Застосування сирамезину в лікуванні злоякісних пухлин

1. Застосування сирамезину або його фармацевтично прийнятної солі для приготування фармацевтичної композиції для використання в лікуванні злоякісної пухлини. 2. Застосування сирамезину або його фармацевтично прийнятної солі для приготування фармацевтичної композиції, призначеної для збільшення та/або забезпечення посиленого ефекту хіміотерапевтичного засобу в лікуванні злоякісної пухлини. 3. Застосування сирамезину або його фармацевтично прийнятної солі для приготування фармаце 2 (19) 1 3 Цей винахід відноситься до застосування сирамезину для приготування лікарських засобів, ефективних для лікування злоякісних пухлин. Пухлинні клітини часто мають придбану стійкість до класичних лікувальних методик, таких як класичний опосередкований каспазою апоптоз. Проте, все ще залишається велика незадоволена потреба в нових ефективних лікарських засобах для лікування злоякісних пухлин. Відомо, що в клітинах, які представляють багато різних типів злоякісних пухлин, стимульовані сигма2рецептори [Bem et al. 1991, Cancer Res. 51, 6558; Vilner et al. 1995, Cancer Res. 55, 408], і, крім того, що ліганди сигма2-рецепторів можуть інгібувати клітинну проліферацію та індукувати апоптоз в пухлинних клітинах [Brent & Pang, 1995, Eur. J. Pharmacol. 278, 151; Crawford & Bowen, 2002, Cancer Res. 62, 313]. Додатково було показано, що сигма2-ліганди можуть потенціювати активність протипухлинних препаратів [Crawford & Bowen, 2002, Cancer Res. 62, 313]. Міжнародна патентна публікація № WO 92/22554 описує ряд лігандів сигма-рецепторів, які вважаються ефективними для лікування ряду психічних і неврологічних розладів. Зв'язок структури цих сполук з їх активністю була також досліджена [Perregaard, J. et al., J. Med. Chem., 1995, 38, 11, p. 1998-2008]. Серед інших численних сполук у WO 92/22554 розкрито сполуку 1'-[4-[1-(4-фторфеніл)-1H-індол3-іл]-1-бутил]-спіро[ізобснзофуран-1(3H)4'піперидин] (сирамезин), нове застосування, якої є предметом цього винаходу. Авторами винаходу несподівано виявлено, що сирамезин має значно більш сильну протипухлинну активність, ніж сигма2-ліганди згідно вищенаведеному посиланню. Цей винахід відноситься до лікарського засобу для лікування злоякісної пухлини. Ліганди сигма2рецепторів були відомі як засоби, що індукують апоптоз в пухлинних клітинах різного походження. Авторами винаходу несподівано виявлено, що, згідно винаходу, сирамезин, коли застосовується окремо, більш сильно індукує апоптоз в пухлинних клітинах, ніж сигма2-активні сполуки згідно вищенаведеному посиланню, такі як галоперидол. Крім того, автори спостерігали значний синергічний ефект сирамезину, вживаного в комбінації з відомими хіміотерапевтичними сполуками, такими як етопозид, доксорубіцин, стауроспорин, вінкристин і тамоксифен. Тому цей винахід демонструє, що сирамезин може бути застосований для виробництва фармацевтичних композицій для лікування 87292 4 злоякісної пухлини і що такі композиції можуть бути застосовані в комбінації з іншими хіміотерапевтичними протипухлинними препаратами та/або в комбінації з променевою терапією. При комбінованому застосуванні сирамезину та протипухлинних хіміотерапевтичних препаратів лікарські засоби можуть вводитися одночасно або послідовно. У одному варіанті здійснення цей винахід відноситься до застосування сирамезину або його фармацевтично прийнятної солі разом з хіміотерапевтичним засобом в синергічній ефективній дозі для приготування фармацевтичної композиції, як вказано вище, яка адаптована для одночасного введення активних інгредієнтів. Зокрема, такі фармацевтичні композиції можуть містити активні інгредієнти в одній і тій же стандартній дозованій формі, наприклад, в одній і тій же пігулці або капсулі. Такі стандартні дозовані форми можуть містити активні інгредієнти у вигляді гомогенної суміші або в окремих відсіках стандартної дозованої форми. У іншому варіанті здійснення цей винахід відноситься до застосування сирамезину або його фармацевтично прийнятної солі разом з хіміотерапевтичним засобом в синергічній ефективній дозі для приготування фармацевтичної композиції