Спосіб визначення штамів лактобактерій для створення еталонних зразків пробіотичних препаратів

Спосіб визначення штамів лактобактерій для створення еталонних зразків, що включає виділення лактобактерій із пробіотичних препаратів, їх ідентифікацію, валідацію їх властивостей - культурально-морфологічних, біохімічних, антагоністичних та інших, який відрізняється тим, що контроль автентичності та активності пробіотичних препаратів і ефективності ростових властивостей поживних середовищ культивування проводять у відповідності із виділеними та визначеними лактобактеріями. (19) (21) u201001091 (22) 03.02.2010 (24) 11.10.2010 (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) МОЙСЕЄВА ГАННА В'ЯЧЕСЛАВІВНА, НАСТОЯЩА НІНА ІВАНІВНА, КРИВОШЛИК МАРИНА ОЛЕКСАНДРІВНА, САХНЮК ОКСАНА МИКОЛАЇВНА (73) ДЕРЖАВНЕ ПІДПРИЄМСТВО "ЦЕНТР ІМУНОБІОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ" 3 53336 4. Валідації методу оцінки ефективності ростових властивостей поживних середовищ культивування ізолятів штамів лактобактерій; 5. Визначення умов зберігання еталонних зразків лактобактерій; 6. Оцінки стабільності властивостей еталонних зразків протягом 17 місяців. Перший етап визначення штамів лактобактерій для створення еталонних зразків пробіотичних препаратів - це виділення штамів із бактерієвмісних препаратів: "Лінекс", "Йогурт Розель" та "Лактобактерин". Бактерієвмісні препарати розчиняють в пептонно-фосфатному буфері, потім за методом серійних десятикратних розведень роблять висіви на селективні поживні середовища із розведень 106 чи 108 (в залежності від активності препарату, що досліджувався): для виділення лактобактерій використовують тверде поживне середовище МРС (або середовище МРС-4). Інкубацію здійснюють при температурі 37°С протягом 48-72год. Далі, використовуючи набір морфологічних, культуральних і біохімічних, а якщо необхідно, і інших тестів, проводять видову ідентифікацію ізольованих культур. Для визначення морфологічних та культуральних властивостей ізоляти штамів лактобактерій (1-2 колонії, відібрані за допомогою бактеріологічної петлі), суспендують у стерильному фізіологічному 0,9% розчині натрію хлориду або в дистильованій воді, готують мазки, фарбують за Грамом і досліджують клітини молочнокислих бактерій бактеріоскопічно. Після бактеріоскопічного підтвердження роблять висів на лактобакагар, МРС-1 (рідке середовище), МРС-4 (тверде середовище) та MRS. Культивування здійснюють в анаеробних умовах з використанням газ-пакетів. Вивчають ріст культур при температурі інкубації 15, 37, 41°С та роблять опис колоній за їх зовнішнім виглядом. Лактобактерії, виділені із комерційних пробіотичних препаратів, та вивчені за морфологічними і культуральними ознаками, ідентифікують до виду за біохімічними властивостями. Біохімічні власти 4 вості вивчають на рідких середовищах та планшетах "Ентеротест" для визначення ферментативної активності штамів. Ідентифікацію лактобактерій та вивчення біохімічних властивостей здійснюють також за допомогою системи тестування АРІ 50 виробництва "Віо Merieux", Франція. Посіви анаеробне інкубують при температурі 37°С впродовж 7 діб. Облік проводять щоденно, починаючи з 24-ої години росту кожної культури, а також за зміною забарвлення середовища (з фіолетового на жовтий). Розкодування систем тестування здійснюють за допомогою програмного забезпечення. Таким чином, в результаті ідентифікації ізольованих штамів до виду, були відібрані перші біологічні матеріали для створення еталонних штамів (робочих еталонних зразків) лактообактерій пробіотичних препаратів: L.acidophilus Л/1-12 із препарату "Лінекс", L.plantarum ЛН/1-3 із препарату "Лактобактерин", L.rhamnosus ЙР/1-2 із препарату "Йогурт Розель". З метою валідації морфологічних та культуральних властивостей опис клітин та колоній ізолятів лактобактерій з різних середовищ культивування досліджують щонайменше тричі. Визначення видової приналежності лактобактерій, що входять до складу іноземних та вітчизняних пробіотичних препаратів надає можливість в подальшому провести їх валідацію за антагоністичними властивостями, яка проявляється в здатності подавляти ріст патогенної та опортуністичної мікрофлори, продукувати антибіотичні речовини, вітаміни, органічні кислоти. Перевірку антагоністичних властивостей лактобактерій здійснюють на чашках Петрі на твердому поживному середовищі МРС-5 методом відстроченого антагонізму по відношенню до тесткультур Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Shigella disenterie, Klebsiella pnevmoniae, Shigella sonei, Shigella flexneri, Proteus vulgaris, Esherihia coli, Enterobacter aerogenes (табл.1). Таблиця 1 Антагоністична активність штамів лактобактерій до еталонних штамів № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Тест-культури Salmonella enteritidis Staphylococcus aureus 049065 Klebsiella pnevmoniae Shigella disenterie 1362 Shigella disenterie 1 Shigella sonei 233169 Shigella flexneri la №8516 Proteus vulgaris 160209 Esherihia coli 240533 Esherihia coli 0111 Enter obacter aerogenes 418 Зони затримки росту тест-культур L.acidophilus L.plantarum L.ramnosus 15±1 27±1 29±1 20±1 24±1 25±1 11±1 19±1 20±1 20±1 12±1 23±1 21±1 16±1 22±1 22±1 25±1 28±1 29±1 17±1 25±1 27±1 18±1 19±1 19±1 