Спосіб здійснення хіміотерапії

Цитостатики применяют например для терапии рака. Ранний диагноз и своевременное удаление опухолей является до сих пор ключом для успешной терапии рака. Радиационная терапия используется при локально ограниченных опухолях и считается полезной как дополнительная терапия после хирургии. При диссеминированных и метастазирующих опухолях остаются только химическая и иммунологическая терапии как способ лечения. При химиотерапии наблюдались всегда тяжелые побочные действие. Так в комбинационных экспериментах назначенные цитостатики вызывают поражение почек, печени, расстройство гемопоэза и много других поражений, которые оказывают сильное влияние на общее состояние и иммунитет больных. Следует еще отметить, что почти все цитостатики обладают сильным иммунодепрессивным действием. Эти побочные действия способствуют тому, что дозировка цитостатика часто не может достигнуть достаточного уровня, или что лечение должно быть прекращено до проявления лечебного эффекта. Недостатком является еще то, что при долговременном применении цитостатика часто возможна резистентность раковых клеток. Наконец, есть такие раковые клетки, против которых все до сих пор известные цитостатики не показывают действие. Иммунотерапию продолжают в большинстве случаев с интерферонами и интерлейкинами для стимулирования клеточного иммунитета. Как правило, эти мероприятия бывают только поддер-живающими и дополнительными. Из-за их цитостатического действия применяют цитостатики для лечения автоиммунных заболеваний, напр. при ревматических заболеваниях, множественном склерозе, псориазе, причем тоже при этом необходимо учитывать все тяжелые побочные действия к поэтому дозировка даже в этих случаях часто недостаточна или лечение должно быть преждевременно прекращено. Задачей изобретения является подготовка комбинации веществ, которая обладает существенно улучшенным цитостатическим или даже цитотоксическим действием по сравнении с настоящими цитостатиками, напр. винкристин, метотрексат, цисплатин, действующими самостоятельно, чтобы осуществить более эффективную терапию, чем до сих пор, и намного смягченным побочным действием и существенным понижением существующей в настоящее время дозировки цитостатика. При комбинации активных веществ появляется возможность повышения терапевтического эффекта известных цитостатиков или вообще он становится возможен, Уже в заявке на европейский патент 85 100 179,2 показано, что по меньшей море один гистон и/или не меньше одного участка гистона обладают гормональным действием, которое можно успешно применять напр. для лечения рака. Особенно речь идет о гистонах Н1, Н2А и/или Н2В и НЗ. В заявке на патент ФРГ 37 37 274-показано прямое цитотоксическое действие гистонов Н2А/Н2В на некоторые раковые клеточные линии. Цитотоксическое действие гистона Н1 на различные раковые клеточное линии показано в USP 07/332.658 /3.04.1989/. Этот документ является CIT-заявкой USP 777.783 /10.01.1385/. Поставленная задача достигается по изобретению, характеризованному ^ формуле изобретения. Активность комбинации веществ по изобретению показана на основе приведенных экспериментов и диаграмм, которые приведены на чертежах Пользовались всегда смесью гистонов Н2А-Н2В или комплексом -Н2А: Н2В- на фиг. 1, которые получили из тимусного препарата /гомеостатический тимический гормон/ из тимуса and Testing of Hemogenous Thymic Horomone Preparations, Annals of the New York Akademy of Sciences 240, рр. 402-403; 28.02.1975/ с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. Элюцию проводили на колонке µ BondpaK С-10 с линеарным градиентом /% В/ от 20 до 80% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте при скорости потока 1 мл/мин. Оптическое поглощение измеряли при 214 nm /Abs/ На фиг. 1 приведены на абсциссе объем в миллилитрах, на левой ординате абсорбция при 214 nm и на правой ординате линеарный градиент /% В/. Соответственно возможна подготовка чистого Н2А и чистого Н2В. Осталось доказать, является ли Н2А: Н2В /рис. 1/ смесью Н2А и Н2В или соединением Н2А и Н2В /Н2А:Н2В - комплекс/ Ясно что можно использовать и другие известные методы для приготовления гистонов. Изобретение, таким образом, не ограничено на применение Н2А:Н2В, но касается также активных участков с цитостатическим или цитотоксическим действием. Хотя