або набору, як вказано вище, які адаптовані для послідовного введення активних інгредієнтів. Зокрема, такі фармацевтичні композиції можуть містити активні інгредієнти в окремих стандартних дозованих формах, наприклад, окремих пігулках або капсулах, які містять будь-який з активних інгредієнтів. Ці окремі стандартні дозовані форми можуть міститися в одному і тому ж контейнері або пакеті, наприклад, блістерній упаковці. Вживаний тут термін "набір" означає фармацевтичну композицію, яка містить кожний з активних інгредієнтів, але в окремих стандартних дозованих формах. Вживаний тут термін "синергічне ефективне дозування" означає таке дозування сирамезину та хіміотерапевтичних засобів, при якому їх комбіноване застосування забезпечує синергічний ефект, переважно максимальний досяжний синергічний ефект. Згідно винаходу, фармацевтична композиція або набір можуть бути адаптовані для одночасного введення активних інгредієнтів або для послідовного введення активних інгредієнтів, як описано вище. Зокрема, цей винахід відноситься до нового застосування сирамезину, що має загальну формулу 5 87292 6 або його фармацевтично прийнятних солей льно, і вони можуть бути представлені в будь-якій для приготування лікарського засобу для лікуванвідповідній формі для такого введення, наприклад, ня злоякісної пухлини. у формі пігулок, капсул, порошків, сиропів або розКрім того, цей винахід відноситься до способу чинів або дисперсій для ін'єкції. Переважно, і відлікування злоякісної пухлини, який включає ввеповідно до завдання цього винаходу, сполука згіддення індивідууму, що потребує цього, фармацевно винаходу вводиться у формі твердого тично прийнятної кількості сирамезину або його фармацевтичного об’єкту відповідно у вигляді піфармацевтично прийнятної солі. гулки або капсули, або у формі суспензії, розчину У ще одному аспекті винахід відноситься до або дисперсії для ін'єкції. способу лікування злоякісної пухлини, який вклюВ цій галузі добре відомі способи приготуванчає введення сирамезину або його фармацевтичня твердих фармацевтичних препаратів. Таким но прийнятної солі індивідууму, якого слід лікувати чином, пігулки можуть бути приготовані шляхом або який вже лікується хіміотерапевтичним засозмішування активних інгредієнтів із звичайними бом: ад'ювантами та/або розріджувачами і наступним Згідно винаходу, сполука, 1'-[4-[1-(4пресуванням суміші в звичайній таблетувальній фторфеніл)-1H-індол-3-іл]-1-бутил]машині. Приклади ад'ювантів або розріджувачів спіро[ізобензофуран-1(3H),4'-піперидин] (сирамевключають: кукурудзяний крохмаль, лактозу, зин), може бути застосована у вигляді основи або тальк, магнію стеарат, желатин, лактозу, смоли і у вигляді її фармацевтично прийнятної кислотноподібне. Будь-який інший ад'ювант або добавка, адитивної солі або у вигляді ангідрату або гідрату такі як барвники, ароматичні речовини, консервантакої солі. Солі сполуки, вживані у винаході, являти тощо, також можуть застосовуватися за умови, ють собою солі, утворені з нетоксичними органічщо вони сумісні з активними інгредієнтами. ними або неорганічними кислотами. З таких оргаВживаний тут термін "композиція" означає нічних солей використовуються солі з малеїновою, продукт, який включає певні інгредієнти в певних фумаровою, бензойною, аскорбіновою, бурштинокількостях, так само як будь-який продукт, який вою, щавлевою, бісметиленсаліциловою, метапрямо або побічно є результатом комбінації певнсульфоновою, етандисульфоновою, оцтовою, них інгредієнтів в певних кількостях. Фармацевтипропіоновою, винною, саліциловою, лимонною, чні композиції, які містять активний інгредієнт, моглюконовою, молочною, яблучною, мигдалевою, жуть бути у формі, придатній для перорального коричною, цитраконовою, аспарагіновою, стеаризастосування, наприклад, у вигляді різних видів новою, пальмітиновою, ітаконовою, гліколевою, пігулок, таблеток, коржиків, водних або масляних пара-амінобензойною, глутаміновою, бензолсульсуспензій, дисперсних порошків або гранул, емуфоновою і теофіліноцтовою кислотами, так само льсій, твердих або м'яких капсул, або сиропів або як з 8-галогентеофілінами, наприклад, 