Спосіб отримання прометафазних та раннємітотичних хромосом із культури лімфоцитів

Реферат: Спосіб отримання прометафазних та раннємітотичних хромосом із культури лімфоцитів включає забір периферійної крові, культивування, гіпотонізацію розчином КСl, фіксацію сумішшю етанолу/метанолу та льодяної оцтової кислоти, центрифугування, розкапування осаду клітин на зволожені охолоджені стекла, фарбування диференційним методом та цитогенетичний аналіз за допомогою світлового мікроскопа. При цьому після забору крові та культивування додають етидіум бромід, колцемід, відцентрифуговують, додають гіпотонічний розчин, фіксатор, центрифугують та проводять цитогенетичний аналіз. UA 82455 U (12) UA 82455 U UA 82455 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, зокрема - медичної генетики, а саме – цитогенетики, і може бути використана для детекції хромосомних аномалій у людини. Відомі способи детекції хромосомних аномалій ґрунтуються на 72-годинному культивуванні лімфоцитів периферійної крові, фіксації культур, отриманні препаратів метафазних пластин хромосом та цитогенетичному аналізі в світловому мікроскопі [1-7]. Найближчим аналогом є метод отримання препаратів прометафазних та раннємітотичних хромосом для цитогенетичного аналізу, який полягає у додатковому додаванні в процесі культивування метотрексату та 5-бромдезоксиуридину/тимідину, актиноміцину Д та додаткової заміни середовища [2]. Недоліком аналогів є застосування в процесі культивування додаткових хімічних чинників (метотрексату, 5-бромдезоксиуридину, актиноміцину) та додаткової заміни культурального середовища, а отже, додаткових матеріальних затрат, та продовження часу культивування лімфоцитів. Задачею корисної моделі є розробка такого способу діагностики хромосомних аномалій, який би за рахунок доступних та недорогих методів дозволяв покращити цитогенетичний аналіз хромосомних порушень у людини. Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі без додаткових затрат на реактиви та без видовження часу культивування покращується якість діагностики за рахунок отримання препаратів прометафазних та раннєметафазних хромосом. Спосіб забезпечує точну ідентифікацію хромосомної аномалії при зменшенні часу діагностики та здешевленні на 30 % вартості проведення аналізу. Спосіб застосовують наступним чином: проводять забір венозної крові в кількості 2 мл в гепаринізований стерильний шприц, культивують 72 години в середовищі RPMI1640 з глютаміном, фітогемаглютиніном та 10 % ембріональною телячою сироваткою, на 66-68-й годині культивування вводять 0,5 мл етидіуму броміду в кінцевій концентрації 10 мкг/мл, на 6769 годині додають 0,05 мл колцеміду в кінцевій концентрації 0,01мкг/мл, культивують 10-20 хвилин, відцентрифуговують при швидкості 1500 об/хв. протягом 8 хвилин, супернатант зливають, до осаду додають 5 мл підігрітого до +37,2 ºС гіпотонічного розчину 0,075M KCl, витримують при кімнатній температурі 25 хвилин, додають 0,5 мл фіксатора (суміш етанолу/метанолу та льодяної оцтової кислоти у пропорції 3:1), відцентрифуговують при 1500 об/хв. протягом 8 хвилин, забирають супернатант, осад струшують та наносять 2-3 краплі клітинної суспензії на охолоджені предметні стекла, отримані препарати диференційно забарвлюють та проводять цитогенетичний аналіз за допомогою світлового мікроскопа. Приклад 1. Пацієнт Б., 1981 р.н., проживає у м. Львові, звернувся у 2011 році до Львівського міжобласного медико-генетичного центру з приводу первинного непліддя протягом 5-ти років. В комплексі обстежень виконане цитогенетичне дослідження згідно з стандартним протоколом, викладеним у методичних рекомендаціях [2]. На отриманих препаратах хромосоми знаходились на стадії середньої та пізньої метафази. Зідентифіковано зміни Y-хромосоми невідомого характеру. На підставі підозри хромосомної патології була проведена цитогенетична діагностика за допомогою пропонованого способу. З 1 мл венозної крові пацієнта шляхом 72-годинного культивування отримано 2 незалежні культури. Після розкапування на предметні стекла та диференційного фарбування виконана цитогенетична діагностика в світловому мікроскопі при збільшенні ×1000. Проаналізовано 20 метафазних пластин із раннємітотичними та прометафазними хромосомами. Встановлений каріотип 46,X, inv(Y)(p11.2q11.222). Для виявлення походження зміненої Y-хромосоми аналогічне дослідження виконане у батька пацієнта, 1957 р.н. Встановлений аналогічний каріотип 46,X, inv(Y)(p11.2q11.222). Отримані результати свідчать про те, що: 1. застосований метод дозволяє отримати високоякісні препарати прометафазних та раннє мітотичних хромосом без застосування додаткових хімічних чинників, додаткової заміни середовища та видовження процедури культивування. 