Спосіб одержання комплексу бромелайну з арабіногалактаном

Реферат: UA 83942 U UA 83942 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до харчової промисловості, зокрема до способу одержання комплексу бромелайну з арабіногалактаном, який має протеолітичну активність. Даний комплекс може бути використано як дієтична добавка. Відома дієтична добавка, що містить у складі арабіногалактан із дигідрокверцетином та аскорбіновою кислотою - препарат Діквертокс. За рахунок такого компонентного складу препарат має комплексний механізм захисної дії при грипі та ГРВІ, у тому числі імуностимулюючу, і ангіопротекторну дію. Останнє особливо важливо у випадку грипозної інфекції, оскільки головною ланкою в патогенезі грипу є ураження судинної системи, що приводить до геморагічних проявів та набряку легень (Заявка РФ на изобретение № 2008135221/15). Відомий також наноструктурований напівсинтетичний гепариноїд - "Агсулар", що представляє собою сульфатований арабіногалактан у вигляді калієвої солі. Препарат є антикоагулянтом прямої дії і гіполіпідемічним засобом. "Агсулар" володіє не тільки гіполіпідемічною дією, а й антиатеросклеротичним ефектом, що полягає в профілактиці утворення атеросклеротичних бляшок в аорті (Заявка РФ на изобретение № 2008738075) Одержують сульфатований похідний арабіногалактан шляхом взаємодії арабіногалактану в диметилсульфоксиді при співвідношенні 1:3 із сульфатуючим агентом - комплексом SО3диметилформамід із концентрацією SO3 18 %. Спосіб проводять при безперервному перемішуванні і постійній температурі 20 °C протягом 30 хв. Після цього реакційну суміш нейтралізували 10 % водним розчином КОН і висаджували в етиловий спирт. Отриману сіль сульфатованого похідного арабіногалактану очищали діалізом проти дистильованої води. Потім розчин упарювали до мінімального об'єму і осаджували етиловим спиртом. 1 г арабіногалактану розчиняли при перемішуванні в 3 мл диметилсульфоксиді, потім добавляли 10 мл комплексу SO3 - диметилформамід із концентрацією SO3 18 %. Сульфатування проводили при інтенсивному переметуванні при t=20 °C протягом 30 хв. Після цього реакційну суміш нейтралізували 17 мл 10 % водного розчину Са(ОН) 2, осаджуючи в 500 мл етилового спирту. Отриманий осад фільтрували на скляному фільтрі № 40, розчиняли в 50 мл дистильованої води і проводили діаліз проти дистильованої води протягом 6 діб. Розчин упарювали до 30 мл і осаджували в 150 мл етилового спирту. Вихід отриманого продукту склав 98 %. Окрім цього, відомий комплекс ніфедепіну з арабіногалактаном (див. патент РФ № 2391980). Комплекс ніфедипіну (диметиловий ефір 2,6-диметил-4-(2'-нітрофенол)-1,4-дигідропіридин-3,5дикарбонової кислоти) з полісахаридом арабіногалактаном, отримували методом механохімічної активації у планетарному млині (при прискоренні 60g); суміш твердих компонентів при ваговому співвідношенні ніфедипін:арабіногалактан 1:(10-40). Але відомий комплекс не має протеолітичної активності. З науково-технічної і патентної літератури заявнику невідомо комплекс бромелайну з арабіногалактаном, а також спосіб його одержання. В основу корисної моделі поставлено задачу створити спосіб одержання раніше невідомого комплексу бромелайну з арабіногалактаном, який має протеолітичну активність. Поставлена задача вирішена способом одержання комплексу бромелайну з арабіногалактаном сосни Pinus silvestris, що включає приготування водних розчинів з масовою часткою бромелайну від 0,1 до 1,0 % та арабіногалактану від 0,1 до 2,5 %, змішування отриманих водних розчинів при співвідношенні (1-2):(2:1), витримування суміші протягом 15-60 хв при 20-35 °C і наступне сушіння при 30-60 °C. Як в Україні так і за її межами такий комплекс з протеолітичною активністю та спосіб його одержання не описано. Комплекс арабіногалактану з протеолітичним ферментом бромелайном одержували, варіюючи масову частку бромелайну в розчині від 0,1 до 1,0 %, арабіногалактану - від 0,1 до 2,5 % при співвідношенні об'ємів водних розчинів ферменту та полісахариду (1-2):(2:1), при t=20-35 °C. Отримані зразки висушували. Для визначення тривалості процесу комплексоутворення контролювали активність ферменту в складі комплексу через кожні 15 хвилин протягом