Спосіб індукції імунітету шовкопрядів

Спосіб індукції імунітету шовкопрядів, що включає вирощування тутового та дубового шов 29289 4. Використання хімічних препаратів у способі становить потенціальну загрозу здоров'ю персоналу лабораторій. 5. Недостатньо високу ефективність способу. Як свідчать матеріали прототипу, рівень зараження гусениць після дії на грену композицією становить 3,6-3,8%, що, очевидно, зберігає потенціальну загрозу накопичення та розповсюдження збудника хвороби. 6. Суттєвим недоліком прототипу є і те, що він здійснюється лише за вирощування одного виду - тутового шовкопряду і неефективний для інших видів комах. В основу винаходу поставлене завдання створити принципово новий спосіб боротьби з нозематозним захворюванням (пебриною), який грунтується на виявленій нами здатності організмів фізіологічно здорових комах, попередньо штучно імуніфікованих збудником хвороби (нозематозом), набувати стійкість до збудника шляхом індукції та підсилення рівня та функцій власного, природного імунітету. Спосіб експериментально обгрунтовується з використанням лабораторних культур тутового та дубового шовкопрядів. Здійснюється запропонований спосіб індукції імунітету на цих комах таким чином. Целюлярну грену шовкопрядів, абсолютно незаражену нозематозом, ретельно промивають у водопровідній воді, просушують і далі витримують у емульсії (специфічному антигені), яка складається зі свіжої інфікованої (зараженої) нозематозом грени, попередньо ретельно розтертої у порцеляновій чашці. Емульсію розтирають до подрібнення нерозчинного у воді хітинового покриву грени з наступною фільтрацією через марлю. Після цього витримують здорову грену шовкопрядів у емульсії інфікованої грени, оброблену таким чином грену просушують і зберігають до терміну настання природної реактивації. В результаті використання запропонованого способу у популяцій тутового і дубового шовкопрядів, що зазвали такої дії, індукується постійний імунітет до збудника хвороби - нозематозу. Отже, запропоновано принципово нове технічне рішення проблеми, яке не має аналогів. Дослідження впродовж трьох (1994-1996) років проводились в Інституті захисту рослин УААН. Матеріалом для досліджень були популяції лабораторних культур тутового шовкопряду Bombyx mori L., породи білококонна-1 покращена (Б-1 пок.) та дубового шовкопряду Antheraeae pernui G.-M., породи Поліський тасар. Приклади здійснення способу Приклад 1. Імунізація грени тутового шовкопряду здійснювалась таким чином. Частину грени, три наважки по 5 г у кожній, яка була уражена нозематозом, відбирали, готували стерильний посуд - порцелянову чашку з ступкою. У чашку поміщали приготовану, уражену нозематозом грену. Кожну наважку грени розбавляли у чотирьох частинах водопровідної води, ретельно розтирали 5-7 хвилин до добре подрібненої, однорідної маси - гомогенату, вміст якого - грена шовкопряду, разом з хітиновим покривом та вмістом. Гомогенат вміщував у собі збудника хвороби - нозематоз. Після ретельного розтирання у ступці та перемішування у воді, гомогенат фільтрували. У подальшому використовували лише фільтрат. Емульсія, яку отримали таким шляхом, називалась "антиген". Це був специфічний антиген із грени тутового шовкопряду, ураженої нозематозом. Крім цього специфічного антигену, у дослідах по обгрунтуванню способу використовували неспецифічні антигени, а саме: желатин, колодій, білок курячого яйця. Крім того, використовували також специфічний антиген, який був вбитий внаслідок дії високої температури, а також суспензія від здорової грени. Наступний елемент способу: готували популяцію тутового шовкопряду, здорову, тобто незаражену нозематозом. Для цього відбирали грену від здорових самиць, яких після відкладання яєць мікроскопували, визначали наявність чи відсутність збудника нозематозу. Відбирали тільки здорові популяції. Це була неодмінна умова дослідів. Отже, схема дослідів по обгрунтуванню запропонованого способу була такою: 1. Специфічний антиген з живим збудником нозематозу, 2. Желатин, неспецифічний антиген. 