Спосіб приготування поліпептидної суміші з використанням гідрогенолізу

1. Спосіб отримання суміші ацетатів поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину, де суміш має бажану пікову молекулярну вагу, що включає етапи, на яких: a) полімеризують N-карбоксіангідриди тирозину, аланіну,  -бензил глютамату і трифторацетиллі 2 (19) 1 3 6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що бажана пікова молекулярна вага складає 4700 дальтон - 11000 дальтон. 7. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що бажана пікова молекулярна вага складає 12500 дальтон. 8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що каталізатор гідрогенолізу являє собою паладоване вугілля, нікелевий каталізатор Ренея, Pt, Pt/C, PtO2, Pd(OH)2, Rh/C або RhCl (РРhз)з. 9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що каталізатор гідрогенолізу являє собою паладоване вугілля. 10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що вагове співвідношення захищеного поліпептиду до каталізатору паладованого вугілля складає 10:1. 11. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що етап реакції поліпептидів з каталізатором гідрогенолізу проводять в розчиннику, вибраному з групи, що складається з метанолу, етанолу або ізопропанолу. 12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що розчинник являє собою метанол. 13. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що ініціатор являє собою первинний амін, діалкіл амін або натрію метоксид. 14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що ініціатор являє собою діетиламін. 15. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що кількість ініціатора складає 1 % - 10 % за вагою. 16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що кількість ініціатора складає 2 % - 5 % за вагою. 17. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що кількість ініціатора складає 2 % за вагою. 18. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що кількість ініціатора складає 5 % за вагою. 19. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що органічна основа в етапі с) являє собою водну органічну основу. 20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що водна органічна основа являє собою первинний, вторинний або третинний амін або метанол/аміак. 21. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що водна органічна основа являє собою піперидин. 22. Спосіб приготування фармацевтичної композиції, що містить водну суміш ацетатів поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину, який відрізняється тим, що суміш має бажану пікову молекулярну вагу, причому вдосконалення включає приготування суміші ацетатів поліпептидів способом за будь-яким з пп. 1-21. 23. Спосіб отримання суміші трифторацетилом захищених поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і трифторацетиллізину, який відрізняється тим, що суміш поліпептидів у незахищеній формі має першу пікову молекулярну вагу, що включає етапи, на яких: a) полімеризують N-карбоксіангідриди тирозину, аланіну, γ-бензилглютамату і трифторацетиллізину з ініціатором в кількості 0,01 % - 20 % за вагою протягом прийнятного часового періоду і при прийнятній температурі для формування суміші захищених поліпептидів, де суміш поліпептидів у неза 93669 4 хищеній формі має першу пікову молекулярну вагу; і b) видаляють бензильну захисну групу із суміші захищених поліпептидів реакцією поліпептидів з каталізатором гідрогенолізу і воднем для отримання суміші трифторацетильних захищених поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і трифторацетиллізину і де суміш поліпептидів у незахищеній формі має першу пікову молекулярну вагу. 24. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що каталізатор гідрогенолізу являє собою паладоване вугілля, нікелевий каталізатор Ренея, Pt, Pt/C, РЮ2, Pd(OH)2, Rh/C або RhCl (PPh3)3, де етап реакції поліпептидів з каталізатором гідрогенолізу проводять в розчиннику, вибраному з групи, яка складається з метанолу, етанолу або ізопропанолу; де ініціатором є первинний амін, діалкіламін або натрію метоксид; де кількість ініціатора складає 1 % - 10 % за вагою. 