Спосіб підвищення ефективності трансдукції

Реферат: Винахід стосується способу підвищення трансдукції кровотворних стовбурових клітин або клітин-попередників, культивованих з лентивірусом, який включає культивування стовбурових клітин або клітин-попередників і лентивірусу в культуральному середовищі, що містить сполуку, яка забезпечує посилення сигнального шляху рецептора простагландину ЕР. UA 114796 C2 (12) UA 114796 C2 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ Ця заявка, відповідно до §119(e) Глави 35 Зводу Законів США, заявляє пріоритет згідно з попередньою заявкою на патент США № 61/541, 736, поданою 30 вересня 2011 р., зміст якої повністю включено в дану заявку шляхом посилання. КОМЕНТАР ДО ЗАЗНАЧЕНОЇ ПОСЛІДОВНОСТІ Послідовність, прикладена до цієї заявки, надана в текстовому форматі як заміна екземпляру на папері, і включена в опис винаходу шляхом посилання. Назва файлу, що містить послідовність, - BLBD_006_01WO_ST25.txt. Розмір файлу 30 кілобайт, дата створення 27 вересня 2012 р., файл підготовлений за допомогою шифрувальної файлової системи EFS-Web. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Галузь техніки Цей винахід відноситься до способу підвищення ефективності трансдукції клітин. Зокрема, цей винахід забезпечує способи і матеріали, що підвищують ефективність трансдукції клітин, таких, як кровотворні стовбурові клітини людини (ГСК), вірусами і/або векторами, які можуть бути застосовані в терапевтичних цілях. Опис рівня техніки Управління з санітарного нагляду за якістю харчових продуктів і медикаментів (FDA) дотепер не санкціонувало продаж жодного з препаратів для генної терапії людини. На сьогоднішній день, генна терапія залишається експериментальною дисципліною і не зарекомендувала себе досить ефективною в процесі клінічних випробувань. З перших клінічних випробувань препаратів для генної терапії, що почалися в 1990 році, значного прогресу не відзначено. В 1999 році, після смерті 18-літнього Джессі Гелсінгера, генна терапія була відкинута на крок назад. Джессі Гелсінгер брав участь у клінічних випробуваннях препаратів для генної терапії недостатності орнітинтранскарбамілази (OTCD). Смерть настала в результаті поліорганної недостатності, що настала через 4 дні після початку терапії. Можливо, смерть викликала інтенсивна імунна відповідь на аденовірусний носій. Інший серйозний скандал відбувся в січні 2003, коли Управління з санітарного нагляду за якістю харчових продуктів і медикаментів тимчасово призупинило проведення всіх клінічних випробувань препаратів для генної терапії із застосуванням ретровірусних векторів у кровотворних стовбурових клітинах. Управління з санітарного нагляду за якістю харчових продуктів і медикаментів пішло на цей крок, коли була отримана інформація про те, що в другої дитини, що брала участь у випробуваннях препаратів для генної терапії у Франції розвився лейкемієподібний синдром. Як ця дитина, так й інша, у якої розвився такий же синдром у серпні 2002, успішно проходили лікування із застосуванням генної терапії з приводу Х-зчепленого синдрому важкого комбінованого імунодефіциту (ТKІН, X-SCID). Консультативний комітет по модифікаторам біологічного відгуку керування (Biological Response Modifiers Advisory Committee, BRMAC) провів засідання в лютому 2003, для визначення можливих заходів, які дозволили б продовжувати деякі клінічні випробування із застосуванням генної терапії для лікування захворювань, небезпечних для життя, з достатнім ступенем безпеки. У квітні 2003 управління зняло заборону на застосування ретровірусних векторів у стовбурових кровотворних клітинах при проведенні випробувань препаратів для генної терапії. Хоч би як, останнім часом кілька груп досягли певних успіхів у застосуванні генної терапії при лікуванні деяких серйозних захворювань. У 2008 британські дослідники з Інституту Офтальмології Університетського Коледжу Лондона (the UCL Institute of Ophthalmology) і Центру Біомедицинських досліджень Національного НДІ охорони здоров'я (NIHR) при офтальмологічній лікарні Мурфілдс (Moorfields Eye Hospital) оголосили про успішні клінічні випробування із застосуванням генної терапії для лікування амаврозу Лебера, одного з видів уродженої сліпоти. Результати показали, що експериментальне лікування безпечне і може поліпшити зір (Maguire et al., N Eнгl J Med. 358(21):2240 (2008)). У 2001, компанія Neurologix, Inc. оголосила про позитивні результати другої фази досліджень застосування генної терапії на пізній стадії хвороби Паркінсона (PD), NLX-P101. В учасників досліджень, що приймали NLX-P101, відзначили статистично значимі і клінічно важливі поліпшення показників рухової активності привідсутності медикаментозного лікування, у порівнянні з контрольною групою, що одержує лікування за допомогою плацебо-хірургії. Поліпшення було відзначено через місяць після початку дослідження, і практично не мінялося протягом шести місяців спостереження з маскуванням критеріїв оцінки. Результати також показали позитивні характеристики безпеки NLX-P101, серйозних побічних ефектів, пов'язаних із застосуванням генної терапії і хірургічного втручання, зареєстровано не було. Пацієнти, притягнуті до дослідження, страждали хворобою Паркінсона в середній і пізній стадії і не піддавалися лікуванню загальновідомими способами. 1 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У 2009 група французьких дослідників привела інформацію про те, що застосування генної терапії з використанням кровотворних стовбурових клітин ефективне в лікуванні Х-зчепленої адренолейкодистрофії (ALD). Узяті у пацієнтів аутологічні стовбурові клітки "відкоригували" генетично ex vivo і ввели назад пацієнтам, що пройшли мієлоаблятивну терапію. За період від 24 до 30 місяців наступного спостереження, відзначили відновлення багатьох типів клітин: 914 % гранулоцитів, моноцитів, а також Т-Т- і В-лімфоцитів, що експресують ALD-білок. Ці результати підтверджують, що кровотворні клітини пацієнтів піддалися трансдукції. Через 14-16 місяців після введення "відкоректованих" клітин, прогресуюча церебральна демієлінізація у двох пацієнтів повністю припинилася. Недавній прогрес в області генної терапії дозволяє сподіватися, що пацієнти, що страждають від гемоглобінопатій, таких як β-таласемія і серпоподібнаклітинна анемія, зможуть одержувати ефективне лікування завдяки новітнім науковим розробкам. Трансплантація кровотворних клітин, модифікованих лентивірусним вектором, що несе ген β-глобіну, привела до тривалого поліпшення в моделях порушення синтезу і обміну гемоглобіну в мишей Imren et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(22):14380-14385; Malik et al., Ann NY Acad Sci. 2005;1054:238-249; May et al., Nature. 2000;406(6791):82-86; Pawliuk et al., Science. 2001;294(5550): 2368-2371), але при цьому, залежність від переливань крові зникла лише у випадку одного пацієнта, що страждає β-таласемією (Cavazzana-Calvo et al., Nature. 2010;467(7313):318-322). Незважаючи на те, що головними перевагами введення генетично модифікованих аутологічних клітин є мінімальний ризик виникнення реакції "трансплантат проти хазяїна" і необхідності проведення імуносупресивної терапії перед трансплантацією, а також відсутність необхідності добору сумісного донора, сучасні методи лікування зустрічаються щонайменше з трьома серйозними проблемами: необхідно проводити токсичну процедуру мієлоабляції (Dunbar et al, . Hum Gene Ther. 1998;9(17):2629-2640); сучасні способи трансдукції можуть забезпечити трансдукцію лише незначної частини кровотворних стовбурових клітин (Santoni de Sio and Naldini, Methods Mol Biol. 2009;506:59-70); а також, різні доступні способи селекції in vivo характеризуються недостатнім ступенем ефективності і безпеки (Beard et al., J Clin Invest. 2010;120(7):2345-2354; Cornetta et al., Cancer Gene Ther. 2006;13(9):886-895; Milsom et al., Cancer Res. 2008;68(15): 6171-6180). Зокрема, у випадку порушень, при яких застосовується генна терапія з використанням кровотворних стовбурових клітин, наприклад, серпоподібноклітинної анемії, β-таласемії, адренолейкодистрофії і адреномієлонейропатії, обмеження в застосуванні включають, але не обмежуються недостатньою ефективністю трансдукції стовбурових кровотворних клітин або клітин-попередників, необхідністю проведення токсичної мієлосупресивної або мієлоаблятивної терапії і відсутністю оптимальних способів селекції трансдуційованих клітин in vivo. Таким чином, у даній галузі техніки виникла необхідність розробити поліпшені способи застосування генної терапії і, зокрема, способи застосування для лікування або профілактики порушень кровотворення. У цьому винаході запропоновані способи вирішення основних проблем у даній галузі техніки. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Загалом, цей винахід забезпечує способи і композиції, що містять сполуку, яка підсилює сигнальні шляхи рецептора простагландину ЕР для підвищення ефективності трансдукції. Крім того, композиції і способи згідно з винаходом забезпечують більш безпечні і надійні способи трансдукції клітин, таких як кровотворні стовбурові клітини людини, вірусами і/або вірусними векторами. Композиції і способи можуть застосовуватися для лікування за допомогою генної терапії з використанням кровотворних стовбурових клітин при відповідних терапевтичних показаннях. Згідно з різними варіантами реалізації, цей винахід відноситься, зокрема, до способу підвищення ефективності трансдукції клітин, що культивуються з ретровірусом. Зазначений спосіб включає культивування клітин і ретровіруса, що містить одну або кілька сполук, які підсилюють сигнальні шляхи рецептора простагландину ЕР. Відповідно до одного з варіантів реалізації, зазначена сполука являє собою невелику молекулу. Відповідно до одного з варіантів реалізації, зазначені клітини являють собою клітинипопередники. Згідно з певним варіантом реалізації, стовбурові клітини або клітини-попередники вибирають із групи, що складається з: ембріональних стовбурових клітин та індукованих плуріпотентних стовбурових клітин. Згідно з іншим варіантом реалізації, стовбурові клітини або клітини-попередники вибирають із групи, що складається з: мезенхімальних стовбурових клітин, стовбурових кровотворних 2 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 клітин, стовбурових клітин нервової тканини, стовбурових клітин сітківки, стовбурових клітин міокарда, стовбурових клітин кістякових м'язів, стовбурових клітин жирової тканини, стовбурових клітин хрящової тканини, стовбурових клітин печінки, стовбурових клітин нирок і стовбурових клітин підшлункової залози. Згідно з певним варіантом реалізації, кровотворні стовбурові клітини або клітинипопередники являють собою стовбурові клітини або кровотворні клітини-попередники. Згідно з іншим варіантом реалізації, зазначені клітини вибирають із групи, що складається з: остеобластів, хондроцитів, адипоцитів, клітин кістякових м'язів, кардіоміоцитів, нейронів, астроцитів, олігодендроцитів, шванівських клітин, клітин сітківки, клітин роговиці, клітин шкіри, моноцитів, макрофагів, нейтрофілів, базофілів, еозинофілів, еритроцитів, мегакаріоцитів, дендритних клітин, Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів, NK-клітин, клітин шлунку, клітин кишечнику, гладком'язових клітин, клітин судин, клітин сечового міхура, α-клітин підшлункової залози, βклітин підшлункової залози, дельта-клітин підшлункової залози, гепатоцитів, клітин нирок, клітин надниркової залози і клітин легенів. Відповідно до іншого певного варіанту реалізації, зазначені клітини являють собою кровотворні стовбурові клітини або кровотворні клітини-попередники. Відповідно до одного з варіантів реалізації, щонайменше, 50 % стовбурових кровотворних клітин або кровотворних клітин-попередників є трансдуційованими. Згідно з іншим варіантом реалізації, щонайменше, 75 % кровотворних стовбурових клітин або кровотворних клітин-попередників є трансдуційованими. Згідно з іншим варіантом реалізації, щонайменше, 90 % кровотворних стовбурових клітин або кровотворних клітин-попередників є трансдуційованими. Згідно з конкретними варіантами реалізації, кожна з композицій або способів, зазначених у цій заявці, включає одну або кілька сполук, які підсилюють сигнальні шляхи рецептора простагландіну ЕР і вибирають із групи, що складається з: PGA2; PGB2; PGD2; PGE1; PGE2; PGF2; PGI2; PGH2; PGJ2; а також їх попередників, метаболітів, похідних і аналогів. Згідно з конкретними варіантами реалізації, кожна з композицій або способів, зазначених у цій заявці, включає одну або кілька сполук, які підсилюють сигнальні шляхи рецептора простагландіну ЕР і вибирають із групи, що складається з: 15d-PGJ2; дельта-12-PGJ2; 2гідроксигептадекатрієнової кислоти (HHT); тромбоксану A2; тромбоксану B2; ілопросту; трепростинілу; травопросту; карбопрост трометаміну; тафлупросту; латанопросту; біматопросту; унопростон ізопропілу; клопростенолу; естрофану; суперфану; мізопростолу; бутапросту; лінолевої кислоти; 13(s)-HODE; LY171883; мідової кислоти; ейкозатрієнової кислоти; епоксиейкозатрієнової кислоти; ONO-259; Cay1039; агоніста рецептора PGE2; 16,16диметил PGE2; 19(R)-гідрокси PGE2; 16,16-диметил PGE2 p-(p-ацетамідобензамідо) фенілового ефіру; 11-дезокси-16,16-диметил PGE2; 9-дезокси-9-метилен-16,16-диметил PGE2; 9-дезокси-9метилен PGE2; сульпростону; сериноламіду PGE2; метилового ефіру PGE2; 16-феніл-тетранор PGE2; 15(S)-15-метил PGE2; 15(R)-15-метил PGE2; BIO; 8-бром-цАМФ; форсколіну; ацетоксиметилового ефіру 1,2-біс етан-N,N,N,N-тетраоцтової кислоти; фендиліну; нікардипіну; ніфедипіну; пімозиду; строфантидину; ланатозиду; L-аргініну; нітропрусиду натрію; ванадату натрію; брадикініну; мебеверину; флурандреноліду; атенололу; піндололу; габоксадолу; оксихінолінкарбонової кислоти; гідралазину; тіабендазолу; бікукуліну; везаміколу; перувозиду; іміпраміну; хлорпропаміду; 1,5-пентаметилентетразолу; 4-амінопіридину; диазоксиду; бенфотіаміну; 12-метоксидодеценової кислоти; N-форміл-метіоніл-лейцил-фенілаланіну; галаміну; IAA 94; і хлортрианізену. Згідно з деякими варіантами реалізації, кожна з композицій або способів, зазначених у цій заявці, включає одну або кілька сполук, які підсилюють сигнальні шляхи рецептора простагландіну ЕР і вибирають із групи, що складається з: простагландіну E2(PGE 2) або 16,16диметил PGE2. Згідно з іншими варіантами реалізації, будь-який зі способів, зазначених у цій заявці, включає культивування клітин і ретровірусу в присутності інгібітора деацетилази гістонів (HDAC). Відповідно до одного з варіантів реалізації, інгібітор деацетилази гістонів (HDAC) вибирають із групи, що складається з: трихостатину А (TSA), вальпроєвої кислоти (VPA), бутирату натрію, субероїланіліду гідроксамової кислоти (SAHA), фенілбутирату натрію, депсипептидів, трапоксину (TPX), пептиду 1, що містить циклічну гідроксамову кислоту (CHAPl), MS-275, LBH589 і PXD-101. Згідно з різними варіантами реалізації, кожна з композицій або способів, зазначених у цій заявці, включає ретровірус, який являє собою лентивірус. 3 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно з конкретними варіантами реалізації, кожна з композицій або способів, зазначених у цій заявці, включає ретровірус, який являє собою вірус імунодефіциту людину (ВІЛ). Згідно з конкретними варіантами реалізації, кожна з композицій або способів, зазначених у цій заявці, включає ретровірус, псевдотипований білком G оболонки вірусу везикулярного стоматиту (VSV-G). Згідно з іншими варіантами реалізації, будь-який зі способів, зазначених у цій заявці, включає культивування клітин у присутності сполуки, яка підсилює сигнальні шляхи рецептора простагландіну ЕР до початку процесу трансдукції. Згідно з конкретними варіантами реалізації, клітини культивують у присутності сполуки, яка забезпечує посилення сигнального шляху рецептора простагландіну ЕР, протягом щонайменше 2 годин. Згідно з іншими варіантами реалізації, клітини культивують у присутності сполуки, яка забезпечує посилення сигнального шляху рецептора простагландіну ЕР, протягом щонайменше 4 годин. Згідно з конкретними варіантами реалізації, клітини культивують у присутності сполуки, яка підсилює сигнальні шляхи рецептора простагландіну ЕР, одночасно з процесом трансдукції. Згідно з іншими варіантами реалізації, клітини культивують у присутності сполуки, яка забезпечує посилення сигнального шляху рецептора простагландіну ЕР, протягом щонайменше 24 годин. Згідно з іншими варіантами реалізації, клітини культивують у присутності сполуки, яка забезпечує посилення сигнального шляху рецептора простагландіну ЕР, протягом щонайменше перших 24 годин після початку процесу трансдукції. Згідно з деякими варіантами реалізації, клітини культивують у присутності сполуки, яка забезпечує посилення сигнального шляху рецептора простагландіну ЕР, протягом щонайменше перших 48 годин після початку процесу трансдукції. Згідно з конкретними варіантами реалізації, кожна з композицій або способів, зазначених у цій заявці, включає ретровірус, який містить вектор, що складається з: лівого (5') довгого кінцевого повтору (LTR-послідовності) ретровірусу; послідовності контролю експресії, функціонально пов'язаної з геном, що представляє інтерес; і правого (3') довгого кінцевого повтору (LTR-послідовності) ретровірусу. Згідно з конкретними варіантами реалізації, кожна з композицій або способів, зазначених у цій заявці, включає ретровірус, який містить вектор, що складається з: лівого (5') довгого кінцевого повтору (LTR-послідовності) ВІЛ-1; псіпослідовності для упаковки (Ψ+); елемента, що зв'язується з білком rev (RRE-структури); промотору β-глобіну і локус контролюючої області (LCR) β-глобіну, функціонально зв'язаних з геном, що представляє інтерес, і правого (3') довгого кінцевого повтору (LTR-послідовності), що включає: один або декілька інсуляторів або поліаденілової послідовності β-глобіну кролика (rβgpA). Згідно з різними варіантами реалізації, кровотворні стовбурові клітини або клітинипопередники вводяться в організм пацієнта, що страждає від гемоглобінопатії. Відповідно до різних певних варіантів реалізації, гемоглобінопатія являє собою β-таласемію або серпоподібнуклітинну анемію. Згідно з конкретними варіантами реалізації, кожна з композицій або способів, зазначених у цій заявці, включає ретровірус, що складається з: лівого (5') довгого кінцевого повтору (LTRпослідовності) ВІЛ-1; псі-послідовності для упаковки (Ψ+); елемента, що зв'язується з білком rev (RRE-структури); промотор MND (синтетичного промотору, що містить область U3 довгого кінцевого повтору (LTR-послідовності) вірусу мишачого лейкозу Молоні (MoMмклV) і енхансер вірусу мієлопроліферативної саркоми мишей), функціонально зв'язаний з полінуклеотидом, що кодує поліпептид ABCD1 людини; правого (3') довгого кінцевого повтору (LTR-послідовності) ВІЛ-1 і поліаденілової послідовності β-глобіну кролика (rβgpA). Згідно з різними варіантами реалізації, стовбурові кровотворні клітини або клітинипопередники вводять пацієнтові, що страждає адренолейкодистрофією або адреномієлонейропатією. Згідно з різними варіантами реалізації, ретровірус являє собою реплікативно-дефектний вірус. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фігура 1 ілюструє результати визначення сполук, що стимулюють трансдукцію клітин CD34+. Клітини піддали процесу відтавання і попередньо стимулювали фактором стовбурових клітин (SCF), тромбопоетином (TPO), білком FltL і інтерлейкіном-3 (IL3), а потім піддали трансдукції GFP+ лентивірусом (що містить зелений флуоресцентний білок). Крім того, клітини піддали 4 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 впливу розчинних факторів у високій, середній і низькій концентрації (див. Таблицю 1) у процесі попередньої стимуляції (0-24 години), або в процесі трансдукції (24-48 годин). Потім клітини промили і культивували протягом приблизно 1 тижня, після чого досліджували за допомогою проточної цитометрії. Потім визначили кількість GFP+ клітин і ілюстрували його на тепловій карті (двомірній колірній карті). Сірі області відповідають приблизно 45 %-вій кількості трансдуційованих клітин, при динамічному діапазоні від 0 % (чорні області) до ~92 % (білі області). КОРОТКИЙ ОПИС ІДЕНТИФІКАТОРІВ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ SEQ ID NO: 1 описує полінуклеотидну послідовність кДНК α-глобіну людини SEQ ID NO: 2 описує амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга α-глобіну людини SEQ ID NO: 3 описує амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга α-глобіну миші SEQ ID NO: 4 описує амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга α-глобіну пацюка SEQ ID NO: 5 описує полінуклеотидну послідовність кДНК β-глобіну людини SEQ ID NO: 6 описує амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга β-глобіну людини SEQ ID NO: 7 описує амінокислотну послідовність мутантного поліпептидного ланцюга βглобіну людини SEQ ID NO: 8 описує амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга β-глобіну миші SEQ ID NO: 9 описує амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга β-глобіну пацюка SEQ ID NO: 10 описує полінуклеотидну послідовність кДНК γ-глобіну людини SEQ ID NO: 11 описує амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга γ-глобіну людини SEQ ID NO: 12 описує амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга γ-глобіну миші SEQ ID NO: 13 описує амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга γ-глобіну пацюка SEQ ID NO: 14 описує полінуклеотидну послідовність кДНК дельта-глобіну людини SEQ ID NO: 15 описує амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга дельта-глобіну людини SEQ ID NO: 16 далі описує послідовність кДНК, що кодує полінуклеотид ACBD1 SEQ ID NO: 17 далі описує послідовність кДНК, що кодує полінуклеотид ACBD1 SEQ ID NO: 18 далі описує амінокислотну послідовність поліпептиду ACBD1. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ A. Короткий опис Цей винахід відноситься до вдосконалених композицій, що застосовуються у генній терапії для лікування, профілактики або поліпшення перебігу генетичних порушень. Одним з важливих завдань генної терапії є підвищення ефективності трансдукції клітин, що містять гени, які будуть введені в організм суб'єкта, в умовах, коли "відкоректовані" клітини не мають природної переваги при відборі перед нетрансдуційованими клітинами. Цей винахід, зокрема, ґрунтується на несподівано отриманій інформації про те, що новітні способи трансдукції клітин згідно з винаходом можуть застосовуватися для одержання більшої кількості "лікувальних" або "відкоректованих" клітин in vitro, ex vivo або in vivo і, відповідно, підвищення ефективності генної терапії. Не обмежуючись якою-небудь певною теорією, цей винахід, зокрема, припускає, що завдяки підвищенню ефективності трансдукції більше клітин стають "відкоректованими" і, таким чином, способи проведення генної терапії згідно з цим винаходом вимагають введення меншої кількості клітин для забезпечення лікувального, профілактичного ефекту або для поліпшення перебігу порушень у пацієнтів, що піддаються генній терапії. Крім того, оскільки пацієнтові вводиться більша кількість трансдуційованих клітин, для одержання лікувального, профілактичного ефекту або для поліпшення перебігу порушень може відпасти необхідність у застосуванні мієлосупресивної або мієлоаблятивної терапії. Відповідно до цього, цей винахід задовольняє клінічну потребу підвищення ефективності генної терапії при лікуванні генетичних захворювань, через те, що більше число "лікувальних" клітин з популяції трансдуційованих клітин можуть бути введені пацієнтові для досягнення лікувального, профілактичного ефекту або для поліпшення перебігу порушення. Зокрема, винахід відноситься до несподівано ефективних способів трансдукції клітин, до векторів і генномодифікованих клітин, що сприяють одержанню бажаних клінічних ефектів при застосуванні генної терапії. Якщо не зазначено інакше, цей винахід відноситься до загальноприйнятих способів, застосовуваних у молекулярній біології і у технології рекомбінантних ДНК у рамках даних галузей знань, деякі з яких описані в цій заявці для ілюстрації. Зазначені способи і технології докладно описані у відповідних джерелах. Див., наприклад, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 5 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, ed., 1984). Зміст усіх зазначених публікацій, патентів і патентних заявок повністю включено в цей опис шляхом посилання. B. Терміни (визначення) Якщо не зазначено інакше, усі технічні і наукові терміни в цій заявці мають значення, прийняте середніми фахівцями в даній галузі техніки. У рамках опису цього винаходу, нижче визначені наступні терміни. У цій заявці термін "ретровірус" відноситься до вірусу, що містить РНК, який за допомогою зворотної транскрипції копіює свою геномну РНК у вигляді дволанцюгового ланцюга лінійної ДНК і потім ковалентно впроваджує її в геном клітини-хазяїна. Ретровіруси традиційно використовуються як засоби впровадження генів (Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). Як тільки вірус впровадився в геном клітини-хазяїна, його називають "провірусом". Провірус служить матрицею для РНК-полімерази II і обумовлює експресію молекул РНК, що кодують структурні білки і ферменти, необхідні для репродукції нових вірусних частинок. Типові ретровіруси включають, але не обмежуються: вірусом мишачого лейкозу Молоні (MMмклV), вірусом мишачої саркоми Молоні (MoMSV), вірусом саркоми мишей Харві (HaMuSV), вірусом пухлини молочної залози мишей (MмкМTV), вірусом лейкемії гібонів (GaLV), вірусом лейкемії котячих (FLV), спумавірусом, вірусом лейкемії мишей Френда, вірусом стовбурових клітин мишей (MSCV), вірусом саркоми Рауса (RSV) і лентивірусом. У цій заявці термін "лентивірус" відноситься до групи (або роду) складних (комплексних) ретровірусів. Типові ретровіруси включають, але не обмежуються: ВІЛ (вірусом імунодефіциту людини, у тому числі ВІЛ-1 і ВІЛ-2); вірусом вісна-меді (VMV); вірусом козячого артритуенцефаліту (CAEV); вірусом інфекційної анемії коней (EIAV); вірусом імунодефіциту котячих (FIV); вірусом імунодефіциту великої рогатої худоби (BIV) і вірусом імунодефіциту мавп (SIV). Відповідно до одного з варіантів реалізації, кращі основні кодуючі послідовності векторівпохідних ВІЛ (напр., цис-діючі елементи ланцюга ВІЛ). У процесі реалізації цього винаходу можуть застосовуватися ретровірусні і, зокрема, лентивірусні вектори. Відповідно до цього, терміни "ретровірус" або "ретровірусний вектор" у цій заявці також включають "лентивірус" або "лентивірусний вектор", відповідно. Згідно з цією заявкою, термін "вектор" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, здатної переносити іншу молекулу нуклеїнової кислоти. Як правило, стерпна молекулярна кислота зв'язана, тобто, вставлена в молекулу нуклеїнової кислоти вектора. Вектор може містити послідовності, що опосередковують самостійну реплікацію в клітині, або послідовності, що дозволяють нуклеїновій кислоті, що представляє інтерес, впроваджуватися в ДНК клітинихазяїна. Вектори, що застосовуються, наприклад, містять плазміди (наприклад, плазміди, що містять ДНК, або, що містять РНК), транспозони, косміди, штучні бактеріальні хромосоми і вірусні вектори Застосовні вірусні вектори містять, наприклад, реплікативно-дефектні ретровіруси і лентивіруси. Як буде очевидно фахівцям у даній галузі техніки, термін "вірусний вектор" широко застосовується для позначення молекули нуклеїнової кислоти (наприклад, плазмідипереносника), яка містить елементи нуклеїнової кислоти вірусного походження, що, як правило забезпечують перенесення молекули нуклеїнової кислоти або інтеграцію в геном клітини, або для позначення вірусної частинки, що опосередковує перенесення нуклеїнової кислоти. Як правило, вірусні частинки містять різні компоненти вірусу, а іноді й компоненти клітини-хазяїна, крім нуклеїнової кислоти (нуклеїнових кислот). Термін "вірусний вектор" може відноситися до вірусу або вірусної частинки, здатної переносити нуклеїнову кислоту в клітини, або до самої стерпної нуклеїнової кислоти. Вірусні вектори і плазміди-переносники містять структурні і/або функціональні генетичні елементи, переважно вірусного походження. Термін "ретровірусний вектор" відноситься до вірусного вектора або плазміди, що містить структурні і функціональні елементи повністю або частково, переважно ретровірусного походження. Термін "лентивірусний вектор" відноситься до вірусного вектора або плазміди, що містить структурні і функціональні елементи повністю або частково, включаючи LTR-послідовності, переважно лентивірусного походження. Термін "гібрид" відноситься до вектора, LTR-послідовності або іншої нуклеїнової кислоти, що містить як ретровірусні, наприклад, лентивірусні послідовності, так і вірусні послідовності не лентивірусного походження. Відповідно до одного з варіантів реалізації, гібридний вектор відноситься до вектора або плазміди-переносника, що містить ретровірусні, наприклад, 6 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лентивірусні послідовності, що забезпечують зворотну транскрипцію, реплікацію, інтеграцію і/або упаковку. Згідно з конкретними варіантами реалізації, терміни "лентивірусний вектор", "лентивірусний експресійний вектор" можуть відноситися до лентивірусних плазмід-переносників і/або інфекційних лентивірусних частинок. Слід розуміти, що посилання на такі елементи, як сайти вбудовування, промотори, що регулюють елементи, гетерологічні нуклеїнові кислоти і т.п., у цій заявці, мають на увазі, що послідовності таких елементів присутні у формі РНК у лентивірусних частинках згідно з винаходом, і у формі ДНК у плазмідах, що містять ДНК, згідно з винаходом. На кожному кінці провірусу присутні структури, що називаються "довгими кінцевими повторами" або "LTR-послідовностями". Термін "довгий кінцевий повтор" ("LTR-послідовність") відноситься до доменів комплементарних пар основ на кінцях ретровірусних ДНК, що представляють собою в контексті природних послідовностей безпосередні повтори, які містять області U3, R і U5. LTR-послідовності, як правило, виконують основні функції в процесі експресії ретровірусних генів (наприклад, у процесі індукції, ініціації і поліаденілювання генних транскриптів), а також у процесі реплікації вірусу. LTR-послідовність містить численні регулюючі області, що включають елементи регуляції на рівні транскрипції, сигнали поліаденілювання і послідовності, необхідні для реплікації та інтеграції вірусного генома. Вірусні LTR-послідовності складаються з трьох областей: U3, R і U5. Область U3 містить енхансерні і промоторні елементи. Область U5 являє собою послідовність між ділянкою зв'язування праймера і областю R, і містить сайт поліаденілювання. Область R (repeat - повтор) перебуває між областями U3 і U5. LTR-послідовність складається з областей U3, R і U5 і присутня як на 5'-, так і на 3'-кінці вірусного генома. Безпосередньо до 5'-кінця LTR-послідовності прилягають послідовності, необхідні для зворотної транскрипції генома (ділянка зв'язування тРНК-праймера) і для ефективного упакування вірусної РНК у частинки (Psi-послідовність). У цій заявці термін "сигнал упакування" або "послідовність упакування" відноситься до послідовностей у складі ретровірусного генома, необхідним для вставки вірусної РНК у вірусний капсид або частинку, див., наприклад, Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 21012109. Багато ретровірусних векторів використовують мінімальний сигнал упакування (що позначається також як psi [Ψ] або [Ψ+] послідовність), необхідний для капсидування вірусного генома. Таким чином, у цій заявці термін "послідовність упакування", "сигнал упакування", "psi" і символ «Ψ» застосовуються відносно некодуючої послідовності, необхідної для капсидування ретровірусних ланцюжків РНК в процесі формування вірусної частинки. Згідно з різними варіантами реалізації, вектори містять модифіковані 5'-кінцеві і/або 3'кінцеві LTR-послідовності. 3'-кінцеві LTR-послідовності часто піддаються модифікації для забезпечення безпеки лентивірусних або ретровірусних систем шляхом досягнення реплікативної дефектності вірусів. У цій заявці, термін "реплікативно дефектний" відноситься до вірусу, не здатного до повної, ефективної реплікації таким чином, що утворюються неінфекційні віріони (наприклад, реплікативно-дефектні дочірні лентивіруси). Термін "реплікативнокомпетентний" відноситься до вірусу дикого типу або до мутантного вірусу, здатного до реплікації, таким чином, що в результаті реплікації вірусу утворюються інфекційні віріони (наприклад, реплікативно-компетентні дочірні лентивіруси). Вектори, що "самоінактивуються" (SIN) відносяться до реплікативно-дефектних векторів, наприклад, ретровірусних або лентивірусних векторів, праві (3'-кінцеві) енхансерні і промоторні елементи LTR-послідовності яких, що називаються також областю U3, піддаються модифікації (наприклад, за допомогою делеції або заміщення) для запобігання вірусній транскрипції після першого циклу вірусної реплікації. Це відбувається через те, що 3'-кінцева U3 область LTRпослідовності служить матрицею для лівої (5'-кінцевої) області U3 LTR-послідовності в процесі вірусної реплікації і, таким чином, вірусний транскрипт не може бути отриманий через відсутність енхансерного і промоторного елемента області U3. Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу, 3'-кінцева LTR-послідовність модифікується таким чином, що область U5 заміщається, наприклад, гетерологічною або штучною полі-А послідовністю, одним або декількома інсуляторними елементами і/або індуцибельним промотором. Слід зазначити, що модифікації LTR-послідовностей, такі як 3'-кінцевих LTR-послідовностей, 5'-кінцевих LTRпослідовностей або й тих, і інших, також включені в обсяг цього винаходу. Для підвищення рівня безпеки, область U3 5'-кінцевої LTR-послідовності заміщається гетерологічним промотором, що запускають транскрипцію вірусного генома в процесі реплікації вірусних частинок. Приклади застосовних гетерологічних промоторів включають, наприклад, промотори вірусу мавп 40 (вірусу SV40) (наприклад, ранні або пізні), цитомегаловірусу (CMV) (наприклад, негайно-ранні), вірусу мишачого лейкозу Молоні (MoМЛV), вірусу саркоми Рауса (RSV) і вірусу простого герпеса (HSV) (тимідинкіназу). Типові промотори здатні підтримувати 7 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 високий рівень транскрипції незалежно від транс-діючих транскрипційних факторів. Таке заміщення знижує ймовірність рекомбінації з одержанням реплікативно-компетентних вірусів, тому що в системі реплікації вірусів відсутня повна послідовність області U3. Згідно з конкретними варіантами реалізації, гетерологічний промотор може бути індуцибельним, таким чином, що транскрипція всього вірусного генома або його частини може відбуватися тільки в присутності одного або декількох факторів індукції. Фактори індукції включають, але не обмежуються однією або декількома хімічними сполуками або фізіологічними умовами, наприклад, температурою або кислотністю, у яких культивуються клітини. Згідно з деякими варіантами реалізації, вірусні вектори містять TAR-элемент. Термін "TAR" відноситься до генетичного елемента "відповіді на трансактивацію", розташованому в області R лентивірусних (наприклад, ВІЛ) LTR-послідовностей. Цей елемент взаємодіє з лентивірусними транс-діючими транскрипційними факторами (tat), підвищуючи рівень вірусної реплікації. Проте, згідно з варіантами реалізації, у яких область U3 5'-кінцевої LTR-послідовності заміщається гетерологічним промоторам, цей елемент не є необхідним. "Область R" відноситься до області ретровірусної LTR-послідовності між кеп-структурою (кеп-угрупованням, тобто, областю початку транскрипції) і початком полі-А послідовності. Область R також визначається розташованими безпосередньо по її кінцях областями U3 і U5. Область R бере участь у процесі зворотної транскрипції, дозволяючи переносити ДНК, що утворюється, з однієї області генома в іншу. У цій заявці, термін "ДНК-флеп елемент" відноситься до нуклеїнової кислоти, послідовність якої включає центральний поліпуриновий тракт і центральну термінуючу послідовність (cPPT і CTS) ретровірусу, наприклад, ВІЛ-1 або ВІЛ-2. Застосовні ДНК-флеп елементи описані в патенті США № 6,682,907 і у Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173. У процесі зворотної транскрипції ВІЛ-1, центральна ініціація "плюс -ланцюга" ДНК в області центрального поліпуринового тракту (cPPT) і центральна термінація в області центральної термінуючої послідовності (CTS) приводять до формування трьохланцюгової структури ДНК: центрального ДНК-флеп елемента. Не обмежуючись існуючими теоріями, ДНК-флеп елемент може бути цис-діючим фактором імпорту лентивірусного геному в ядро і/або збільшити титр вірусу. Згідно з конкретними варіантами реалізації, основна кодуюча послідовність ретровірусного або лентивірусного вектора містить один або декілька ДНК-флеп елементів, розташованих проти ходу або по ходу транскрипції гетерологічних генів вектора, що представляють інтерес. Наприклад, згідно з конкретними варіантами реалізації, плазміда-переносник містить ДНК-флеп елемент. Відповідно до одного з варіантів реалізації, вектор згідно з винаходом містить ДНК-флеп елемент ВІЛ-1. Відповідно до одного з варіантів реалізації, ретровірусні або лентивірусні векторипереносники містять один або декілька "елементів експорту". Термін "елемент експорту" відноситься до цис-діючого посттранскрипційного регуляторного елементу, що регулює транспорт РНК-транскрипту з ядра клітини в цитоплазму. Приклади елементів експорту РНК включають, але не обмежуються елементом, що зв'язується з білком rev вірусу імунодефіциту людини (RRE) (див., наприклад, Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; і Cullen et al., 1991. Cell 58: 423), і посттранскрипційним регуляторним елементом вірусу гепатиту В (HPRE). Як правило, елемент експорту РНК розташований з 3'-кінця нетрансльованої області (UTR) гена і може бути присутнім в одній або декількох копіях. Згідно з конкретними варіантами реалізації, рівень експресії гетерологічних послідовностей у вірусних векторах підвищується за допомогою вставки у вектори посттранскрипційних регуляторних елементів, ефективних полі-А послідовностей і, при необхідності, сигналів термінації транскрипції. Безліч посттранскрипційних регуляторних елементів можуть підвищити експресію гетерологічних нуклеїнових кислот, наприклад, посттранскрипційний регуляторний елемент вірусу гепатиту бабаків (WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886), посттранскрипційний регуляторний елемент вірусу гепатиту В (HPRE) (Huaнг and Yen, 1995, Mol. Cell. Biol., 5:3864) і т.п. (Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766). Згідно з визначеними варіантами реалізації, вектори згідно з винаходом не містять посттранскрипційні регуляторні елементи, такі як WPRE або HPRE, тому що в деяких випадках ці елементи підвищують ризик трансформації клітин і/або не підвищують кількість транскрипта іРНК і стабільність іРНК в істотному ступені. Тому, згідно з деякими варіантами реалізації, вектори згідно з винаходом не містять WPRE або HPRE як додаткових факторів безпеки. Елементи, що опосередковують ефективну термінацію і поліаденілювання транскриптів гетерологічних нуклеїнових кислот, підвищують експресію гетерологічних генів. Сигнали термінації транскрипції, як правило, розташовані по ходу транскрипції від сигналу поліаденілювання. Термін "полі-А сайт" або "полі-А послідовність" у цій заявці відноситься до послідовності ДНК, що опосередковує термінацію і поліаденілювання первинного РНК 8 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 іранскрипта РНК-полімеразою II. З огляду на те, що транскрипти, позбавлені поліаденілового "хвоста", нестабільні і швидко руйнуються, краще ефективне поліаденілювання рекомбінантних транскриптів. Типові сигнали поліаденілювання, які можуть застосовуватися у векторах згідно з винаходом, включають "ідеальні" полі-А послідовності (наприклад, AATAAA, ATTAAA AGTAAA), послідовність поліаденілювання з бичачого гормону росту (BGHpA), послідовність поліаденілювання β-глобіну кролика (rβgpA), або іншу гетерологічну або ендогенну полі-А послідовність, відому в даній галузі техніки. Згідно з конкретними варіантами реалізації, ретровірусний або лентивірусний вектор також включає один або декілька інсуляторів. Інсулятори беруть участь у захисті послідовностей, що експресуються лентивірусами, наприклад, поліпептидів, що мають терапевтичні властивості, від впливу сайтів інтеграції, яке може бути опосередковане цис-діючими елементами геномной ДНК, що порушують регуляцію експресії перенесених послідовностей (тобто, ефект положення; див., наприклад, Burgess-Beusse et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99:16433; and Zhan et al., 2001, Hum. Genet., 109:471). Згідно з деякими варіантами реалізації, вектори-переносники включають один або декілька інсуляторів на 3′-кінці LTR-послідовності; у процесі інтеграції провірусу в геном клітини-хазяїна, провірус здобуває один або декілька інсуляторів як на 5′кінцевих, так і на 3′-кінцевих LTR-послідовностях, у результаті репродукції 3′-кінцевих LTRпослідовностей. Застосовні інсулятори згідно з винаходом включають, але не обмежуються курячим β-глобіновим інсулятором (див. Chung et al., 1993. Cell 74:505; Chung et al., 1997. PNAS 94:575; і Bell et al., 1999. Cell 98:387, включені в цю заявку шляхом посилання). Приклади інсуляторів включають, але не обмежуються інсулятором локусу β-глобіну, такого як курячий інсулятор HS4. Відповідно до певних особливих варіантів реалізації цього винаходу, більша частина основних кодуючих послідовностей векторів має лентивірусне походження, наприклад, такі, отримані з ВІЛ-1. Проте, слід розуміти, що в рамках винаходу можуть застосовуватися різні лентивірусні джерела; більше того, певні послідовностінуклеїнових кислот лентивірусів можуть бути піддані всіляким заміщенням і змінам за умови збереження здатності вектора-переносника виконувати функції, описані в цій заявці. Крім того, у даній галузі техніки відомі різні лентивірусні вектори, див. Naldini et al., (1996a, 1996b, and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, патенти США №№ 6,013,516; і 5,994,136, багато з яких можуть застосовуватися для створення вірусного вектора або плазміди-переносника згідно з цим винаходом. У цій заявці, термін "сполука" відноситься до низькомолекулярних органічних сполук, простагландінів, активаторів цАМФ, агоністів сигнального шляху Wnt, агоністів сигнальних шляхів цАМФ/фосфоінозитид-3-кінази (PI3K)/серин-треонінової кінази (AKT), агоністів сигнального шляху Ca2+, агоністів сигнального шляху NO/ангіотензину і неорганічних речовин, що включають усі без винятку аналоги і похідні вищевказаних сполук. Терміни "невелика молекула", "невелика органічна молекула", "невелика молекулярна сполука" відносяться до низькомолекулярних сполук, що характеризуються молекулярною масою, що не перевищує приблизно 5 кДа, приблизно 4 кДа, приблизно 3 кДа, приблизно 2 кДа, приблизно 1 кДа, або приблизно 0,5 кДа. Згідно з конкретними варіантами реалізації, невеликі молекули можуть являти собою нуклеїнові кислоти, пептиди, пептидоміметики, пептоїди та інші невеликі органічні сполуки, препарати і т.п. Бази даних хімічних і/або біологічних сполук, таких як бактеріальні, грибкові або водоростяні екстракти, відомі в даній галузі знань і можуть бути вивчені в процесі будь-якого роду випробувань у рамках винаходу. Приклади способів одержання молекулярних баз даних можуть бути вивчені в наступних джерелах: (Carell et al., 1994a; Carell et al., 1994b; Cho et al., 1993; Dewitt et al., 1993; Gallop et al., 1994; Zuckermann et al., 1994). Бази даних сполук можуть бути представлені у вигляді розчинів (Houghten et al., 1992) на гранулах (Lam et al., 1991), на кристалах (Fodor et al., 1993), бактерій, спор (Ladner et al., патент США № 5,223,409, 1993), на плазмідах (Cull et al., 1992) або на фагах (Cwirla et al., 1990; Devlin et al., 1990; Felici et al., 1991; Ladner et al., патент США № 5,223,409, 1993; Scott and Smith, 1990). Описаний в цій заявці винахід має на увазі застосування різних баз даних для визначення невеликих молекул, що забезпечують посилення сигнального шляху рецептора простагландіну ЕР на кожному з етапів. Бази даних, застосовні з метою реалізації цього винаходу, включають, але не обмежуються: (1) базами даних хімічних речовин, (2) базами даних природних речовин і (3) сполученими (комбінованими) базами даних, що містять довільні пептиди, олігонуклеотиди і/або органічні сполуки. Бази даних хімічних речовин складаються зі структурних аналогів і похідних відомих сполук або сполук, що визначаються як "hits" або "leads" за класифікацією природних сполук. Бази даних природних речовин складаються з безлічі мікроорганізмів, тварин, рослин або водних 9 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 організмів, що використовуються при одержанні комбінацій для класифікування шляхом: (1) культивування і виділення з рідких екстрактів ґрунтових, рослинних і морських мікроорганізмів або (2) виділення з рослин або морських організмів. Бази даних природних речовин включають полікетиди, нерибосомні пептиди і їх варіанти (штучного походження). Див. Cane, D. E., et al., (1998) Science 282:63-68. Сполучені (комбіновані) бази даних складаються з комбінації великої кількості пептидів, олігонуклеотидів або органічних молекул. Такі бази досить просто створити за допомогою традиційних способів автоматизованого синтезу баз даних, ПЦР, клонування або за допомогою запатентованих способів. Особливий інтерес представляють сполучені (комбіновані) бази даних пептидів і олігонуклеотидів. Зокрема, сполучена (комбінована) база даних хімічних речовин являє собою групу різних хімічних сполук, отриманих шляхом хімічного або біологічного синтезу з декількох хімічних "цеглинок", таких як реагенти. Наприклад, лінійна сполучена (комбінована) база даних хімічних речовин, така як база даних пептидів, створюється шляхом з'єднання хімічних "цеглинок" (амінокислот) у будь-якому можливому порядку при заданій довжині сполуки (тобто, кількості амінокислот у поліпептидному ланцюжку). Мільйони хімічних сполук можуть синтезуватися за допомогою такого роду комбінування хімічних "цеглинок". Для більш докладних даних про комбінаторну хімію і створених на її основі баз даних, див. Huc, I. and Нгuyen, R. (2001) Comb. Chem. High Throughput Screen 4:53-74; Lepre, C A. (2001) Drug Discov. Today 6:133-140; Peнг, S. X. (2000) Biomed. Chromatogr. 14:430-441; Bohm, H. J. and Stahl, M. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:283-286; Barnes, C and Balasubramanian, S. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:346-350; Lepre, Enjalbal, C, et al., (2000) Mass Septrom Rev. 19:139-161; Hall, D.G., (2000) Nat. Biotechnol. 18:262-262; Lazo, J.S., and Wipf, P. (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 293:705-709; Houghten, R.A., (2000) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40:273-282; Kobayashi, S. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. (2000) 4:338-345; Kopylov, A.M. and Spiridonova, V.A. (2000) Mol. Biol. (Mosk) 34:1097-1113; Weber, L. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:295-302; Dolle, R.E. (2000) J. Comb. Chem. 2:383-433; Floyd, C D., et al., (1999) Prog. Med. Chem. 36:91-168; Kundu, B., et al., (1999) Prog. Drug Res. 53:89-156; Cabilly, S. (1999) Mol. Biotechnol. 12:143-148; Lowe, G. (1999) Nat. Prod. Rep. 16:641-651; Dolle, R.E. and Nelson, K.H. (1999) J. Comb. Chem. 1:235-282; Czarnick, A.W. and Keene, J.D. (1998) Curr. Biol. 8:R705-R707; Dolle, R.E. (1998) Mol. Divers. 4:233-256; Myers, P.L., (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:701-707; and Pluckthun, A. and Cortese, R. (1997) Biol. Chem. 378:443. Устаткування для створення сполучених баз даних комерційно доступне (див., наприклад, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.). Крім того, комерційно доступна безліч готових сполучених баз даних (див., наприклад, Comgenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, Mo., Chemstar, Ltd., Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa., Martek Biosciences, Columbia, Md. і т.п.). У цій заявці, термін "метаболічний попередник" відноситься до форми сполуки, у процесі метаболізму, що перетворюється у сполуку, що представляє інтерес. У цій заявці, термін "метаболіт" відноситься до форми сполуки, отриманої в результаті метаболічних перетворень. У випадку хімічних сполук, таких як органічних хімічних сполук, терміни "аналог" і "похідне" відносяться до молекул хімічних сполук, споріднених іншій хімічній сполуці структурно і функціонально, нерідко структурно відрізняючись одним елементом або групою; у той же час, такі молекули можуть відрізнятися модифікацією декількох груп (наприклад, 2, 3 або 4-х груп) за умови збереження функції вихідної хімічної сполуки. Зазначені модифікації добре знайомі фахівцям у даній галузі і включають, наприклад, приєднання або заміщення хімічних груп, таких як складні ефіри або аміди кислот, захисні групи, такі як бензильна група спирту або тіолу, або трет-бутоксикарбонільна група амінів. Також, модифікації включають бічні алкільні ланцюги, які, як алкільні замісники (наприклад, метильні, диметильні, етильні і т.п.), зміни в рівні насиченості або ненасиченості бічних ланцюгів і приєднання модифікованих груп, таких як заміщена фенільна або феноксигрупа. Похідні можуть включати кон'югати, такі, як біотинові або авідинові групи, ферменти, такі як пероксидаза хріну і їй подібні, включаючи також радіоізотопно-мічені, біолюмінісцентні, хемолюмінісцентні або флуоресцентні групи. Також, до агентів, зазначених у цій заявці, можуть бути приєднані групи, що змінюють їх фармакокінетичні характеристики, наприклад, що підвищують період напіввиведення in vivo або ex vivo, або підвищують здатність проникнення в клітини, у числі інших бажаних характеристик. Також, сюди включені пролікарські препарати, що як відомо поліпшують багато бажаних характеристик лікарських препаратів (наприклад, розчинність, біодоступність, простоту виробництва і т.п.) (див., наприклад, 10 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 WO/2006/047476, включену в цю заявку шляхом посилання, де зазначені приклади пролікарських препаратів-агоністов простагландіну). У цій заявці, терміни "полінуклеотид" або "нуклеїнова кислота" відносяться до інформаційної РНК (іРНК), РНК, геномної РНК (гРНК), плюс -ланцюга РНК (RNA(+)), мінус-ланцюга РНК (RNA()), геномної ДНК (гДНК), комплементарної ДНК (кДНК) або ДНК. Полінуклеотиди включають одно- і дволанцюгові полінуклеотиди. Краще, полінуклеотиди згідно з винаходом включають полінуклеотиди або їх варіанти, послідовності яких ідентичні, щонайменше, приблизно на 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % стандартним послідовностям, зазначеним у цій заявці (див., наприклад, ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ), у той же час, як правило, зазначений варіант зберігає щонайменше одну біологічну функцію стандартної послідовності. Відповідно до різних показових варіантів реалізації, цей винахід, зокрема, відноситься до полінуклеотидних послідовностей вірусних векторів і плазмід-переносників, а також до композицій зазначених агентів. Згідно з конкретними варіантами реалізації, винахід забезпечує полінуклеотиди, що кодують один або декілька терапевтично поліпептидів, і/або інші гени, що викликають інтерес. Згідно з конкретними варіантами реалізації, цей винахід забезпечує полінуклеотиди, що кодують поліпептид глобіну або АТФ-зв'язувальну касету підродини D (ALD), поліпептид (ABCD1), як описано в цій заявці. У цій заявці, терміни "варіант полінуклеотиду" і "варіант" відносяться до полінуклеотидів, що характеризуються значною схожістю послідовності з послідовностями стандартних полінуклеотидів або до полінуклеотидів, що гібридизуються зі стандартними полінуклеотидами в строгих умовах, зазначених у заявці. Ці терміни включають полінуклеотиди, що піддаються вставці, делеції або заміщенню одного або декількох нуклеотидів, у порівнянні зі стандартним полінуклеотидом. Щодо цього, фахівцям у даній галузі очевидно, що стандартний полінуклеотид може піддаватися певним мутаціям, таким як вставки, делеції або заміщення за умови, що модифікований полінуклеотид зберігає біологічні функції стандартного полінуклеотиду. У цій заявці, термін "виділений" відноситься до матеріалу, наприклад, полінуклеотиду, поліпептиду, клітині, у значній мірі або абсолютно позбавленому компонентів, пов'язаних з ним у його природному стані. Згідно з конкретними варіантами реалізації, терміни "отриманий" або "утворений від" застосовуються як синоніми терміна "виділений". Наприклад, "виділений полінуклеотид" у цій заявці відноситься до полінуклеотиду, отриманого за допомогою видалення послідовностей з обох його кінців, що присутні у його природному стані, наприклад, до фрагмента ДНК, відщепленого від послідовностей, між якими він розташований у природному стані. Терміни, що описують орієнтацію полінуклеотидів, включають: 5' (як правило, кінець полінуклеотиду, що несе вільну фосфатну групу) і 3' (як правило, кінець полінуклеотиду, що несе вільну гідроксильну (-ОН) групу). Полінуклеотидні послідовності можуть бути зазначені, як орієнтовані в напрямку 5' → 3' або в напрямку 3' → 5'. Терміни "комплементарний" і "комплементарність" відносяться до полінуклеотидів (тобто, нуклеотидних послідовностей), що мають спорідненість згідно з правилами спарювання основ. Наприклад, послідовність ДНК 5' A G T C A T G 3' комплементарна послідовності 3' T C A G T A C 5'. Остання нерідко записується у зворотному напрямку, зліва направо від 5'-кінця до 3'-кінця: 5' C A T G A C T 3'. Послідовність, що збігається сама з собою при читанні у зворотному порядку, називається паліндромною послідовністю. Комплементарність може бути "частковою", коли лише деякі з основ нуклеїнових кислот відповідають правилам спарювання основ; також, комплементарність двох послідовностей нуклеїнових кислот може бути "повною". Термін "касета експресії нуклеїнової кислоти" у цій заявці відноситься до послідовностей вектора, здатних експресувати РНК і, слідом за цим, поліпептид. Відповідно до одного з варіантів реалізації, касета експресії нуклеїнової кислоти містить ген(и), що представляє(ють) інтерес, наприклад, полінуклеотид(и), що представляє(ють) інтерес. Згідно з іншим варіантом реалізації, касета експресії нуклеїнової кислоти містить одну або кілька регуляторних послідовностей і ген(и), що представляє(ють) інтерес, наприклад, полінуклеотид(и), що представляє(ють) інтерес. Вектори можуть містити одну, дві, три, чотири, п'ять або більше касет експресії. Касета експресії розташована і орієнтована в послідовності вектора таким чином, що нуклеїнова кислота в касеті може бути транскрибована в РНК і, при необхідності, далі трансльована в білок або поліпептид, який може бути підданий відповідній посттрансляційній модифікації, необхідній для забезпечення виконання біологічної функції в трансформованій клітині, і може бути доставлений у відповідний відділ клітини для виконання цієї функції або за допомогою спрямованої доставки усередині клітини, або експортований з клітини в позаклітинний простір. Краще, 3' і 5'-кінці касети пристосовані для безпосередньої інтеграції у вектор, наприклад, на обох кінцях присутні сайти, що розпізнаються рестрикційними 11 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ендонуклеазами. Згідно з кращим варіантом реалізації винаходу, касета експресії нуклеїнової кислоти включає послідовність терапевтичного гена для лікування, профілактики або поліпшення перебігу генетичних порушень, таких як порушень кровотворення. Касета експресії може бути виділена та інтегрована в плазміду або вірусний вектор як єдиний елемент. Полінуклеотиди включають полінуклеотиди, що представляють інтерес. У цій заявці, термін "полінуклеотид(и), що представляє(ють) інтерес" відноситься до одного або декількох полінуклеотидів, наприклад, полінуклеотиду, що кодує поліпептид (тобто, полінуклеотиду, що представляє інтерес), інтегрованому у вектор експресії, експресія якого бажана. Згідно з кращими варіантами реалізації, вектори і/або плазміди згідно з винаходом включають один або декілька полінуклеотидів, що представляють інтерес, наприклад, ген глобіну або ген ABCD1. Згідно з конкретними варіантами реалізації, полінуклеотид, що представляє інтерес, кодує поліпептид, який забезпечує терапевтичний, профілактичний ефект або поліпшує перебіг захворювання кровотворної системи або порушення, тобто, відноситься до "терапевтичного поліпептиду", що наприклад, кодується геном глобіну. Див., наприклад, патенти США №№ 6,051,402 і 7,901,671, опис і формула винаходу яких повністю включені в цю заявку шляхом посилання. Див., наприклад, SEQ ID Nos: 1, 5, 10 і 14. Згідно з іншими варіантами реалізації, полінуклеотид, що представляє інтерес, кодує поліпептид, який забезпечує терапевтичний, профілактичний ефект або поліпшує перебіг адренолейкодистрофії або адреномієлонейропатії, тобто, відноситься до "терапевтичного поліпептиду", що наприклад, кодується геном ABCD1. Див., наприклад, SEQ ID Nos: 16-17. Див., наприклад, патенти США №№ 5,869,039 і 6,013,769, опис і формула винаходу яких повністю включені в цю заявку шляхом посилання. У цій заявці, термін "глобін" відноситься до всіх білків або їх субодиниць, здатних ковалентно або нековалентно зв'язуватися гемовою групою і, таким чином, переносити або запасати кисень. Термін глобін включає субодиниці гемоглобіну, міоглобіну або їх мутантних варіантів хребетних і безхребетних. Приклади глобінов включають α-глобін і його варіанти, βглобін і його варіанти, γ-глобін і його варіанти, а також δ-глобін і його варіанти. Відповідно до одного з варіантів реалізації, полінуклеотид, що представляє інтерес, являє собою ген, що кодує поліпептид, який забезпечує терапевтичний ефект у процесі лікування гемоглобінопатії, наприклад, α-глобін, β-глобін або β-глобінА-T87Q. Полінуклеотиди, що представляють інтерес, а також поліпептиди, що ними кодуються, включають як полінуклеотиди, що кодують поліпептиди дикого типу, так і їх функціональні варіанти та фрагменти. Згідно з конкретними варіантами реалізації, послідовність функціонального варіанта щонайменше на 80 %, 90 %, 95 % або 99 % ідентична послідовності відповідного стандартного полінуклеотиду дикого типу. Згідно з конкретними варіантами реалізації, біологічна активність функціонального варіанта або фрагмента відповідного поліпептиду дикого типу становить щонайменше 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % або 110 % біологічної активності поліпептиду дикого типу. Типові представники полінуклеотидів, застосовних згідно з цим винаходом, включають, але не обмежуються полінуклеотидами, що кодують α-глобін, β-глобін і β-глобінАT87Q. Полінуклеотиди згідно з цим винаходом, незалежно від довжини власної кодуючої послідовності можуть бути зв'язані з іншими послідовностями ДНК, такими як промотори і/або енхансери, нетрансльовані області (UTR), послідовності Козака, сигнали поліаденілювання, додаткові сайти, що розпізнаються рестрикційними ендонуклеазами, сайти множинного клонування, ділянки внутрішньої посадки рибосоми (IRES), сайти, що розпізнаються рекомбіназами (наприклад, LoxP, FRT і Att), стоп-кодони, кодони, що термінують транскрипцію, і полінуклеотиди, що кодують поліпептиди, що саморозщеплюються, епітопні мітки, описані в цій заявці або відомі в даній галузі, таким чином, что їх довжина може суттєво варіювати. Тому мається на увазі, що може застосовуватися полінуклеотид практично будь-якої довжини, краще, довжини, що забезпечує достатню простоту одержання і застосування в рамках протоколу рекомбінантної ДНК згідно з винаходом. Термін "послідовність, що регулює експресію" відноситься до полінуклеотидної послідовності, яка включає один або кілька промоторів, енхансеров та інших елементів, що регулюють транскрипцію, а також їх комбінації, здатні стимулювати, регулювати і контролювати транскрипцію або експресію функціонально зв'язаних полінуклеотидів. Згідно з конкретними варіантами реалізації, вектори згідно з винаходом містять одну або кілька послідовностей, що регулюють експресію, специфічних відносно певних клітин, типів клітин або послідовностей клітинних поколінь, наприклад, клітин-мішеней; таким чином, експресія полінуклеотидів, функціонально зв'язаних з послідовностями, що регулюють експресію, специфічними відносно певних клітин, типів клітин або послідовностей клітинних поколінь, відбувається винятково в 12 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітинах-мішенях, але не в інших клітинах. Кожна з послідовностей, що регулюють експресію і мають специфічність у відношенні певних клітин, у векторах може функціонувати в клітинах одного або різних типів, залежно від того, якого роду терапія повинна проводитися. Згідно з кращими варіантами реалізації, вектори містять одну або кілька послідовностей, що регулюють експресію, специфічних відносно кровотворних клітин, наприклад, кровотворних стовбурових клітин або кровотворних клітин-попередників. Відповідно до інших кращих варіантів реалізації, вектори містять одну або кілька послідовностей, що регулюють експресію і специфічних у відношенні еритроїдних клітин. Термін "промотор" у цій заявці відноситься до сайту полінуклеотиду (ДНК або РНК), який розпізнає і з яким зв'язується РНК-полімераза. Термін "енхансер" відноситься до сегмента ДНК, що включає послідовності, здатні забезпечити підвищений рівень транскрипції і, у певних умовах, функціонувати незалежно від їхньої орієнтації у відношенні інших регулюючих послідовностей. Енхансер може функціонувати спільно або підсилювати дію промотерів і/або інших енхансерів. Термін "промотор/енхансер" відноситься до сегментів ДНК, здатних виконувати функції як промотору, так і енхансера. Згідно з конкретними варіантами реалізації, вектор згідно з винаходом містить екзогенні, ендогенні або гетерологічні регулюючі послідовності, такі як промотори і/або енхансери. "Ендогенна" регулююча послідовність пов'язана з певним геном у природних умовах. "Екзогенна" регулююча послідовність поміщується безпосередньо по сусідству з геном шляхом маніпуляції з генами (тобто, за допомогою способів, що застосовуються у молекулярній біології) таким чином, що транскрипція такого гена стимулюється пов'язаним з ним енхансером/промотором. "Гетерологічна" регулююча послідовність являє собою екзогенну послідовність, отриману з видів, відмінних від виду клітини, гени якої зазнають маніпуляції. "Синтетична" регулююча послідовність може включати елементи однієї або декількох ендогенних і/або екзогенних послідовностей і/або послідовностей, дослідження яких in vitro або in silico показали, що дані послідовності оптимально функціонують як промотор і/або енхансер для проведення певної генної терапії. Термін "функціонально зв'язаний" відноситься до розташування описаних компонентів безпосередньо по сусідству один з одним таким чином, що вони можуть взаємодіяти у заданий спосіб. Відповідно до одного з варіантів реалізації, термін відноситься до функціонального зв'язку між послідовністю, що регулює експресію нуклеїнової кислоти (такої, як промотор і/або енхансер, або іншою послідовністю, що регулює експресію), і другою полінуклеотидною послідовністю, наприклад, полінуклеотидом, що представляють інтерес, таким чином, що послідовність, що регулює експресію, стимулює транскрипцію нуклеїнової кислоти, що відповідає другій послідовності. У цій заявці термін "конститутивна послідовність, що регулює експресію" відноситься до промотора, енхансера або промотора/енхансера, що постійно стимулює транскрипцію функціонально зв'язаної послідовності. Конститутивна послідовність, що регулює експресію може являти собою "універсальний" промотор, енхансер або промотор/енхансер, що стимулює експресію в багатьох різних типах клітин і тканин; також вона може являти собою промотор, енхансер або промотор/енхансер, специфічний для певних клітин або тканин, який стимулює експресію в певних типах клітин і тканин, відповідно. Типові універсальні послідовності, що регулюють експресію, включають, але не обмежуються: негайно-ранній промотор цитомегаловірусу (CMV), промотор вірусу мавп 40 (SV40) (наприклад, ранній або пізній), LTRпромотор вірусу мишачого лейкозу (MoМЛV) Молоні, LTR-послідовність вірусу саркоми Рауса (RSV), промотор (тимідинкіназу) вірусу простого герпеса (HSV), промотори H5, P7.5 і P11 вірусу осповакцини (вірусу вакцинії), промотор фактора елонгації 1-альфа (EF1a), білок ранньої відповіді EGR1, феритин H (FerH), феритин L (FerL), гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу (GAPDH), еукаріотичний фактор ініціації трансляції 4A1 (EIF4A1), білок теплового шоку 70 кДа 5 (HSPA5), білок теплового шоку 90 кДа бета 1 (HSP90B1), білок теплового шоку 70 кДа (HSP70), β-кінезин (β-KIN), локус ROSA 26 людини (Irions et al., (2007) Nature Biotechnology 25, 14771482), промотор убіквітину С (UBC), промотор фосфогліцераткінази-1 (PGK), енхансер цитамегаловірусу/промотор β-актину курей (CAG) і промотор β-актину. Згідно з конкретними варіантами реалізації, може бути кращим застосування послідовностей, що регулюють експресію, специфічних до клітин або тканин, для експресії бажаної полінуклеотидної послідовності відповідно до типу клітин або тканин (наприклад, для експресії певної нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид лише в певних типах клітин або тканин, або лише у певні фази життєвого циклу). Типові приклади промоторів, специфічних до тканин, включають, але не обмежуються: промотор B29 (експресія в В-клітинах), промотор транскрипційного фактора карликовості 13 UA 114796 C2 5 10 15 2025 30 35 40 45 50 55 60 (CBFa2) (експресія в стовбурових клітинах), промотор CD14 (експресія в моноцитах), промотор CD43 (експресія в лейкоцитах і тромбоцитах), промотор CD45 (експресія в кровотворних клітинах), промотор CD68 (експресія в макрофагах), промотор CYP450 3A4 (експресія в гепатоцитах), промотор десміну (експресія в м'язових клітинах), промотор еластази 1 (експресія в ацинарних клітинах підшлункової залози), промотор ендокліну (експресія в ендотеліальних клітинах), промотор фібробласт-специфічного білка 1 (FSP1) (експресія у фібробластах), промотор фібронектину (експресія у фібробластах), промотор тирозинкінази FLT1 (експресія в ендотеліальних клітинах), промотор гліального фібрилярного кислого білка (GFAP) (експресія в астроцитах), промотор інсуліну (експресія в β-клітинах підшлункової залози), промотор інтегрину α-2b (ITGA2B) (експресія в мегакаріоцитах), промотор фактора міжклітинної адгезії 2 (ICAM-2) (експресія в ендотеліальних клітинах), промотор інтерферону-бета (IFN-β) (експресія в кровотворних клітинах), промотор кератину 5 (експресія в кератиноцитах), промотор міоглобіну (MB) (експресія в м'язових клітинах), промотор міогенного фактора 1 (MYOD1) ((експресія в м'язових клітинах), промотор нефрину (експресія в подоцитах), промотор γ-карбоксиглутаматбілка 2 кісток (OG-2) (експресія в остеобластах), промотор 3-оксоацил-КоА-трансферази (Oxct2B), (експресія в гаплоїдних сперматидах), промотор сурфактантного білка В (SP-B) (експресія в клітинах легенів), промотор синапсину (експресія в нейронах), промотор білка синдрому Віскотта-Олдріча (WASP) (експресія в кровотворних клітинах). Відповідно до одного з варіантів реалізації, вектор згідно з цим винаходом містить один або кілька промоторів і/або енхансерів, специфічних до кровотворних клітин або тканин, обраних із групи, яка включає: промотор β-глобіну людини, LCR-послідовність β-глобіну людини, енхансер HS40 α-глобіну людини і промотор анкірину-1, функціонально зв'язаних з полінуклеотидом, що кодує поліпептид глобіну. Згідно з іншим варіантом реалізації, згідно з цим винаходом включає промотор, активний у клітинах мікроглії, функціонально зв'язаний з полінуклеотидом, що кодує поліпептид АТФзв'язувальної касети підродини D, члена 1 (ABCD1). Згідно з конкретними варіантами реалізації, промотор включає енхансер вірусу мієлопроліферативної саркоми з делецією ділянки негативного контролю, промотор dl587rev із заміщеною ділянкою зв'язування праймера (MND), або їх транскрипційно активні фрагменти. У цій заявці термін "умовна експресія" може відноситися до будь-якого виду умовної експресії, включаючи, не обмежуючись: експресію, що репресується, експресію в клітинах або тканинах, що характеризуються особливим фізіологічним, біологічним, патологічним статусом і т.п. Дане визначення не виключає експресію, специфічну до клітин або тканин. Деякі варіанти реалізації винаходу забезпечують умовну експресію полінуклеотидів, що викликають інтерес, наприклад, експресія регулюється за допомогою обробки конкретними препаратами, або шляхом створення умов, що стимулюють експресію або підвищують/понижують рівень експресії полінуклеотиду, що кодується полінуклеотидом, що викликає інтерес. Типові приклади індуцибельних промоторів/систем включають, але не обмежуються: промотори, що активуються стероїдами, такі як промотори генів, що кодують рецептори глюкокортикоїдів або естрогену (що активуються відповідними гормонами), промотор металотіонеїну (що активується різними важкими металами), промотор MX-1 (що активується інтерфероном), система "GeneSwitch", регульована міфепристоном (Sirin et al., (2003) Gene, 323:67), перемикач гена, що активується куматом (низькомолекулярна сполука, що зв'язується з репресором CyMR) (WO 2002/088346), тертациклин-залежні регуляторні системи і т.п. Умовна експресія також може здійснюватися за допомогою сайт-специфічних ДНК рекомбіназ. Згідно з конкретними варіантами реалізації винаходу, вектор включає щонайменше один (як правило, два) сайт рекомбінації, що розпізнається сайт-специфічними рекомбіназами. У цій заявці, термін "рекомбіназа" або "сайт-специфічна рекомбіназа" включає білки, що сприяють вирізанню, або інтегративні білки, ферменти, кофактори, або білки, що зв'язуються з нуклеїновими кислотами, які беруть участь у реакціях рекомбінації, що включають один або кілька сайтів рекомбінації (наприклад, два, три, чотири, п'ять, сім, десять, дванадцять, п'ятнадцять, двадцять, тридцять, п'ятдесят і т.д.), у числі яких можуть бути білки дикого типу (див. Landy, (1993) Current Opinion in Biotechnology 3:699-707), мутантні білки, їх похідні (наприклад, білки злиття, що включають послідовності рекомбінантних білків і їх фрагменти), фрагменти і варіанти. Типові приклади рекомбіназ, застосовних згідно з конкретними варіантами реалізації цього винаходу, включають, але не обмежуються: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, резолвазой Tn3, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 і ParA. Вектори можуть містити один або кілька сайтів рекомбінації, що розпізнаються будь-якою з широкого спектра сайт-специфічних рекомбіназ. Слід розуміти, що сайт-мішень сайтспецифічної рекомбінази поряд з іншими сайтами необхідний для інтеграції вектора, наприклад, 14 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ретровірусного або лентивірусного вектора. У цій заявці терміни "рекомбінантна послідовність", "сайт рекомбінації", "сайт сайт-специфічної рекомбінації" відносяться до певної послідовності нуклеїнової кислоти, яку розпізнає і з якою зв'язуються рекомбінази. Наприклад, одним з сайтів рекомбінації рекомбінази Cre є loxP, що представляє собою послідовність з 34 пар основ, що включає два інвертовані повтори з 13 пар основ (що грають роль сайтів рекомбінації), між якими розташована корова (серцевинна) послідовність з 8 пар основ (Див. Фіг. 1 в Sauer, B., (1994) Current Opinion in Biotechnology 5:521-527). Інші приклади сайтів loxP включають, але не обмежуються: lox511 (Hoess et al., 1996; Bethke and Sauer, 1997), lox5171 (Lee and Saito, 1998), lox2272 (Lee and Saito, 1998), m2 (Laнгer et al., 2002), lox71 (Albert et al., 1995) і lox66 (Albert et al., 1995). Відповідні сайти рекомбінації рекомбінази FLP включають, але не обмежуються: FRT (Mcleod, et al., 1996), F1, F2, F3 (Schlake and Bode, 1994), F4, F5 (Schlake and Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff et al., 1988), FRT(RE) (Senecoff et al., 1988). Інші приклади рекомбінантних послідовностей включають послідовності attB, attP, attL і attR, що розпізнаються рекомбіназами сімейства λ Integrase (γ-інтегрази), наприклад, phi-c31 (φC31). Сайт-специфічна рекомбіназа φC31 опосередковує рекомбінацію тільки між гетеротиповими сайтами attB (довжиною в 34 пари основ) і attP (довжиною в 39 пар основ) (Groth et al., 2000). attB і attP, що позначаються так за сайтами приєднання інтегрази фагу в геномах бактерії і фагу, відповідно, включають недосконалі інвертовані повтори, до яких з високою долею ймовірності приєднуються гомодимери φC31 (Groth et al., 2000). Сайти attL і attR, що утворюються в результаті, практично не піддаються подальшій рекомбінації, опосередкованій φC31 (Belteki et al., 2003), таким чином реакція є необоротною. Відносно каталізу процесу вставлення, виявилося, що ДНК, що містить attB, вставляється в сайт attP генома з більшою ймовірністю, ніж сайт attP у сайт attB генома (Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). Таким чином, типовий алгоритм полягає в гомологічній рекомбінації "сайту установки", що несе attP, з певною ділянкою, яка потім взаємодіє з attB-несучою послідовністю, що приєднується, для наступної вставки. У цій заявці термін "ділянка внутрішньої посадки рибосоми" або "IRES" відноситься до елемента, що забезпечує пряме проникнення кодону ініціації цистрону (області, що кодує білок), наприклад, АТГ (ATG), у рибосому, таким чином, забезпечуючи трансляцію незалежно від кепа (5'-нетрансльованої області). Див., наприклад, Jackson et al., (1990) Trends Biochem Sci 15(12):477-83), а також Jackson and Kaminski, (1995) RNA 1(10):985-1000. Згідно з конкретними варіантами реалізації, вектори згідно з винаходом включають один або декілька полінуклеотидів, що представляють інтерес, які кодують один або кілька поліпептидів. Згідно з певним варіантом реалізації, для забезпечення ефективної трансляції кожного з безлічі поліпептидів, полінуклеотидні послідовністі можуть розділятися однією або декількома послідовностями IRES або полінуклеотидів, що кодують поліпептиди, що саморозщеплюються. У цій заявці термін "послідовність Козака" відноситься до короткої нуклеотидної послідовності, що значною мірою полегшує початкове приєднання іРНК до малої субодиниці рибосоми і підвищує рівень трансляції. Консенсусна послідовність Козака являє собою послідовність (GCC)RCCATGG, де R - це пуринова основа (A або G) (Kozak, (1986) Cell. 44(2):283-92 і Kozak, (1987) Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48). Згідно з конкретними варіантами реалізації, вектори згідно з винаходом містять полінуклеотиди, що містять послідовність Козака і кодуючий поліпептид, що представляє інтерес. Згідно з конкретними варіантами реалізації, вектори містять ген, що селектується, який також позначається як селективний маркер. Типові селективні гени кодують білки, які (a) забезпечують стійкість до антибіотиків або інших токсинів, наприклад, до ампіциліну, неоміцину, гігроміцину, метотрексату, зеоцину, бластицидину або тетрацикліну, (b) компенсують ауксотрофні порушення, або (c) забезпечують живильні елементи, відсутні в комплексному живильному середовищі, наприклад, що кодують D-аланінрацемазу в бацилах. Для виділення ліній трансформованих клітин може застосовуватися скільки завгодно систем селекції, включаючи, але не обмежуючись: гени тимідинкінази вірусу простого герпесу (Wigler et al., (1977) Cell 11:223-232) і аденінфосфорибозилтрансферази (Lowy et al., (1990) Cell 22:817-823), які можуть бути використані у відповідно tk- і aprt- клітинах. Згідно з різними варіантами реалізації, вектори згідно з винаходом можуть застосовуватися для підвищення, стимуляції або підтримки рівня експресії одного або декількох поліпептидів, наприклад, глобінів. У цій заявці терміни "поліпептид" і "білок" взаємозамінні і відносяться до полімерів амінокислотних залишків, а також до їхніх варіантів і синтетичних аналогів. Таким чином, ці терміни відносяться до полімерів амінокислот, у яких один або кілька амінокислотних залишків являють собою синтетичні неприродні амінокислоти, такі як хімічні аналоги відповідних 15 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 природних амінокислот, а також до природних полімерів амінокислот. Типові приклади застосовних поліпептидів глобіну наведені в способах і композиціях певних варіантів реалізації цього винаходу, наприклад, SEQ ID NOs: 2-4, 6-9, 11-13 і 15. Також див., наприклад, патенти США №№ 6,051,402 і 7,901,671, повний опис і формула винаходу яких включені в цю заявку шляхом посилання. Типові приклади застосовних поліпептидів ABCD1 наведені в способах і композиціях певних варіантів реалізації цього винаходу, наприклад, SEQ ID NO: 18. Також див., наприклад, патенти США №№ 5,869,039 і 6,013,769, повний опис і формула винаходу яких включені в цю заявку шляхом посилання. Певні варіанти реалізації цього винаходу також включають "варіанти" поліпептидів. Термін "варіант" поліпептиду відноситься до поліпептидів, що відрізняються від стандартного поліпептиду наявністю вставки, делеції, процесінгу і/або заміни щонайменше одного амінокислотного залишку при збереженні поліпептидом біологічної активності. Згідно з конкретними варіантами реалізації, варіант поліпептиду відрізняється від стандартного поліпептиду наявністю однієї або декількох замін, консервативних або неконсервативних, як відомо фахівцям у даній галузі. Згідно з конкретними варіантами реалізації, амінокислотна послідовність варіанта поліпептиду щонайменше приблизно на 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ідентична або схожа з відповідною послідовністю стандартного поліпептиду. Згідно з конкретними варіантами реалізації, вставки або делеції амінокислот відбуваються на C-кінці і/або на N-кінці стандартного поліпептиду. Як зазначено вище, поліпептиди згідно з винаходом можуть бути модифіковані різними способами, включаючи заміни, делеції, процесінг і вставки амінокислот. Способи таких маніпуляцій добре відомі в даній галузі. Наприклад, варіанти амінокислотних послідовностей стандартних поліпептидів можуть бути отримані за допомогою мутування ДНК. Способи мутагенезу і зміни нуклеотидних послідовностей добре відомі в даній галузі. Див., наприклад Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492, Kunkel et al., (1987) Methods in Enzymol, 154: 367-382, U.S. Pat. No. 4,873,192, Watson, J.D. et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummiнгs, Menlo Park, Calif. і включені в ці джерела посилання. З керівництвом з прийнятних замін амінокислот без втрати білком, що представляє інтерес, біологічної активності, можна ознайомитися в Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washiнгton, D.C.). Термін "клітина-хазяїн" відноситься до клітин, трансфіційованих, інфікованим або трансдуційованим рекомбінантним вектором або полінуклеотидом згідно з винаходом in vivo, ex vivo, або in vitro. Клітини-хазяї можуть включати клітини, що упаковують, клітини-продуценти і клітини, інфіковані вірусних вектором. Згідно з конкретними варіантами реалізації, клітини-хазяї, інфіковані вірусним вектором згідно з винаходом, вводяться суб'єктові в терапевтичних цілях. Згідно з конкретними варіантами реалізації, термін "клітина-мішень" взаємозамінний з терміном "клітина-хазяїн" і відноситься до трансфіційованих, інфікованих або трансдуційованих клітин певного типу. Згідно з кращими варіантами реалізації, клітина-мішень являє собою стовбурову клітину або клітину-попередник. Відповідно певним кращим варіантам реалізації, клітина-мішень являє собою соматичну клітини, наприклад, зрілу стовбурову клітини, клітини-попередник або диференційовану клітину. Відповідно до певних кращих варіантів реалізації, клітина-мішень являє собою кровотворну клітину, наприклад, кровотворну стовбурову клітину або кровотворну клітину-попередник. Інші клітини-мішені, застосовні в терапевтичних цілях, описані нижче. Термін "стовбурова клітина" відноситься до недиференційованої клітини, здатної (1) до самовідновлення протягом тривалого часу або до розподілу з одержанням щонайменше однієї копії, ідентичної материнській клітині, (2) до диференціювання на рівні однієї клітини в безліч, або, у деяких випадках, в один спеціалізований тип клітин і (3) до функціональної регенерації тканин in vivo. Стовбурові клітини, відповідно до їх диференціювального потенціалу, на тотипотентні, плюрипотентні, мультипотентні і оліго/уніпотентні. "Самовідновлення" відноситься до специфічної здатності клітини ділитися з одержанням ідентичних їй дочірніх клітин і утворювати спеціалізовані типи клітин (потентність). Самовідновлення може відбуватися двома способами. При асиметричному розподілі клітин одна з дочірніх клітин ідентична материнській клітині, у той час як друга дочірня клітина відрізняється від неї і являє собою клітину-попередник або диференційовану клітину. При асиметричному розподілі популяція клітин не збільшується. При симетричному розподілі клітин обидві дочірні клітини ідентичні материнській. "Проліферація" або "розмноження" клітин відносяться до симетричного розподілу. У цій заявці термін "тотіпотентний" відноситься до здатності клітини дати початок будь-якій клітинній лінії організму. Наприклад, у ссавців лише зигота і бластомери, що утворюються після 16 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 першого дроблення, є плуріпотентними. У цій заявці, термін "плюрипотентний" відноситься до здатності клітини дати початок будь-якій клітинній лінії тіла або соми (тобто, власне ембріона). Наприклад, емюріональні стовбурові клітини являють собою тип плуріпотентних клітин, здатних дати початок кожному з трьох зародкових листків: ектодермі, мезодермі і ентодермі. У цій заявці, термін "мультипотентний" відноситься до здатності зрілої стовбурової клітини дати початок різним типам клітин однієї клітинної лінії. Наприклад, стовбурові кровотворні клітини здатні дати початок лінії клітин крові, наприклад, лімфоїдним або мієлоїдним клітинам. У цій заявці, термін "олігопотентний" відноситься до здатності зрілої стовбурової клітини диференціювати лише в деякі різні типи клітин. Наприклад, лімфоїдні або мієлоїдні стовбурові клітини здатні дати початок відповідно лінії лімфоїдних або лінії мієлоїдних клітин. У цій заявці, термін "уніпотентний" відноситься до здатності клітини дати початок тільки одному типу клітин. Наприклад, сперматогоніальні стовбурові клітини здатні дати початок тільки чоловічим статевим клітинам. У цій заявці, термін "попередник" або "клітина-попередник" відноситься до клітин, здатних до самовідновлення і до диференціювання в більш зрілі клітини. Багато клітин-попередників диференціюють у клітини однієї клітинної лінії, але мають високий проліферативний потенціал. Стовбурові кровотворні клітини (HSCs) дають початок комітованим кровотворним клітинампопередникам (HPCs), здатним диференціювати в будь-які зрілі кров'яні клітини протягом усього життя організму. Термін "стовбурова кровотворна клітина" або "HSC" відноситься до мультипотентних стовбурових клітин, здатних дати початок будь-яким кров'яним клітинам організму, включаючи мієлоїдні (наприклад, моноцити або макрофаги, нейтрофіли, базофіли, еозинофіли, еритроцити, мегакаріоцити/тромбоцити, дендритні клітини) і мієлоїдні клітинні лінії (наприклад, Т-клітини, В-клітини, NK-клітини), а також інші клітинні лінії, відомі в даній галузі техніки (див. Fei, R., et al., патент США № 5,635,387; McGlave, et al., U.S. Patent No. 5,460,964; Simmons, P., et al., патент США № 5,677,136; Tsukamoto, et al., патент США № 5,750,397; Schwartz, et al., патент США № 5,759,793; DiGuisto, et al., патент США № 5,681,599; Tsukamoto, et al., патент США № 5,716,827). Трансплантація кровотворних стовбурових клітин і кровотворних клітин-попередників тваринам, що піддалися впливу смертельних доз радіації, може відновити популяцію еритроцитів, нейтрофілів-макрофагів і мегакаріоцитів. Для досягнення достатнього титру вірусу нерідко виникає необхідність в одержанні великої кількості вірусних частинок. Вірусні частинки одержують за допомогою трансфекції в пакувальні клітини вектора-переносника, що несе структурні і/або додаткові гени вірусу, наприклад, гени gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx або nef, або інші ретровірусні гени. У цій заявці, термін "пакувальний вектор" відноситься до вектора експресії або вірусного вектора, що позбавлений пакувального сигналу і містить полінуклеотид, який кодує один, два, три, чотири або більше структурних і/або додаткових генів вірусу. Як правило, пакувальні вектори включені в пакувальні клітини і вводяться за допомогою трансфекції, трансдукції або інфікування. Способи трансфекції, трансдукції та інфікування добре відомі в даній галузі знань. Ретровірусний/лентивірусний вектор-переносник згідно з цим винаходом може бути введений у пакувальну клітинну лінію за допомогою трансфекції, трансдукції або інфікування для одержання клітин-продуцентів або лінії клітин-продуцентів. Пакувальні вектори згідно з цим винаходом можна вводити в клітини або в лінії клітин людини за допомогою стандартних способів, включаючи, наприклад, кальцій-фосфатну трансфекцію, ліпофекцію або електропорацію. Згідно з деякими варіантами реалізації, пакувальний вектор вводять у клітини разом з домінантним маркером, що селектується, таким як неоміцин, гігроміцин, пуроміцин, бластицидин, зеоцин, тимідинкіназа, дигідрофолатредуктаза (DHFR), глутамінсинтетаза або аденозиндеаміназа (ADA), з наступним селектуванням з присутністю відповідного субстрату і виділенням клонів. Маркер, що селектується, може бути фізично пов'язаний з генами пакувального вектора, наприклад, за допомогою IRES або вірусних пептидів, що саморозщепляються. Вірусні оболонкові білки (env) визначають спектр клітин, які можуть бути інфіковані і трансформовані рекомбінантними ретровірусуми, отриманими з клітинних ліній. У випадку лентивірусів, таких як ВІЛ-1, ВІЛ-2, вірусу імунодефіциту мавп (SIV), вірусу імунодефіциту котячих (FIV) і вірусу кінського грипу (EIV), білки env включають gp41 і gp120. Краще, вірусні оболонкові білки, що експресуються пакувальними клітинами згідно з винаходом, кодуються особливим вектором, окремо від вірусних генів gag і pol, як було зазначено вище. Типові приклади ретровірусних генів env, застосовних згідно з винаходом, включають, але не обмежуються генами оболонкових білків: вірусу лейкозу мишей (МЛV), вірусу лейкозу мишей (10A1), ендогенного вірусу бабуїнів (BAEV), вірусу лейкозу котячих- В (FeLV-B), RD114, вірусу, асоційованого з вірусом саркоми (SSAV), вірусу Ебола, вірусу Сендай, вірусу "пташиної чуми" 17 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (FPV) і вірусу грипу. Також, можливе застосування генів, що кодують оболонкові білки вірусів, що містять РНК (наприклад, сімейства пікорнавірусів, кальцивірусів, астровірусів, тогавірусів, флавівірусів, коронавірусів, параміксовірусів, рабдовірусів, філовірусів, ортоміксовірусів, буньявірусів, аренавірусів, реовірусів, бірнавірусів, ретровірусів), і генів вірусів, що містять ДНК (сімейства гепаднавірусів, цирковірусів, парвовірусів, паповавірусів, аденовірусів, герпесвірусів, поксвірусів та іридовірусів). Типові приклади включають: вірус лейкозу котячих (FeLV), вірус венесуельського енцефаліту коней (VEE), вірус гепатиту F (HFV), вірус дермальної саркоми (глаукоми) (WDSV), вірус лісу Семліки (SFV), вірус сказу, вірус лейкозу птахів (ALV), вірус імунодефіциту великої рогатої худоби (BIV), вірус лейкозу великої рогатої худоби (BLV), вірус Епштейна-Барра (EBV), вірус козячого артриту-енцефаліту (CAEV), вірус некрозу селезінки (SNV), вірус ChTLV, Т-лімфотропний вірус мавп (STLV), вірус пухлини молочних залоз мишей (MPMV), ретровірус білячої мавпи (SMRV), вірус, асоційований з вірусом Рауса (RAV), вірус саркоми Фуджинамі (FuSV), вірус карциноми птахів (MH2), вірус еритробластозу птахів (AEV), вірус мієлобластозу птахів (AMV), вірус саркоми птахів (CT10) і вірус інфекційної анемії коней (EIAV). Згідно з іншими варіантами реалізації, оболонкові білки для псевдотипування вірусу згідно з цим винаходом включають, але не обмежуються білки наступних вірусів: вірусів грипу А, такі як H1N1, H1N2, H3N2 і H5N1 (пташиний грип), вірусу грипу B, вірусу грипу C, вірусу гепатиту A, вірусу гепатиту B, вірусу гепатиту C, вірусу гепатиту D, вірусу гепатиту E, ротавірусу, норовірусу, кишкових аденовірусів серотипу 40 і 41, парвовірусу, вірусу лихоманки Денге, вірусу віспи мавп, мононегавірусів, лісавірусу, такого як вірус сказу, лагоського вірусу кажанів, вірусу Мокола, вірусу Дювенхаге, європейського вірусу кажанів 1 і 2, австралійського вірусу кажанів, вірусу ефемерної лихоманки великої рогатої худоби, везикуловірусу, вірусу везикулярного стоматиту (VSV), вірусів герпесу, таких як вірус простого герпеса типів 1 і 2, вірусу вітряної віспи, цитомегаловірусу, вірусу Епштейна-Барра (EBV), герпесвірусу людини (HHV), герпесвірусу людини типів 6 і 8, ВІЛ (HIV), папіломавірусу, γ герпес-вірусу мишей, аренавірусів, таких як вірус аргентинської геморагічної лихоманки, вірус болівійської геморагічної лихоманки, вірус Сабіа, вірус венесуельської геморагічної лихоманки, вірус лихоманки Ласса, вірус Мачупо, вірус лімфоцитарного хоріоменінгіту (LCMV), буньявірусів, таких як вірус кримсько-конголезької геморагічної лихоманки, хантавірус, вірус геморагічної лихоманки з нирковим синдромом, вірус лихоманки долини Ріфт, філовірусів, включаючи вірус Ебола і вірус Марбург, флавівірусів, включаючи вірус хвороби Кьясанурського лісу, вірус омської геморагічної лихоманки, вірус кліщового енцефаліту і параміксовірусів, таких як вірус Хендра і вірус Ніпах, вірусів чорної і білої віспи (натуральної віспи) альфавірусів, таких як венесуельський вірус енцефаліту коней, східний вірус енцефаліту коней, західний вірус енцефаліту коней, коронавірусу, асоційованого з важким гострим респіраторним синдромом (SARS-CoV), вірусу лихоманки Західного Нілу і будьяких вірусів, що викликають енцефаліт. Відповідно до одного з варіантів реалізації, винахід забезпечує упакування клітин, що виробляють частинки рекомбінантного ретровірусу, наприклад, лентивірусу, псевдотипованого з глікопротеїном вірусу везикулярного стоматиту (VSV-G). У цій заявці терміни "псевдотип" або "псевдотипування" відносяться до вірусів, оболонкові білки яких замінені оболонковими білками інших вірусів, що мають бажані властивості. Наприклад, ВІЛ може бути псевдотипованим з оболонковими глікопротеїнами вірусу везикулярного стоматиту, що дозволяє ВІЛ інфікувати більш широкий спектр клітин, оскільки оболонкові білки ВІЛ (що кодуються геном env), як правило, націлюють вірус на клітини, що експресують CD4 (CD4+ клітини). Згідно з кращим варіантом реалізації, лентивірусні оболонкові білки зазнають псевдотипування з VSV-G. Відповідно до одного з варіантів реалізації, винахід забезпечує упакування клітин, що виробляють рекомбінантний ретровірус, наприклад, лентивірус, псевдотипований з оболонковим глікопротеїном вірусу везикулярного стоматиту. У цій заявці, термін "пакувальна клітинна лінія" відноситься до клітинних ліній, що не містять пакувальний сигнал, але постійно, або тимчасово експресують вірусні структурні білки і реплікативні ферменти (наприклад, gag, pol і env), необхідні для коректного упакування вірусних частинок. Для одержання пакувальних клітин згідно з винаходом може використовуватися будьяка клітинна лінія. Як правило, клітини являють собою клітини ссавців. Згідно з певним варіантом реалізації, клітини, що використовуються для одержання пакувальних клітин, являють собою клітини людини. Застосовні клітинні лінії включають, але не обмежуються, наприклад наступними клітинами: CHO, BHK, MDCK, C3H 10T1/2, FLY, Psi-2, BOSC 23, PA317, WEHI, COS, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, MRC5, A549, HT1080, 293, 293T, B-50, 3T3, NIH3T3, Hepg2, Saos-2, Huh7, Hela, W163, 211і 211A. Згідно з кращими варіантами реалізації, 18 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пакувальні клітини являють собою клітини 293, 293T або A549. Відповідно до іншого кращого варіанту реалізації, використовуються клітини A549. У цій заявці, термін "клітинних ліній-продуцентів" відноситься до клітинних ліній, здатних робити рекомбінантні ретровірусні частинки, що містять пакувальні клітинні лінії і конструкції вектора-переносника, що несуть сигнал упакування. Виробництво інфекційних вірусних частинок і вихідних розчинів вірусів може здійснюватися із застосуванням стандартних методів. Способи одержання вихідних розчинів вірусів добре відомі в даній галузі техніки і описані, наприклад, у Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633 і N.R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113. Інфекційні вірусні частинки можуть бути виділені з пакувальних клітин із застосуванням стандартних методів. Наприклад, інфекційні частинки можуть бути виділені за допомогою лізису клітин, або з надосадової рідини культур клітин, як відомо в даній галузі знань. При необхідності, виділені вірусні частинки можуть піддатися додатковому очищенню. Застосовні способи очищення добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Терміни "підсилювати", "стимулювати", "підвищувати", "збільшувати" відносяться до здатності композицій і/або способів згідно з винаходом викликати, служити причиною або сприяти продукції більшої кількості трансдуційованих клітин у порівнянні з кількістю клітин, одержуваних у присутності переносника або контрольної молекули/композиції окремо. Відповідно до одного з варіантів реалізації, стовбурова кровотворна клітина, трансдуційована за допомогою композицій і способів згідно з винаходом, дає початок більшій кількості трансдуційованих клітин у порівнянні з клітинами, трансдуційованими за допомогою існуючих композицій і способів. Підвищення рівня трансдукції клітин може бути зафіксоване за допомогою методів, відомих у даній галузі, таких як аналіз по гену-репортеру, ПЦР у масштабі реального часу і експресія поверхневих білків клітини і т.п. "Підвищений" або "посилений" рівень трансдукції, як правило, вказує на "статистично значиме" підвищення кількості трансдуційованих клітин, наприклад, в 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 або більше разів (наприклад, в 500 або 1000 разів) (включаючи всі цілі і дробові множники >1, наприклад, 1,5, 1.6, 1.7. 1.8 і т.п.) разів перевищує кількість клітин, трансдуційованих у присутності вектора, контрольної композиції окремо або трансдуційованих інших існуючим способом. Терміни "послабляти", "знижувати", "зменшувати", "придушувати" відносяться композиціям і/або способам, у результаті застосування яких кількість трансдуційованих клітин суттєво нижче у порівнянні з кількістю клітин, одержуваних за допомогою композицій і/або способів згідно з цим винаходом. "Знижена" або "менша" кількість, як правило, вказує на "статистично значиме" зниження кількості трансдуційованих клітин, наприклад, в 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 або більше разів (наприклад, в 500 або 1000 разів) (включаючи всі цілі і дробові множники >1, наприклад, 1,5, 1,6, 1,7. 1,8 і т.п.) разів нижче кількості клітин, трансдуційованих за допомогою композицій і/або способів згідно з цим винаходом. Терміни "зберігається", "підтримується", "не міняється", "без істотних змін", "без істотного зниження" відносяться, як правило, до фізіологічних реакцій у певних клітинних лініях, по інтенсивності порівнянним з реакціями в присутності переносника або контрольної молекули/композиції окремо. Порівнянний рівень інтенсивності реакції вказує на відсутність істотної відмінності від рівня реакції в стандартних умовах. Застосування термінів і понять в однині може відноситися також і до безлічі описуваних об'єктів. Наприклад, "елемент" може відноситися і до безлічі елементів. Розділові/пояснювальні союзи "або" і "чи то" можуть мати на увазі як об'єкти окремо, так і разом, а також їх комбінації. У цій заявці терміни "включає", "містить" і "несе" є синонімами. У цій заявці, термін "приблизно" відноситься до кількості, рівня, оцінки, числа, частоти, процентної частки, розміру, величини, маси або довжини, що відрізняються від стандартної кількості, рівня, оцінки, числа, частоти, процентної частки, розміру, величини, маси або довжини на 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % або 1 %. Відповідно до одного з варіантів реалізації, термін "приблизно" відноситься до діапазону в межах ± 15 %, ± 10 %, ± 9 %, ± 8 %, ± 7 %, ± 6 %, ± 5 %, ± 4 %, ± 3 %, ± 2 % або ± 1 % від стандартної кількості, рівня, оцінки, числа, частоти, процентної частки, розміру, величини, маси або довжини. У цьому описі, якщо не домовлено інакше, терміни "включає", "містить", "що включає" мають на увазі перерахування зазначених етапів, елементів або сукупностей етапів або елементів, не виключаючи будь-які інші етапи, елементи або сукупності етапів або елементів. "Складається з" означає, що узагальнююче слово обмежується перерахованими далі однорідними членами. Таким чином, фраза "складається з" означає, що перераховані елементи є необхідними, і ніякі інші елементи, крім перерахованих, не можуть бути додані. Фраза "головним чином складається з" означає, що узагальнююче слово обмежується перерахованими елементами та іншими елементами, чия присутність не впливає на активність або функцію перерахованих елементів. 19 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таким чином, фраза "складається з" означає, що перераховані елементи є необхідними, у той час як присутність інших елементів необов'язкова і залежить від їхнього впливу на активність або функцію перерахованих елементів. У цьому описі посилання на "варіант реалізації" означають, що певна властивість, структура або характеристика, описана у зв'язку з даним варіантом реалізації, включена щонайменше в один з варіантів реалізації згідно з цим винаходом. Таким чином, фрази "відповідно до одного з варіантів реалізації" у цьому описі необов'язково відносяться до одного і того ж варіанту реалізації. