Спосіб диференційної діагностики справжньої поліцитемії і вторинних еритроцитозів

Реферат: Спосіб диференційної діагностики справжньої поліцитемії і вторинних еритроцитозів включає скринінг периферичної крові на наявність мутації V617F гена JAK2 шляхом полімеразної ланцюгової реакції. Визначають наявність спленомегалії, шкірного свербежу після "водних процедур", показники загального аналізу крові - число еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів, нейтрофілів, рівень лактатдегідрогенази та еритропоетину сироватки, наявність трипаросткової гіперплазії кісткового мозку за даними трепанобіопсії з подальшим визначенням імовірності наявності захворювання. UA 91831 U (12) UA 91831 U UA 91831 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме гематології, і може бути використана для проведення диференційної діагностики справжньої поліцитемії (СП) та вторинних еритроцитозів (BE). Диференціювання BE, що виникає на фоні цілої низки різноманітних патологічних станів і клонального еритроцитозу при СП залишається складним завданням, особливо на початковій стадії патологічного процесу, у зв'язку з тим, що клінічна картина та дані лабораторних показників за цих двох форм еритроцитозів можуть бути подібними [1]. Так, близько 30 % хворих на СП на момент встановлення діагнозу не мають лейкоцитозу, тромбоцитозу та спленомегалії, що є критеріями діагностики цього захворювання згідно з критеріями ВООЗ [2, 3]. З іншого боку, такі важливі для СП діагностичні ознаки, як спленомегалія та лейкоцитоз, можуть бути присутні і у певної кількості пацієнтів з BE. Результати гістологічного дослідження кісткового мозку (KM), якому вітчизняна гематологія надає вирішального значення, не завжди дозволяють уточнити діагноз через часте отриманням незадовільних зразків KM, відсутністю його трипаросткової гіперплазії, необхідної для верифікації діагнозу СП, в дебюті цього захворювання [4]. Саме складністю диференційної діагностики пояснюється те, що певна кількість випадків СП в еритроцитемічній стадії внаслідок відносно індолентного клінічного перебігу залишаються недіагностованими [5], або, навпаки, має місце гіпердіагностика на користь СП [4]. У той же час чітке розмежування цих двох патологічних станів є надзвичайно важливим у зв'язку з більш агресивним перебігом СП, високою частотою тромботичних ускладнень та принципово різною тактикою терапії (застосування для лікування СП цитостатичних препаратів, що мають мієлотоксичну та мутагенну дію). Сучасні досягнення в галузі молекулярної біології довели існування специфічних генетичних маркерів мієлопроліферативних неоплазій (МПН), до яких належить і СП. Їх специфічною ознакою є мутація V617F гена JAK2, яка може бути використана як діагностичний маркер [6]. Однак наявність лише мутації JAK2 V617F є недостатньою для верифікації саме СП, оскільки вона виявляється також і при інших МПН, а саме есенціальній тромбоцитемії (у 50 % випадків) та первинному мієлофіброзі (60 % випадків) [7]. Тому при проведенні диференційної діагностики СП та BE, окрім V617F-позитивного статусу гена JAK2, необхідна присутність й інших критеріїв діагностики: діагностичний рівень гемоглобіну, субнормальний рівень еритропоетину сироватки, наявність трипаросткової гіперплазії KM. Тим не менше, в реальній клінічній практиці не такими й рідкісними є випадки відсутності достатньої кількості необхідних діагностичних показників, що унеможливлює точну верифікацію діагнозів СП та BE [8]. На сьогоднішній день проблемним завданням залишається пошук моделей диференційної діагностики (МПН), у т.ч. СП, з різноманітними реактивними станами та мієлопроліферативними реакціями, зокрема BE. При цьому важливим є оптимальний підбір об'єктивних діагностичних показників у системі їх інтегральної оцінки, що забезпечувало б достатньо точне їх прогностичне диференціювання з адекватними ступенями чутливості, специфічності, передбачуваної прогностичної цінності позитивного або негативного результату тощо. Відомий спосіб диференційної діагностики СП і BE, яку здійснюють шляхом визначення спонтанного ураження нейтрофілів периферичної крові з вирахуванням індексу спонтанного ураження клітин, за значенням якого діагностують одну з патологій [9]. Зазначений спосіб при задовільній точності диференційної діагностики (чутливість 90,6 %) є досить складним у виконанні та не може бути використаним на широкому контингенті пацієнтів. Крім того, спосіб не враховує офіційно затверджені ВООЗ сучасні критерії верифікації СП. Найближчим до способу, що заявляється, є спосіб ідентифікації мутації гена JAK2 при справжній поліцитемії шляхом полімеразної ланцюгової реакції у режимі реального часу [10]. Найближчий аналог здійснюють наступним чином. У пацієнтів з гематокритом > 51 % проводять забір зразка венозної крові. З гранулоцитів периферичної крові виділяють ДНК. Для виявлення мутації V617F гена JAK2 проводять алель-специфічну полімеразну ланцюгову реакцію. При наявності мутації стверджують про наявність у пацієнта СП, при відсутності - про наявність BE. Перевагою даного способу є застосування сучасного високочутливого молекулярногенетичного методу ПЦР, який дозволяє ідентифікувати наявність мутації JAK2 V617F, що є одним із офіційно затверджених ВООЗ критеріїв діагностики СП [11]. Проте спосіб має наступні недоліки: - врахування лише одного діагностично значущого показника - мутації V617F гена JAK2, що дозволяє, в разі її виявлення у пацієнта з еритроцитозом нез'ясованого генезу, стверджувати про високу ймовірність наявності у нього будь-якої з МПН, а не конкретно СП; 1 UA 91831 U 5 10 15 20 - включення в алгоритм диференційної діагностики лише пацієнтів з величиною гематокриту > 51 %, що не враховує категорію пацієнтів, в яких не відбувається досягнення "діагностичного" рівня гематокриту, натомість присутній "діагностичний" рівень гемоглобіну або еритроцитів; - можливість помилкового встановлення діагнозу BE хворим на JAK2 - негативну СП, яким для остаточної верифікації діагнозу необхідно проведення дослідження кісткового мозку. Таким чином, найближчий аналог не використовує достатньої кількості параметрів диференційної діагностики, що ускладнює клінічну інтерпретацію типу еритроцитозу та не забезпечує точності діагностики. В основу корисної моделі поставлено задачу підвищити точність диференційної діагностики, максимально індивідуалізувати алгоритм інтерпретації типу еритроцитозу шляхом оптимального підбору об'єктивних, найбільш значущих клініко-лабораторних параметрів з можливістю використання на широкому контингенті пацієнтів в умовах реальної клінічної практики. Поставлену задачу вирішують тим, що у способі диференційної діагностики справжньої поліцитемії і вторинних еритроцитозів, що включає скринінг периферичної крові на наявність мутації V617F гена JAK2 шляхом полімеразної ланцюгової реакції, згідно з корисною моделлю, додатково визначають наявність спленомегалії, шкірного свербежу після "водних процедур", показники загального аналізу крові - число еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів, нейтрофілів, рівень лактатдегідрогенази та еритропоетину сироватки, наявність трипаросткової гіперплазії кісткового мозку за даними трепанобіопсії з подальшим визначенням імовірності наявності захворювання Р за формулою побудованої логлінійної математичної моделі: P  1/(1  exp((136  x1  0,27  x 2  8,06  x3  12,75  x 4  0,01 x5  0,72  x 6  0,29  x7  2,02  x8  7,26  x9 , 24,05  x10  17,53  x11  26,93)) , 25 де x 1 - наявність спленомегалії, x 2 - наявність свербежу шкіри, x 3 - наявність підвищеного числа еритроцитів, x 4 - наявність підвищеного рівня гематокриту, x 5 - число тромбоцитів, x 6 - число лейкоцитів, 30 x 7 - наявність підвищеного числа нейтрофілів, x 8 - наявність підвищеного рівня лактатдегідрогенази, x 9 - наявність зниженого рівня еритропоетину, x10 - наявність мутації JAK2 V617F, x11 - наявність трипаросткової гіперплазії кісткового мозку, 35 40 45 50 55 і при значенні Р більше 0,5 діагностують справжню поліцитемію, а при значенні Р менше 0,5 діагностують вторинні еритроцитози. Потенційна оптимізація диференційної діагностики СП і BE дозволяє, навіть на початковій стадії, відокремити клональний еритроцитоз при СП від вторинного, уникнути можливих ускладнень при помилковій верифікації діагнозу та забезпечити позитивний ефект. Спосіб здійснюють наступним чином. У пацієнта з підозрою на наявність СП (число еритроцитів або рівень гемоглобіну, або рівень гематокриту вище референтних значень) проводять визначення ряду клінічних показників: наявність свербежу шкіри після "водних процедур" та збільшення розмірів селезінки (спленомегалії). Проводять забір венозної крові для визначення числа еритроцитів, тромбоцитів, нейтрофілів та рівня гематокриту периферичної крові (з використанням автоматичного гематологічного аналізатора), визначають рівень лактатдегідрогенази (ЛДГ) (колориметричним ферментним методом на біохімічному аналізаторі) та еритропоетину (ЕПО) сироватки (методом твердо-фазного імуноферментного аналізу). Для виявлення мутації V617F гена JAK2 проводять алель-специфічну полімеразну ланцюгову реакцію [12]. Стан KM (наявність його трипаросткової гіперплазії) визначають в гістологічних препаратах трепанобіоптатів здухвинної кістки за стандартною методикою [13]. На наступному етапі отримані дані вносять до створеної