Готування придатної для зберігання суспензії життєздатних яєць глистів

1. Спосіб готування фармацевтичного препарату для внутрішнього застосування, що містить придатну для зберігання суспензію життєздатних яєць паразитичних, не патогенних для людини гельмінтів Trichuris suis, після прийому якої розвивається достатня для стимуляції регуляторних людських Т-клітин кількість гельмінтів, який відрізняється тим, що на одній стадії суспензію яєць гельмінтів піддають обробці кислотою при значенні рН не більше 2, а на іншій стадії значення рН підвищують до рівня не менше 4 і додають фармакологічно прийнятний консервант. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що обробка кислотою полягає у додаванні сірчаної кислоти. 3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що використовують консервант, вибраний із групи, що включає сорбінову кислоту, бензойну кислоту, солі цих кислот, ефіри парабензойної кислоти, пропіленгліколь і комбінації цих консервантів. 4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що використовують один або кілька консервантів, вибраних із групи, що включає сорбінову кислоту у концентрації від 0,01 до 0,2 мас. %, бензойну кислоту у концентрації від 0,1 до 0,3 мас. %, ефіри 2 (19) 1 3 Даний винахід відноситься до способу готування суспензій, що містять життєздатні, здатні до розвитку яйця паразитичних хробаків (гельмінтів) і придатних для терапевтичного застосування. Вплив паразитарних інфекцій на активацію імунної системи їхніх тваринних організмів-хазяїв є відомим фактом (Review, D.M. McKay, Parasitology 132, 2006, сс . 1-12). Активація імунної системи впливає також на зустрічальність і плин її захворювань. Результати епідеміологічних досліджень свідчать про те, що в регіонах з високою частотою глистяних інвазій (гельмінтозів) автоімунні захворювання зустрічаються рідше, ніж у регіонах, у яких завдяки кращим санітарно-гігієнічним умовам частота зустрічальності подібних інфекцій нижче. При вивченні цитокінового профілю людей, які страждають хворобою Крона, що представляє собою хронічне запальне захворювання травного тракту, було встановлено, що зараження гельмінтами може викликати стимуляцію Тh2-імуноцитів. Зараження гельмінтами дозволяє попереджати хворобу Крона, що є автоімунним захворюванням з домінуванням Th1-кліток, відповідно впливати на це захворювання (Summers й ін., Am. J. Gastroenterol. 98, 2003, сс . 2034-2041). Зараження гельмінтами дозволяє також впливати на інші викликувані Th1-імуноцитами захворювання, так само як і на викликуваний бактеріями Helicobacter гастрит й автоімунний енцефаломієліт. Ще в 1973 р. у літературі (Beer, Parasitology 67, 1973, сс . 253-262) з'явилися повідомлення про те, що придатної для імунізації людини могла б служити нематода Trichuris snis, що, не будучи патогенною для людини, не приводить до виникнення нематодозу. Нематода Trichuris suis є близьким родичем хробака Trichuris humanis і здатна, не розмножуючись, виживати у шлунковокишковому тракті людини. При такій самообмеженій інфекції ніякі терапевтичні заходи не потрібні. Тим самим зараження нематодом Trichuris suis дозволяє імунізувати організм людини. В R.J.S. Beer (Parasitology 65, 1972, сс . 343350) описаний спосіб збору й очищення яєць глистів. Відповідно до цього способу яйця глистів на стадії розвитку ембріонів культивують при 32°С в 0,2%-ому розчині дихромату калію й щодня аерують. Аналогічний спосіб очищення яєць глистів описаний в DE 10163115. Відповідно до цієї публікації яйця глистів очищають зід можливо присутніх мікроорганізмів і вірусів шляхом хімічних реакцій, при яких відбувається утворення гідроксильних або кисневих радикалів. У зазначеній публікації описана, зокрема, так називана реакція Фентона. У ході такої реакції з Н2О2 при дії FeCl2 in statu nascendi ("у момент виділення") утвориться кисень, що володіє дезінфікуючою дією, що і використається для очищення яєць глистів. У Boes й ін. в Veterinary Parasitology, 1998, сс . 181-190, описані розвиток ембріонів в отримані з жіночих особин яйцях глиста Ascaris suum при 96480 4 їхній витримці у сірчаній кислоті й інфективність таких яєць. В Summers й ін. (GUT 54, 2005, сс. 87-90) описаний спосіб очищення яєць нематоди Т. suis, які спочатку для розвитку ембріонів витримують протягом 5-6 тижнів у буферному розчині, що містить антибіотики (пеніцилін/стрептоміцин/амфотерицин В), а потім також культивують в 0,2%-ому розчині дихромату у фосфатному буфері при p 6-7. Застосування подібних агентів, що знищують бактерії й віруси, має цілий ряд різних істотних недоліків, які розглянуті нижче. При використанні розчину дихромату, так само як і при використанні розчину Фентона й той, і інший розчин необхідно видаляти після закінчення короткого періоду часу, щоб уникнути ушкодження яєць глистів. Крім цього, результати проведених експериментів свідчать про те, що в наступний за очищенням період розвитку