Спосіб отримання андрогенних калусів цукрових буряків in vitro

Реферат: UA 86424 U UA 86424 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології та селекції для отримання ембріоногенного калусу in vitro з пиляків цукрових буряків та створення гаплоїдних рослин з диплоїдних та диплоїдних з тетраплоїдних і відповідних гомозиготних ліній. Відомий спосіб отримання калусу на сегментах листка, частинках черешків і пагонів цукрових буряків, що включає культивування експлантів на модифікованому середовищі Гамборга з вітамінами за Уайтом з додаванням 0,1 мг/л НОК, 0,2 мг/л БАП, або 0,1-0,5 мг/л 2,4Д і БАП. Відомий спосіб отримання ембріоногенного калусу з пиляків кукурудзи (Сатарова Т.Н. Особенности культуры пыльников кукурузы на примере генотипа В14 Ч W19 // Изв. РАН. Сер. Биология. - 1994. - 5. - С. 771-779), що включає холодову передобробку матеріалу при 8 °C, протягом 14 діб у холодильнику. Впливу холодом піддають волоті, загорнуті в мокрі паперові рушники і поліетиленові пакети або висаджені на живильне середовище пиляки. Після передобробки холодом для індукції ембріогенного калусу пиляки висаджують на живильне середовище Дженовезі YP (Genovesi A.D., Collins G.E. In vitro production of haploid plant of corn via anther culture // Crop. Sci.-1982.-22, № 6. - P. 1137-1144.). Утворений ембріогенний калус пересаджують на середовище YPd (Petolino J., Jones A. of elite genotypes of maise // Crop. Sci.1986.-26. - P. 1072-1074.), що містить 7,7 мг/л гліцину, 500,0 - гідролізату казеїну, 1,0 - ІОК, 1,0 кінетину, 146 мг/л глютаміну, 30 г/л сахарози, 2,5 - активованого вугілля, 7 г/л агару "Difco" для ініціації утворення колеоптиля та корінця. Культивують пиляки та калус при 27 С і 16-годинному освітленні. У відомому способі пиляки висаджують на середовище Дженовезі YP, яке за кількістю макро-мікроелементів суттєво відрізняється від середовища Мурасіге-Скуга, що використовується в запропонованому способі, містить іншій кількісний склад вітамінів - тіаміну, піридоксину та нікотинової кислоти, а також іншу кількість гліцину, сахарози та додатково містить пантетонат кальцію, гідролізат казеїну, активоване вугілля, трийодбензойну кислоту, які відсутні у середовищі для ініціації калусогенезу у запропонованому способі отримання андрогенних калусів цукрових буряків in vitro, друге середовище, на яке пересаджують андрогенні калуси кукурудзи також суттєво відрізняється від запропонованого, воно не містить активованого вугілля, трийодбензойної кислоти та крім вищезгаданих розбіжностей за кількістю макро-мікроелементів, вітамінів, гліцину, сахарози, містить кінетин та ІОК, які відсутні у другому середовищі запропонованого способу та інші дози глутаміну. Найбільш близьким аналогом є спосіб отримання андрогенних калусних тканин для різних генотипів яблуні, в основі якого лежить властивість мікроспор та інших клітин пиляка в певних умовах переключатися з характерного для них гаметофітного на спорофітний шлях розвитку з утворенням гаплоїдних рослин. Спосіб включає передобробку пиляків перед висівання на середовище пониженими температурами (+3…+5 °C протягом 8 діб, висаджування їх на живильне середовище Мурасіге-Скуга з додаванням кінетину, ІОК, ІМК, НОК, 2,4-Д по 1 мл/л або з додаванням 2,0 мг/л кінетину; 3,0 мг/л ІОК; 0,8 мг/л 2,4Д; 1,0 мг/л БАП, культивування пиляків після посіву в темряві при температурі 24+2 °C та відносній вологості повітря 60-70 %, а після утворення калусів - при 16-годинному освітленні 1000-1500 люкс, пасивуванням калусів на інші регенераційні середовища перший пасаж - середовище з додаванням 1 мг/л НОК, 2 мг/л БАП (середовище Р); 1 мг/л НОК, 7мг/л БАП, 2 мг/л кінетину (середовище Рі), третій - 1 мг/л НОК, 2 мг/л БАП, 5 мг/л кінетина (середовище Р2), витримуванням калусів на останньому третьому середовищі 1,5 місяці до появи на калусах пагонів. Відомий та пропонований способи мають спільні суттєві ознаки: передобробку пиляків перед висаджуванням на живильне середовище пониженими температурами; - висаджування їх на живильне середовище з макро-мікроелементами та додаванням ІОК, ІМК, НОК, 2,4-Д та БАП; - культивування пиляків після посіву в темряві при температурі 24+2 °C та відносній вологості повітря 60-70 %; - культивування пиляків після утворення калусів - при 16-годинному освітленні 1000-1500 люкс; - 3-4 кратне пасивування калусів на середовища з іншим гормональним складом. Але відомий спосіб не забезпечує отримання андрогенних калусів цукрових буряків in vitro, тому що призначений для отримання андрогенних калусів саме з пиляків яблуні, у якої навіть різні генотипи для ініціації та розвитку калусних тканин потребують певного складу та співвідношення гормональних речовин у живильному середовищі; всі живильні середовища аналога містять занадто високі дози макроелементів, а також - ауксинів та цитокінінів, відрізняються за кількістю бору, не містять певних амінокислот, тоді як у запропонованому способі отримання андрогенних калусів цукрових буряків in vitro, саме знижені дози 1 UA 86424 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 макроелементів, збалансовані співвідношення гормональних речовин, амінокислот забезпечують отримання калусів з пиляків цукрових буряків, а послідовне пересаджування калусів забезпечує появу пагонів. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб отримання андрогенних калусів цукрових буряків in vitro шляхом висаждування пиляків на живильні середовища певного складу. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі отримання андрогенних калусних тканин для різних генотипів яблуні, що включає холодову передобробку матеріалу при 8 °C, протягом 14 діб у холодильнику; висаджування пиляків на живильне середовище з макромікроелементами та додаванням ІОК, ІМК, НОК, 2,4-Д та БАП; культивування пиляків після посіву в темряві при температурі 24+2 °C та відносній вологості повітря 60-70 %, а після утворення калусів - при 16-годинному освітленні 1000-1500 люкс; 3-4-кратне пасивування калусів на середовища з іншим гормональним складом, згідно з корисною моделлю холодову передобробку матеріалу - генеративних стебел з бутонами, відокремлених від насінників цукрових буряків, занурених у воду, або розчин макро-мікроелементів за Мурасіге-Скугом у повній дозі чи розведеній в 2-4 рази проводять у холодильній камері за температури 6-10 °C, при 16-годинному освітленні 1000-1500 люкс протягом 7-20 діб; пиляки висаджують на модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози мікроелементів та повну дозу мікроелементів, бор використовують у подвійній дозі з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л, амінокислот: глютамінової - 250-500 мг/л, аспарагінової кислоти - 30-50 мг/л, тирозину - 1-10 мг/л, аргініну - 2-10 мг/л, гідроксипроліну - 2-4 мг/л, регуляторів росту: 2,4-Д - 1-2,5 мг/л та БАП - 0,3-0,8мг/л, після посіву пиляки культивують в темряві за температури 26-32 °C та відносній вологості повітря 50-70 %; після появи калусу його пересаджують на друге середовище - модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л та БАП - 0,5-1,5 мг/л, через 15-30 діб калуси пересаджують на трете середовище - модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л, а також БАП - 1-5 мг/л, ІОК або НОК 0,2-0,6мг/л та ГК - 0,2-1,0 мг/л і витримують 1-2 місяці до появлення первинних корінців та бруньок. Новими суттєвими ознаками корисної моделі є: - проведення холодової передобробки матеріалу - генеративних стебел з бутонами, відокремлених від насінників цукрових буряків, занурених у воду, або водний розчин макромікроелементів за Мурасіге-Скугом у повній дозі чи розведеній в 2-4 рази за у холодильній камері за температури 6-10 °C, при 16-годинному освітленні 1,0-2,0 клк протягом 7-30 діб; - склад первинного середовища, на яке висаджують пиляки для ініціації калусогенезу модифікованого середовища Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози мікроелементів та повну дозу мікроелементів, з використанням бору у подвійній дозі та додаванням вітамінів за Гамборгом і аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л, амінокислот: глютамінової - 250-500 мг/л, аспарагінової кислоти - 30-50 мг/л, тирозину -1-10 мг/л, аргініну - 2-10 мг/л, гідроксипроліну - 2-4 мг/л, регуляторів росту: 2,4-Д - 1-2,5 мг/л та БАП - 0,3-0,8мг/л; - склад другого середовища, на яке пересаджують калуси для стимуляції їх росту модифікованого середовища Мурасіге-Скуга, з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л