3. Колодій, неспецифічний антиген. 4. Білок курячого яйця, неспецифічний антиген. 5. Специфічний антиген з вбитим збудником ноземи. 6. Гомогенат здорової грени. 7. Контроль, грена здорова, нічим не оброблена. Наступний елемент способу. Здорову грену в кількості 2500 шт., по 300 шт. в кожному варіанті, а у першому - 400 шт., занурювали у антигени, водні їх розчини на 12 хвилин. Таку операцію проводили восени. Після цього грену виймали з емульсії, розташовували тонким шаром на фільтрувальному папері і переносили в холодильник. Після процесу імунізації, як і до того, вона зберігалась при температурі +4-6)С до кінця зимівлі, до початку інкубації. Інкубація грени починалась у першій декаді травня, коли грену переносили у відгодівельне приміщення, спочатку при температурі 10-12°С, а на третій день інкубації підтримувалась оптимальна для виду температура та вологість повітря. Наступний прийом способу - штучне зараження гусениць нозематозом у першому, другому та третьому віках. Крім вище наведених варіантів, формували варіанти популяцій, яких обробляли суспензією живої ноземи. Інфікування проводилось шляхом обприскування листя шовковиці суспензією спор ноземи. Для підрахунку спор у певному об'ємі, використовували камеру Горяєва. У 4 та 5-му віках із всіх гусениць, що заражались у 1-му віці, брали по 20 особин для досліджень. Зокрема, у кожної гусениці брали гемолімфу, кишечник та шовкові залози. Внаслідок мікроскопічного аналізу, встановлювали наявність у цих органах збудників нозематозу. Після завершення відгодівельного періоду, коли гусениці утворили кокони, на 7-й день, кокони підраховували та зважували. Кокони кожного варіанту розміщали у спеціальні мішечки, які зберігали на стелажах. Метеликів, що вилетіли, залишали в ізоляторах і також аналізували на наявність збудника нозематозу. Порівняння отриманих результатів проводили із способом-прототипом. 2 29289 В табл. 1 наведені результати, що свідчать про рівень ураження тутовою шовкопряду нозематозом в залежності від того, чим обробляли грену перед її штучним інфікуванням. Як видно, у варіанті, де грену обробляли специфічним антигеном з живим збудником нозематозу (спосіб, що пропонується), при інфікуванні нозематозом гусениць першого віку зараження не відбулося. Це свідчить про те, що популяція шовкопряду, грена якої була, згідно зі способом, що пропонується, оброблена суспензією з вмістом нозематозу, повністю імунна до збудника. Зараження не відбулося (табл. 1.). У той час, як у інших варіантах з неспецифічним антигеном (желатин, колодій, білок яйця) було уражено 66,3-71,6% популяції шовкопряду. Аналогічний варіант обробки грени із вбитим збудником нозематозу не викликав імунітету, і популяція була заражена на 75,3%. Про те, що зараження гусениць нозематозом відбулося, свідчать результати, де здорових гусениць не обробляли суспензією ноземи, було заражено 82,3%. Приклад 2. Умови досліду аналогічні наведеним у прикладі 1. Специфіка досліду у тому, що імунізовану раніше грену інфікували нозематозом у другому гусеничному віці. Результати досліджень, стосовно рівня ураження шовкопряда нозематозом, наведено у табл. 2. Як видно, рівень ураження шовкопряда у варіанті, де застосовували специфічний антиген з живим збудником нозематозу (спосіб, що пропонується), становив лише 2%. У той час, як в інших варіантах цей показник був від 65,3 до 85,3%. Тобто практично вся популяція була заражена нозематозом, у тому числі використовувався специфічний антиген з