Сукцинат біс-(етилового ефіру)-п-амінометилбензойної кислоти, який має противірусну активність по відношенню до вірусів грипу, вісповакцини, імунодефіциту та герпесу, а також антитоксоплазменну дію

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к сукцинату бис-(этилового эфира 4аминометилбензойной кислоты) формулы: обладающему противовирусным и антитоксоплазменным действием, что предполагает его применение в медицинской практике. Заявляемое соединение в литературе не описано. Наиболее близким по структуре и биологической активности является глутамат гидразина амбена (Заявка Ns 4427547/04, положительное решение от 02.11.83). В качестве базовых объектов сравнения взяты: противовирусный препарат ремантадин, который обладает противовирусной активностью только в отношении вирусов гриппа серотипа А; в отношении вирусов осповакцины (ВОВ) и иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-1)- азидотимидин; в отношении вирусов герпеса простого I типа (ВПГ-1) - Е-аминокапроновая кислота; при исследовании антитоксоплазменного действия - пириметамин. Задача изобретения - выявление нового соединения в ряду производных 4-аминоме-тилбензойной кислоты, обладающего комплексным - противовирусным и анти-токсоллазменным действием. Поставленная задача достигается синтезом нового соединения I, обладающего противовирусным и антитоксоплазменным действием, которое получают взаимодействиєм этилового эфира 4аминометилбензойной кислоты с янтарной кислотой в водной среде. Пример 1. Получение сукцината бис-(этилового эфира амбена). Смесь из 5,37 г (0,003 моль) этилового эфира амбена, 1,77 г (0,015 моль) янтарной кислоты и 20 мл воды кипятят 15 мин. К горячей реакционной.массе добавляют 5 г активированного угля марки ОУ-А; раствор фильтруют горячим, охлаждают льдом и выпавший осадок отфильтровывают. Получают 6,7 г (93,8%) белого кристаллического соединения I с температурой плавления 175-177°С. Найдено, %: С 60,25; Η 6,77; N 5,74. C24H32N2 O8. Вычислено, %: С 60,50; Η 6,72; N 5,88. Пример 2. Противовирусная активность в отношении вируса гриппа серотипа А. Исследование проведено на эталонном штамме вируса гриппа А (Гонконг/1/68 (Η3Ν2), который вызвал пандемию гриппа в 1968-1969 гг. и является родоначальником штаммов с антигенной формулой Η3Ν2, актуальных и в настоящее время. При определении у препарата противовирусного действия его в стерильных условия х растворяли в поддерживающей среде состава: NaCI - 8,0 г; КСl - 0,6 f; СаСl2 - 0,8 г; МgСІ2 - 0,05 г; глюкоза - 0,3 г; желатин 2,0 г; левомицетин -0,1 г; фенол-рот-25 мл 0,01%-ного раствора на 1 л дистиллированной воды. рН - 7,0 (среду стерилизуют при 115°С в течение 30 мин). [Ильенко В.И. Ме тоды испытания и оценки противовирусной активности химических соединений в отношении вируса гриппа. Методические рекомендации. Л., 1977, 25 с.}. На среде, содержащей соединение I (опыт) и не содержащей его (контроль) разводили аллантоис-ный вирус А (Гонконг/1/68 (H3N2) до концентрации вируса порядка 100 ЭИД50/мл и 10 контрольных и 10 опытных проб инкубировали 24 часа при 36°С с фрагментами хорионаллантоисных оболочек (ХАО) 12-14-дневных куриных эмбрионов. Затем культуральную жидкость из опытных и отдельно контрольных проб объединяли и концентрацию инфекционного вируса в них определяли титрованием десятикратных разведений на новой культуре ХАО [Лозицкий В.П. Некоторые методические подходы при изучении противогриппозных свойств ингибиторов протеолиза. Методические проблемы химиотерапии вирусных инфекций. Минск, 1980, с. 120125]. Концентрацию инфекционного вируса рассчитывали методом Кербера в модификации И.П.Ашмарина и выражали в ТИД50 [Ашмарин И.П., Воробьев А.А. С татистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962, 5 40 с]. Поскольку во все х экспериментах каждому опыту соответствовал свой контроль, т.