Спосіб одержання a-заміщених рацемічних 4-метилтіо-бутанових кислот

1 Способ получения а - замещенных рацемических 4-метилтио-бутановых кислот, отличающийся тем, что а - замещенные рацемические 4метилтиобутиронитрилы гидролизуют с помощью нитрилазы, продуцируемой микроорганизмами, выбранными из группы Alcahgenes faecahs ATCC8750, Rhodococcus sp HT 29-7 FERM ВР-3857 или Gordona terrae FERM BP-4535 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что а - замещенным рацемическим 4-метилтиобутирони трилом является 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил 3 Способ по п 1, отличающийся тем, что рН значение среды составляет от 4 до 11 4 Способ по п 3, отличающийся тем, что рН значение среды составляет от 5 до 9 5 Способ по п 1, отличающийся тем, что температура гидролиза составляет 30 •• 60° С = 6 Способ по п 5, отличающийся тем, что температура гидролиза составляет 30 •• 50°С = 7 Способ по п 1, отличающийся тем, что концентрация а - замещенного 4-метилтиобутиронитрила в исходном растворе составляет 10 ^ 400ммоль 8 Способ по п 7, отличающийся тем, что концентрация а - замещенного 4-метилтиобутиронитрила в исходном растворе составляет 50 •• 200 ммоль на литр = 9 Способ по п 1, отличающийся тем, что концентрация а - замещенной 4-метилтио-бутановой кислоты в растворе составляет 10 "^ 2000 ммоль на литр 10 Способ по п 9, отличающийся тем, что концентрация а - замещенной 4-метилтио-бутановой кислоты в растворе составляет 100 "^ 1500 ммоль на литр Настоящее изобретение относится к использованию нитри-лазы в качестве катализатора гидролиза нитрильной группы до карбоксильной группы Более конкретно оно относится к использованию нитрилазы, выбираемой из нитрилаз микроорганизмов вида Alcahgenes, Rhgdocaccu* или Gordona, и более конкретно Alcahgenes faecahs, депонированного под номером АТСС 8750, Rhodococcus p HT 29-7, депонированного под номером PERM ВР-3857, или Gordona terrae MA-1, депонированного под номером FERM BP-4535 Нитрилаза Alcahgenes faecahs описывается, например, в европейском и японском патентах, опубликованных под соответствующими номерами ЕР 348 901 и JP 03 224 496, причем оба патента принадлежат фирме Асахи В этих патентах, в частности, в европейском патенте, нитрилазу используют для получения из рацемических нитрилов оптически активных кислот Предпочтительные исходные нитрилы замещены в о 00 48953 кислоту получают с избытком энантиомера равным 9 1 % В европейском патенте 486 289 и в соответствующем ему американском патенте США 5 326 702 фирмы NITTO CHEMICAL описывается использование Alcahgenes sp ВС 35-2 (FEKM №11265 или FEP М-ВР-3318) для гидролиза нитрила миндальной кислоты в присутствии сульфита, в этом случае миндальную кислоту получают с избытком одного энантиомера около 98% В патенте Японии JP 04 341 185 фирмы Асахи описывается получение и использование нитрилазы Alcahgenes faecahs ATCC 8750 для решения проблем получения оптически чистых соединений из их рацемических нитрилов Селективная в отношении одного из энантиомеров нитрилаза, описываемая в вышеуказанном патенте Японии, предпочтительно гидролизует 2-гидрок-синитрил следующей ниже общей формулы (I) до 2гидроксикар-боновой кислоты формулы (II) он он R -С - С8 (Г) (П) н н в которых R означает возможно замещенную арильную группу или возможно замещенную гетероциклическую группу В этом патенте указывается, что гидролиз нитрила миндальной кислоты с помощью вышеуказанной нитрилазы позволяет получать 100% избытка одного энантиомера в виде Р-(-)-миндальной кислоты В примере 5 указывается, что вышеуказанную