8еліксирів. Композиції, призначені для пероральнобромтеофіліном. З таких неорганічних солей викого застосування, можуть бути приготовані відповіристовуються солі з соляною, бромистоводневою, дно до будь-якого відомого в даній галузі способу сірчаною, сульфаміновою, фосфорною і азотною виробництва фармацевтичних композицій, і такі кислотами. Переважно, сполука застосовується у композиції можуть містити один або більше засовигляді фумарату або хлористоводневої солі. бів, вибраних з групи, що складається з підсолоФумарат 1'-[4-[1-(4-фторфеніл)-1H-індол-3-іл]джуючих речовин, смакових добавок, барвників і 1-бутил]-спіро[ізобензофуран-1(3H),4'-піперидину] консервантів, для забезпечення фармацевтично може бути приготований, як описано у [Perregaard, приємних і прийнятних препаратів. Пігулки містять J. et al., J. Med. Chem., 1995,38,11,1998-2008 (споактивний інгредієнт в суміші з нетоксичними фарлука 14f)], а основа та інші фармацевтично прийнмацевтично прийнятними ексципієнтами, які підятні солі можуть бути одержані відповідно до стаходять для виробництва пігулок. Ці ексципієнти ндартних процедур. можуть бути, наприклад, інертними розріджувачаТаким чином, кислотно-адитивні солі за винами, такими як кальцію карбонат, натрію карбонат, ходом можуть бути одержані шляхом обробки 1'лактоза, кальцію фосфат або натрію фосфат; гра[4-[1-(4-фторфеніл)-1H-індол-3-іл]-1-бутил]нулюючими агентами і дезинтеграторами, наприспіро[ізобензофуран-1(3H),4'-піперидину] кислотою клад, мікрокристалічною целюлозою, натрію кросв інертному розчиннику з наступними преципітацікармелозою, кукурудзяним крохмалем або єю, виділенням і необов'язково перекристалізаціальгіновою кислотою; зв'язувальними агентами, єю за відомими способами і, якщо бажано, мікронінаприклад, крохмалем, желатином, полівінілпірозацією кристалічного продукту вологим або сухим лідоном або гуміарабіком, і змащувальними засопомелом, або іншим зручним способом, або пригобами, наприклад, магнію стеаратом, стеариновою туванням частинок за способом емульгування розкислотою або тальком. чинника. Згідно винаходу, композиції можуть бути заПереважно, преципітація солі виконується в стосовані для лікування злоякісної пухлини у ссавінертному розчиннику, наприклад, інертному поляців, переважно у людей. рному розчиннику, такому як спирт (наприклад, Сирамезин або його сіль для застосування згіетанол, 2-пропанол і н-пропанол). дно винаходу найзручніше вводити перорально в Згідно винаходу, 1'-[4-[1-(4-фторфеніл)-1Hстандартних дозованих формах, таких як пігулки індол-3-іл]-1-бутил]-спіро[ізобензофуран-1(3H),4'або капсули, що містять активний інгредієнт (в піперидин] або його фармацевтично прийнятна розрахунку на вільну основу) в кількості від присіль можуть вводитися будь-яким відповідним близно 0,01мкг/кг/день до 100мг/кг/день, переважшляхом, наприклад, перорально або парентерано від 0,01мкг/кг/день до 30мг/кг/день маси тіла, 7 87292 8 більш переважно від 0,5мг/день/кг до 7,0мг/день/кг ки матки (цервикальну карциному, передпухлинну маси тіла. Коли сирамезин комбінований з іншими цервикальну дисплазію), яєчників (яєчникову карсполуками, щоб одержати збільшений ефект або циному [серозну цистаденокарциному, муцинозну щоб дати можливість застосуванню субнормальцистаденокарциному, некласифіковану карциноної дози іншої сполуки для мінімізації побічних му], пухлини з клітин гранулезної оболонки, пухлиефектів, тоді для лікування можуть бути застосони з клітин Сертолі-Лейдига, дисгерміному, злояківані субнормальні дози сирамезину та/або іншої сну тератому), вульви (плоскоклітинну карциному, сполуки. Розрахунок певних доз для пацієнтів є інтраепітеліальну карциному, аденокарциному, звичайною практикою для фахівців в даній галузі. фібросаркому, меланому), піхви (світлоклітинну Фармацевтичні композиції та способи згідно з карциному, плоскоклітинну карциному, ботріоїдну цим винаходом вважаються особливо ефективнисаркому (ембріональну рабдоміосаркому), маткоми для лікування злоякісних пухлин, включаючи вих труб (карциному); гематологічні: крові (мієлоїтверді пухлини, такі як карциноми шкіри, молочної дний лейкоз [гострий або