25. Спосіб за п. 24, який відрізняється тим, що каталізатор гідрогенолізу являє собою паладоване вугілля. 26. Спосіб за п. 25, який відрізняється тим, що масове співвідношення захищеного поліпептиду до каталізатору паладованого вугілля складає 10:1. 27. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що етап реакції поліпептидів з каталізатором гідрогенолізу проводять в розчиннику, вибраному з групи, що складається з метанолу, етанолу або ізопропанолу. 28. Спосіб за п. 27, який відрізняється тим, що розчинником є метанол. 29. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що ініціатор являє собою первинний амін, діалкіламін або натрію метоксид. 30. Спосіб за п. 29, який відрізняється тим, що ініціатор являє собою діетиламін. 31. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що кількість ініціатора складає 1 % - 10 % за вагою. 32. Спосіб за п. 31, який відрізняється тим, що кількість ініціатора складає 2 % - 5 % за вагою. 33. Спосіб за п. 32, який відрізняється тим, що кількість ініціатора складає 2 % за вагою. 34. Спосіб за п. 32, який відрізняється тим, що кількість ініціатора складає 5 % за вагою. 35. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що перша пікова молекулярна вага складає 2000 дальтон - 40000 дальтон. 36. Спосіб за п. 35, який відрізняється тим, що перша пікова молекулярна вага складає 4700 дальтон - 11000 дальтон. 37. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що перша пікова молекулярна вага складає 12500 дальтон. 38. Суміш трифторацетилом захищених поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і трифторацетиллізину, отримана способом за будь-яким з пп. 23-37. 39. Спосіб отримання суміші ацетатів поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину, який відрізняється 5 93669 6 тим, що суміш має бажану пікову молекулярну вагу, що складається з етапів, на яких: a) отримують суміш трифторацетилом захищених поліпептидів способом за будь-яким з пунктів 2337; b) обробляють суміш, отриману на етапі а), розчином органічної основи; с) видаляють вільні трифторацетильні групи і домішки низької молекулярної ваги ультрафільтрацією для отримання суміші поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину; і d) проводять реакцію суміші поліпептидів з водним розчином оцтової кислоти для формування суміші ацетатів поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину, що має бажану пікову молекулярну вагу. 40. Спосіб за п. 39, який відрізняється тим, що органічна основа являє собою водну органічну основу. 41. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що водна органічна основа являє собою первинний, вторинний або третинний амін або метанол амонію. 42. Спосіб за п. 41, який відрізняється тим, що водна органічна основа являє собою піперидин. В тексті цієї заявки є посилання на різні публікації шляхом їх повного цитування. Описи винаходів цих публікацій в їх повноті включені в дану заявку шляхом посилання для того, щоб більш детально описати стан рівня техніки, до якої належить даний винахід. Передумови даного винаходу Глатирамер ацетат (GA) - це суміш поліпептидів, придатний для лікування множинного склерозу. КОПАКСОН®, торгова назва для фармацевтичної композиції, що містить глатирамер ацетат (GA) в якості активного інгредієнту, включає ацетати синтетичних поліпептидів, що містять чотири природніх амінокислоти: L-глутамінову кислоту, Lаланін, L-тирозин і L-лізин із середньою молярною фракцією 0,141, 0,427, 0,095 і 0,338, відповідно. Середня молекулярна вага глатирамеру ацетату складає 4700-11000 дальтон. Хімічно глатирамер ацетат має назву ацетат (сіль) полімеру Lглютамінової кислоти з L-аланіном, L-лізином і Lтирозином. Його структурна формула: (GIu, Ala, Lys, Tyr)xxCH3COOH (C5H9NO4C3H7NO2C6H14N2O2C9H11NO3)xxC2 H4O2 CAS - 147245-92-9 ("Копаксон", Physician's Desk Reference, (2000), Медікал Еконмікс Ко., Інк, (Монтвале, Нью Джерсі), 3115.) Способи приготування