нитрилазу можно использовать для гидролиза алифатических нитрилов, как вале-ронитрил, акрилонитрил, 2галогенпропионитрилы, хлорацетонит-рил Однако, здесь ничего не говорится об энантиоселективнос-ти этого гидролиза в отношении алифатических нитрилов, обладающих асимметрическим центром В тексте этого патента также уточняется, что нитрилаза Alcahgenes faecahs обладает оптимальной активностью при рН-значении от 6,5 до 8,0, температура использования вышеуказанного фермента, согласно этой ссылке, всегда должна быть ниже 45°С Совершенно неожиданно обнаружено, что если вышеуказанный фермент Alcahgenes faecahs ATCC 8750 использовать для гидролиза 4метилтио-2-гидроксибутиронитрила, то этот гидролиз протекает без всякой селективности в отношении оптически чистых изомеров Этот фермент гидролизует вышеуказанный нитрил с образованием рацемической смеси двух кислот без всякого предпочтения в отношении того или другого из изомеров Нитрилаза Rhodoccccus sp HT 29-7, депонированная под номером FERM ВР-3857, описывается, например, в европейском и американском патентах, опубликованных под соответствующими номерами ЕР 610 049 и США 5 296 373, причем оба принадлежат фирме NITTO Согласно этим патентам, и в частности патенту США, нит-рилазу используют для получения оптически активных кислот из рацемических нитрилов, содержащих фенильную группу Все исходные нитрилы содержат ароматический радикал, причем речь идет по существу о гидролизе нитрила миндальной кислоты или его производных, замещенных в ароматическом ядре В примере 1 вышеуказанного патента США описывается гидролиз рацемического нитрила миндальной кислоты с помощью Rhodococcus sp HT 29-7, причем R (-) - миндальную кислоту получают с избытком энантиомера 100% В примере 2 описывается гидролиз замещенных в ароматическом ядре производных нитрила миндальной кислоты, причем избыток одного из энантиомеров производного миндальной кислоты также составляет 100%, то же самое наблюдают, когда проводят гидролиз нитрилов бензальдегида В европейском патенте 610 049 фирмы NITTO CHEMICAL описывается использование Rhodococcus sp HT 29-7 (FERM ВР-3857), Alcahgenes sp ВС 35-2 (FERM BP-3318) или Brevibactenum acetyhcum IAM 1790 для гидролиза гидроксинитрилов, замещенных в гаммаположении ароматическим ядром, до оптически активной - гидроксикарбоновой кислоты, замещенной фенильной группой Получаемые с помощью Rhodo-coccus sp HT 29-7 кислоты всегда содержат избыток одного энантиомера, изменяющийся в зависимости от исходного нитрила и в зависимости от присутствия или отсутствия фосфорной кислоты (рН среды около 8,2) Совершенно неожиданно обнаружено, что если вышеуказанный фермент Rhodococcus sp HT 29-7 (FERM ВР-3857) использовать для гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила, то этот гидролиз протекает без всякой селективности в отношении энантиомеров Этот фермент гидролизует вышеуказанный нитрил с образованием рацемической смеси двух кислот без предпочтительного образования того или другого из изомеров Нитрилаза Gordona terrae MA-1, депонированная под номером FERM BP-4535, описывается в европейском патенте О 610 048 для гидролиза нитрилов, содержащих в гамма-положении фенильную группу и в альфа-положении гидроксильную группу, до соответствующей оптически активной кислоты Избыток одного энантиомера во всех примерах составляет от 92% до 100% Совершенно неожиданно обнаружено, что если вышеуказанный фермент Gordona terrae MA-1 использовать для гидролиза 4-метилтио-2гидроксибутиронитрила, то этот гидролиз протекает без какой-либо селективности в отношении