хронічний], гострий лімзалози, мозку, шийки матки, карциноми яєчок тофобластний лейкоз, хронічний лімфоцитарний що. Зокрема, злоякісні пухлини, які можуть бути лейкоз, мієлопроліферативні захворювання, мнопіддані лікуванню сполуками, композиціями і спожинну мієлому, мієлодиспластичний синдром), собами згідно з винаходом, включають, але не хворобу Ходжкіна, неходжкінську лімфому [злоякіобмежуються тільки ними: серцеві: саркому (ангіосну лімфому]; шкіри: злоякісну меланому, базальсаркому, фібросаркому, рабдоміосаркому, ліпосаноклітинну карциному, плоскоклітинну карциному, ркому), міксому, рабдоміому, фіброму, ліпому і саркому Капоши, диспластичні невуси, ліпому, тератому; легеневі: бронхогенну карциному (плосангіому, дерматофіброму, келоїди, псоріаз; і надкоклітинну, недиференційовану дрібноклітинну, ниркових залоз: нейробластому. недиференційовану крупноклітинну, аденокарциТаким чином, термін "злоякісна клітина", як тут ному), альвеолярну (бронхіолярну) карциному, передбачено, включає клітину, що уражена будьбронхіальну аденому, саркому, лімфому, хондрояким з ідентифікованих вище станів, і термін "зломатозну гамартому, мезотеліому; гастроінтестинаякісна пухлина" включає будь-який з ідентифіковальні: стравоходу (плоскоклітинну карциному, адених вище станів, але не обмежуєтьсятільки ними. нокарциному, лейоміосаркому, лімфому), шлунку Будь-які зі згаданих вище станів потрібно розгля(карциному, лімфому, лейоміосаркому), підшлундати як окремі варіанти здійснення, і композиції, кової залози (протокову аденокарциному, інсулінаправлені на лікування кожного стану, відповідно ному, глюкагоному, гастриному, карциноїдні пухможуть бути заявлені окремо або можуть бути лини, віпому), тонкої кишки (аденокарциному, включені в групу пунктів формули винаходу, коли лімфому, карциноїдні пухлини, саркому Калоши, застосовується термін "злоякісна пухлина". лейоміому, гемангіому, ліпому, нейрофіброму, Коли будь-яке з вказаних вище показань для фіброму), товстої кишки (аденокарциному, тубулялікування злоякісної пухлини згадується відносно рну аденому, ворсинчасту аденому, гамартому, застосування сирамезину, фармацевтичної комполейоміому); сечостатевого тракту: нирки (аденоказиції, набору, способу лікування, мається на увазі рциному, пухлину Вільмса [нефробластому], лімокремий варіант здійснення. Відповідно, кожне з фому, лейкоз), сечового міхура і сечовипускальновказаних вище показань може бути заявлено го каналу (плоскоклітинну карциному, окремо разом з вказаним застосуванням сирамеперехідноклітинну карциному, аденокарциному), зину, фармацевтичною композицією, набором, передміхурової залози (аденокарциному, саркоспособом лікування і способом ідентифікації спому), яєчка (семіному, тератому, ембріональну карлук, ефективних для лікування. циному, тератокарциному, хоріокарциному, саркоЕкспериментальна процедура му, проміжклітинну карциному, фіброму, Клітинна культура фіброаденому, аденоматоїдні пухлини, ліпому; Клітини мишачої фібросаркоми WEHI-S, печінки: гепатому (гепатоцелюлярну карциному), Wn902, Wn912 і WEHI-R4 являють собою нормахолангіокарциному, гепатобластому, ангіосаркому, льні, вектор контролюючі, підвищено продукуючі гепатоцелюлярну аденому, гемангіому; кісток: осHsp70 і стійкі до hTNF клітини, відповідно. Інші теогенну саркому (остеосаркому), фібросаркому, типи протестованих клітин включають: типи MCF7злоякісну фіброгістіоцитому, хондросаркому, сарS1 і MDA-MB-468 пухлинних клітин молочної залокому Юїнга (Ewing), злоякісну лімфому (ретикулязи людини і неонкогенні безсмертні епітеліальні рноклітинну саркому), множинну мієлому, злоякісклітини молочної залози HBL100. MCF7 casp.3.1 і ну гігантоклітинну пухлинну хордому, 3.3 і neo2 є окремими клонами клітин, експресуюостеохронфрому (кістково-хрящеві екзостози), чих каспазу-3 і вектор. MCF7 рСЕР, -Вс12 WT, доброякісну хондрому, хондробластому, хондроміBcl2 NT, -Bcl2 Acta і -Вс12 Сb5 є окремими клонаксофіброму, остеоїдостеому і гігантоклітинні пухми клітин, експресуючих вектор, дикий тип Вс12, лини; нервової системи: черепа (остеому, гемангіобмежений цитоплазмою Вс12, обмежений мітоому, гранулему, ксантому, деформуючий