вбитим збудником 72,6%. Отже, імунітет захищає гусениць і у випадку інфікування їх у другому віці. Приклад 3. Умови досліду аналогічні наведеним у досліді 1. Специфіка досліду у тому, що імунізовану раніше грену інфікували нозематозом у третьому гусеничному віці. Результати досліджень наведено у табл. 3 Підтверджена встановлена закономірність, яка свідчить про те, що використання запропонованого способу - долати імунні перешкоди і заражати шовкопряда. У інших варіантах рівень ураження становив 61,6-87,3%. Приклад 4. Умови досліду аналогічні наведеним у прикладі 1. Об'єкт досліджень - дубовий шовкопряд. Особливістю біології цього виду є те, що він зимує на стадії лялечки. Імунізацію грени цього виду проводили весною, зразу після відкладання самицями яєць. У решті випадків умови досліду були такими, як у прикладі 1. Результати досліджень наведені у табл. 4. Як видно, у першому варіанті, а це спосіб, що пропонується, коли використовували специфічний антиген з живим збудником, ураження нозематозом не відбулося. У інших варіантах, які необхідні для доказу способу, що пропонується, було заражено 67,3-84,3% шовкопряду. Приклад 5. Дубовий шовкопряд інфікували нозематозом у другому гусеничному віці. Результати досліджень наведено у табл. 5. Встановлено, що згідно з запропонованим способом, нозематозом було заражено всього 1,5% популяцій шовкопряду. В решті варіантів цей показник становив 69,3 84,3%. Це свідчить про високу ефективність запропонованого способу. Приклад 6. Дубовий шовкопряд інфікували нозематозом у третьому гусеничному віці. Результати досліджень наведено у табл. 6. Встановлена висока ефективність способу, що викликає індукцію імунітету шовкопряду. Якщо у цьому варіанті було уражено тільки 2,2%, то в решті цей рівень становив 64,0-82,6%. Отже, використання запропонованого способу індукції імунітету показало високий технічний результат на обох видах шовкопрядів, які були здатні протистояти зараженню нозематозом, практично повністю. Приклад 7. Популяція тутового шовкопряду. Обгрунтовується феномен дії індукованого імунітету у способу, що пропонується. Саме імунітет до хвороби визначив позитивний ефект. Цей ефект було досягнуто завдяки спрямованій індукції імунітету внаслідок дії специфічного антигену, живої культури нозематозу на здорову грену тутового та дубового шовкопрядів. Суть досліду полягає у тому, що такі стресові, сильнодіючі фактори як формалін повністю вбивають здатність проявляти імунну реакцію на дію антигену. До початку реактивації тутового шовкопряду грену обробили водним розчином формаліну в різних концентраціях. Після того гусениць першого, другого та третього віків інфікували суспензією нозематозу шляхом обробки нею листя шовковиці. У табл. 7 наведені результати досліджень. Як видно, формалін повністю виключає дію імунітету, внаслідок чого 67,0-86,5% популяції шовкопряду було уражено нозематозом. В той час як використання запропонованого способу майже повністю знезаразило шовкопряда (табл. 7). Приклад 8. Умови досліду аналогічні тим, що наведені у прикладі 7. Об'єкт досліджень - дубовий шовкопряд. Отримані результати наведено у табл. 8. Встановлено високий рівень дії запропонованого способу у протистоянні хворобі шляхом індукції імунітету. Приклад 9. Об'єкт - тутовий шовкопряд. Підсумкова дія запропонованого способу. У табл. 9 наведені підсумкові результати продуктивності внаслідок використання запропонованого способу. Порівняння досягнутого позитивного результату проводиться зі способом-прототипом та зі специфічним антигеном з вбитим збудником хвороби. Встановлено значне перевищення продуктивності шовкопряду у порівнянні з обома способами. Приклад 10. Об'єкт досліджень - дубовий шовкопряд. Як і у попередньому прикладі, оцінювали позитивний