Спосіб стандартизації сухих екстрактів трави деяких видів роду шавлія

Реферат: UA 96798 U UA 96798 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі фармації, зокрема до фітохімії, і може бути використана для стандартизації лікарської рослинної сировини та препаратів на її основі. З літературних даних відомо, що гідроксикоричні кислоти, зокрема корична, оксикорична, ферулова, хлорогенова кислоти та інші, містяться практично в кожній рослині, являють собою метаболіти та беруть участь у біосинтезі інших біологічно активних речовин. Природні гідроксикоричні кислоти проявляють високу біологічну активність. Лікарські препарати на основі рослинної сировини з високим вмістом гідроксикоричних кислот використовуються як протимікробні, антиоксидантні, протизапальні, в'яжучі, гіпотензивних, діуретичні лікарські засоби [1]. В народній медицині здавна використовують різні види роду Шавлія при різноманітних захворюваннях, таких як ангіна, фарингіт, стоматит, екзема, трофічна виразка, артроз, радикуліт, неврит та інші [2, 3, 4]. За літературними даними мажоритарним компонентом представників роду Шавлія є розмаринова кислота, яка проявляє антиоксидантну дію [5, 6]. Розмаринова кислота є похідним кавової кислоти або 3,4-дигідроксикоричної кислоти. Виходячи з цього, вважалось за доцільне кількісно визначити вміст маркерної сполуки роду Шавлія - розмаринової кислоти в сухих екстрактах трави деяких видів зазначеного роду, які можна використовувати як потенційні лікарські засоби. Раніше нами було досліджено, що сухі екстракти трави шавлії кільчастої та шавлії відхиленої проявляють противиразкову, протизапальну та антидіабетичну активності [9, 10, 11, 12]. За найближчий аналог нами взято патент України МПК (2012.01)А61K 31/00 Бюл. № 23 від 10.12.2012 [7]. Автори цього патенту визначали методом ВЕРХ вміст розмаринової кислоти в сировині листя розмарину лікарського в багатокомпонентних рослинних сумішах. В результаті в присутності біологічно активних речовин інших рослин було ідентифіковано та кількісно визначено розмаринову кислоту, як компонента листя розмарину лікарського, за допомогою методу ВЕРХ з попередньою очисткою проби, з застосуванням твердофазної екстракції. Недоліком існуючого способу стандартизації сировини є те, що найближчий аналог передбачає визначення вмісту розмаринової кислоти лише для листя розмарину лікарського та для багатокомпонентних рослинних сумішей, до складу яких входить листя розмарину лікарського. Також існуючий спосіб визначення розмаринової кислоти вимагає досить тривалого часу хроматографування, який становить 60 хвилин, та попередньої очисткою проби, з застосуванням твердофазної екстракції. Об'єкт, який підлягає удосконаленню - спосіб ідентифікації та визначення кількісного вмісту розмаринової кислоти в сухих екстрактах трави деяких видів роду Шавлія. Як зазначалося, в сировині представників роду Шавлія міститься біологічно активна речовина розмаринова кислота [8], що є похідним гідроксикоричної кислоти. Виходячи з цього, з застосуванням методу високоефективної рідинної хроматографії(ВЕРХ), нами було розроблено методику визначення розмаринової кислоти в сухих екстрактах трави шавлії кільчастої та шавлії відхиленої, зібраної в різних регіонах України. Згідно з отриманими даними, в усіх пробах було ідентифіковано та кількісно визначено похідне гідроксикоричної кислоти - розмаринову кислоту, її вміст в досліджуваних зразках знаходився в межах від 5,83±0,001 % до 9,18±0,012 %, у перерахунку на суху сировину. Процес ідентифікації та кількісного визначення розмаринової кислоти, як компонента сухих екстрактів трави шавлії кільчастої та шавлії відхиленої полягає в знаходженні оптимальних умов для хроматографічного розділення розмаринової кислоти та інших біологічно активних сполук досліджуваних зразків. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити ідентифікацію та кількісне визначення розмаринової кислоти таким чином, щоб забезпечити можливість стандартизації іншої рослинної сировини, до складу якої входить розмаринова кислота, крім листя розмарину лікарського, також скороти час хроматографування. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб стандартизації сухих екстрактів трави деяких видів Шавлія включає використання методу ВЕРХ. При цьому використовується градієнтне елюювання з використанням підкислених водної та ацетонітрильної рухомих фаз, колонки, заповненої силікагелем октадецилсилільним для хроматографії, застосування якої дозволяє добитися розділення піків розмаринової кислоти та інших компонентів рослинної сировини. Приклади конкретного виконання Приклад 1. Наважки масою близько 50,0 мг порошку сухих екстрактів трави шавлії кільчастої та шавлії відхиленої поміщають в мірні колби місткістю 50 мл, розчиняють в 70 % (об./об.) спирті 1 UA 96798 U 5 10 Р, об'єм розчину доводять тим самим розчинником до позначки, фільтрують через мембранні фільтри з розміром пор 0,45 мкм. По 2,0 мл кожного з одержаних розчинів доводять сумішшю ацетонітрил: вода у співвідношенні (1:1) до 10,0 мл. По 15 мкл досліджуваного розчину та розчину достовірного зразку розмаринової кислоти поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі, обладнаному УФ-детектором в наступних умовах: колонка з нержавіючою сталі, С18 SunFire, розміром 100 мм х4,6 мм з розміром зерна 3,5 мкм; детектування за довжини хвилі 330 нм; температура термостату колонок 38 °C; швидкість потоку 1,0 мл/хв.; об'єм проби, що уводиться 15 мкл. Рухома фаза А - 0,05 % розчин кислоти трифтороцтової; Рухома фаза В - 0,05 % розчин кислоти трифтороцтової в ацетонітрилі. Умови градієнтного елюювання: Час, хвилини 01 120 2030 3033 3333,5 15 20 25 30 35 40 45 50 Рухома фаза А, % (об/об) 92 9275 750 0 092 Рухома фаза В, % (об/об) 8 825 25100 100 1008 Режим ізократичний градієнтний градієнтний ізократичний градієнтний Вміст розмаринової кислоти в досліджуваних зразках (в %) обчислюється за наступною формулою: A пр  Сст  100  10  100  Р  100 , X A пр  mпр  2  100  (100  W ) де Апр - площа піку розмаринової кислоти на хроматограмі досліджуваного розчину; Аст - площа піку розмаринової кислоти на хроматограмі розчину порівняння розмаринової кислоти; Сст - концентрація розмаринової кислоти в розчині порівняння розмаринової кислоти, г/мл; mпp - наважка досліджуваного зразку, г; Р - вміст основної речовини у достовірному зразку розмаринової кислоти, %; W - втрата в масі при висушуванні досліджуваного зразку, %. Приготування розчину порівняння розмаринової кислоти: Близько 10,0 мг (точна наважка) РСЗ кислоти розмаринової, розчиняють у 70 % (об./об.) спирті Р, об'єм розчину доводять тим самим розчинником до 100,0 мл. 2,0 мл одержаного розчину доводять розчинником до 10,0 мл. На хроматограмі досліджуваного розчину повинен бути присутній пік, час утримування якого відповідає часу утримування піку розмаринової кислоти на хроматограмі розчину порівняння розмаринової кислоти. На підставі експериментальних даних для сухих екстрактів трави шавлії кільчастої та шавлії відхиленої нами рекомендовано граничний вміст розмаринової кислоти не менше 4,5 % в перерахунку на суху сировину. Хроматограми розчину порівняння розмаринової кислоти, досліджуваних розчинів сухих екстрактів трави шавлії кільчастої та шавлії відхиленої представлені на фіг. 1, фіг. 2, фіг. 3 відповідно. За даних умов аналізу пік розмаринової кислоти має час утримування близько 19 хвилин (фіг. 1). На хроматограмах досліджуваних сухих екстрактів трави шавлії кільчастої та шавлії відхиленої (фіг. 2 та фіг. 3, відповідно) присутній пік розмаринової кислоти з часом утримування близько 19 хвилин. На підставі отриманих даних зроблено висновок, що у сухих екстрактах трави шавлії кільчастої та шавлії відхиленої, а також рослинній сировині, до складу якої входить похідне гідроксикоричної кислоти - розмаринова кислота, можна точно визначати її наявність та кількісний вміст. Запропонована ВЕРХ-методика визначення розмаринової кислоти практично в 2 рази коротша, ніж ВЕРХ-методика запропонована в найближчому аналогу. Корисна модель обумовлює можливість ідентифікації та визначення кількісного вмісту розмаринової кислоти, як фізіологічно активного компонента, що присутній в сухих екстрактах трави шавлії кільчастої та шавлії відхиленої. Порівняння способів визначення у найближчому аналогу та корисній моделі наведено в таблиці. 