остит), хондріями Вс12 і обмежені ER Bcl2 (Maria Hoyer оболонок (менінгіому, менінгіосаркому, гліоматоз), Hansen, Apoptosis Laboratory, Danish Cancer мозку (астроцитому, медулобластому, гліому, епеSociety). Клітини SK-N-MC клітинної лінії нейробндимому, герміному [пінеалому], гліобластому різластоми людини (АТСС, США). Крім того, були номанітну, олігодендрогліому, шванному, ретинопротестовані клітинні лінії карциноми шийки матки бластому, природжені пухлини), спинномозкову людини HeLa (люб'язно надані доктором J. Lucas, нейрофіброму, менінгіому, гліому, саркому); гінеDanish Cancer Society) і МЕ180. Також були протекологічні: матки (ендометріальну карциному), шийстовані НЕК293-А, клітинна лінія злоякісної пухли 9 87292 10 АС927 (подарунок W. Bowen, Brown University, ни передміхурової залози РС3 і неонкогенна безСША), 3-метиладеніну, актиноміцину D, циклогексмертна епітеліальна клітинна лінія передміхуросаміду і холестерину. вої залози PNT1A. Нетрансформовані NIH3T3 миВиявлення загибелі клітин шачі фібробласти були люб'язно надані С. Життєздатність клітин Holmberg (University of Copenhagen, Данія). ФіброЖиттєздатність клітин була виміряна, застособласти були перетворені за допомогою pBabe-puro вуючи випробування зменшення МTT. Перетвоmock -SV40LT, -v-Ha-ras, -c-src, як описано рення солі тетразолію 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)[Fehrenbacher et al., 2004]. Клітини були розмно2,5-дифенілтетразодію броміду (МТТ, SIGMAжені в DMEM (Invitrogen, Paisly, Великобританія), Aldrich) в забарвлений в синій колір продукт фордоповненим 10% інактивованою високою темперамазану було оцінено спектрофотометрично шлятурою сироваткою теляти (Biological Industries, Beit хом поглинання при 570нм, застосовуючи мікроHaemek, Ізраїль), 0,1мМ неосновними амінокислопланшетний зчитувальний пристрій Versamax тами (Invitrogen) і антибіотиками, або RPMI-1640 (Molecular Devices). Виживаність була визначена (Invitrogen), доповненим 6% інактивованою висояк відсоток необроблених клітин або оброблених кою температурою сироваткою теляти і антибіотиінгібітором клітин: клітини були висіяні на 96ками, при 37°С в зволоженій повітряній атмосфері лунковий планшет, що містить 200мкл середовиз 5% СО2. Клітини були протестовані повторно і ща, і наступного дня вони були оброблені лікарсьзнайдені негативними відносно мікоплазми забаркими засобами. Вплив на життєздатність клітин вленням барвником хьохст (hoechst) (H-33342, була оцінена через 24-60 годин після додавання Molecular Probes, Eugene, OR). лікарського засобу шляхом видалення 100мкл сеЗв'язування [3Н]сирамезину з клітинними мемредовища і додавання 25мкл розчину МТТ бранами або тканинними мембранами (1мг/мкл в PBS, стерилізованому фільтруванням). Присутність сирамезин-чутливих зв'язуючих Після 3 годин інкубації при 37°С в темряві, застоділянок на тканині, приготованій з клітинних ліній, суванням 100мкл буфера солюбілізації (20% SDS як вказано вище, або тканині від гризуна або люв 50% розчині диметилформаміду) була посилена дини, було продемонстровано, застосовуючи проникність клітин, і наступного дня вони були [3H]Lu 28-179 (сирамезин)-зв'язувальний тест, опипроаналізовані на спектрофотометрі. саний раніше [Saby, К. et al., Neuropharmacol., Загибель клітин і цитотоксичність 2002, 43, 95-100]. Стисло, клітини були культивоЗагибель клітин і цитотоксичність були оцінені, вані, як описано, зібрані у фосфатному буферному застосовуючи тест з вивільненням лактатдегідросольовому розчині, застосовуючи скрабер, і генази (ЛДГ) (LDH) (Roche, Mannheim, Німеччина). центрифуговані (1000´g, 10 хвилин). Одержані Руйнування плазматичної мембрани, що вивільняє гранули були застосовані для [3H]Lu 28-179цитоплазматичну ЛДГ в культуральне середовизв'язувальних тестів, як описано у [Søby et al., ще, є мірою цитотоксичності або лізису клітин. 