результат внаслідок використання запропонованого способу у порівнянні зі способомпрототипом. Як видно з наведених у табл. 10 результатів, досягнуто значних показників продуктивності шовкопряду у запропонованому способі, що перевищує прототип за показником шовконосності на 10,4-11,6%. Таким чином, запропонований спосіб індукції імунітету шовкопрядів технологічно сприйнятливий, включає використання специфічних препара 3 29289 тів, дозволяє досягти значних позитивних результатів. куколки / Инфекционные и протозастные болезни вредных насекомых. - М.: Сельхозгиз, 1956. 3. Кашкарова Л.Ф., Хаханов А.И., Современные методы борьбы с пебриной тутового шелкопряда. Научные основы развития шелководства. - Ташкент, 1987. - С. 66-71. 4. Кашкарова Л.Ф., Хаханов А.И., Андроскина Л.Т., Янов В.Я. Препарат для борьбы с пебриной тутового шелкопряда: Авторское свидетельство СССР, № 1481922, МКИ А01К67/04. 14.01.1987 (прототип). Джерела інформації: 1. Марченко И,П., Бурлуцкая М.И. Изучение условий термического режима, пригодного в качестве борьбы с пебриной шелкопрядов // Труды Украинской опытной станции шелководства. Т. 4. – Харьков, 1959. - С. 13-18. 2. Поярков Э.Ф. Биологиxеский метод борьбы с пебриной тутового шелкопряда на фазе грины и Таблиця 1 Результат використання специфічного антигену при обробці грени тутового шовкопряду з наступним інфікуванням гусениць у першому віці Умови дії на грену, з наступним зараженням нозематозом Специфічний антиген з живим збудником нозематозу Желатин Колоїд Білок курячого яйця Специфічний антиген з вбитим збудником нозематозу Гомогенат здорової грени Популяція здорових гусениць, оброблених суспензією ноземи Контроль, здорова грена нічим не оброблена Гусениць у досліді, екз. В т. ч. Заражено нозематозом, екз. Заражено, % 400 0 0,0 300 300 300 211 199 215 70,3 66,3 71.6 300 226 75,3 300 238 79,3 300 247 82,3 300 0 0,0 Таблиця 2 Результат використання специфічного антигену при обробці грени тутового шовкопряду з наступним інфікуванням гусениць у другому віці Умови дії на грену, з наступним зараженням нозематозом Специфічний антиген з живим збудником нозематозу Желатин Колоїд Білок курячого яйця Специфічний антиген з вбитим збудником нозематозу Гомогенат здорової грени Популяція здорових гусениць, оброблених суспензією ноземи Контроль, здорова грена нічим не оброблена Гусениць у досліді, екз. В т. ч. заражено нозематозом, екз. Заражено, % 400 0 2,0 300 300 300 244 196 218 74,6 65,3 72,6 300 253 84,3 300 244 74,6 300 256 85,3 300 4 1,0 Таблиця 3 Результат використання специфічного антигену при обробці грени тутового шовкопряду з наступним інфікуванням гусениць у третьому віці Умови дії на грену, з наступним зараженням нозематозом Специфічний антиген з живим збудником нозематозу Желатин Колоїд Білок курячого яйця Специфічний антиген з вбитим збудником нозематозу Гусениць у досліді, екз. В т. ч. заражено нозематозом, екз. Заражено, % 400 11 2,7 300 300 300 216 185 209 72,0 61,6 69,6 300 231 77,0 4 29289 Продовження табл. 3 Умови дії на грену, з наступним зараженням нозематозом Гомогенат здорової грени Популяція здорових гусениць, оброблених суспензією ноземи Контроль, здорова грена нічим не оброблена Гусениць у досліді, екз. 300 В т. ч. заражено нозематозом, екз. 223 300 262 87,3 300 6 1,5 Заражено, % 74,3 Таблиця 4 Результат використання специфічного антигену при обробці грени дубового шовкопряду з наступним інфікуванням гусениць у першому віці Умови дії на грену, з наступним зараженням нозематозом Специфічний антиген з живим збудником нозематозу Желатин Колоїд Білок курячого яйця Специфічний антиген з вбитим збудником нозематозу Гомогенат здорової грени Популяція здорових гусениць, оброблених суспензією ноземи Контроль, здорова грена нічим