энантиомеров Этот фермент гидролизует вышеуказанный нитрил с образованием рацемической смеси двух кислот без предпочтительного получения того или другого из изомеров Настоящее изобретение относится к способу получения рацемических альфа-замещенных 4метилтио-бутановых кислот путем гидролиза альфа-замещенных рацемических 4-метилтиобутиронитрилов с помощью нитрилазы одного из следующих микроорганизмов Alcahgenes faecahs, депонированный под номером АТСС 8750, Rhodococcus sp HT 29-7, депонированный под номером FERM ВР-3857, или Gordona terrae MA-1, депонированный под номером -TERM BP-4535 Согласно способу изобретения, микроорганизм может быть использован таким, какой есть, или иммобилизованным на хорошо известных 48953 специалисту носителях Кроме того, генетическая информация, которая кодирует фермент, может быть передана от одного родственного микроорганизма (такого, как A faecahs ATCC 8750 ) к другому микроорганизму, такому, как Bacillus subtilis В качестве одного из вариантов способа согласно изобретению, вместо микроорганизма в свободном виде или в иммобилизованном используют соответствующее количество фермента, который полностью или частично очищен Из альфа-замещенных 4метилтиобутиронитрилов предпочтительно используют 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил, который позволяет получать гидрокси-аналог рацемического метионина При таком варианте получения производных метионина избегают образования побочных неорганических соединений в значительных количествах, удаление которых вызывает все больше и больше проблем в связи с защитой окружающей среды Эти ферменты в рамках настоящего изобретения обладают нитрилазной активностью в области рН-значений, составляющих от 4 до 11, и оптимальной активностью при рН-значении в пределах от 5 до 9 Оптимальная температура их использования составляет 30-60°С, однако предпочтительно их использовать при температуре в пределах от 30 до 50°С Предпочтительно работают с концентрациями нитрила в исходном растворе от Юммоль до 400ммоль на литр и предпочтительно от 50ммоль до 200ммоль на литр Концентрация получаемой аммониевой соли кислоты мало влияет на активность фермента, если эта концентрация ниже 2моль на литр, предпочтительно, от 0,1 до 1,5моль на литр Изобретение более полно описывается с помощью нижеследующих примеров, которые не ограничивают его Пример 1 Микроорганизм Alcahgenes faecahs ATCC 8750 выращивают в следующей среде ацетат аммония Юг/л дрожжевой экстракт 5г/л пептон 5г/л дигидрофосфат калия (К2НРО4) 5г/л гептагидрат сульфата магния (MgSC^ 7 Н2О) 0,2г/л гептагидрат сульфата железа - (II) (FeSO4 7 Н2О) ЗОмг/л хлорид натрия 1 г/л бензонитрил 0,5г/л рН=2 Культивирование осуществляют при 30°С в колбах Эрленмейера емкостью 2л, содержащих 600мл среды Содержимое перемешивают в течение 30 часов со скоростью 150 оборотов в минуту Осадок из клеток извлекают, промывают раствором хлорида натрия с концентрацией 9г/л, затем замораживают Рабочие условия для гидролиза бутиронитрила следующие 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил 50ммоль клетки 5мг/мл фосфатный буфер 200ммоль температура 30°С продолжительность 4 часа Изучение кинетики гидролиза 4-метилтио-2гидроксибути-ронитрила показывает линейное продуцирование 2,8 мкмоль гид-рокси-аналога метионина в час и на мг сухих клеток Избыток одного из энантиомеров образующейся кислоты определяют с помощью жидкостной хроматографии он составляет 0% при выходе кислоты 80 % Пример 2 Оценивают стабильность фермента, наблюдая за кинетикой продуцирования гидроксианалога метионина в