізоляти штамів (1-2 колонії відібрані за допомогою бактеріологічної петлі), суспендують у стерильному фізіологічному 0,9 % розчині натрію хлориду або в дистильованій воді, готують мазки, фарбують за Грамом і досліджують клітини молочнокислих бактерій бактеріоскопічно. Після бактеріоскопічного підтвердження роблять висів на селективне тверде середовище М-17. Вивчають ріст культур при температурі інкубації 15, 20, 37, 41 °С та роблять опис колоній за їх зовнішнім виглядом. Ентеробактерії, виділені із комерційних пробіотичних препаратів, та вивчені за морфологічними і культуральними ознаками, ідентифікують до виду за біохімічними властивостями. Біохімічні власти 4 вості вивчають на рідких середовищах та планшетах "Ентеротест" для визначення ферментативної активності штамів. Ідентифікацію ентерококів та вивчення біохімічних властивостей здійснюють також за системою тестування АРІ 20 STREP API GP MEDIUM, API ZIM. Посіви анаеробно інкубують при температурі 37 °С впродовж 7 діб. Облік проводять щоденно, починаючи з 24-ої години росту кожної культури, а також за зміною забарвлення середовища (з фіолетового на жовтий). Розкодування систем тестування здійснюють за допомогою програмного забезпечення. Таким чином, в результаті ідентифікації ізольованих штамів ентерококів до виду, були відібрані перші біологічні матеріали для створення еталонних штамів (робочих еталонних зразків) ентерококів пробіотичних препаратів: - E. faecium Л/1-3 із препарату "Лінекс", - Е. faecium Л/4-5 із препарату "Вагілак", - E. faecium Л/1-3 із препарату "Біфіформ". З метою валідації морфологічних та культуральних властивостей опис клітин та колоній ізолятів ентерококів з різних середовищ культивування досліджують щонайменше тричі. Визначення видової приналежності ентерококів, що входять до складу іноземних та вітчизняних пробіотичних препаратів, надає можливість в подальшому провести їх валідацію за антагоністичними властивостями, яка проявляється в здатності подавляти ріст патогенної та опортуністичної мікрофлори, продукувати антибіотичні речовини, вітаміни, органічні кислоти. Перевірку антагоністичних властивостей ентерококів здійснюють на чашках Петрі на твердих поживних середовищах MRS та М-17 методом відстроченого антагонізму по відношенню до тесткультур Esherihia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pnevmoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa (табл. 1). Таблиця 1 Антагоністична активність штамів ентерококів до еталонних штамів Зони затримки росту тест-культур № п/п 1 2 3 4 5 Тест-культури Esherihia coli 0111 Klebsiella pnevmoniae Staphylococcus aureus 049065 Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgaris 160209 E.faecium, еталонний зразок "Вагілак" 8,4±2,5 10,4±1,0 17,7±2,1 11,4±l,0 15,5±1,5 З даних таблиці 1 видно, що ентерококи характеризуються значними зонами затримки росту до патогенних тестових штамів - показники антагоністичної активності експериментальних еталонних штамів відповідають показникам виробничих штамів, що використовуються в лікувальних препаратах. E.faecium, E.faecium, ета- E.faecium, етавиробничий лонний зразок лонний зразок штам "Мікро"Біфі-форм" "Лінекс" ген", РФ, Уфа 7,2±1,5 9,0±1,2 16,4±1,1 12,4±1,5 16,5±1,3 9,7±2,5 10,9±1,5 19,7±1,7 12,4±1,5 14,5±1,0 9,6±1,5 10,5±1,0 17.9,0±1,9 11,9±1,0 14,7±1,4 З ізольованих штамів ентерококів, що пройшли валідацію за культурально-морфологічними, біохімічними та антагоністичними властивостями, створюють робочі еталонні зразки, у відповідності з якими перевіряють бактерієвмісні препарати за автентичністю, специфічною активністю, та здійснюють оцінку ефективності ростових властивостей 5 поживних середовищ культивування молочнокислих бактерій. Еталонні зразки ентерококів використовують за двома умовами зберігання : 1. Еталонні зразки штамів ентерококів короткотривалого зберігання - на поживних середовищах культивування під вазеліновим маслом при температурі 4-8 °С протягом 2 місяців. 