2 UA 96798 U Таблиця Характеристика способів стандартизації сухих екстрактів трави деяких видів роду Шавлія № п/п Об'єкт Найближчий аналог Компонент Розмаринова кислота Корисна модель Розмаринова кислота 1 2 5 10 15 20 25 30 Об'єкт дослідження Листя розмарину лікарського в рослинних сумішах, що містять в своєму складі листя розмарину, корені любистку, траву золототисячнику, корені солодки, плоди шипшини, плоди коріандру та шишки хмелю Сухі екстракти трави шавлії кільчастої та шавлії відхиленої, які містять розмаринову кислоту в якості основного біологічно активного компонента Метод визначення Метод ВЕРХ Можливість кількісної стандартизації листя розмарину лікарського; специфічне визначення Метод ВЕРХ Можливість кількісної стандартизації сухих екстрактів трави шавлії кільчастої та шавлії відхиленої, які можуть використовуватись в якості лікарських засобів з проти виразковою, протизапальною та анти діабетичною діями; специфічне визначення Джерела інформації: 1. Карпук В. В.Фармакогнозия: учеб. пособие / В. В. Карпук. - Минск: БГУ, 2011.-340 с. 2. Соколов С. Я. Справочник по лекарственным растениям / С. Я. Соколов, И. П. Замотаев. М.: Медицина, 1985. - 464 с. 3. Солодовниченко Н. М. Лікарська рослинна сировина та фітопрепарати: посіб. з фармакогнозії з основами біохімії лікарських рослин / Н. М. Солодовниченко, М. С. Журавльов, В. М. Ковальов. - X.: Вид-во НФаУ: Золоті сторінки, 2001. - 408 с 4. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России.-5-е изд. - М.: АстраФармСервис, 2006. - 1632 с. 5. Genena A., Hense Н., Smania Junior A. de Souza S. Rosemary (Rosmarinus officinalis) - a study of the composition, antioxidant and antimicrobial activities of extracts obtained with supercritical carbon dioxide / Cienc. Tecnol. Aliment.-2008. - N 28(2). - P. 463-469. 6. Bahman Nickvar, Mohhamad Kamalinejad, Hamidreza Izadpanah. In vitro free radical scavenging activity of five Salvia spesies./ Pak. Journal Pharmaceutical Science, 2007, Vol. 20(4). P. 291-294. 7. ГудзенкоА.В., Цуркан О.О., Ковальчук Т.В. Спосібстандартизації листя розмарину лікарського (Rosmarinus officinalis L.) в багатокомпонентних рослинних сумішах. Патент № А61K 31/00. Надрук. 10.12.2012, Бюл. № 23. - 5 с. 8. Tosun M., Ercisli S., Sengul M., Ozer H., Polat Т., Ozturk E. Antioxidant Properties and Total Phenolic Content of Eight Salvia Species from Turkey. / Biological Reserch, Vol. 42, 2009. P. 175181. 9. Семенченко О.М., Цуркан О.О., Корабльова О.А., Бурмака О.В. Дослідження гострої токсичності та протизапальної активності екстрактів трави деяких видів роду Salvia L. Фармацевтичний журнал. - 2013 - №6. - С 84-87. 10. Семенченко О.М. Порівняльне дослідження впливу деяких видів роду Шавлія на рівень глюкози в крові самців-щурів на моделі стрептозотоцинового діабету (діабет 1 типу). "Медична наука та практика XXI століття" (м. Київ, 07-08 лютого 2014р.):Збірник матеріалів міжнародної науково-практичної конференції. Київ: "Київський медичний науковий центр", 2014. - С. 111-114. 11. Семенченко О.М., Цуркан О.О., Корабльова О.А., Бурмака О.В. Експериментальне вивчення противиразкової активності трави деяких видів роду SalviaL. на моделі спиртовопреднізолонової виразки шлунка у щурів. Фармакологія та лікарська токсикологія, №2 (38)/2014. - С. 55-58. 3 UA 96798 U 12. SemenchenkoOIha, Korableva Olga. The experimental study of anti-ulcer activity of herbs of some of the genus Salvia at the experimental alcohol-prednisolone model of gastric ulcer in rats. Book of Abstracts of Young Scientists Meeting "Trends in Natural Products Research", June 23-25, 2014, Olomouc, Czech Republic, p. 81. 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Спосіб стандартизації сухих екстрактів трави деяких видів роду Шавлія, що включає використання методу ВЕРХ, який відрізняється тим, що маркерну сполуку роду Шавлія розмаринову кислоту, визначають хроматографуванням на рідинному хроматографі, обладнаному УФ-детектором, в градієнтному режимі з використанням підкислених водної та ацетонітрильної рухомих фаз, колонки, заповненої силікагелем октадецилсилільним для хроматографії. 4 UA 96798 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5