механизм цитостатического или цитотоксического действия гистонов или их. активных участков еще не изучен, изобретение свидетельствует, что имеет большое значение активное действие повторяющихся последовательностей аминокислот КRAA и КРVA. Первая находится напр. в С - концевом участке Н1 и последняя напр. в N - концевом участке Н2В. Злокачественные клетки культивировали в полных питательных средах /RPM11640 с 10% фетальной телячьей сывороткой/. Среда ежедневно обновлялась. После зарастания дна культивационной чашки клетки соскоблили и частично перенесли, потому что для опытов были необходимы клетки в оптимальной фазе роста. Культивация была осуществлена при 36,5 гр. С и 5,5% СО2 в термостате. Концентрация живых клеток была определена окраской нигрозином СО 2% в фосфатов буфферирозованном физиологическое растворе в счетной камере по Нойбауеру. Составные части химиотерапевтического препарата по изобретению /напр. Н2А:Н2В и известное цитостатического средство/ смешали с культивационной средой отдельно или в комбинации по изобретению и стерильно фильтрировали. Для экспериментов соскоблили малигные клетки из дна не очень густо заросших чашек, определили число живых клеток и установили на 3,5 х 10^ клеток/мл. Части этой суспензии клеток смешали с химиотерапевтическим средством по изобретению или с отдельными составными частями и инкубировали и термостате. Концентрация малигных клеток в ямке была 1,75 x 105 клеток/мл. Эксперимент 1 Активность Н2А:Н2В в комбинаций с цитостатиками цисплатин, метотрексат, и винкристин тестировали in vitro с линией линфомных клеток СН77. Рис. 2 показывает тест цитотоксичности с приведенными цитостатиками и Н2А:Н2В каждый раз в сравнении с клетками ОН77 клеточной линии лимфомы. Клетки этой линки инкубировали 48 ч. с: Cis Pi l /1 мкг/мл цисплатин/ C is Р2 /2 мкг/мл цисплатин/, МТХ1 /5 мкг/мл метотрексат/, МТX2 /10 мкг/мл метотрексат/, Vini / 5 мкг/мл винкристин/, Vin2 /10 мкг/мл винкристин/ и 250 мкг/мл H2А:Н2B. Отмечали прирост клеток и процентах. "К" обозначает контроль прироста клеток после 48 ч. /Рост клеток без добавления цитостатика или Н2А:Н2В/. Цитостатики и Н2А:Н2В оказывают лишь низкий цитотоксический эффект, или они совсем без эффекта. Фиг. 3 показывает тест цитотоксичности, причем приведенные цитостатики использовались в комбинации с Н2А:Н2В. Клетки лимфомной линии ОН77 инкубировали 48 ч. с Vini 1/Н2А:Н2В /5 мкг/мл винкристин + 100 мкг/мл Н2А:Н2В/ MTX1/Н2А:Н2В /5 мкг/мл метотрексат + 100 мкг/мл Н2А:Н2В/ Lis Pi /Н2А:H2B /1 мкг/мл цисплатин + 100 мкг/мл Н2А:Н2В/ Отмечали прирост клеток в процентах. "К" также означает контроль прироста клеток после 48 ч. без всяких добавок и для лучшего сравнения с Н2А:Н2В показано цитостатическое действие одного Н2А:Н2В в концентрации 100 мкг/мл. Комбинация Н2А:Н2В + винкристин всегда в концентрациях, в которых отдельные вещества вызывают только малозаметное цитостатическое действие /фиг. 2/, показала синергичное действие с цитотоксическим эффектом /фиг. 3/. Цитостатическое действие с комбинациями Н2А:Н2В + метотрексат или Н2А:Н2В, цисплатин улучшеного в сравнении с отдельными веществами. Это относится прежде всего к комбинации Н2А:Н2В метотрексат. Эксперимент 2 Действие Н2А:Н2В в комбинации с приведенными цитостатиками тестировали in vitro на клетках линии меланома. Рис. 4 показывает следующий тест цитотоксичности с указанными цитостатиками и Н2А:Н2В всегда в сравнении с клетками линии меланома ЕС 463. Клетки этой линии инкубировали с приведенными веществами каждый раз отдельно и отмечали прирост клеток п процентах: Lis P1 /1 мкг/мл цисплатин/ Lis P2 /2 мкг/мл цисплатин/, MTX1 /5 мкг/метотрексат/, MTX2 /10 мкг/мл метотрексат/, Vin1 /5 мкг/мл винкристин/, Vin 2 /10 мкг/мл винкристин/ и 250 мкг/мл Н2А:Н2В, "К" обозначает контроль прироста клеток после 48 ч. без всякой добавки. На фиг. 5 показан прирост клеток линии меланома ЕС463 после 48 ч. с приведенными цитостатиками в комбинации с Н2А:Н2В, инкубированными следующим образом: Vin1 /Н2А:Н2В /5 мкг/м винкристин + 100 мкг/мл Н2А:Н2В/ MТХ1/Н2А:Н2В /5 мкг/мл метотрексат + 100 мкг/мл Н2А:Н2В/ Lis P1 /Н2А:Н2В /1 мкг/мл цисплатин + 100 мкг/мл Н2А:Н2В/ "К" обозначает контроль прироста клеток после 48 ч. без всякой добавки и Н2А:Н2В предоставляет цитостатическое действие одного Н2А:Н2В в дозе 100 мкг/мл. Фиг. 5 изображает, что комбинация Н2А:Н2В + винкристин, которые как отдельные вещества действуют слабо цитостатически /фиг. 4/ не действует синергично, но лишь только суммарно. Наоборот, метотрексат и цисплатин, которые отдельно не действуют даже цитостатически /фиг. 4/, в комбинации с Н2А:Н2В всегда действуют цитотоксически /синергично, см. фиг. 5/. Эксперимент 3 Действие Н2А:Н2В и комбинации с указанными цитостатиками тестировали in vitro тоже на клеточной линии фибробластов Hufibl .