ембріонів (протягом 3 місяців при 22-25°С) незважаючи на таке попереднє очищення відбувається інтенсивне інфікування яєць. Наступне зберігання яєць із ембріонами, що розвиваються, при 2-8°С також не дозволяє уникнути інфікування яєць. Обумовлено це, імовірно, тим, що після видалення подібних агентів, що знищують мікроорганізми й віруси, у суспензії яєць нематоди Т. suis знову починається розмноження мікроорганізмів. Крім цього з розчину необхідно повністю видаляти дихромат. Однак дотримання цієї умови зв'язано зі значними труднощами. Описане в Summers додавання антибіотиків щоб уникнути сильного інфікування яєць на стадії розвитку у них ембріонів хоча й дозволяє запобігти інтенсивному розмноженню мікроорганізмів на цій стадії, однак не гарантує повного їхнього знищення. Після видалення антибіотиків на наступних стадіях очищення яєць і при їхньому зберіганні аж до моменту застосування знову відбувається інтенсивне розмноження мікроорганізмів. В основу даного винаходу було покладене завдання розробити спосіб готування суспензії яєць глистів з ембріонами, що розвиваються, яке після її очищення від забруднюючих вірусів і мікроорганізмів, насамперед бактерій, можна було б зберігати без небезпеки проростання грибкових спор і розмноження дріжджів. У приготовленої подібним способом суспензії яйця глистів повинні зберігати свою здатність до розвитку з них дорослих особин. Крім цього приготовлені таким способом суспензії яєць глистів повинні бути придатні для терапевтичного застосування. При створенні даного винаходу зненацька було встановлено, що для вирішення зазначеного вище завдання найбільш придатний комбінований спосіб очищення й консервування, оскільки він на відміну від відомих способів не вимагає застосування токсичних речовин (наприклад, дихромату калію (K2Сr2О7)) і дезінфікуючих засобів. На стадії очищення виділені яйця гельмінтів, переважно яйця гельмінта Т. suis, протягом 1-72 5 год інкубують у розчині кислоти, переважно у розчині H2SO4, зі значенням рН не більше 2 (див. приклад 1). Оптимальна тривалість інкубації становить від 2 до 8 год, переважно 3 год. Інкубацію проводять при температурі у межах від 4 до 37°С, переважно від 25 до 35°С. При готуванні прийнятого всередину фармацевтичного препарату, що містить придатну для зберігання суспензію життєздатних яєць паразитичних, не патогенних для людини гельмінтів, після прийому якої розвивається достатня для стимуляції регуляторних людських Т-кліток кількість гельмінтів, спочатку на першій стадії суспензію яєць гельмінтів піддають обробці кислотою при значенні рН не більше 2. На наступній стадії значення рН підвищують до рівня не менше 4 і додають фармакологічно прийнятний консервант. У принципі можлива й зворотна послідовність проведення зазначених стадій, а саме: спочатку можна додавати консервант, а потім проводити обробку кислотою. Однак переважно все-таки спочатку проводити обробку кислотою й потім додавати консервант. Обробка кислотою у кращому варіанті полягає у додаванні сірчаної кислоти. При обробці кислотою її додають у кількості, достатній для зниження значення рН до рівня у межах від приблизно 0,5 до 2. У ще одному варіанті значення рН знижують до рівня у межах від приблизно 0 до менше 1. До числа придатних для застосування у цих потребах кислот відносяться соляна кислота, азотна кислота й сірчана кислота, переважно, однак, використати сірчану кислоту. Обробка кислотою повинна тривати лише протягом порівняно короткого періоду часу, щоб уникнути занадто сильного ушкодження яєць глистів. Щодо цього існує також взаємозв'язок між тривалістю обробки кислотою і її концентрацією. Значення рН переважно знижувати до менше 2, найбільше переважно навіть до рівня у межах від 0,6 до 0,8. Тривалість обробки кислотою становить від декількох хвилин до декількох годин, переважно від 120 до 360 хв. Протягом такого ще припустимого короткого періоду часу триває процес розвитку ембріонів у яйцях глистів (триває у цілому 3 місяці при 22-25°С). Після обробки кислотою значення рН додаванням прийнятної основи, наприклад, NaOH, знову підвищують до більше 4. Потім додають один або кілька консервантів, у якості яких у принципі можна використати всі придатні для консервування харчових продуктів або лікарських препаратів речовини. Переважно ж використовувати консерванти, які добре переносяться саме тими людьми, які страждають хворобою Крона. Консервант переважно вибирати із групи, що включає сорбінову кислоту, бензойну кислоту, солі цих кислот, ефіри парабензойної кислоти, ефіри парагідроксибензойної кислоти, пропіленгліколь і комбінації таких консервантів. Найбільше переважно використовувати один або кілька консервантів, вибраних із групи, що включає сорбінову кислоту у концентрації від 0,01 до 0,2%, насамперед від 0,1 до 0,2%, бензойну кислоту у концентрації від 0,1 до 0,3 мас. %, ефіри парагідроксибензойної кислоти у концентрації від 