течение ISO часов при использовании свободных клеток Рабочие условия следующие 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил ЮОммоль клетки 10мг/мл фосфатный буфер ЗООмМ 5мл температура 25°С Нитрил вводят последовательно путем добавления ЮОммоль по мере потребления нитрила Образование соответствующей кислоты представлено в таблице 1 Таблица 1 Время (часы) Образовавшаяся кислота (ммоль/литр) 0 2 17 24 47 70 172 180 0 39 230 312 466 556 860 940 Активность (мкмоль/час мг сухих клеток) 0 1,7 1,3 1,1 1,2 0,4 0,6 0,6 Начальная активность составляет 2мкмоль/час мг сухих клеток Этот пример доказывает стабильность фермента, несмотря на присутствие кислоты в высоких концентрациях (0,9моль гидрокси-аналога метионина) Пример 3 Стабильность фермента в зависимости от количества субстрата и количества образовавшейся кислоты была измерена в следующих условиях Стабильность фермента в зависимости от количества субстрата нитрил см Таблицу клетки Юмг/мл фосфатный буфер ЗООмМ, рН=7,0 5мл температура 25°С продолжительность 1 час Концентрация рила (ммоль) 50 100 150 200 500 нит- Активность (мкмоль/час мг сухих клеток) 2 2 2 2 0 Стабильность фермента в зависимости от ко 48953 личества образовавшейся кислоты, Рабочие условия нитрил 50ммоль клетки 2,5м г/мл фосфатный ЮОмМ буфер, рН=7,0 1мл температура 30°С продолжительность 2 часа Концентрация кислоты (ммоль) 0 100 200 300 400 500 600 700 Активность (мкмоль/час мг сухих клеток) 3,2 4,5 3,8 4,1 4 4 3,4 2,8 Пример 4 Очистка нитрилазы Клетки Alcahgenes jfaecahs культивируют в течение 24-х часов при 30°С в среде, описанной в примере 1 После центрифугирования культуры, осадок обрабатывают буфером с рН=7,5 (25мМ ТРИСHCI, 10% (вес/объем) глицерина) Суспензию клеток подвергают ультразвуковой обработке, затем центрифугируют, чтобы получить неочищенный экстракт Этот неочищенный экстракт затем обрабатывают сульфатом аммония до 30 % насыщения Полученный осадок снова суспендируют в буфере с рН=7,5, затем подвергают диализу против 2 л того же самого буфера в течение ночи Полученный раствор затем вносят в анионообменную колонку с Q -Сефарозой Fast Flow HR 26/10®, предварительно уравновешенной с буфером, имеющим рН=7,5 Активную нитрилазу затем элюируют с помощью градиента от О до 1М раствора хлорида натрия Активные фракции затем помещают в анионообменную колонку с MOHO-Q - HR 5/5®, предварительно уравновешенной с буфером, имеющим рН=7,5 Нитрилазу элюируют с помощью градиента от О до 1М раствора хлорида натрия Содержащие активную нитрилазу фракции объединяют, затем добавляют 1М раствор сульфата аммония Этот раствор вносят в колонку для гидрофобных взаимодействий с фенил-сефарозой HR 5/5®, предварительно уравновешенной с буфером, имеющим рН=7,5, к которому добавлен 1 моль сульфата аммония Активную нитрилазу затем элюируют с помощью градиента от 1 до О М раствора сульфата аммония Молекулярную массу протеина определяют путем гель-фильтрации Она составляет около 260 килодальтонов При электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия наблюдают единственную полосу 43 килодальтона (чистота 95 %) Кинетика гидролиза 4-метилтио-2гидроксибутиронитрила до гидрокси-аналога метионина с помощью нитрилазы A faecahs является линейной Время (часы) Активность (мкмоль/час, Выход реакмг протеина) ции (%) 0 0,5 1 21,5 24,8 29 1 3 5 68 77 87 0 150 171 150 150 150 Пример 5 Влияние рН-значения Рабочие условия нитрил Протеин ацетатный ЮОмМ буфер с рН=4-5 фосфатный ЮОмМ буфер с рН=6-7 буфер ТРИС-НСІ, ЮОмМ, с рН=8-9 боратный ЮОмМ буфер с рН=Ю-11 температура продолжительность 