2002]. Ферментативна активність ЛДГ, що приводить до Апоптотичні стимули окиснення лактату до пірувату та відновлення Були протестовані наступні апоптотичні стиNAD+ до NADH+H+, була виміряна спектрофотомули: сирамезин (Lu 28-179), аналоги сирамезину: метрично шляхом перетворення солі тетразолію 28131М, 28134М, 292880, 32160F, 32124С і 32168F (жовтої) в сіль формазану (червону). Клітини були і галоперидол (Н. Lundbeck A/S, Копенгаген, Дависіяні та оброблені, як описано для випробування нія), людські TNF-a (Strathmann Biotech Gmbh, щодо МТТ. Після аналізу було видалено 50мкл Німеччина), тапсигарджин, етопозид, доксорубісередовища і змішано з 50мкл буфера реакції. цин, стауроспорин, вінкристин, тамоксифен Середовище, що залишилося, було видалено та (SIGMA-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі), конканаміцин клітини лізовані в 1% Тритоні Х-100 протягом 20 A (Alexis Biochemicals, Сан-Дієго, Каліфорнія). хвилин при 37°С. Вміст лактатдегідрогенази (ЛДГ) Фармакологічні інгібітори та лікарські засоби також був виміряний в клітинному лізаті та була Були застосовані наступні інгібітори протеаз: проведена оцінка % вивільнення ЛДГ: zVAD-fmk, DEVD-fmk (Bachem Bubendorf, ШвейцаЦитотоксичність (% вивільнення ЛДГ)=ЛДГв серія), DEVD-CHO (Neosystems, Страсбург, Франція), LEHD-СНО, zFA-fmk (Enzyme System Products, редовищі/(ЛДГв середовищі +ЛДГв лізаті)´100% Ядерне ущільнення Livermore, Каліфорнія), СА-074-Ме (Peptides Форма загибелі клітин була оцінена за типом International, Луїсвілл, Кентуккі), АРС11138 (Celera ядерного ущільнення при забарвленні хьохстом Applied Biosystems, Foster City, Каліфорнія, США), (проникним в клітину Hoechst 33342, SIGMAПепстатин A, PD150606, та інгібітор calpain І (СІ) Aldrich) оброблених лікарським засобом клітин. (Calbiochem, La Jolla, Каліфорнія), TPCK Непроникний в клітину барвник Sytox Green (Boehringer Mannheim), пефаблок (AEB SF) (Roche (Molecular Probes) був застосований для оцінки Diagnostics, DK). Були застосовані наступні антивтрати цілісності мембрани, і результати були пооксиданти: Бутилований гідроксіанізол (ВНА), aрівняні з морфологічними змінами ядер, спостетокоферол, g-токоферол, глутатіону етиловий есрежуваними при використанні барвника Hoechst. тер (GSH), N-ацетилцистеїн (NAC) (SIGMA-Aldrich, Клітини були інкубовані з 10.000-кратним розвеСент-Луїс, Міссурі). Клітини були попередньо інкуденням 25мг/мл хьохсту і/або 10.000-кратним розбовані з інгібіторами і антиоксидантами за 1 годиведенням 5мМ барвника Sytox Green протягом 5 ну до лікарського засобу. хвилин при 37°С, після чого були проаналізовані Крім того, був досліджений вплив наступних тип ядерного ущільнення і можливе сумісне забалікарських засобів на цитотоксичність сирамезину: антагоністів сигма2-рецепторів BD1047 (Tocris) і 11 87292 12 рвлення, застосовуючи інвертований мікроскоп докремлення від субстрату і аналізування проточOlympus IX-70. ною цитометрією, застосовуючи FACSort (Becton Електрофорез на гелі для виявлення розщепDickinson, Сан-Хосе, Каліфорнія) з аргоновим іонлювання ДНК. Клітини були зібрані та інкубовані ним лазером з вихідною довжиною хвилі 488нм, та при 50°С протягом ночі в 120мкл буфера лізису проаналізовані, застосовуючи програмне забезпе(100мМ NaCl, 100мМ Трис-HCl (рН 8,0), 25мМ чення CELLQuest. EDTA, 0,5% SDS і 100мкг/мл протеїнази К). Зразки Випробування лізосомальної стабільності in були преципітовані 6М NaCl і центрифуговані при vitro 13.000 обертів на хвилину протягом 5 хвилин при Клітини MCF-7, висіяні на 14 см чашки, були 4°С. Геномна ДНК була потім преципітована з сузавантажені Fe-декстраном протягом 9 годин, з пернатанту 2,5 об'ємами 96% етанолу. Після наступним 16-годинним очищенням в культуральцентрифугування при 20.000 обертах на хвилину ному середовищі. Потім клітини були промиті в протягом 10 хвилин при 4°С і промивання 70% PBS і відокремлені від субстрату. Клітинний осад етанолом, осади були розчинені в 10мМ Трис-НСІ був повторно суспендований в буфері SCA (20мМ (рН 8,0) і 1мМ EDTA, що містить 1мкг/мл панкреаHepes KОН, 10мМ KСl, 1,5мМ MgCl2,1мМ EDTA, тичної рибонуклеази (Rnase А). Зразки були інку1мМ EGTA, 250мМ цукрози, рН 7,5) і урівноважебовані при 37°С протягом 1,5 години, і була оцінений на льоду протягом 20 хвилин. Клітинний осад на концентрація ДНК за спектральною був гомогенізований 150-200 ударами тефлоновопоглинальною здатністю (А) при 