14±1 23±1 25±1 5 53336 З даних таблиці 1 видно, що лактобактерії характеризуються значними зонами затримки росту до патогенних тестових штамів - показники антагоністичної активності експериментальних еталонних штамів відповідають показникам виробничих штамів, що використовуються в лікувальних препаратах. З ізольованих штамів лактобактерій, що пройшли валідацію за культурально-морфологічними, біохімічними та антагоністичними властивостями, створюють робочі еталонні зразки, у відповідності з якими перевіряють бактерієвмісні препарати за автентичністю, специфічною активністю та здійснюють оцінку ефективності ростових властивостей поживних середовищ культивування молочнокислих бактерій. Еталонні зразки лактобактерій використовують за двома умовами зберігання: 1. Еталонні зразки штамів лактобактерій короткотривалого зберігання - на поживних середовищах культивування під вазеліновим маслом при температурі 4-8°С протягом 2 місяців. 2. Еталонні зразки лактобактерій довготривалого зберігання - у висушеному стані. Ліофілізова 6 ні еталонні зразки штамів лактобактерій виготовляють із концентрованої суспензії бактеріальних клітин кожного штаму еталонного зразку за кількіс10 11 тю живих бактерій 10 -10 КУО (колонієутворюючих одиниць), що змішують із захисним середовищем у співвідношенні 1:1 та ліофілізують. В якості захисного середовища використовують 10%розчин відновленого знежиреного молока та 20%розчин сахарози, змішані у співвідношенні 4:1 за об'ємом. Ліофілізовану суміш в ампулах запаюють в полум'ї газової горілки під тиском. Ліофілізовані еталонні зразки молочнокислих бактерій випробовують за терміном зберігання при різних температурах та за різних умов протягом 17 місяців. Оцінку стабільності властивостей розроблених та стандартизованих еталонних зразків пробіотиків здійснюють за тестами: специфічна активність (вміст живих молочнокислих бактерій), контамінація сторонньою мікрофлорою, кислотоутворення, визначення рН через 6, 12 та 17 місяців від моменту виготовлення (табл.2). Таблиця 2 Стабільність валідації властивостей еталонних зразків лактобактерій Тест валідації Специфічна активність Контамінація сторонньою мікрофлорою Кислотоутворення Визначення рН Дата виготовлення 11 3×10 Через 6міс. 11 3×10 Через 12міс. 10 6,7×10 Через 17міс. 9 1×10 Відсутня Відсутня Відсутня Відсутня 257±3°Т 4,6±0,2 257±2,5°Т 4,6±0,2 245°Т 4,6±0,2 234°Т 4,6±0,2 Висновок Еталонні зразки штамів лактобактерій, що пройшли валідацію, можуть бути використані для контролю якості бактерієвмісних препаратів за двома способами: 1. Культуру штамів лактобактерій, що зберігають на відповідних поживних середовищах під вазеліновим маслом при температурі 4-8°С протягом 2 місяців використовують: а) для визначення автентичності пробіотичного препарату бактеріоскопічним методом - фарбування за Грамом випробовуваного та еталонного зразку, і порівняння їх культуральноморфологічних властивостей. б) для оцінки ростових властивостей поживних середовищ культивування за методом приготування бактеріальної суспензії із культури лактобактерій у логарифмічній фазі росту у відповідності із стандартом мутності 10 МО (міжнародних одиниць) та висіву еквіваленту 100 КУО, отриманого методом серійних розведень. 2. Бактеріальний концентрат лактобактерій у ліофілізованому стані, що зберігають при температурі 4-8°С протягом 15 місяців використовують: а) для перевірки автентичності пробіотичного препарату: розведення ліофілізованого еталонного зразка лактобактерій та випробовуваного препарату дистильованою водою, фарбування за Грамом і порівняння їх культуральноморфологічних властивостей. б) для визначення специфічної активності пробіотичного препарату -визначення кількості живих лактобактерій паралельно з випробовуваним зразком пробіотичного препарату за методом серійних десятикратних розведень у пептоннофосфатно-буферному або фізіологічному розчині, та висіву на поживні середовища культивування молочнокислих бактерій. в) для оцінки ростових властивостей поживних середовищ - культивування за методом приготування бактеріальної суспензії із культури молочнокислих бактерій у логарифмічній фазі росту у відповідності із стандартом мутності 10 МО та висіву еквіваленту 100 КУО, отриманого методом серійних розведень. Джерела інформації: 1. Евлашкина В.Ф. Специфическая активность бифидосодержащих моно- и комплексних препаратов и усовершенствование методов их контроля. Автореф. дис.на соиск. уч. ст. к.б.н., Москва, 2009г. 2. Качество препаратов из нормальной микрофлори кишечника человека // Сб. Научн. Тр. Ташкентського НИИВС "Медицина", 1988 - С.7479. 7 53336 3. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. - М., 1980, с.7. 4. Керівні вказівки для національних органів щодо забезпечення якості біологічних препаратів, Серія технічних доповідей ВООЗ №822. 5. Т.М. Лясковский, В.С. Подгорский. Оценка пробиотиков, согласно рекомендациям междуна Комп’ютерна верстка А. Рябко 8 родных организаций // Мікробіологічний журнал. 2005. - 65. - 6. - С.104-111. 6. Г. Мойсеева, Н. Настояща, В. Задорожна "Підходи до стандартизації медичних імунобіологічних препаратів" // Вісник фармакології та фармації. - 2007 - №10. - С.56-60. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601