50ммоль 50мкг/мл 1мл 30°С 1-2 часа РН Активность (мкмоль/час мг протеина) 4 5 6 7 8 9 10 11 0 42 232 272 405 412 158 0 Пример 6 Влияние температуры Рабочие условия нитрил 50 ммоль протеин 50 мкг/мл фосфатный буфер ЮОмМ с рН=7,0 температуры, изменяющиеся от 4°С до 60°С продолжительность 1 час Оптимальная температура функционирования фермента составляет 50°С Температура в °С 4 10 20 30 40 50 60 Активность (мкмоль/час мг протеина) 45 67 140 272 419 570 333 Сравнительный пример с нитрилом миндальНОИ КИСЛОТЫ Рабочие условия нитрил миндальной кислоты протеин фосфатный буфер ЮОмМ с рН=7,0 температура 7ммоль 5 м кг/мл 1мл 30°С п , Активность Избыток Время (мину- , . ; (мкмоль/час мг про- одного энантеина) тиомера 15 1000 1 60 1030 1 Очищенная нитрилаза, следовательно, энан 48953 тиоселективна в отношении нитрила миндальной кислоты, но не энантиоселективна в отношении 4метилтио-2-гидроксибутиронитрила 15 Пример 7 Гидролиз 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила с помощью Rhodococcus sp, HT 29-7 FEBM ВР3857 Микроорганизм Rhodococcus sp- HT 29-7 FEliM BP-3857 культивируют в следующей среде глицерин 20г/л дрожжевой экстракт (ДИФКО) Зг/л дигидрофосфат калия К2РО4 1г/л динатрийгидрофосфат 12 НгО 4,4г/л Na2HPO4, 12Н 2 О 2,8г/л сульфат натрия Na2SO4 гексагидрат хлорида магния (МдСЬ 6 Н2О) 0,85г/л дигидрат хлорида кальция (СаСЬ 2 Н2О) 0,05г/л гидрат сульфата марганца - (II) (MnSO4 Н2О) 0,033г/л гептагидрат сульфата желе- За - (II) (FtSO4 7 Н20) 0,01 Зг/л гептагидрат сульфата цинка (ZnO4 7 Н2О) 0,005г/л бензонитрил 0,05 г/л рН=7,5 Культивирование осуществляют приі 30°С в колбах Эрленмей-ера емкостью 2л, содержащих 600мл среды Содержимое перемешивают в течение 140 часов со скоростью 150 оборотов в минуту Осадок клеток извлекают, промывают раствором хлорида натрия с концентрацией 9г/л, затем замораживают Влияние рН-значения на гидролиз Рабочие условия 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил ЮОммоль оптическая плотность при 660нм 15 ацетатный буфер ЮОмМ с рН=4-5 фосфатный буфер ЮОмМ с рН=6, 07,0 1мл ЮОмМ буфер ТРИС-НСІ с рН=8,0-9,0 боратный буфер ЮОмМ с рН=10,0-11,0 температура продолжительность РН-Значение 4 5 6 7 8 9 10 11 30°С 10 часов Выход кислоты 0% 100% 100% 100% 100% 100% 20% 0% Пример 8 Влияние концентрации субстрата Стабильность фермента в зависимости от количества субстрата также определяют в следующих условиях 4-МЄТИЛТИО-2 гидроксибутиронитрил оптическая плотность при 660нм фосфатный буфер ЗООнМ с рН=7,0 см таблицу 20 5мл 10 30°С 2 часа температура продолжительность Концентрация нитрила (ммоль) 50 100 200 300 400 500 Выход кислоты 90% 44% 22% 10% 0% 0% Пример 9 Стабильность фермента в зависимости от количества образующейся кислоты Рабочие условия, 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил ЮОммоль оптическая плотность при 660нм 15 фосфатный буфер ЮОмМ с рН=7,0 1мл температура 30°С продолжительность 6 часов Концентрация кислоты (ммоль) 0 200 400 600 800 1000 Выход кислоты 100% 100% 100% 100% 100% 100% Пример 10 Избытокэнантиомера 4-МЄТИЛТИО-2 гидроксибутиронитрил оптическая плотность при 660нм фосфатный буфер ЮОмМ с рН=7,0 температура Время инкубации (часы) 2 6 24 Выход кислоты (%) 15 50 100 140ммоль 14 1 мл 20°С Оптическая чистота Изучение кинетики гидролиза 4-метилтио-2гидроксибутиро-нитрила показывает продуцирование по линейной зависимости гидрокси-аналога метионина в час и на мг сухих клеток С помощью жидкостной хроматографии определяют наличие избытка какого-либо энантиомера образовавшейся кислоты, этот избыток равен 0% при выходе кислоты