Способи очищення циклоспорину а та циклоспорин а високої чистоти

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб очищення циклоспорину А для одержання циклоспорину А високої чистоти з неочищеного продукту, що містить циклоспориновий комплекс, з використанням процесу хроматографування на силікагелевій колонці, в якому застосовують багатостадійне хроматографування з використанням суміші розчинників, основним компонентом якої є толуол.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що послідовно здійснюють 2-4 стадії хроматографування.

3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що послідовно здійснюють 3 стадії хроматографування.

4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як суміш розчинників використовують толуол-ацетон.

5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить щонайбільше 30 % ацетону.

6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як суміш розчинників використовують толуол-етилацетат.

7. Спосіб за п. 6, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить щонайбільше 35 % (об.) етилацетату.

8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що на щонайменше одній стадії хроматографування застосовують градієнтне елюювання.

9. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що циклоспориновий комплекс, що його використовують як вихідний матеріал для хроматографування, перед хроматографуванням нагрівають до 80-120 °С.

10. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить від 10 до 30 % ацетону.

11. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить від 10 до 35 % (об.) етилацетату.

12. Циклоспорин А високої чистоти, в якому вміст циклоспорину L, циклоспорину U та циклоспорину D становить менше ніж 0,05 % (мас.), і вміст циклоспорину В та циклоспорину С становить менше ніж 0,02 % (мас.).

13. Промисловий спосіб очищення циклоспорину А з неочищеного продукту, що містить циклоспориновий комплекс, з використанням процесу хроматографування на силікагелевій колонці, в якому здійснюють багатостадійне хроматографування на колонці із силікагелем у нормальній фазі, з використанням суміші розчинників, основним компонентом якої є толуол.

14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що циклоспориновий комплекс, що його використовують як вихідний матеріал для хроматографування, перед хроматографуванням нагрівають до 80-120 °С.

15. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить від 10 до 30 % ацетону.

16. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить від 10 до 35 % (об.) етилацетату.

Текст

1 Спосіб очищення циклоспорину А для одержання циклоспорину А високої чистоти з неочищеного продукту, що містить циклоспориновий комплекс, з використанням процесу хроматографування на силікагелевій колонці, в якому застосовують багатостадійне хроматографування з використанням суміші розчинників, основним компонентом якої є толуол 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що послідовно здійснюють 2-4 стадії хроматографування 3 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що послідовно здійснюють 3 стадії хроматографування 4 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що як суміш розчинників використовують толуол-ацетон 5 Спосіб за п 4, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить щонайбільше 30 % ацетону 6 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що як суміш розчинників використовують толуолетилацетат Метою цього винаходу є спосіб хроматографічного очищення циклоспорину А з неочищеного продукту, до складу якого входить циклоспориновий комплекс, за допомогою колонки, наповненої 7 Спосіб за п 6, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить щонайбільше 35 % (об ) етилацетату 8 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що на щонайменше одній стадії хроматографування застосовують градієнтне елюювання 9 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що циклоспориновий комплекс, що його використовують як вихідний матеріал для хроматографування, перед хроматографуванням нагрівають до 80-120 °С 10 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить від 10 до ЗО % ацетону 11 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить від 10 до 35 % (об) етилацетату 12 Циклоспорин А високої чистоти, в якому вміст циклоспорину L, циклоспорину U та циклоспорину D становить менше ніж 0,05 % (мас), і вміст циклоспорину В та циклоспорину С становить менше ніж 0,02% (мас) 13 Промисловий спосіб очищення циклоспорину А з неочищеного продукту, що містить циклоспориновий комплекс, з використанням процесу хроматографування на силікагелевій колонці, в якому здійснюють багатостадійне хроматографування на колонці із силікагелем у нормальній фазі, з використанням суміші розчинників, основним компонентом якої є толуол 14 Спосіб за п 13, який відрізняється тим, що циклоспориновий комплекс, що його використовують як вихідний матеріал для хроматографування, перед хроматографуванням нагрівають до 80-120 °С 15 Спосіб за п 13, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить від 10 до ЗО % ацетону 16 Спосіб за п 13, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить від 10 до 35 % (об) етилацетату силікагелем та шляхом застосування багатоетапного хроматографування з колонкою, заповненою силікагелем у нормальній фазі та сумішшю розчинників, головною складовою якої є толуол О ю 00 ю 58511 Циклоспорини є циклічними ундекапептидами, N-метильованими у декількох місцях, причому більшість з них має підтверджений фармакологічний ефект На цей час відомо 25 членів цієї групи сполук, які позначено літерами від А до Z Спочатку циклоспорин А виділяли разом з ними Згаданий циклоспорин є природним матеріалом і його було виділено з культурального бульйону Tolypocladium mflatum штаму Gams (Helv Chim Acta 52 1075/1976/) Спочатку ця сполука стала відомою, як слабкий протигрибковий антибіотик, пізніше увагу було притягнуто до його імуносупресорного ефекту (Дж Ф Борел (J F ВогеІ) та ІНШІ Immunology 32 1017/1977/) 3 цієї причини він знаходив застосування, головним чином, під час трансплантування органів від інших людей (легені, серце, нирки, кістковий мозок, шкіра) Дані фармакологічних досліджень підтвердили, що ця сполука пригнічує як гуморальні, так і КЛІТИННІ імунні реакції завдяки гальмуванню проліферації Т-клітин та припиненню синтезу інтерлейкшу-2 Пізніше було встановлено, що циклоспорин А є ефективним при лікуванні автоімунних та запальних захворювань різного типу, наприклад, автоімунних гематологічних захворювань, виразкового коліту, дифузного тиреотоксичного зобу, розсіяного склерозу, псоріазу, а також ревматичного артриту Було проведено додаткові експерименти по лікуванню інфекцій, викликаних найпростішими, а також пухлин Важливість цієї групі засвідчується тим фактом, що