0,02 до 0,3 мас. %, пропіленгліколь у концентрації 96480 6 від 5 до 20 мас. % і комбінації таких консервантів з концентрацією у зазначених межах. Для швидкої інактивації мікроорганізмів і вірусів замість сильних кислот можна також використовувати більш слабкі кислі розчини з додаванням зазначених вище консервантів, переважно сорбінової кислоти і її солей. Перевага застосування таких розчинів перед застосуванням сильних кислот складається у можливості очищення яєць, їхньої витримки для розвитку у них ембріонів (протягом 3 місяців при 22-25°С) і введення в організм пацієнта в одному єдиному середовищі завдяки її менш кислому значенню рН. Настільки тривале знаходження яєць у подібному середовищі не приводить до зниження їхньої життєздатності (див. приклад 5). Такий бережливий спосіб передбачає застосування середовищ, які містять консерванти, зі значенням рН не менше 1, переважно не більше 2, і не приводить до зниження мікробіологічної чистоти суспензії яєць глистів. Отримані у результаті суспензії яєць глистів, які містять консервант, з ембріонами, що розвиваються, придатні для прийому пацієнтом у вигляді рідини (розчину) для пиття. До складу таких суспензій яєць глистів при необхідності можна включати додаткові фармацевтично прийнятні добавки, такі як барвники, смакові речовини або загусники. Відповідно до цього об'єкта винаходу є також прийняті усередину фармацевтичні препарати, що містять придатну для зберігання суспензію життєздатних яєць паразитичних, не патогенних для людини гельмінтів, насамперед гельмінтів Т. suis, після прийому якої розвивається достатня для стимуляції регуляторних Т-кліток кількість гельмінтів і зміст мікроорганізмів у якій становить менше 1000 колоноутворюючих одиниць (КУО) на мл її об'єму. У кращому варіанті зміст мікроорганізмів у прийнятому усередину фармацевтичному препараті становить менше 100 колоноутворюючих одиниць на мл об'єму суспензії. У найбільш кращому варіанті зміст мікроорганізмів у прийнятому усередину фармацевтичному препараті становить менше 10 колоноутворюючих одиниць на мл об'єму суспензії. Кількість колоноутворюючих одиниць визначають звичайними мікробіологічними методами. Під мікроорганізмами у даному контексті маються на увазі бактерії, віруси, гриби, дріжджі й найпростіші, при цьому повинна бути виключена присутність тих мікроорганізмів, які могли б завдати шкоди здоров'ю. Запропонований у винаході спосіб дозволяє одержувати придатну для зберігання суспензію яєць паразитичних, не патогенних для людини гельмінтів у формі, придатній для фармацевтичного застосування. Запропонована у винаході обробка, з одного боку, дозволяє завдяки практично повному знищенню забруднюючих мікроорганізмів, насамперед бактерій, а також грибів, вірусів і за певних умов найпростіших, одержувати придатний для фармацевтичного застосування препарат. З іншого боку, подібна обробка є настільки бережливою, що яйця глистів після прийому препарату, що їх містить, зберігають свою здатність дозрівати 7 96480 у травному тракті пацієнта й забезпечувати тим самим необхідну стимуляцію імунної системи. Запропоновані у винаході препарати придатні головним чином для лікування різних запальних захворювань травного тракту, насамперед хронічних запальних захворювань травного тракту. Запропоновані у винаході препарати найбільше переважно застосовувати для лікування запальних захворювань травного тракту, називаних хворобою Крона. Приклад 1: Зниження вмісту мікроорганізмів у суспензії яєць гельмінта Т. suis Відповідно до рекомендацій Німецької фармакопеї (DAB, Deutsches Arzneibuch, розділ 2.6.12, останнє відновлення з 24-м додатковим випуском у 2006 р.) визначали кількість мікроорганізмів у суспензії яєць гельмінта Trichuris suis (TSOсуспензії) у фосфатному буфері (рН 7) у концентрації 2400 яєць/мл. За результатами аналізу кількість мікроорганізмів у суспензії склала 190000 КУО/мл. Цю суспензію потім повторно забуферу 8 вали розведеним розчином H2SO44 до рН 2. Після 3-годинної витримки при 30°С кількість мікроорганізмів знизилася до менше 20 КУО/мл. Після цього перевіряли якість приготовленої описаним вище способом суспензії. Для цього відповідно до рекомендацій Німецької фармакопеї (DAB) використовували певні тест-штами бактерій, дріжджів і грибів. Результати цієї перевірки представлені у прикладах 2а, 2б й 2в. Приклад 2: Визначення кількості мікроорганізмів а) Живильну суспензію, склад якої відповідав представленому у DAB 2.6.13, інокулювали зазначеними нижче у таблиці 1 споротвірними й не споротвірними тест-бактеріями. Потім суспензію повторно забуферували розведеним розчином H2SO4 до рН 2 і витримували протягом 6 год при 30°С. Після цього визначали кількість мікроорганізмів, одержавши представлені у таблиці 1 результати. Таблиця 1 Мікроорганізм Clostridium sporog. Bacillus subtilis Escherichia coli Slaphylococus aureus Salmonella typhymurhim H2SO4, pH 2, через 6 год