от 15 % до 100% Пример 11, Влияние температуры Рабочие условия 4-МЄТИЛТИО-2 гидроксибутиронитрил оптическая плотность при 660нм фосфатный буфер ЮОмМ с рН=7,0 температура продолжительность Температура (°С) 10 20 30 40 10Оммоль 15 1 мл см таблицу 6 часов Выход кислоты (%) 70 100 100 100 48953 Пример 31 15 12 Гидролиз 4-МЄТИЛТИО-2 аминобутиронитрила Рабочие условия 4-метил-2-гидроксибутиронитрил оптическая плотность при 660нм фосфатный буфер ЮОмМ с рН=7,0 температура Время (часы) Выход кислоты 0,5 1 2 5 40 51 62% 78% 23ммоль 15 1мл 30°С Избыток одного энан-тиомера кислоты не определен 0,12 не определен 0.15 Пример 13 Условия культивирования используемые для Gordona terrae МАИ (FEP М ВР-4535) следующие глицерин Юг/л дрожжевой экстракт 0,4г/л гидрофосфат калия К2НРО4 6,8г/л гидрофосфат натрия с 12 Н?О (Na 2 HPO 4 12H 2 O) 1,1 г/л сульфат натрия Na2SO4 2,8г/л гексагидрат хлорида магния MgCI; 6Н2О 0,4г/л дигидрат хлорида кальция СаСЬ * Н2О 40 м г/л гидрат сульфата марганца - (ІГ MnSO4 H20 4 м г/л хлорид железа - (III) 0,6м г/л сульфат цинка 0,3м г/л бензонитрил 0,5г/л рН=7,2 Активность фермента Культивированные клетки затем промывают, после чего вводят в контакт с гидроксиметилтиобутиронитрилом для количественного анализа активности Рабочие условия концентрация нитрила 23ммоль концентрация клеток 6,8г/л ЮОмМ фосфатный буфер рН=7,0 , температура = 35°С _ Рисунок Зі Гидролиз циаягид I А А / — рина ДМТР с помощью / 12 Пример 14 Влияние концентрации циангидрина АМТР на активность нитрилазы Определяют влияние начальной концентрации гидроксиметилтиобутиронитрила на активность нитрилазы, результаты приводятся в следующей таблице Рабочие условия концентрация клетокЮО мМ 5,1 г/л фосфатный буферрН=7,0, температура = 35°С Кинетику измеряют для времени 0,5, 1, 2 и 3 часов Концентрация нитрила (ммоль) 50 100 200 300 400 Вплоть до 200ммоль активность мало изменяется с изменением концентрации субстрата Пример 15 Влияние концентрации гидроксианалога мети-онина на нитрилазную активность В этом опыте исследуют влияние концентрации 4-гидрокси-2-метилтио-бутаноата аммония на нитрилазную активность Рабочие условия концентрация клеток 5г/л концентрация нитрила ЮОммоль ЮОмМ фосфатный буфер с рН=7,0 температура 35°С Концентрацию карбоксилата аммония изменяют в пределах от 0 до 1,5моль Концентрация кислоты Активность (мкмоль/час (моль/л) мг сухих клеток) 0 9,4 0,5 14 1 19 15 Концентрация 4-гидрокси-2-метилтиобутаноата аммония практически не изменяет начальную активность штамма Gordona terrae HT 297 Пример 16 Влияние рН-значения и температуры Рабочие условия концентрация нитрила ЮОммоль концентрация клеток 7,5г/л ЮОмМ ацетатный буфер с рН=4-5 ЮОмМ фосфатный буфер с рН=6-7 ЮОмМ ТРИС-НСІ буфер с рН=8-9 ЮОмМ боратный буфер с рН=10И1 температура 30°С кинетика за время 1,2,4 и 6 часов рН-Значение Кинетика гидролиза гидроксиметилтиобутиронитрила линейная Начальная скорость составляет 13ммоль/час г сухих клеток Активность (ммоль/час гсухих клеток) 14 13 15 0 0 "ел 11 50 60 Активность (ммоль/час г сухих клеток) 0,6 2,5 7,8 9,6 15,3 13 9 10 11 48953 18 5,7 11 14 Температура (°С) Оптимальное значение рН составляет около 8-9 в условиях, предложенных заявителем Влияние температуры на нитрилазную активность Gordona terrae MA-1 Рабочие условия концентрация нитрила ЮОммоль концентрация клеток 7,5г/л ЮОмМ фосфатный буфер с рН=7,0 кинетика за 1 час 10 20 30 40 50 60 Оптимальная 50°С Активность (ммоль/час г сухих клеток) 0,6 2,3 3,2 3,4 3,5 1,9 температура ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 составляет 40