2. застосований метод дозволяє провести точну ідентифікацію хромосомної перебудови, що дає можливість встановити коректний діагноз та призначити відповідне лікування. Отже, в результаті проведення цитогенетичної діагностики у пацієнтів ідентифікована інверсія Y-хромосоми. Приклад 2. Пацієнтка Ф, 2011 р.н., народилася та постійно проживає у м Ужгороді Закарпатської області. Проходила медико-генетичне консультування у Львівському міжобласному медикогенетичному центрі з приводу стигм дизембріогенезу. На підставі підозри хромосомної патології була проведена цитогенетична діагностика згідно з стандартним протоколом (2) та встановлено 1 UA 82455 U 5 10 15 20 25 30 35 40 наявність 45 хромосом із відсутністю 21-ї хромосоми та зміни довжини коротких плечей 18-ї хромосоми, зідентифіковано зміни хромосом невідомого характеру. Для ідентифікації хромосомних перебудов виконано цитогенетичні дослідження запропонованим способом. З 1 мл венозної крові пацієнта Ф. та її батьків методом 72-годинного культивування отримано по 2 незалежні культури від кожного обстежуваного. Проаналізовано по два диференційно забарвлених препарати, по 10 метафаз із прометафазними та раннє мітотичними хромосомами. Проводили цитогенетичний аналіз в світловому мікроскопі при збільшенні х1000. У пробанда Ф. встановлений каріотип 45,XX, -18,-21, der(18),t(18;21)(p11;p11). Отримані результати свідчать про те, що: 1. застосований метод дозволяє отримати високоякісні препарати прометафазних та раннємітотичних хромосом без застосування додаткових хімічних чинників, додаткової заміни середовища та видовження процедури культивування. 2. застосований метод дозволяє провести точну ідентифікацію хромосомної перебудови, що дає можливість встановити коректний діагноз та призначити відповідне лікування. Отже, в результаті проведення цитогенетичної діагностики встановлено складну хромосомну перебудову, яка включає моносомію по коротких плечах 18-ї хромосоми з утворенням деривату внаслідок транслокації між 18-ю та 21-ю хромосомою. Запропонований спосіб застосований при 150 дослідженнях. При цьому, в 7 випадках вдалося діагностувати наявність хромосомних перебудов. В той час, як при використанні найближчого аналога, стандартного культивування однозначний діагноз (без продовження культивування із застосуванням додаткових чинників) не вдалося встановити у жодному випадку. Таким чином, використання запропонованого способу дозволяє збільшити ефективність діагностики при зниженні тривалості процесу та зменшенні матеріальних видатків. Джерела інформації: 1. Гулеюк Н.Л. Методи культивування амніоцитів: Методичні рекомендації / Н.Л. Гулеюк, Д.В. Заставна, Г.М. Безкоровайна, О.З.Гнатейко. - Київ, 2005.-17 с. 2. Зерова-Любимова Т.Е. Цитогенетичні методи дослідження хромосом людини: Методичні рекомендації / Т.Е. Зерова-Любимова, Н.Г. Горовенко. - Київ, 2003.-23 с. 3. Захаров А.Ф. Хромосомы человека. Атлас / А.Ф. Захаров, В.А. Бенюш, Н.П. Кулешов, Л.И. Барановская. - М.: Медицина, 1982.-263 с. 4. Bangs C.D. Chromosome Preparation from Peripheral Blood. / C.D. Bangs, T.A. Donlon // Current Protocols in Human Genetics.-2005. - Suppl. 45.-4.1.1-4.1.19. 5. Lockwood D.H. The Use of Subchromosome-Length Unique Band Sequences in the Analysis of Prophase Chromosomes / D.H. Lockwood, D.A. Johnstont, V.M. Riccardit, S.0. Zimmerman // Am. J. Hum. Genet.-1988. - V. 43. - P. 934-947. 6. Rybak J. A Simple Reproducible Method for Prometaphase Chromosome Analysis / J. Rybak, A. Tharapel, S. Robinett, M. Garcia, C. Mankinen, M. Freeman // Hum Genet.-1982. - V. 60. - P. 328333. 7. Sawyer J.R. High resolution mid-prophase human chromosomes induced by echinomycin and ethidium bromide / J.R. Sawyer // Hum Genet.-1995. - V. 95. - P. 49-55. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 55 Спосіб отримання прометафазних та раннємітотичних хромосом із культури лімфоцитів, який включає забір периферійної крові, культивування 72 години при +37,2 ºС, гіпотонізацію розчином 0,075M KCl, фіксацію сумішшю етанолу/метанолу та льодяної оцтової кислоти у пропорції 3:1, центрифугування при швидкості 1500 об/хв. протягом 8 хвилин, розкапування осаду клітин на зволожені охолоджені стекла, фарбування диференційним методом та цитогенетичний аналіз за допомогою світлового мікроскопа, який відрізняється тим, що після забору крові та культивування на 66-68 годині додають етидіум бромід в кінцевій концентрації 10 мкг/мл, на 67-69 годині додають колцемід в кінцевій концентрації 0,01 мкг/мл на 10-20 хвилин, відцентрифуговують, додають гіпотонічний розчин, фіксатор, центрифугують та проводять цитогенетичний аналіз. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2