поліпептидів цього типу, включаючи гатирамер ацетат, описані в патенті США №3849550, опублікованому 19 листопада 1974, Teitelbaum та ін., патенті США №5800808, опублікованому 1 вересня 1998, Konfino та ін., і в публікації міжнародної заявки РСТ №WO00/05250, опублікованій 3 лютого 2000 (Aharoni та ін.), що включені до даного опису посиланням. Наприклад, поліпептиди цього типу були отримані з Nкарбоксиангідридів тирозину, аланіну, -бензил глютамату і -N-трифторацетиллізину. Полімеризацію проводили при температурі оточуючого середовища в безводному діоксані з діетиламіном в якості ініціатору. Разблокування -карбоксильної групи глютамінової кислоти проводили гідробромідом (НВr) у крижаній оцтовій кислоті з наступним видаленням трифторацетильних груп із залишків лізину за допомогою 1М піперидину (патент США №3849550, опублікований 19 листопада 1974, Teitelbaum та ін.). Зняття захисту -карбоксильної групи глютамінової кислоти потребує використання великої кількості HBr/оцтової кислоти. У результаті продукується великий об'єм кислотних відходів. Усунення цих кислотних відходів є складним і дорогим. Альтернативні способи отримання таких поліпептидів є необхідними для того, щоб усунути проблеми продуктів кислотних відходів. Короткий опис винаходу Об'єкт винаходу забезпечує спосіб отримання суміші ацетатів поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину, де суміш має бажану пікову молекулярну вагу, що складається з етапів, на яких: а) полімеризують N-карбоксиангідриди тирозину, аланіну, -бензил глютамату і трифторацетиллізину з ініціатором у кількості 0,01%-20% за вагою протягом прийнятного часового періоду і при прийнятній температурі для формування суміші захищених поліпептидів, де суміш поліпептидів у незахищеній формі має першу пікову молекулярну вагу; b) видаляють бензильну захисну групу із суміші захищених поліпептидів за допомогою контакту поліпептидів з каталізатором гідрогеноліза і воднем для отримання суміші трифторацетил захищених поліпептидів, де суміш поліпептидів у незахищеній формі має першу пікову молекулярну вагу; c) видаляють трифторацетильну захисну група із трифторацетил захищених поліпептидів за допомогою контакту поліпептидів з розчином органічної основи для формування суміші поліпептидів, де суміші поліпептидів у незахищеній формі мають першу пікову молекулярну вагу; d) видаляють вільні трифторацетильні групи і домішки низької молекулярної ваги ультрафільтрацією для отримання суміші поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину; і е) забезпечують контакт суміші поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину з водним розчином оц 7 тової кислоти для формування суміші ацетатів поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину і має бажану пікову молекулярну вагу. Об'єкт винаходу також забезпечує спосіб отримання суміші трифторацетил захищених поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і трифторацетиллізину, де суміш поліпептидів у незахищеній формі має першу пікову молекулярну вагу, що включає етапи, на яких: a. полімеризують N-карбоксиангідриди тирозину, аланіну, -бензил глютамату і трифторацетиллізину з ініціатором у кількості 0,01%-20% за вагою протягом прийнятного часового періоду і при прийнятній температурі для формування суміші захищених поліпептидів, де суміш поліпептидів у незахищеній формі має першу пікову молекулярну вагу; і b. видаляють бензильну захисну групу із суміші захищених поліпептидів за допомогою контакту поліпептидів з каталізатором гідрогеноліза і воднем, для отримання суміші трифторацетил захищених поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і трифторацетиллізину, і де суміш поліпептидів у незахищеній формі має першу пікову молекулярну вагу. Детальний опис винаходу Об'єкт винаходу забезпечує спосіб отримання суміші ацетатів поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину, де суміш має бажану пікову молекулярну вагу, що включає етапи, на яких: a) полімеризують N-карбоксиангідриди тирозину, аланіну, -бензил глютамату і