е. имел место случай связанных выборок, то о статистической достоверности воздействия судили по непараметрическому критерию знаков (КЗ) [Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Л., 1973, 132 с], что диктовало необходимость проведения не менее 5 опытов в серии. Одновременно исследовали прямое вирулицидное воздействие препарата на внеклеточный вирус и и х влияние на чувствительность культуры к заражению после предварительной в течение 1 сут обработки ее с удалением препарата перед инфицированием клеток. Результаты изучения противовирусного действия соединения I на вирус гриппа серотипа А представлены в табл. 1. Как следует из табл. 1, заявляемое соединение проявляет выраженную антивирусную активность в отношении вируса гриппа А в концентрации 1,25 мг/мл при репродукции вируса в его присутствии. При предварительной обработке ткани препаратом, а также изучении вирулицидного его действия в указанной выше концентрации, статистически достоверного действия не обнаружено. Следовательно, противовирусная активность соединения 1 связана с непосредственным его вмешательством в процесс вирусной репродукции. В меньшей дозе противовирусное действие соединения I в отношении вируса гриппа А не проявлялось. Глутамат гидразида амбена, выбранный в качестве референс-препарата, поскольку он близок по структуре и также обладает противовирусным действием, тормозит репродукцию вируса гриппа А в дозе не менее 3 мг/мл (Заявка №4427547/04), т.е. в 2,4 раза большей, чем соединение I. Однако известный противогриппозный препарат ремантадин проявляет антивирусное действие в культуре ткани в отношении вирусов гриппа серотипа А при его концентрации 25-30 мкг/мл [Индулен М.К., Калниня В.А,, Рязанцева Г.М., Бубович В,И. Механизмы антивирусного действия производных адамантана. Рига, 1981, 168 с]. Таким образом, соединение І в отношении вирусов гриппа серотипа А проявляет в 2,4 раза более выраженное антивирусное действие, чем глутамат гидразина амбена, но менее выраженное, чем ремантадин. Пример 3. Противовирусная активность сукцината бис-(этилового эфира амбена) в отношении вируса гриппа серотипа В. Исследование проведено на штамме В/Ленинград/17/86, выделенном в г.Ленинграде в 1986 г. При определении антивирусного действия соединения I, его предварительно растворяли в спецсреде описанного в примере 2 состава. Затем определяли снижение инфекционной активности вируса В при титровании ее на фрагментах ХАО, в присутствии соединения I (опыт) по сравнению с инфекционной активностью вируса, определенной в отсутствие соединения I (контроль) [Лозицкий В.П., Дегтяренко В.И., Поляк Р.Я. Подавляющее действие Е-аминокапроновой кислоты (ингибитора протеаз) на репродукцию вирусов гриппа в тканевых системах/. Вирусные ингибиторы и механизмы их действия. Рига, 1977, с. 150-154]. Одновременно исследовали вирулицидное действие соединения I на внеклеточный вирус и их влияние на чувствительность культуры к заражению после предварительной в течение 1 сут обработки ее с удалением препарата перед инфицированием клеток. Инкубация вируса гриппа В при заражении им фрагментов ХАО во все х вариантах опытов продолжалась 72 часа при 34°С. Расчет ТИДбо и статистическая обработка проводились, как в примере 1. Результаты изучения противовирусного действия соединения I на вирус гриппа серотипа В представлены в табл. 2. Как следует из табл. 2, соединение I проявляет антивирусную активность в отношении вируса гриппа В даже в более низкой концентрации, чем в отношении вируса гриппа А, а именно - 0,5 мг/мл. Поскольку препарат в этой же концентрации оказывает вирулицидное действие и не выявляет регулярно противовирусного действия при предварительной обработке им ткани, можно предположить, что репродукция вируса гриппа В соединение I тормозит за счет его вирулицидного действия. В меньших концентрациях антивирусной активности соединение I не проявляет. Референс-препарат - глутамат гидразида амбена проявляет противовирусное действие в отношении гриппа В дозе 3 мг/мл, т.е. в 6 раз большей, чем эффективная концентрация испытуемого соединения I. Известный противогриппозный препарат ремантадин проявляет антивирусное действие только в отношении штаммов вируса гриппа серотипа А, но не В [Индулен М.К., Калниня В.А., Рязанцева Г.М., Бубович В.М. Ме ханизмы антивирусного действия производных адамантана. Рига, 1981, 168 с]. Таким образом, соединение І в отношении вирусов гриппа серотипа В, в отличие от ремантадина, проявляет антивирусное действие, причем оно является более выраженным, чем у глатамата гидразина амбена. Пример 4. Противовирусное действие сукцината бис-(этилового эфира амбена) в отношении вирусов осповакцины (ВОВ). При изучении противовирусной активности соединений І в отношении ВОВ (серый клон) использовали тканевую культуру первично-трипсинизированных эмбрионов кур (ФЭК) производства отдела культур клеток БелНИИЭМ, выращенную на 5% гемогидролизате по стандартной методике [Вотяков В.И., Бореко Е.И., Владыко Г.В. и др. Первичное изучение антивирусных свойств синтетических и природных соединений. Методические рекомендации. Минск, 1986, с.1-25]. Культуры ФЭК, выращенные на чашках Петри и дне пенициллиновых флаконов, отмывали от ростовой среды, наносили 0,00002 БОЕ/клетка вируса. После часового контакта вируссодержащую жидкость удаляли. и наносили покрытие на основе среды 199 включающее 1% бактагара, 0,005% нейтрального красного, антибиотики. Для культур, выращенных на дне пенициллиновых флаконов, в состав покрытия добавлялисоединение I с тем, чтобы конечная концентрация его составила 3-100 мкг/мл (метод редукции бляшек). После затвердения покрытия на чашках Петри устанавливали мерные (0,05 мл) отрезки трубки, заполненные раствором (5 мг/мл соединения I) ("скринингтест"). После 48-часовой инкубации культур сосчитывали количество бляшек (при исследовании методом редукции бляшек) или измеряли зоны токсичности и подавления образования бляшек (при исследовании методом "скрининг-тест"). Токсические свойства заявляемого соединения определяли по наличию цитопатического действия на культуре ФЭК, инкубированных в присутствии различных концентраций. Максимально переносимой концентрацией (МПК) считали наивысшую дозу соединения, не вызывающую изменений клеточной морфологии. Критерием антивирусного действия служили наличие и величина зоны подавления образования бляшек, снижение титра вируса в присутствии соединений различных концентраций. Минимальной активной концентрацией (МАК) считали дозу, в присутствии которой снижение инфекционного титра вируса соответствовало 1,25 Ig БОЕ/мл. Хи-миотерапевтический индекс (ХТИ) высчитывали как отношение МПК/МАК. В качестве референс-препарата в системе ин витро на моделях ВОВ и ВИЧ-1 использовали азидотимидин (АЗТ), противовирусное действие которого проявляется в концентрации 800 мкг/мл. В результате проведенных исследований установлено, что МПК заявляемого соединения для культур ФЭК и Нд составляет 100 мкг/мл. Соединение І в дозе, соответствующей МПК, и трех последующи х ингибировало размножение вируса осповакцины со снижением инфекционного титра по сравнению с контролем на величину, равную 1,53 Ід БОЕ/мл. В дозе 6 мкг/мл отмечено снижение титра вируса, равное 1,05 Ig БОЕ/мл. Химиотерапевтический индекс составил 8 (см. табл. 3). Согласно принятой схеме оценки [Вотяков В.И. Актуальные задачи в научной разработке соединений с антивирусными свойствами. Молекулярная биология вирусов, химиотерапия и химиопрофилактика вирусных инфекций. Минск, 1974, с. 10-20], активность заявляемого соединения следует считать высокой. Пример 5. Противовирусное действие сукцината бис-{этилового эфира амбена) в отношении иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-1). Определение активности соединения І в отношении ВИЧ-1 проводили в хронических инфицированных клетках Н 9 с помощью непрямого метода флюоресцирующих антител как описано на модели ретровируса лейкоза крупного рогатого скота [Коломиец А.Г., Хлюстов СВ., Коломиец Н.Д. и др. К вопросу скрининга антивирусных ве ществ на модели ретровирусов. Методические проблемы экспериментальной химиотерапии вирусных инфекций. Минск, 1980, с.62-66]. Критерием антивирусного действия соединения служило снижение числа вируспродуцирующих клеток в опытных и контрольных пробах. В результате проведенных исследований установлено, что через 48 часов после внесения в культуру клеток Н9 соединение I в концентрации 25-100 мкг/мл ингибирует репродукцию ВМЧ-1 (штамм 111 в) в клетках на 50-70% (см. табл. 4). АЗТ в концентрации 25-100 мкг/мл -ингибирует репродукцию ВИЧ-1 на 80-100%. Таким образом, соединение І в отношении ВИЧ-1 проявляет менее выраженное антивирусное действие, чем азидотимидин. Пример 6. Противовирусное действие сукцината бис-(этилового эфира амбена) в отношении вирусов герпеса простого I типа (ВЛГ-1). Изучение противовирусной активности заявляемого соединения в отношении ВПГ-1 проведено на модели герпетического кератоконъюнктивита кроликов. Заражение производили на скарифицированную роговицу как описано в работе [Коломиец А.Г., Чекина А.Ю., Коломиец Н.Д. и др. Изучение эффективности применения ингибиторов протео-лиза и специфического иммуноглобулина при экспериментальном офтальмогерпесе. Антивир усные вещества. Минск, 1984, с.48-49], использовали штамм С 1 ВПГ. В каждой группе было по 20 кроликов. В качестве ре-ференс-препарата использовали 5%-ный раствор Е-аминокапроновой кислоты (ЕАКК). Препарат вводили в виде инстилля-ций в течение 7-10 дней (6 раз в сутки). Соединение I использовали в виде 1%-ного раствора. Лечение начинали через 72 часа после заражения. Анализ результатов, полученных при сравнении соединения I и ЕАКК, показал более высокую терапевтическую эффективность первого при лечении кератоконъюнктивита. У животных, получивши х соединение I отмечено более доброкачественное течение заболевания и выздоровление наступало значительно раньше, чем при использовании ЕАКК (см. табл. 5). Более высокая терапевтическая эффективность и антивирусная активность соединение I подтверждается тем, что к 30 дню наблюдения из 20 кроликов, получавших соединение I, от герпетического менингоэнцефалита пал лишь один кролик, тогда как в контрольной группе - 8, а в гр уппе получавшей ЕАКК - 5 кроликов. Пример 7. Антитоксоплазменное действие сукцината бис-(этилового эфира амбена). Исследование проведено в эксперименте на мышах, инфицированных токсоплазмами штамма T.gondd RH. При определении у соединения I анти-токсоплазменного действия перитонеальный мышиный эксудат, содержащий токсоплазмы, разводили стерильным физиологическим раствором до концентрации 10 млн/мл, которую определяли при помощи' камеры Горяева. Порошок препарата растворяли в приготовленной взвеси токсоплазмы из расчета 5, 50, 100 или 150 мг/кг массы животных опытных групп. Белых беспородных мышей заражали внутрибрюшинно по 0,2 мл взвеси. Через 4 дня после заражения мышей выводили из опыта глубоким эфирным наркозом, а затем в стерильных условиях собирали перитонеальный эксудат, содержащий токсоплазмы. Эффективность эксперимента определяли с учетом объема перитонеального эксудата, концентрации токсоплазм в нем. Статистическую достоверность отличий определяли по непараметрическому критерию знаков[Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Л., 1973, 332 с]. Наряду с антитоксоплазменным действием мышей наблюдали на предмет токсического воздействия препарата по внешним проявлениям - вздыбленность шерсти, дрожание, поносы, а также падежу в группах животных. С каждой дозой препарата было проведено по 5 опытов, средние результаты которых приведены в табл. 6. Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о значительном подавлении репродукции токсоплазм в особенности при использовании препарата в дозе 50 мг/кг массы, однако уменьшение дозы до 5 мг/кг не оказывало существенного влияния на размножение токсоплазм. Таким образом, сукцинат бис-(этилового эфира амбена) обладает антитоксоплазменным действием, наиболее выраженным в дозе 50 мг/кг массы. Следует отметить, что токсического влияния соединения I, использованного в указанных дозах, обнаружено не было. Пример 8. Токсичность сукцината бис-(этилового эфира амбена) проверена на половозрелых белых мышах (масса 19-21 г) согласно общепринятой методике /Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов. - Киев, ВНИИГИНТОКС, 1969,160 с/. При внутримышечном введении результаты опытов показали, что заявляемое соединение і согласно ГОСТ 12.1.007-76 "Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности" относится к малотоксичным веществам. Его ЛД50 = 2820 (2710-2930) мг на 1 кг массы тела животного. При пероральном введении ЛД50 - 6240 (6100-6380) мг на 1 кг массы тела животного. Как видно из табл. 1-6, сукцинат бис-(этилового эфира амбена) обладает: противовирусной активностью не только в отношении вирусов гриппа серотипа А, но, в отличие от ремантадина, и в отношении вирусов гриппа серотипа В, причем это действие проявляется в отношении вируса гриппа В 2,4 раза, в отношении вируса гриппа В - в 6 раз меньшей дозе, чем у глутамата гидразида амбена; кроме того, заявляемое соединение в 9,7 раза менее токсично, чем ремантадин; противовирусной активностью в отношении вирусов осповакцины (ВОВ) и иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-1). Полученные данные расширяют спектр противовирусных препаратов и несмотря на то, что по своей активности в отношении ВОВ и ВИЧ-1 заявляемое соединение несколько уступает азидотимидину, оно может оказаться полезным для сочетанного использования с другими, более токсичными препаратами (что позволит снизить дозу токсичных препаратов и вероятность формирования резистентных штаммов); более выраженным лечебно-профилактическим действием в отношении герпетической.инфекции, вызванной ВПГ-1 по сравнению с референс-препаратом -e-аминокапроновой кислотой, превышая ее активность в 5 раз; уступая по антитоксоплазменному действию референс-препарату пириметамину, заявляемое соединение не вызывает, свойственных периметамину, побочных процессов: истощение организма, поносы, токсическое действие на гемопоэз, тератогенное действие на плод и др.