шляхом введення різних амінокислот та замісників може бути одержано цілий ряд синтетичних споріднених сполук (наприклад, патенти ЕР 56782, Швейцарії № 630062 та ЕР 29122) Більша частина циклоспоринів може бути одержана шляхом бродіння 3 цією метою використовують, наприклад, культури мікроорганізмів Cylmdrocarpon Lucidum Booth (опис винаходу до патенту Швейцарії № 589716), Tnchoderma polysporum Rifai (опис винаходу до патенту Швейцари № 603790), Tolypocladium vanum (опис винаходу до патенту Угорщини № 201577) Наприкінці процесу зброджування утворюється циклоспориновий комплекс, до складу якого можуть входити також ІНШІ домішки (складові культуральних живильних середовищ, протиспінювачі, метаболіти і т ш ), у залежності від характеру згаданого процесу Взагалі, згаданий продукт виділяють з бульйону шляхом екстрагування Це може здійснюватись шляхом відокремлення міцелію від бульйону центрифугуванням або фільтрацією, з наступним розчиненням активного інгредієнту, який знаходиться у міцели, метанолом або ацетоном, та наступним екстрагуванням фільтрату за допомогою розчинників, які не змішуються з водою Іншим відомим способом є застосування процесу без фільтрування, шляхом екстрагування цільного бульйону органічним розчинником, який не змішується з водою Розчинник, який входить до складу органічної фази, випарюють вакуумною перегонкою Однак, під час екстрагування органічним розчинником до органічної фази переходять також сполуки, які мають ліпідну природу, що викликає ускладнення впродовж подальшого очищення Існують ВІДОМІ способи відокремлення цих сполук (наприклад, опис винаходу до патенту Швейцарії № 589716 або опублікована заявка на патент Германії № 2455859), за якими залишок, після видалення розчиннику до екстрагування, розчиняється у суміші метанолу та води, після чого декілька разів екстрагується таким же самим об'ємом петролейного ефіру Порції петролейного ефіру об'єднуються і циклоспорини виділяють з них за допомогою суміші метанолу та води Згадана активна речовина, завдяки багаторазовому екстрагуванню, переходить з об'єднаної метаноловодяноі фази до етиленхлориду, який, після цього, промивають водою та випарюють до сухості Згаданий неочищений продукт, одержаний вищезгаданим способом, до складу якого входять циклоспорини, може бути з більшою ефективністю очищений за допомогою одного з хроматографічних способів ВІДПОВІДНО ДО способу, опис якого наведено у патенті США № 4117118, суміш циклоспоринів переносять спочатку до колонки Sephadex LH-20 та елююють метанолом, після чого, послідовно, елююють на колонці з оксидом алюмінію сумішшю толуолу та етилацетату (15%), та на силікагелевій колонці сумішшю хлороформу та етанолу (2%) Незважаючи на повторні етапи хроматографування, одержаний продукт не є чистим, але представляє собою суміш циклоспорину А та В Подібний хроматографічний спосіб, разом з іншими, розкривається у патенті США № 4215199, за яким попереднє очищення здійснюють за допомогою суміші хлороформу та метанолу (98 2%, у об'ємному відношенні) на силікагелевій колонці Після ЦЬОГО елюат випарюють до сухості Згаданий залишок розчиняють у метанолі та піддають хроматографуванню на колонці Sephadex LH-20 з використанням метанолу, як елюенту Елюатні фракції випарюють до сухості, після чого згаданий залишок розчиняють у суміші хлороформу та метанолу (98 2%, у об'ємному відношенні) Одержаний розчин знову піддають хроматографуванню на силікагелевій колонці У елюаті першим з'являється циклоспорин А Цю та наступні фракції відокремлюють і очищені компоненти одержують шляхом випарювання згаданих елюатів За патентом Німеччини № 298276, маслянистий неочищений продукт розчиняють у невеликій КІЛЬКОСТІ хлороформу, після чого піддають хроматографуванню на алюмінієвій колонці за допомогою хлороформу Фракції, до складу яких входить циклоспорин А, випарюють у вакуумі, розчиняють у хлороформі, вносять до подібної ж колонки, після чого елююють хлороформом Фракції, до складу яких входить активна речовина, знову випарюють у вакуумі До одержаного залишку додають гексан та кристалізують циклоспорин А Одержаний продукт промивають гексаном, потім сушать і, нарешті, перекристалізовують з суміші ефіру та гексану або ацетону За патентом Угорщини № 201577, згаданий