трифторацетиллізину з ініціатором у кількості 0,01%-20% за вагою протягом прийнятного часового періоду і при прийнятній температурі для формування суміші захищених поліпептидів, де суміш поліпептидів у незахищеній формі має першу пікову молекулярну вагу; b) видаляють бензильну захисну групу із суміші захищених поліпептидів за допомогою контакту поліпептидів із каталізатором гідрогеноліза і воднем для приготування суміші трифторацетил захищених поліпептидів, де суміш поліпептидів у незахищеній формі має першу пікову молекулярну вагу; c) видаляють трифторацетильну захисну групу з трифторацетил захищених поліпептидів за допомогою контакту поліпептидів з розчином органічної основи для формування суміші поліпептидів, де суміші поліпептидів у незахищеній формі мають першу пікову молекулярну вагу; d) видаляють вільні трифторацетильні групи і домішки низької молекулярної ваги ультрафільтрацією для отримання суміші поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину; і е) забезпечують контакт суміші поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину з водним розчином оцтової кислоти для формування суміші ацетатів поліпептидів, кожний з яких складається з глюта 93669 8 мінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину, і мають бажану пікову молекулярну вагу. У варіанті здійснення перша пікова молекулярна вага може бути 2000 дальтон - 40000 дальтон, або 2000 дальтон - 20000 дальтон або 4000 дальтон - 8600 дальтон або 4000 дальтон - 8000 дальтон або 6250 дальтон - 8400 дальтон або 2000 дальтон - 13000 дальтон або 4700 дальтон - 13000 дальтон або 10000 дальтон - 25000 дальтон або 15000 дальтон - 25000 дальтон або 18000 дальтон - 25000 дальтон або 20000 дальтон - 25000 дальтон або 4700 дальтон - 11000 дальтон або 7000 дальтон або 13000 дальтон - 18000 дальтон або 15000 дальтон або 12500 дальтон. У варіанті здійснення бажана пікова молекулярна вага може бути 2000 дальтон - 40000 дальтон або 2000 дальтон - 20000 дальтон або 4000 дальтон - 8600 дальтон або 4000 дальтон - 8000 дальтон або 6250 дальтон - 8400 дальтон або 2000 дальтон - 13000 дальтон або 4700 дальтон 13000 дальтон або 10000 дальтон - 25000 дальтон або 15000 дальтон - 25000 дальтон або 18000 дальтон - 25000 дальтон або 20000 дальтон - 25000 дальтон або 4700 дальтон - 11000 дальтон або 7000 дальтон або 13000 дальтон - 18000 дальтон або 15000 дальтон або 12500 дальтон. У варіанті здійснення каталізатором гідрогеноліза може бути паладоване вугілля, нікелевий каталізатор Ренея, Pt, Pt/C, PtO2, Pd(OH)2, Rh/C, або RhCl (PPh3)3. В іншому варіанті здійснення каталізатором гідрогеноліза може бути паладоване вугілля. В іншому варіанті здійснення вагове співвідношення захищеного поліпептиду з каталізатором - паладованим вугіллям може бути 10:1. У варіанті здійснення етап контакту поліпептидів з каталізатором гідрогеноліза може бути проведений в розчиннику, вибраному з групи, що включає метанол, етанол або ізопропанол. В іншому варіанті здійснення розчинником може бути метанол. У варіанті здійснення ініціатором може бути первинний амін, діалкіл амін або натрію метоксид. В іншому варіанті здійснення ініціатором може бути діетиламін. У варіанті здійснення етап контакту поліпептидів з каталізатором гідрогеноліза може бути проведений в розчиннику, вибраному з групи, що включає метанол, етанол або ізопропанол. В іншому варіанті здійснення розчинником може бути метанол. У варіанті здійснення ініціатором може бути первинний амін, діалкіл амін або натрію метоксид. В іншому варіанті здійснення ініціатором може бути діетиламін. В іншому варіанті здійснення кількість ініціатору може бути 0,05% - 19% за вагою або 0,1% - 17% за вагою, або 0,5% - 15% за вагою, або 1% - 10% за вагою, або 2% - 5% за вагою, або 2% за вагою, або 5% за вагою. У варіанті здійснення органічна основа в етапі с) може бути водною органічною основою. В іншому варіанті здійснення водною органічною основою може бути первинний, вторинний або третинний амін або метанол амонію. 