260нм. Був прого товкача. Після центрифугування протягом 5 ведений електрофорез ДНК (5мкг/смугу) на 1,5% хвилин при 750g, супернатант був виділений і був агарозному гелі, і ДНК була візуалізована забарвповторений етап центрифугування. Одержаний ленням бромідом етидію. супернатант був перенесений у колонку, що знаАктивність каспази та катепсину ходиться в магнітному полі. Лізосомальна фракція Для вимірювання активності цитозольного фебула промита двічі та елюйована з колонки. Вивірменту цистеїнкатепсину субзливальні клітини, льнення лізосомальних катепсинів було потім вивисіяні на 24-лункові планшети, були оброблені міряно в 25мкл розчину лізосом в чорних 96екстракційним буфером (250мМ цукрози, 20мМ лункових планшетах costar, як описано для виміHEPES, 10мМ KСl,1,5мМ MgCl2, 1мМ EDTA, 1мМ рювань активності катепсину. Після 1,5 години EGTA, 1мМ пефаблоку; рН 7,5), що містить реакції при 37°С, Vmax виділення AFC аналізували 20мгк/мл дигітоніну, протягом 12-15 хвилин на протягом 20 хвилин при 30°С, застосовуючи флульоду. Для вимірювання загальної активності кліорометр Spectramax Gemini (Molecular Devices, тинного ферменту цистеїнкатепсину клітини були Саннівейл, Каліфорнія). оброблені вищезгаданим екстракційним буфером, Імуноблот-аналіз та імунофлуоресценція що містить 200мкг/мл дигітоніну, протягом 12-15 Вживані первинні антитіла включали мишачі хвилин на льоду. Для аналізу 3/7-каспазоподібної моноклональні антитіла проти катепсину В активності субзливальні клітини були оброблені (Oncogene Research Products, Бостон, ΜΑ), катепбуфером для екстракції каспази (0,5% Тритон Хсину L (Transduction Laboratories, Lexington, Кенту100, 25мМ HEPES, 5мМ MgCl2,1мМ EGTA, 1мМ ккі), цитохрому с (BD Pharmingen) і гліцеральдегідпефаблоку, рН 7,5) протягом 20 хвилин на льоду. 3-фосфатдегідрогенази (GAPDH, Biogenesis, Активність, подібна активності каспази 3/7 і активPoole, Великобританія), Hsp70 (2H9; люб'язно наності цистеїнкатепсину, була оцінена додаванням даний Борисом Моргулісом, Санкт-Петербург, Роодного об'єму 20мкМ Ac-DEVD-AFC (Biomol) в бусія), і кролячого поліклонального катепсину D фер для реакції з каспазою (100мМ HEPES, 20% (DAKO corporation, Каліфорнія), і AIF (apoptosis lab, гліцерину, 0,5мМ EDTA, 0,1% CHAPS, 5мМ DTT, Danish Cancer Research). Для імуноблот-аналізу 1мМ пефаблоку, рН 7,5) або 20мкМ zFR-AFC білки були розділені 6-12% SDS-PAGE і перенесе(Enzyme System Products) в буфер для реакції з ні на нітроцелюлозну мембрану. Після інкубації катепсином (50мМ натрію ацетату, 4мМ EDTA, первинних антитіл протягом 1 години при кімнатній 8мМ DTT, 1мМ пефаблоку, рН 6,0), відповідно. температурі або при 4°С протягом ночі, блот був Vmax виділення AFC (збудження 400нм, випроміінкубований з вторинними козиними антимишачинювання 489нм) аналізували протягом 20 хвилин ми або антикролячими антитілами IgG, кон'юговапри 30°С, застосовуючи флуорометр Spectramax ними з пероксидазою хріну, протягом 1 години при Gemini (Molecular Devices, Саннівейл, Каліфорнія). кімнатній температурі. Подальше виявлення білка Випробування лізосомальної стабільності, клібуло виконано, застосовуючи ECL або ECL plus тинна культура (Amersham Biosciences, Бакінгемшир, Англія). Клітини були піддані дії лізосомотропної слабЩоб візуалізувати катепсини, AIF і cyt С, клітикої основи і метахроматичного флуорохрома акни були фіксовані та була посилена їх проникність ридинового оранжевого (АО, Molecular Probes), в -20°С метанолі протягом 10 хвилин при 25°С. який акумулюється в кислих камерах. Високо конПісля попереднього блокування 5% козиною сироцентрований АО в кислих лізосомах показує черваткою (у 1% BSA, 0,3% Тритоні Х-100 в PBS) провону флуоресценцію, але після перелокалізації тягом 20 хвилин, клітини були інкубовані з первинзелену флуоресценцію в цитоплазмі. Щоб контроними антитілами (у 0,25% BSA, 0,1% Тритоні ΧΙ 00 лювати лізосомальну цілісність, субзливальні обв PBS), як вказано, протягом 1,5 години. Після 1 роблені лікарським засобом клітини були піддані години інкубації з вторинними антитілами Alexa дії 0,1-0,5мкг/мл АО протягом 3 годин при 37°С. Fluor-488 або -546-кон'югованими