неочищений продукт, одержаний після випарювання, може бути очищеним на силікагелевій колонці шляхом елюювання сумішшю хлороформу та метанолу з поступовим підвищенням концентрації метанолу Згаданий процес починають чистим хлороформом з поступовим підвищенням 58511 (ступенями по 0,5% об'ємних) вмісту метанолу у елюаті Циклоспорин А елююють з колонки хлороформом, до складу якого входить 2 об'ємних відсотки метанолу, у разі циклоспорину В згадана доля дорівнює 2,5 об'ємним відсоткам, у разі циклоспорину С вона дорівнює 3 об'ємним відсоткам Компоненти одержують шляхом випарювання згаданих фракцій У вищезгаданих способах наведено опис, головним чином, способів зброджування циклоспорину, причому головною метою етапів очищення є ідентифікування одержаного продукту Внаслідок цього, згаданий продукт виділяють лише у незначній КІЛЬКОСТІ і наводяться лише фізичні та ХІМІЧНІ характеристики без публікування даних, які мають відношення до чистоти продукту та КІЛЬКІСНОГО вмісту домішок Рюгер (Rueger) та ІНШІ (Helv Chim Acta 59(4), crop 1075-92 (1976)) виділяв невеликі КІЛЬКОСТІ чистого циклоспорину А та С шляхом повторного хроматографування та інших етапів очищення для ідентифікування та структурного аналізу ВІДПОВІДНО до згаданої статті, неочищений продукт, одержаний внаслідок зброджування Tnchoderma polysporum Rifai, до складу якого входили, головним чином, циклоспорини А та С, знежирювали метанолом та петролейним ефіром Після випарювання одержаний залишок розчиняють у хлороформі та піддають хроматографуванню шляхом градієнтного елюювання за допомогою суміші хлороформу та метанолу (98,5 1,5, у об'ємному відношенні), як елюенту Чистий кристалічний циклоспорин А одержують шляхом додаткового хроматографування Згадану фракцію, до складу якої входить циклоспорин А, розчиняють у метанолі та піддають хроматографуванню на колонці Sephadex LH-20 з застосуванням метанолу, як елюенту ПІКОВІ фракції випарюють, розчиняють у толуолі та піддають хроматографуванню на колонці, заповненій оксидом алюмінію, з використанням толуолу, як елюенту, у присутності концентрації оцтової кислоти, яка підвищується Кристалічний продукт одержують після випарювання фракцій та обробки активованим вугіллям у спиртовому розчині Спосіб очищення, який може бути здійснено у промисловому масштабі, описано у патенті США № 5382655 За цим способом, неочищений продукт, до складу якого входять різні циклоспоринові компоненти, піддають тепловій обробці перед хроматографуванням на силікагелевій колонці за допомогою сумішей хлороформ-дихлорметанетанолу та хлороформ-етилацетат-етанолу Одержаний продукт піддають додатковому хроматографуванню та перекристалізації, наслідком чого є одержання чистого продукту, придатного для застосування у препаратах до впорскування Очищення неочищеного продукту, до складу якого входить суміш циклоспоринів, є дуже важким, оскільки домішки подібної хімічної структури дуже нагадують за хроматографічними характеристиками циклоспорин А, як головний продукт Попередньо описані способи підтверджують, що, незалежно від застосованої суміші розчинників та внаслідок перекриття хроматографічних шків, для одержання певних компонентів у чистій формі необхідно здійснення додаткових етапів хроматографічного або іншого очищення ВІДОМІ способи очищення поки що характеризуються, у цілому, не тільки тим, що їх запотребування розчинників є доволі великим, але і тим, що вони також потребують застосування розчинників або сумішей розчинників 3 - 4 різних типів та наповнювачів колонок 2 - 3 типів Внаслідок згаданих фактів, під час здійснення одного процесу необхідними виявляються способи хроматографування та регенерування декількох типів, що ускладнює розробку економного технологічного способу промислового використання, простого за конструктивним рішенням та застосуванням З точки зору захисту довколишнього середовища, додаткові проблеми становить застосування хлорованих вуглеводнів, оскільки все більша та більша КІЛЬКІСТЬ країн прикладає зусилля до обмеження їх використання Щодо наповнювачів хроматографічних колонок, застосування оксиду алюмінію, як наповнювача для промислового використання, є дуже сумнівним, оскільки припустиме навантаження та відокремлювальна здатність, внаслідок