9 В іншому варіанті здійснення водною органічною основою може бути піперидин. Об'єкт винаходу також забезпечує суміш ацетатів поліпептидів, отриманих попередніми способами. Об'єкт винаходу також забезпечує фармацевтичну композицію, що містить попередню суміш і фармацевтично прийнятний носій. Об'єкт винаходу також забезпечує спосіб приготування фармацевтичної композиції, що включає змішування попередньої суміші з фармацевтично прийнятним носієм. Об'єкт винаходу також забезпечує спосіб приготування фармацевтичної композиції, що містить водну суміш ацетатів поліпептидів, кожний з яких суміші захищених поліпептидів, де суміш поліпептидів у незахищеній формі має першу пікову молекулярну вагу; і b) видаляють бензильну захисну групу з суміші захищених поліпептидів за допомогою контакту поліпептидів з каталізатором гідрогеноліза і воднем, для отримання суміші трифторацетил захищених поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і трифторацетиллізину, і де суміш поліпептидів у незахищеній формі має першу пікову молекулярну вагу. У варіанті здійснення каталізатором гідрогеноліза може бути паладоване вугілля, нікелевий каталізатор Ренея, Pt, Pt/C, PtO2, Pd (OH)2, Rh/C, або RhCl (PPh3J3). В іншому варіанті здійснення каталізатору гідрогеноліза може бути паладоване вугілля. В іншому варіанті здійснення вагове співвідношення захищеного поліпептиду до каталізатору паладованого вугілля може бути 10:1. У варіанті здійснення етап контакту поліпептидів з каталізатором гідрогеноліза може бути проведений в розчиннику, вибраному з групи, що містить метанол, етанол або ізопропанол. В іншому варіанті здійснення розчинником може бути метанол. В іншому варіанті здійснення ініціатором може бути первинний амін, діалкіл амін або натрію метоксид. У варіанті здійснення ініціатором може бути діетиламін. В іншому варіанті здійснення кількість ініціатору може бути 0,05% - 19% за вагою або 0,1% - 17% за вагою, або 0,5% - 15% за вагою, або 1% - 10% за вагою, або 2% - 5% за вагою, або 2% за вагою, або 5% за вагою. У варіанті здійснення перша пікова молекулярна вага може бути 2000 дальтон - 40000 дальтон або 2000 дальтон - 20000 дальтон або 4000 дальтон - 8600 дальтон або 4000 дальтон - 8000 дальтон або 6250 дальтон - 8400 дальтон або 2000 дальтон - 13000 дальтон або 4700 - 13000 дальтон або 10000 дальтон - 25000 дальтон або 15000 дальтон - 25000 дальтон або 18000 дальтон - 25000 дальтон або 20000 дальтон - 25000 дальтон або 4700 дальтон - 11000 дальтон або 7000 дальтон або 13000 дальтон - 18000 дальтон або 15000 дальтон або 12500 дальтон. Об'єкт винаходу також забезпечує суміш трифторацетил захищених поліпептидів, кожний з 93669 10 яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і трифторацетиллізину, отриманими будь-якими процесами, що безпосередньо передують цьому. Об'єкт винаходу також забезпечує спосіб отримання суміші ацетатів поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину, де суміш має бажану пікову молекулярну вагу, що включає етапи, на яких: а) обробляють попередню суміш розчином органічної основи, b) видаляють вільні трифторацетильні групи і домішки низької молекулярної ваги ультрафільтрацією для отримання суміш поліпептидів, кожний з яких містить глютамінову кислоту, аланін, тирозин і лізин, і c) забезпечують контакт суміші поліпептидів з водним розчином оцтової кислоти для формування суміші ацетатів поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину, яка має бажану пікову молекулярну вагу. У варіанті здійснення попереднього способу органічна основа може бути водною органічною основою. В іншому варіанті здійснення попереднього способу, водною органічною основою може бути первинний, вторинний або третинний амін або метанол амонію. В іншому варіанті здійснення попереднього способу водна органічна основа може бути піперидином. Детальний опис експериментальних даних Приклад 1 Синтез полі[5-бензил-1-1-Glu, N6-TFA-L-Lys, LAIa, L- Туr] 7,43г L-тирозин N-карбоксиангідриду додали до 260мл діоксану і суміш нагрівали до 60°С протягом 20 хвилин і потім фільтрували. 