засобами програми статистичної обробки STATISTICA 10.0 за допомогою процедур Nonlinear Estimation (Quick Logit Regression) логлінійної математичної моделі. Математична модель диференційної діагностики була вибрана з класу логлінійних функцій, оскільки одні клініко-лабораторні показники, що 2 UA 91831 U визначаються, мають кількісні значення, інші належать до альтернативних (бінарних) змінних. Адекватність отриманої моделі є значною: x 2  178,00 ; p  0,001. Модель має наступний вигляд: P  1/(1  exp((136  x1  0,27  x 2  8,06  x3  12,75  x 4  0,01 x5  0,72  x 6  0,29  x7  2,02  x8 , 5 7,26  x9  24,05  x10  17,53  x11  26,93) , де P - імовірність наявності СП або BE, x 1 - наявність спленомегалії, x 2 - наявність свербежу шкіри, x 3 - наявність підвищеного числа еритроцитів, x 4 - наявність підвищеного рівня гематокриту, x 5 - число тромбоцитів, x 6 - число лейкоцитів, x 7 - наявність підвищеного числа нейтрофілів, x 8 - наявність підвищеного рівня ЛДГ, x 9 - наявність зниженого рівня ЕПО, 10 15 20 25 30 35 40 45 50 x10 - наявність мутації JAK2 V617F, x11 - наявність трипаросткової гіперплазії KM. Параметри моделі перенесені в MS Excel, що дає змогу вираховувати величину імовірність одного з діагнозів в автоматичному режимі. Змінні х5 та х6 мають кількісні значення, інші змінні є бінарними і вносяться до моделі як 1 (показник наявний) або 0 (показник відсутній). При значенні Р більше 0,5 діагностують СП, а при значенні Р менше 0,5 діагностують BE. Корисна модель пояснюється прикладами. Приклад 1 Пацієнт Р.В., 1955 р.н., направлено до гематолога ДНУ "НПЦ ПКМ" ДУС у зв'язку зі змінами в аналізі крові, виявленими на черговому медичному огляді. Пацієнт скарг не пред'являв. На УЗД органів черевної порожнини розміри селезінки в нормі. В аналізі крові: еритроцити 12 підвищені до 7,2·10 /л, гемоглобін - підвищений до 195 г/л, гематокрит - підвищений до 65 %, 9 12 тромбоцити - 260·10 /л, лейкоцити - 9,0·10 /л, в формулі крові нейтрофільозу немає. Рівень ЛДГ та ЕПО сироватки в нормі. Мутація V617F гена JAK2 виявлена. В трепанобіоптаті кісткового мозку присутня лише двопаросткова гіперплазія (еритроїдного та мієлоїдного паростків). Значення Р, вирахуване за допомогою логлінійної математичної моделі, дорівнює 0,99, що є більшим за визначене граничне значення 0,5. Таким чином, відповідно до способу, що заявляється, у хворого констатовано наявність справжньої поліцитемії. Приклад 2 Пацієнтка К.Г., 1946 р.н., направлена до гематолога ДНУ "НПЦ ПКМ" ДУС в зв'язку зі змінами в аналізі крові, виявленими на черговому медичному огляді. Пацієнтка скаржилася на свербіж шкіри після "водних процедур". На УЗД органів черевної порожнини розміри селезінки в 12 нормі. В аналізі крові: еритроцити - підвищені до 6,03·10 /л, гемоглобін - підвищений до 176 г/л, 9 12 гематокрит - підвищений до 52 %, тромбоцити - 288·10 /л, лейкоцити - 7,7·10 /л, у формулі крові нейтрофільозу немає. Рівень ЛДГ підвищений, ЕПО сироватки в нормі. Мутація V617F гена JAK2 не виявлена. В трепанобіоптаті кісткового мозку присутня трипаросткова гіперплазія. Значення Р, вирахуване за допомогою логлінійної математичної моделі, дорівнює 0,98, що є більшим за визначене граничне значення 0,5. Таким чином, відповідно до способу, що заявляється, у хворого діагностована JAK2-негативна справжня поліцитемія. Приклад 3 Пацієнт З.М., 1962 р.н., направлений до гематолога ДНУ "НПЦ ПКМ" ДУС в зв'язку зі змінами в аналізі крові, виявленими на черговому медичному огляді. Пацієнт скаржиться на свербіж шкіри після "водних процедур". На УЗД органів черевної порожнини виявлена помірна 12 спленомегалія. В аналізі крові: еритроцити - підвищені до 6,2·10 /л, гемоглобін - підвищений до 9 12 195 г/л, гематокрит - підвищений до 55 %, тромбоцити - 146·10 /л, лейкоцити - 12,8·10 /л, в формулі крові присутній нейтрофільоз. Рівень ЛДГ в нормі, рівень ЕПО сироватки знижений. Мутація V617F гена JAK2 не виявлена. В трепанобіоптаті кісткового мозку трипаросткової гіперплазії немає. Значення Р, вирахуване за допомогою логлінійної математичної моделі, дорівнює 0,03, що є меншим за визначене граничне значення 0,5. Таким чином, відповідно до способу, що заявляється, у хворого діагностовано вторинний еритроцитоз. За період з 2009 по 2013 роки за запропонованою методикою було обстежено 210 осіб, з них 90 хворих на СП та 120 пацієнтів з BE. При вибраному для імовірності наявності захворювання (Р) значенні розподілу 0,5 пацієнти були розподілені наступним чином (табл.) 3 UA 91831 U Таблиця Чотирипільна таблиця розрахунку операційних характеристик математичної моделі Імовірність наявності захворювання (Р) Віднесені до СП (Р>0,5) Віднесені до BE (P