його невеликої питомої поверхні, є дуже малими На додаток до цього, він є невигідним для промислового застосування, оскільки наповнювач з оксиду алюмінію є жорстким та дуже крихким, що викликає необхідність застосування спеціального обладнання та технології Таким чином, подібні наповнювачі не можуть використовуватись у часто спорожнюваних колонках з нержавіючої сталі, які широко застосовуються у ХІМІЧНІЙ промисловості Наповнювачі типу Sephadex є дуже дорогими і у випадку циклоспоринового комплексу їх ефективність є дуже обмеженою, оскільки розміри молекул дуже незначно взаємно відрізняються Метою цього винаходу є розробка легкого до застосування у промисловому масштабі способу хроматографічного очищення, придатного для одержання інгредієнту циклоспорину А, який вміщує набагато менше домішок, і, завдяки цьому, є більш безпечним для застосування у медичній практиці Метою авторів цього винаходу була розробка такої технології хроматографічного очищення, яка потребувала б суміші розчинників та наповнювача для колонки тільки одного типу Силікагель було використано, як наповнювач для колонки завдяки його переважаючим властивостям — високій питомій поверхні, великому розміру пор, сприятливій здатності до поглинання, легкого маніпулювання та відносно низькій вартості Для цього наповнювача, який є придатним для відокремлення циклоспоринових компонентів з високою вибірковістю, необхідно було підібрати ідеальну суміш розчинників та спосіб В результаті експериментів, автори цього винаходу дійшли висновку, що мета може бути здійсненою багатоетапним хроматографуванням на силікагелевій колонці з використанням суміші розчинників, як елюенту, головною складовою якої є толуол Здивування викликало те, що навіть такі компоненти, як циклоспорини U та L, які є найбли жчими до циклоспорину А, можуть бути відокремленими за допомогою триетапного хроматографування на силікагелевій колонці з використанням, як елюенту, ацетону, до складу якого входить толуол Згадані компоненти відрізняються від циклоспорину А тільки метальною групою ВІДПОВІДНО ДО першого прикладу міжнародної заявки № WO 94/16091, суміш розчинників, яка складається з толуолу та ацетону, також використовується на одному етапі Одержаний продукт перекристалізовують з суміші розчинників, яка складається з ефіру та гексану (Вихід 66,6%) Оптичне обертання згаданого продукту є достатнім, однак температура його розтоплення є значно нижча за наведену у літературі, що свідчить про те, що згаданий продукт не є чистим Таким чином, навіть у разі перекристалізації з розчиннику одержують продукт низького рівня чистоти з низьким виходом Спосіб за цим винаходом є придатним для відокремлення домішок, які стрічаються найчастіше, наприклад, циклоспоринів В та С, які на цей час є присутніми у найбільших кількостях, та, крім того, таких складових, як циклоспорини D, U та L, які на цей час є присутніми у слідових кількостях Вміст циклоспоринів В та С у кінцевому продукті, циклоспорині А, який було одержано таким чином, складає менше, аніж 0,02 мас %, у той час, як вміст циклоспоринів L, U та D є меншим від 0,05 мас % Метою цього винаходу є поліпшений спосіб очищення циклоспорину А з неочищеного продукту, до складу якого входить циклоспориновий комплекс, який, крім того, забезпечує можливість одержання надзвичайно чистого циклоспорину А у великих масштабах, за допомогою хроматографічного очищення на силікагелевій колонці з застосуванням багатоетапного хроматографування з сумішшю розчинників, до складу якої, як головна складова, входить толуол Іншою новою особливістю цього способу є надзвичайно високе навантаження колонки У традиційній хроматографічній практиці ступінь навантаження колонки складає не більше, ніж 5 - 10% від наповнення згаданої колонки, причому згадане значення для циклоспоринів є ще нижчим 58511 8 складові За цим винаходом, у переважному варіанті, послідовно застосовуються 2 - 4 хроматографічні етапи, більш доцільним є застосування трьох етапів Перевантаження згаданої колонки є найбільшим на першому етапі хроматографування Безперечне відокремлення активної речовини та домішок забезпечує також можливість застосування високого навантаження колонки на двох наступних етапах хроматографування