34,61г N6трифторацетил-L-Лізин N-карбоксиангідрид додали до 630мл діоксану, і розчин розмішували при 20-25°С протягом 15 хвилин і потім фільтрували. 21,25г L-аланіну N-карбоксиангідриду додали до 395мл діоксану і розчин розмішували при 20-25°С протягом 15 хвилин і потім фільтрували. 14,83г 5бензил L-глютамату N-карбоксиангідриду додали до 260мл діоксану і розчин розмішували при 2025°С протягом 10 хвилин і потім фільтрували. Розчини комбінували в 2л колбі Ерленмейєра, оснащеній механічною мішалкою. Розчини перемішували разом протягом 5 хвилин. 3,9г діетиламіну потім додали до реакційної суміші. Суміш розмішували протягом 24 годин при 23-27°С. Реакційну суміш потім додавали до 5л деінізованої води. Твердий реакційний продукт фільтрували, відмивали і висушували при 60°С у вакуумі. Готували 65,6г твердого біло-кремового порошку. Приклад 2 Зняття захисних груп (Гідрогеноліз) полі [5бензил-L-Glu, N6-TFA-L-Lys, L-AIa, L-Tyr] для формування полі[L-Glu, N6-TFA-L-Lys, L-AIa, L-Tyr] 18г твердого продукту, стабілізованого як описано в Прикладі 1, суспендували в 540мл метанолу. Додавали 1,8г вологого паладію на деревному вугіллі (10% Pd на деревному вугіллі типу 87L 11 Powder, Johnson Matthey - Розділення Благородних Металів). Гідрогеноліз досягали за допомогою барботирування Н2 при 2атм. протягом 7 годин крізь суміш. Суміш фільтрували. Реакційну суміш концентрували до 270мл і додавали до 600мл води. Суміш розмішували протягом однієї години і суміш фільтрували і висушували до отримання 14г біло-кремового порошку. Приклад 3 Видалення груп трифторацетилу для формування полі [L-GIu, L-Lys, L-AIa, L-Tyr] 9г продукту, синтезованого в Прикладі 2, додали до 540мл води. 60мл піперидину додали до суміші, і суміш розмішували при кімнатній температурі протягом 24 годин. Суміш фільтрували і отримували чистий фільтрат з жовтуватим відтінком. Ультрафільтрацію проводили, використовуючи мембрани 5 кілодальтон, для видалення всіх низькомолекулярних домішок. Після 6 циклів ультрафільтрації розчин закислювали оцтовою кислотою до досягнення значення рН 4,0. Додавали воду і розчин піддавали ультрафільтрації поки рН досягала значення 5,5. Розчин концентрували і ліофілізували протягом 60 годин. Отримували 4,7г білого, ліофілізованого осаду полі[L-GIu, L-Lys, LAla, L-Tyr]. Приклад 4 Аналіз Молекулярної Ваги Молекулярну вагу продукту Прикладу 3 визначали, використовуючи Супероза 12 HR колонку для гель-фільтрації HPLC (ВЕРХ - високо ефективна рідкісна хроматографія), оснащену УФ детектором. Фосфатний буфер, рН 1,5 використовували в якості рухливої фази. Загальний час утримування колонки визначали, використовуючи 200мкл ацетону, розбавленого в 1мл води. Колонку калібрували за допомогою TV маркерів молекулярної ваги, використовуючи обчислення Millennium, що описані в патенті США №6514938, опублікованому 4 лютого 2003 (Gad та ін.) (див. специфічно Приклад 2), що включено в даний опис за допомогою посилання. Після калібровки отримували розчин 5мг/мл продукту Прикладу 3. Вимірювали максимальний час утримування піку, і визначали пікову молекулярну вагу, що складав 12700 дальтон. Приклад 5 Гідроліз і Визначення Аміноксилотного Вмісту Розчин зразку готували, використовуючи 10мг поліпептиду з Прикладу 3, доданий до розчину аргініну внутрішнього контролю. Пробні розчини гідролізували, використовуючи концентровану НСl, що містить 1% (вага/об'єм) фенолу, в атмосфері N2 при 110°С протягом 24 годин. Готували і гідролізували амінокислотні контрольні розчини, кожен з яких містить одну речовину з глютамату, аланіну, тирозину, і лізину НСl. Пробний розчин і контролі дериватизували з ортофтолдіальдегідом. Проби і контролі аналізували з використанням Merck LiChrosorb RP18 7мкм колонки, оснащеної UV детектором. Рухливою фазою був фосфатний буфер рН 2,5/ ацетонітрильний градієнт. Молярні фракції аміноксилот в пробі поліпептиду визначали, спираючись на площу піку. 93669 12 Амінокислота Молярна фракція Глютамінова кислота 0,138 Аланін 0,42 Тирозин 0,099 Лізин 0,343 Приклад 6 Формування