години. Арабіногалактан одержували біотехнологічним способом із тирси сосни Pinus silvestris. Приклад. Готували 0,5 %-ні розчини арабіногалактану й бромелайну шляхом розчинення наважок у 3 дистильованій воді при 22 °C і перемішуванні. До розчину арабіногалактану 100 см додавали 3 при перемішуванні 100 см розчин бромелайну. Суміш витримували при температурі 22 °C протягом 30 хвилин. Комплекс висушували при температурі 40 °C, використовуючи конвекційнусушку. Отримано 0,975 г. В отриманому комплексі співвідношення арабіногалактану:бромелайн 1 UA 83942 U 5 10 15 20 25 30 1:1 (на суху речовину). Активність ферментної складової комплексу сягає 80 % від активності нативного ферменту (див. табл.). рН оптимум вільного бромелайну знаходиться біля 6 од. Оптимальне значення рН для бромелайну в складі комплексу знаходиться в межах 6-8 (фіг. 1). Термооптимум складає 50 °C (фіг. 2). Крива 1 на фіг 1,2, 3, 4 - вільний фермент; крива 2 - фермент у складі комплексу. Термостабільність ферменту в отриманому продукті визначали при фізіологічних значеннях температури (37 °C) та температурі 50 °C. Бромелайн при зазначених температурах має сталу активність. У комплексі з арабіногалактаном за цих умов його активність поступово зростає до максимальної (фіг. 3, 4). При 37 °C максимальної активності фермент у комплексі досягає за 4,5 год. (фіг. 3), у той час як при 50 °C - за 3 год. (фіг. 4). Це свідчить, що комплекс проявляє пролонговану дію. Додатковим підтвердженням утворення комплексу арабіногалактан - бромелайн є результати дослідження отриманого продукту методами гель-хроматографії, ІЧ-спектроскопії, ЯМР-спектроскопії. Вихідні криві елюції арабіногалактану та ферменту на сефадексі G-75 представлено на фіг. 5, 6 (відповідно гель-хроматома арабіногалактану та гель-хроматома бромелайну) , а продукту їх взаємодії - на фіг. 7 (гель-хроматома комплексу арабіногалактан-бромелайн, крива 1 полісахаридна складова, крива 2 - білкова складова). Піки полісахаридної та білкової складових сумісні і об'єм їх виходу відповідає значенню молекулярної маси блакитного декстрану 90 kDa і є адитивною величиною молекулярних мас арабіногалактану (65 kDa) та бромелайну (33 kDa). У порівнянні з ІЧ-спектрами вихідних сполук, у спектрі продукту взаємодії арабіногалактан бромелайн має місце зміщення смуги поглинання карбонільних груп у низькочастотну область; смуги поглинання гідроксильних груп - у високочастотну; смуга поглинання груп NH 2 у спектрі -1 комплексу знаходиться при 3305-3345 см тоді як відповідна смуга поглинання в ІЧ-спектрі -l бромелайну складає 3290-3417 cm (фіг. 8 - ІЧ-спектр білок-полісахаридного комплексу). Отже інтерпретація спектрів поглинання комплексу та його складових в інфрачервоній області показала, що взаємодія арабіноглактану з бромелайном супроводжується значними змінами в ІЧ-спектрі. 13 Комплексоутворення білка з полісахаридом підтверджено спектрами ЯМР С (фіг. 9 - ЯМР 13 С білок-полісахаридного комплексу) . Дієтичну добавку у вигляді комплексу бромелайну з арабіногалактаном для покращення реологічних властивостей крові вживають перорально. Таблиця Активність ферменту у складі комплексу від активності нативного ферменту Час комплексоутворення 15 30 45 S:F Vs/Vf 1:1 1:2 2:1 1:1 1:2 2:1 1:1 1:2 2:1 0,2:1 0,6:1 1:1 1,4:1 2:1 3,5:1 5:1 61,35 51,35 29,05 67,61 55,35 33,45 65,31 55,12 33,52 72,45 52,45 29,67 78,41 56,45 34,53 77,04 56,15 34,70 75,69 54,69 38,54 80,83 75,69 40,23 79,22 75,40 40,05 75,89 55,89 31,45 80,03 65,89 41,56 78,53 63,45 41,76 75,61 57,61 32,43 79,90 57,61 42,07 77,90 57,61 41,89 75,71 60,71 32,30 79,77 60,71 42,56 78,87 60,71 41,70 75,67 60,67 32,06 79,83 60,67 42,43 78,53 60,67 41,50 35 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 Спосіб одержання комплексу бромелайну з арабіногалактаном, який характеризується тим, що включає приготування водних розчинів з масовою часткою бромелайну від 0,1 до 1,0 % та арабіногалактану від 0,1 до 2,5 %, змішування отриманих водних розчинів при співвідношенні (1-2):(2:1), витримування суміші протягом 15-60 хв при 20-35 °C і наступне сушіння при 30-60 °C. 2 UA 83942 U 3 UA 83942 U 4 UA 83942 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5