Сприятливим для згаданого очищення є застосування суміші розчинників, яка складається з толуолу-ацетону, причому максимальний вміст ацетону дорівнює ЗО об'ємним відсоткам За іншим сприятливим способом, застосовується суміш розчинників, яка складається з толуолу-ети л ацетату, причому концентрація етилацетату є нижчою за 35 об'ємних ВІДСОТКІВ У згаданому способі очищення сприятливим є, як мінімум, одноразове застосування градієнтного елюювання За даними експериментів, які було проведено авторами цього винаходу, встановлено, що для очищення циклоспоринового комплексу, який піддається обробці у нашому випадку, сприятливим є застосування 1 0 - 3 0 об'ємних %, більш сприятливим - 13 -18 об'ємних %, ацетону та 10-35 об'ємних % або 15-20 об'ємних % етилацетату Згадані багатоетапна хроматографія, суміш розчинників, до складу якої толуол входить, як головний компонент, та високе навантаження колонки є взаємопов'язаними складовими, і необхідний результат може бути досягнуто лише у разі їх спільного застосування Таким чином, для одержання надзвичайно чистого продукту, одночасно повинні використовуватись усі три вищезгадані ВІДПОВІДНО ДО МОЖЛИВОГО способу за цим ви находом, елюювання, у випадку триетапного хроматографування, здійснюють толуолом, до складу якого входить 15 об'ємних % ацетону або 18 об'ємних % етилацетату На першому етапі відокремлюється основна частина циклоспорину С, на другому етапі видаляється більша частина циклоспоринів В, L та U, і, нарешті, на третьому етапі, КІЛЬКІСТЬ компонентів L та U, а також інших невизначених домішок, може бути зменшеною до рівня нижче 0,05 мас % На першому етапі втрати циклоспорину А є мінімальними, однак у попередніх фракціях другого та третього етапу значні КІЛЬКОСТІ циклоспорину А видаляються разом з циклоспорином D, який є дуже близьким до циклоспорину А Згаданий циклоспорин А може бути одержаним на четвертому етапі у дуже чистій формі Для порівняння, у таблиці, яку представлено далі, наведено профілі вмісту домішок у циклоспорині А, який відповідає стандартам фармакопеї США, у активному інгредієнті, циклоспорині А, препарату для впорскувань SANDIMMUN®, а також ВІДПОВІДНІ дані по циклоспорину А, який було одержано за цим винаходом Таблиця Домішки Циклоспорин С Циклоспорин В Невизначена домішка Циклоспорин L Циклоспорин U Циклоспорин D Стандарт фармакопеї США мас % 0,09 0,05 0,12 Препарат для впорскувань SANDIMMUN® мас % 0,17 0,21 0,35 0,35 Продукт за Прикладом 1 мас % 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 58511 З наведених даних видно, що циклоспорин А, який було одержано за цим винаходом, за якістю значно перевищує параметри препарату для впорскувань SANDIMMUN®, більше того, він перевищує навіть вимоги фармакопеї США Спосіб за цим винаходом є придатним також для очищення неочищеного продукту як у невеликих, так і у значних масштабах Крім того, що спосіб за цим винаходом є придатним для одержання чистого циклоспорину А, він має також деякі суттєві технологічні переваги Оскільки використовується технологічний спосіб (хроматографія) тільки одного типу, згаданий спосіб очищення надає можливість уніфікованого керування, більше того, він є відтворюваним і може бути перетвореним на безперервний спосіб Крім того, згаданий спосіб має особливу перевагу, яка полягає у тому, що, оскільки на трьох етапах хроматографування застосовується суміш розчинників одного типу, це значно спрощує регенерування як згаданих колонок, так і згаданих розчинників Додаткова особлива перевага згаданого процесу полягає утому, що на першому етапі хроматографування домішки з високими зв'язувальними властивостями залишаються у згаданій колонці, що значно полегшує регенерування наповнювачів колонки на двох наступних етапах Цей винахід представляється наведеними далі прикладами, які ні в якому разі не обмежують обсягу цього винаходу З порівняльного прикладу (Приклад 4) витікає, що у разі застосування у триетапному способі хроматографування традиційної суміші розчинників, до складу якої входять дихлорметан та ацетон, і яка застосовувалась до цього часу у відомих способах, було б неможливим одержання кінцевого продукту подібної чистоти Приклад 1 Триетапне хроматографічне очищення неочищеного циклоспоринового продукту