Ацетату Забезпечують контакт продукту будь-якого з прикладів 1-3 з водним розчином оцтової кислоти для формування ацетату поліпептиду. Обговорення Автори даного винаходу виявили, що гідрогеноліз є ефективним у видалені бензильних груп із залишків глютамату захищених поліпептидів. Специфічно, автори винаходу виявили, що застосування гідрогенолізу з використанням каталізатору паладованого вугілля є ефективним у видаленні бензильних груп із залишків глютамату для формування трифторацетильного поліпептиду, який є захищеним трифторацетильними групами на залишках лізину. Каталізатор, нариклад, паладоване вугілля, можна відновити і використовувати повторно, таким чином, усуваючи відходи. Трифторацетильні групи згодом видаляють із залишків лізину за допомогою піперидину. Інші каталізатори гідрогеноліза можуть бути також використані для видалення бензильних груп із залишків глютамату. Такі відомі каталізатори гідрогеноліза являють собою нікелевий каталізатор Ренея, Pt, Pt/C, PtO2, Pd (OH)2, Rh/C, RhCl (РРh3)3, та інші каталізатори перехідних металів. Реакція гідрогенолізу можна проводити при температурі від 20°С до 100°С і тиску від 1атм до 100атм. Використання гідрогенолізу замість НВr/оцтової кислоти для видалення бензильних груп, тем не менш, представляє наступне ускладнення. При використанні НВr/оцтової кислоти, вона виконує подвійну функцію: видалення бензильної групи із залишків глютамату і очищення поліпептиду до досягнення бажаної середньої молекулярної ваги суміші. Гідрогеноліз, тем не менш, не гідролізує поліпептид. Таким чином, винахідники даного способу далі модифікували спосіб отримання для досягнення бажаної пікової молекулярної ваги з використанням специфічної кількості ініціатору реакції полімеризації. Використовуваними ініціаторами є nгексиламін та інші первинні аміни, діетиламін та інші діалкіламіни або натрію метоксид або будьяка комбінація ініціаторів. Патент США №5,800,808, опублікований 1 вересня 1998 (Konfino, та ін.) розкриває використання 0,1-0,2% діетиламіну в якості ініціатору в способі, що проводять при кімнатній температурі протягом 24 годин, що також використовує НВr для отримання поліпептидів з молекулярною вагою в діапазоні 5000-9000 дальтон. Навпроти, в цих прикладах заявники використовували 3,9г діетиламіну в якості ініціатору з 7,43г L-тирозин N-карбоксиангідриду, 34,61г N6-трифторацетил-L-Лізин Nкарбоксиангідриду, 21,25г L-аланін Nкарбоксиангідриду і 14,83г 5-бензил L-глютамат Nкарбоксиангідриду в способі, що проводять при 23°С-27°С протягом 24 годин для отримання сумі 13 93669 ші поліпептидів із середньою молекулярною вагою 12700 дальтон. На пікову молекулярної ваги суміші поліпептидів також впливають температура процесу і час реакції. В будь-якому варіанті здійснення об'єкту винаходу визначення пікової молекулярної ваги суміші поліпептидів можна проводити після полімеризації поліпептиду, але до видалення або бензильної захисної групи, або трифторацетильної захисної групи. Альтернативно, в будь-якому варіанті здійснення об'єкту винаходу пікової молекулярної ваги суміші поліпептидів може бути визначений після видалення бензильної захисної групи, аде до видалення трифторацетильної захисної групи. Ще одною альтернативою в будь-якому варіанті здійс Комп’ютерна верстка М. Ломалова 14 нення об'єкту винаходу є визначення пікової молекулярної ваги суміші поліпептидів після видалення обох захисних груп з поліпептиду. Регулювання пікової молекулярної ваги суміші поліпептидів можна також проводити на згаданих етапах способу за допомогою відомих методик, таких як хроматографічне фракціонування, фільтрація, ультрафільтраційний діаліз, ферментативний гідроліз або седиментація. Об'єкт винаходу забезпечує спосіб отримання суміші ацетатів поліпептидів, кожний з яких складається з глютамінової кислоти, аланіну, тирозину і лізину, який забезпечує зменшене утворення водних відходів і покращений контроль за піковою молекулярною вагою суміші ацетатів поліпептидів. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601