Фиг. 6 показывает еще один тест цитотоксичности с цитостатиками и Н2А:Н2В каждый раз в сравнении с клеточной линией фибробластов Hufibl. Клетки этой линии инкубировали 48 ч. со следующими отдельными веществами: Lis P1 /1 мкг/мл цисплатин/ Lis P2 /2 мкг/мл цисплатин/ MTX1 /5 мкг/мл метотрексат/, MТХ2 /10 мкг/мл метотрексат/, Vini1 /5 мкг/мл винкристин/, Vini2 / 10 мкг/мл винкристин/ и 250 мкг/мл Н2А:Н2В "К" обозначает контроль прироста клеток без всякой добавки. На фиг. 7 инкубировались клетки линии фибробластов Hufibl в течение 48 ч. с указанными цитостатиками в комбинации с Н2А:Н2В следующим образом и отмечали процент прироста клеток: Vini1 /Н2А:Н2В /5 мкг/мл винкристин + 100 мкг/мл Н2А:Н2В/ MТХ1/Н2А:Н2В /5 мкг/мл метотрексат + 100 мкг/мл Н2А:Н2В/ Lis P1 /Н2А:Н2В / 1 мкг/мл цисплатин + 100 мкг/мл Н2А:Н2В/ Кроме того для сравнения инкубировали клетки линии Hufile только со 100 мкг/мл Н2А:Н2В. "К" обозначает контрольный прирост клеток без всякой добавки. Синергичное действие Н2А:Н2В с цитостатиками не обнаружено для не трансформированных человеческих фибробластов. Наблюдающееся уже цитостатическое действие химиотерапевтических средств повышено с помощью Н2А:Н2В /фиг. 6/, но не превращается в цитоток-сическое действие. Изобретение не ограничено комбинацией смеси гистонов Н2А:Н2В или их комплекса с цитостатиками. Можно предполагать, что сравнительное действие можно достичь с самим гистоном Н2А или комбинацией гистона Н2В с цитостатиками. Кроме того можно предполагать, что сравнительное действие окажут гистоны Н1 и НЗ в комбинации с цитостатиками. В конечном счете специалисту понятно, что вместо гистонов можно взять их активные участки, которые состоят по крайней мере из пяти аминокислот и оказывают цитостатические или цитотоксические действия. Изобретение в конце концов не ограничено указанными цитостатиками. Согласно изобретению сможет специалист поставить в комбинацию любые цитостатики по крайней мере с одним гистоном или активным участком гистона, чтобы по изобретению приготовить новые комбинированные химиотерапевтические средства, которые показывают вопреки пониженной дозе исполь-зуемого цитостатика усиленное цитостатическое действие, так что при усиленном цитостатическом действии побочные действия можно ослаблять, или можно предложить новые комбинированные химиотерапевтические средства, которые обладают даже синергичным действием с цитостатическим эффектом, причем тоже для этого можно уменьшить дозу цитостатика и соответственно можно ослаблять побочные действии. Лишь синергичным действием можно достигнуть активности до сих пор не действующих цитостатиков, которые отдельно не показали терапевтический эффект при лечении опухолей или автоиммунных заболеваний. Поскольку применение гистонов не вызывает побочных действий, согласно изобретению появляется возможность при комбинации с цитостатиками проводить химиотерапию с намного по-вышенной перспективой успеха за более продолжительный период лечения, причем побочные действия цитостатика можно поддерживать в приемлемых пределах. Комбинацию веществ по изобретению можно назначить таким образом, что первое и второе активное вещество назначают вместе или отдельно. Синергичное действие комбинации веществ по изобретению появится всегда в месте патогенного процесса независимо от того, отдельные вещества были применены вместе или отдельно. Хотя представленные выше эксперименты показывают только действие комбинаций веществ по изобретению против раковых клеток, особенно опухолей лимфатических желез и злокачествен-ного меланома, изобретение не ограничивается использованием в терапевтических процессах для лечения опухолей. Естественно возможно использование комбинации веществ в терапевтических процессах для лечения автоиммунных заболеваний. Фиг.1 27704 Фиг.2 Фиг.3 4 27704 Фиг.4 Фиг.5 5 27704 Фиг.6 Фиг.7 6 27704 7