2. Еталонні зразки ентерококів довготривалого зберігання - у висушеному стані. Ліофілізовані еталонні зразки штамів ентерококів виготовляють із концентрованої суспензії бактеріальних клітин кожного штаму еталонного зразку за кількістю живих бактерій 107-108 КУО (колонієутворюючих одиниць), що змішують із захисним середовищем у співвідношенні 1:1 та ліофілізують. В якості захис 53335 6 ного середовища використовують 10 %- розчин відновленого знежиреного молока та 20 %- розчин сахарози, змішані у співвідношенні 4:1 за об'ємом. Ліофілізовану суміш в ампулах запаюють в полум'ї газової горілки під тиском. Ліофілізовані еталонні зразки молочнокислих бактерій випробовують за терміном зберігання при різних температурах та за різних умов протягом 17 місяців. Оцінку стабільності властивостей розроблених та стандартизованих еталонних зразків пробіотиків здійснюють за тестами: специфічна активність (вміст живих молочнокислих бактерій), контамінація сторонньою мікрофлорою, кислотоутворення, визначення рН через 6, 12 та 17 місяців від моменту виготовлення (табл. 2). Таблиця 2 Стабільність валідації властивостей еталонних зразків ентеробактерій Тест валідації Дата виготовлення Специфічна активність 5 109 Контамінація сторонньою Відсутня мікрофлорою Кислотоутворення 157±2,0 °Т Визначення рН 5,6±0,3 Висновок Еталонні зразки штамів ентерококів, що пройшли валідацію, можуть бути використані для контролю якості бактерієвмісних препаратів за двома способами: 1. Культуру штамів ентерококів, що зберігають на відповідних поживних середовищах під вазеліновим маслом при температурі 4-8 °С протягом 2 місяців використовують : а) для визначення автентичності пробіотичного препарату бактеріоскопічним методом - фарбування за Грамом випробовуваного та еталонного зразку, і порівняння їх культуральноморфологічних властивостей. б) для оцінки ростових властивостей поживних середовищ культивування за методом приготування бактеріальної суспензії із культури ентерококів у логарифмічній фазі росту у відповідності із стандартом мутності 10 МО (міжнародних одиниць) та висіву еквіваленту 100 КУО, отриманого методом серійних розведень. 2. Бактеріальний концентрат ентерококів у ліофілізованому стані, що зберігають при температурі 4-8 °С протягом 15 місяців використовують: а) для перевірки автентичності пробіотичного препарату: розведення ліофілізованого еталонного зразка ентерококів та випробовуваного препарату дистильованою водою, фарбування за Грамом і порівняння їх культурально-морфологічних властивостей. б) для визначення специфічної активності пробіотичного препарату - визначення кількості живих ентерококів паралельно з випробовуваним зразком пробіотичного препарату за методом серійних десятикратних розведень у пептонно Через 6 міс. 5 109 Відсутня Через 12 міс. 3,7 108 Відсутня Через 17 міс. 1 108 Відсутня 154±2,0 °Т 5,6±0,3 143 °Т±1,5 °Т 5,6±0,3 137 °Т±1,5 °Т 5,6±0,3 фосфатно-буферному або фізіологічному розчині, та висіву на поживні середовища культивування молочнокислих бактерій. в) для оцінки ростових властивостей поживних середовищ - культивування за методом приготування бактеріальної суспензії із культури молочнокислих бактерій у логарифмічній фазі росту у відповідності із стандартом мутності 10 МО та висіву еквіваленту 100 КУО, отриманого методом серійних розведень. Джерела інформації: 1. Евлашкина В. Ф. Специфическая активность бифидосодержащих моно - и комплексних препаратов и усовершенствование методов их контроля. Автореф. диена соиск. уч. ст.. к.б.н., Москва 2009 г. 2. Качество препаратов из нормальной микрофлори кишечника человека // Сб. Научн. Тр. Ташкентського НИИВС "Медицина", 1988 - С. 7479. 3. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. - М., 1980, с. 7. 4. Керівні вказівки для національних органів щодо забезпечення якості біологічних препаратів, Серія технічних доповідей ВООЗ № 822. 5. Т. М. Лясковский, В. С. Подгорский. Оценка пробиотиков, согласно рекомендациям международных организаций // Мікробіологічний журнал. 2005. - 65. - 6. - С. 104-111. 6. Г. Мойсеева, Н. Настояща, В. Задорожна "Підходи до стандартизації медичних імунобіологічних препаратів," // Вісник фармакології та фармації. – 2007 - № 10. - С. 56-60. 7 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков 53335 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601