та БАП -0,5-1,5 мг/л; - склад третього середовища, на яке пересаджують калуси для стимуляції органогенезу появи первинних корінців та бруньок - модифікованого середовища Мурасіге-Скуга, з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л, а також БАП - 1-5 мг/л, ІОК або НОК 0,2-0,6мг/л та ГК - 0,2-1,0 мг/л. Впровадження запропонованого способу отримання андрогенних калусів цукрових буряків in vitro забезпечить створення гаплоїдних рослин цукрових буряків з диплоїдних та диплоїдних з тетраплоїдних і відповідних гомозиготних ліній, що значно прискорить селекційний процес. Спосіб здійснюється таким чином. Стебла з бутонами насінників цукрових буряків, занурюють у воду або розчин макромікроелементів за Мурасіге-Скугом у повній дозі чи розведеній в 2-4 рази, проводять їх холодову передобробку у холодильній камері за температури 6-10 °C, при 16-годинному освітленні 1,0-2,0 клк протягом 7-30 діб. Після охолодження пиляки висаджують на модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози мікроелементів та повну дозу мікроелементів (бор використовують у подвійній дозі), вітаміни: нікотинову кислоту - 1.0 мг/л, піридоксин -1,0 мг/л тіамін 10,0 мг/л - за Гамборгом та аскорбінову кислоту - 1 мг/л, з додаванням амінокислот: глютамінової - 250-500 мг/л, аспарагінової кислоти - 30-50 мг/л, тирозину - 1-10 мг/л, аргініну -2-10 мг/л, гідроксипроліну - 2-4 мг/л, регуляторів росту: 2,4-Д - 1 2 UA 86424 U 5 10 15 2,5 мг/л та БАП - 0,3-0,8 мг/л. Культивують пиляки після висаджування на живильне середовище в темряві за температури 26-32 °C та відносній вологості повітря 50-70 %. Після появи калусу його пересаджують на друге середовище - модифіковане середовище МурасігеСкуга, що містить вітаміни: нікотинову кислоту - 1.0 мг/л, піридоксин - 1,0 мг/л, тіамін 10,0 мг/л за Гамборгом та аскорбінову кислоту - 1 мг/л, з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л та БАП - 0,5-1,5 мг/л. Через 15-30 діб калуси пересаджують на трете середовище - модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л, а також БАП - 1-5 мг/л, ІОК або НОК 0,2-0,6мг/л та ГК - 0,2-1,0 мг/л і витримують 1-2 місяці до появлення первинних корінців та бруньок. Дані, що наведені в таблиці 1, свідчать, що умови холодової перед обробки рослинного матеріалу цукрових буряків - генеративних стебел, відокремлених від насінників, занурених у воду чи водний розчин макро-мікроелементів за Мурасіге-Скугом, розміщених у холодильній камері за температури 6-10 °C, при 16-годинному освітленні 1,0-2,0 клк, які запропоновані у корисній моделі - забезпечують не тільки холодову перед обробку, а й тривале - більш як 45 діб, збереження в умовах холодильної камери, тоді як зберігання окремих пиляків чи стебел, загорнутих у мокрий фільтрувальний папір забезпечує менш тривале їх збереження - не більше 10 діб. Таблиця 1 Вплив умов холодової передобробки рослинного матеріалу цукрових буряків - генеративних стебел, відокремлених від насінників на тривалість його збереження в умовах холодильної камери № 1. 2. 20 25 30 Умови холодової обробки генеративних стебел Згідно з найближчим аналогом Згідно з корисною моделлю 8 + + 10 + + Тривалість збереження, діб 15 20 зо 40 + + + + 45 + Дані, які наведені в таблиці 2, свідчать, що використання середовищ, які надані у аналозі не сприяє ініціації утворення калусу. Утворення калусних тканин на пиляках цукрових буряків в умовах in vitro відбувається тільки на запропонованому середовищі - модифікованому середовище Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози мікроелементів та повну дозу мікроелементів, з використанням бору у подвійній дозі та додаванням вітамінів за Гамборгом і аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л, амінокислот: глютамінової - 250-500 мг/л, аспарагінової кислоти - 30-50 мг/л, тирозину - 1-10 мг/л, аргініну - 2-10 мг/л, гідроксипроліну - 2-4 мг/л, регуляторів росту: 2,4-Д - 1-2,5 мг/л та БАП - 0,3-0,8 мг/л, подальший їх ріст забезпечує друге середовище модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л та БАП - 0,5-1,5 мг/л, а появу первинних корінців та бруньок трете середовище - модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л, а також БАП - 1-5 мг/л, ІОК або НОК 0,2-0,6мг/л та ГК - 0,2-1,0 мг/л. Таблиця 2 Вплив живильного середовища на ініціацію калусогенезу на пиляках цукрових буряків, регенерацію пагонів в культурі in vitro № 1. 