з застосуванням суміші розчинників толуолу та ацетону Якість ВИХІДНОГО неочищеного циклоспоринового продукту Вміст циклоспорину А 60,9 мас % Вміст циклоспорину В 11,2 мас % Вміст циклоспорину С 8,3 мас % Вміст циклоспорину L 1,79 мас % Вміст циклоспорину U 1,58 мас % Вміст циклоспорину D 1,25 мас % Перший етап Хроматографування здійснюють на двох хроматографічних колонках, з'єднаних послідовно, кожна з яких споряджена оболонкою, має об'єм 8 літрів, діаметр 10см, довжину 100см Кожна з двох колонок вміщує 3,95 - 3,95кг силікагелю Kieselgel типу Merck з розміром зерна 0,04 - 0,063мм Під час першого етапу хроматографування обидві колонки вміщують свіжий силікагель У разі наступного етапу хроматографування, перша згадана колонка відокремлюється і з нею з'єднується друга колонка, яка вміщує свіжий силікагель У подальшому, на кожному етапі хроматографування використовується тільки одна нова колонка Одержання неочищеного продукту 4,1кг неочищеного продукту (з чистотою 10 60,9%), попередньо розчинені у 15 літрах толуолу, вносять до пари послідовно з'єднаних колонок 19 літрів одержаного розчину заливають до верхньої частини згаданої першої колонки через фільтр зі швидкістю 2,4л/годину Після завантаження, згаданий матеріал елююють сумішшю розчинників ацетону-толуолу (13 87 об'ємних %), доки об'єм потоку, що витікає, на дні другої колонки не буде дорівнювати 39 літрам Вміст циклоспорину у потоці, що витікає, аналізують засобами тонкошарової хроматографії Фракції, які не вміщують циклоспорину, збирають, як відходи 28 літрів потоку, що виходить, після появи циклоспорину, розглядаються, як головна фракція Вміст сухого матеріалу у проміжній речовині І, яку одержано таким чином, складає 3,23кг Якість циклоспорин А 75 мас % цикл оспорил В 10,1 мас % циклоспорин С 1,6 мас % циклоспорин L 1,7 мас % циклоспорин U 1,5 мас % циклоспорин D 1,3 мас % Вихід, вирахований за циклоспорином А 97% Другий етап Розділення здійснюють на колонці довжиною 1 метр, об'ємом 8 літрів, спорядженій оболонкою Згадана колонка вміщує силікагель Kieselgel 60 Merck (0,015 - 0,040мм) Маса наповнювача складає 3,95кг Розчин проміжної речовини І (об'ємом, приблизно, 3 літри та вмістом сухої речовини 370 грамів), яку було одержано на першому етапі, завантажують до згаданої колонки зі швидкістю 2,4л/годину, після чого промивають 1л толуолу Після завантаження згаданого матеріалу, колонку елююють 10 літрами суміші ацетону толуолу (15 85 об'ємних %), потім 20 літрами розчину ацетону толуолу (25 75 об'ємних %) Швидкість потоку розчиннику до фракції 17 літрів дорівнює 2,4л/годину, після чого, з фракції 18 літрів, вона підвищується до 5л/годину Фракції аналізуються засобами тонкошарової хроматографії (TLC) Фракції 1-11 літрів є відходами, фракції 12 - 19 літрів розглядаються, як критичні фракції І, і з них відбираються зразки Профілі домішок аналізуються засобами високоефективної тонкошарової хроматографії (HPLC), і ними маніпулюють, як попередніми фракціями або змішують з головними фракціями Таким чином може бути одержана попередня фракція, вміст сухого матеріалу якої дорівнює 80г, яка після цього випарюється до сухості Фракції 20 - 25 літрів об'єднуються, як головна фракція Фракції 26 - 31 літр розглядаються, як критичні фракції і, після аналізу, вони об'єднуються з головною фракцією або ними маніпулюють, як кінцевою фракцією Головну фракцію, одержану вищезгаданим чином, випарюють до сухості на плівковому випарювачі, спорядженому вібраційною мішалкою Одержують 234г проміжної речовини її з виходом 80% та наступною якістю циклоспорин А 95 мас % циклоспорин U 1,2 мас % циклоспорин L 0,7 мас % циклоспорин В

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Process for purification of cyclosporin

Назва патенту російською

Способ очищения циклоспорина

МПК / Мітки

МПК: A61P 29/00, A61K 38/00, C07K 7/64, C07K 1/16, A61K 31/00, A61P 37/00, A61P 37/02

Мітки: чистоти, циклоспорин, способи, високої, очищення, циклоспорину

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/7-58511-sposobi-ochishhennya-ciklosporinu-a-ta-ciklosporin-a-visoko-chistoti.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Способи очищення циклоспорину а та циклоспорин а високої чистоти</a>

Подібні патенти