не оброблена Гусениць у досліді, екз. В т. ч. заражено нозематозом, екз. Заражено, % 400 0 0,0 300 300 300 231 202 219 77,0 67,3 73,0 300 238 79,3 300 242 80,6 300 253 84,3 300 0 0,0 Таблиця 5 Результат використання специфічного антигену при обробці грени дубового шовкопряду з наступним інфікуванням гусениць у другому віці Умови дії на грену, з наступним зараженням нозематозом Специфічний антиген з живим збудником нозематозу Желатин Колоїд Білок курячого яйця Специфічний антиген з вбитим збудником нозематозу Гомогенат здорової грени Популяція здорових гусениць, оброблених суспензією ноземи Контроль, здорова грена нічим не оброблена Гусениць у досліді, екз. В т. ч. заражено нозематозом, екз. Заражено, % 400 6 1,5 300 300 300 253 208 215 84,3 69,3 71,6 300 244 81,3 300 235 78,3 300 218 72,6 300 6 2,0 Таблиця 6 Результат використання специфічного антигену при обробці грени дубового шовкопряду з наступним інфікуванням гусениць у третьому віці Умови дії на грену, з наступним зараженням нозематозом Специфічний антиген з живим збудником нозематозу Желатин Колоїд Білок курячого яйця Специфічний антиген з вбитим збудником нозематозу Гомогенат здорової грени Гусениць у досліді, екз. В т. ч. заражено нозематозом, екз. Заражено, % 400 9 2,2 300 300 300 233 192 215 77,6 64,0 71,6 300 241 80,3 300 210 70,0 5 29289 Продовження табл. 6 Умови дії на грену, з наступним зараженням нозематозом Популяція здорових гусениць, оброблених суспензією ноземи Контроль, здорова грена нічим не оброблена Гусениць у досліді, екз. В т. ч. заражено нозематозом, екз. Заражено, % 300 248 82,6 300 7 2,3 Таблиця 7 Результати обробки формаліном грени тутового шовкопряду на втрату імунітету до збудника нозематозу Варіант Перший Другий Третій Гусениць у досліді, екз. 200 200 200 В т. ч. заражено нозематозом, екз. 134 142 173 Заражено, % 67,0 71,0 86,5 Другий 200 0 0,0 Третій 200 5 2,5 Вік гусениць Формалін 0,3% Формалін 0,5% Формалін 0,6% Антиген з живим збудником: спосіб, що пропонується Антиген з живим збудником: спосіб, що пропонується Таблиця 8 Результати обробки формаліном грени дубового шовкопряду на втрату імунітету до збудника нозематозу Варіант Перший Другий Третій Гусениць у досліді, екз. 200 200 200 В т. ч. заражено нозематозом, екз. 164 174 152 Заражено, % 82,0 87,0 76,0 Другий 200 0 0,0 Третій 200 6 3,0 Вік гусениць Формалін 0,3% Формалін 0,5% Формалін 0,6% Антиген з живим збудником: спосіб, що пропонується Антиген з живим збудником: спосіб, що пропонується Таблиця 9 Продуктивність тутового шовкопряду внаслідок використання запропонованого способу індукції імунітету проти збудника нозематозу Варіант Специфічний антиген з живим збудником нозематозу Специфічний антиген з вбитим збудником нозематозу Прототип Маса самиць мг/% до прототипу Шовкова Кокон оболонка % шовку Маса самців мг/% до прототипу Шовкова Кокон оболонка % шовку 1962/105,8 401/111,4 20,43/105,2 1711/106,6 389/112,1 22,73/105,1 1760/89,7 307/76,5 17,44/85,3 1527/89,2 312/80,2 20,43/89,8 1853/100,0 360/100,0 19,42/100,0 1604/100,0 347/100,0 21,63/100,0 6 29289 Таблиця 10 Продуктивність дубового шовкопряду внаслідок використання запропонованого способу індукції імунітету проти збудника нозематозу Маса самиць мг/% до прототипу Шовкова Кокон оболонка Варіант Специфічний антиген з живим збудником нозематозу Специфічний антиген з вбитим збудником нозематозу Прототип % шовку Маса самців мг/% до прототипу Шовкова Кокон оболонка % шовку 6981/107,2 63,9/119,6 9,15/111,6 4873/105,5 523/116,5 10,73/110,4 5693/81,5 432/67,6 7,58/82,8 4153/85,2 356/88,0 8,57/79,8 6511/100,0 534/100,0 8,20/100,0 4618/100,0 449/100,0 9,72/100,0 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 34 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 7