2 3. 4 5. 6. 7. 8. 35 Середовище № 1 за аналогом № 1а за аналогом № 2 за аналогом № 3 за аналогом № 4 за аналогом № 1 корисної моделі № 2 корисної моделі № 3 корисної моделі Ініціація утворення калусу + Середовище № 1 за прототипом 3 Ріст калусу + + + Проліфірація корінців та стебла + UA 86424 U 5 10 15 20 25 30 Живильне середовище Мурасіге-Скуга з додаванням кінетину, ІОК, ІМК, НОК, 2,4-Д по 1 мл/л. Середовище № 1а за аналогом Живильне середовище Мурасіге-Скуга з додаванням 2,0 мг/л кінетину; 3,0 мг/л ІОК; 0,8 мг/л 2,4Д; 1,0 мг/л БАП. Середовище № 2 за аналогом Живильне середовище Мурасіге-Скуга з додаванням 1 мг/л НОК, 2 мг/л БАЛ (Р). Середовище № 3 за аналогом Живильне середовище Мурасіге-Скуга з додаванням 1 мг/л НОК, 7мг/л БАП, 2 мг/л кінетииа (середовище Рі) Середовище № 4 за аналогом Живильне середовище Мурасіге-Скуга з додаванням 1 мг/л НОК, 2 мг/л БАП, 5 мг/л кінетина (середовище Р2) Середовище № 1 корисної моделі Модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози мікроелементів та повну дозу мікроелементів, з використанням бору у подвійній дозі та додаванням вітамінів за Гамборгом і аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л, амінокислот: глютамінової - 250-500 мг/л, аспарагінової кислоти - 30-50 мг/л, тирозину - 1-10 мг/л, аргініну - 2-10 мг/л, гідроксипроліну - 2-4 мг/л, регуляторів росту: 2,4-Д - 1-2,5 мг/л та БАП - 0,3-0,8мг/л. Середовище № 2 корисної моделі Модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л, а також БАП - 0,5-1,5 мг/л; Середовище № 3 корисної моделі Модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л, а також БАП - 1-5 мг/л, ІОК або НОК 0,2-0,6 мг/л та ГК - 0,21,0 мг/л. Пропонований спосіб отримання андрогенних калусів цукрових буряків in vitro сприятиме створенню гаплоїдних рослин цукрових буряків з диплоїдних та диплоїдних з тетраплоїдних і відповідних гомозиготних ліній, що дозволяє значно прискорити селекційний процес за рахунок скорочення часу на створення гомозиготних ліній цукрових буряків. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 45 50 55 Спосіб отримання андрогенних калусів цукрових буряків in vitro, що включає холодову передобробку пиляків, висаджування пиляків на живильне середовище з макромікроелементами та додаванням ІОК, ІМК, НОК, 2,4-Д та БАП, культивування пиляків після висаджуання в темряві при температурі 24+2 °С та відносній вологості повітря 60-70 %, культивування пиляків після утворення калусів - при 16-годинному освітленні 1000-1500 люкс, 34-кратне пасивування калусів на середовища з іншим гормональним складом, який відрізняється тим, що для холодової передобробки як експланти використовують генеративні стебла з бутонами, відокремлені від насінників цукрових буряків, занурені у воду або розчин макро-мікроелементів за Мурасіге-Скугом у повній дозі чи розведеній в 2-4 рази у холодильній камері за температури 6-10 °C, при 16-годинному освітленні 1000-1500 люкс протягом 7-20 діб; пиляки висаджують на модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози мікроелементів та повну дозу мікроелементів, бор у подвійній дозі, з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л, амінокислот: глютамінової - 250-500 мг/л, аспарагінової кислоти - 30-50 мг/л, тирозину - 1-10 мг/л, аргініну - 2-10 мг/л, гідроксипроліну - 2-4 мг/л, регуляторів росту: 2,4-Д - 1-2,5 мг/л та БАП - 0,3-0,8 мг/л, культивування пиляків після посіву в темряві за температури 26-32 °С та відносній вологості повітря 50-70 % до появи калусу, пересаджування його на друге середовище - модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л та БАП - 0,5-1,5 мг/л, пересаджування калусів через 15-30 діб на трете середовище - модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, з додаванням вітамінів за Гамборгом та аскорбінової кислоти в дозі 1 мг/л, а також БАП - 1-5 мг/л, ІОК або НОК 0,2-0,6 мг/л та ГК - 0,2-1,0 мг/л, витримування його 1-2 місяці до появлення первинних корінців та бруньок. 4 UA 86424 U Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5