антимишачими Клітини були оцінені або із застосуванням інвертоIgG або антикролячими IgG (Molecular Probes), ваного мікроскопа Olympus IX-70, або шляхом віклітини були промиті тричі в 0,05% Твіні 20 в PBS і 13 87292 14 прикріплені, застосовуючи набір ProLong Antifade нення лізосомальних катепсинів в цитозоль здаKit (Molecular Probes). Був проведений софокусний ється залученим у виконання процесу загибелі. Це аналіз, застосовуючи мікроскоп Zeiss Axiovert відкриття засновано як на імуногістохімічних заба100M з програмним забезпеченням LSM 510. рвленнях лізосомальних катепсинів В і L, так і на Експерименти in vivo вивільненні катепсинів in vitro з очищених лізосом. Також, застосування фармакологічних інгібіторів Клітини WEHI-R4 (5´106) були імплантовані катепсинів може зменшити загибель, що індукупідшкірно на спині імунокомпетентних самок миється сирамезином. Пухлинні клітини, які були шей BALB/c. Лікування сирамезином почалося за захищені від більшості інших протипухлинних лідва дні до імплантації пухлини. Миші були роздікарських засобів ектопічною експресією Bcl-2, були лені на групи (5-9/групу), і перорально вводили ефективно убиті сирамезином. Тоді як деякі хіміо200мкл 1) носія (0,5% метилцелюлози 15 в 0,9% терапевтичні засоби активують р53-залежний розчині NaCl), 2) 100мг/кг/день сирамезину в сушлях загибелі, сирамезин не активує р53. Це вкаспензії (у 0,5% метилцелюлозі 15 в 0,9% розчині зує, що шлях загибелі значно відрізняється від NaCl) 7 днів на тиждень. Для комбінаційних дослітого, що індукований ДНК-пошкоджувальними заджень in vivo вводилося 50мг/кг сирамезину собами (такими як етопозид), результат, який під7днів/тиждень в комбінації з окремою дозою етотверджує дані, показує широкий діапазон показань позиду (внутрішньочеревинно) до 30мг/кг (що введля лікування злоякісної пухлини сирамезином, дений в день перший). Об'єми пухлин були оцінені оскільки р53-залежний шлях загибелі часто є скоіз застосуванням штангенциркуля. Вплив лікарсьмпрометованим при раку. Це також засновано на ких засобів на пухлинне зростання контролювався вищезгаданому спостереженні, що сирамезинпротягом 14-21 дня перед убиванням мишей. індукована загибель пухлинних клітин не інгібуєтьРезультати ся Bcl-2. Дозо-залежним чином сирамезин ефективно Важливо, що сирамезин мав добру переносіндукує програмовану клітинну загибель в культиність in vivo і показав антионкогенний ефект в ізовованих пухлинних клітинних лініях різного похогенній пухлинній ксенотрансплантатній моделі на дження, включаючи клітинні лінії, що походять від BALB/c мишах. Крім того, спостерігався комбінопухлин передміхурової залози, молочної залози та ваний ефект сирамезину та етопозиду in vivo в шийки матки. Чутливість клітин до сирамезину порівнянні з групами, що піддавалися лікуванню збільшується після онкогенного перетворення ras окремо сирамезином і етопозидом, відповідно. або src, що показує, що сирамезин має бажану Крім того, сирамезин діє синергічним чином разом ефективність протипухлинного лікарського засобу, з етопозидом, доксорубіцином, стауроспорином, щоб індукувати його селективну дію на ракові клівінкристином і тамоксифеном в індукції клітинної тини при суто обмеженому впливі на нормальні загибелі в WEHI-S клітинах. Ці результати показуклітини. Крім того, сирамезин, коли тестувався на ють, що сирамезин є новим протипухлинним літлі сигма-лігандів в згаданому посиланні, таких як карським засобом, який є особливо ефективним в галоперидол і пентазоцин, в клітинах WEHI-S і порівнянні з іншими сигма-лігандами, на які зробMSF7, був значно більш сильним індуктором апоплені посилання, і який може бути застосований тозу, ніж галоперидол і пентазоцин. Форма загиокремо або в комбінації зі звичайними хіміотерабелі, що індукується сирамезином, є каспазопевтичними засобами для лікування злоякісних незалежною на підставі морфологічних змін ядер пухлин. під час процесу загибелі, відсутності захисту фармакологічними інгібіторами каспази і відсутності ефектора активації каспази. Замість цього, вивіль Комп’ютерна верстка О. Гапоненко Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601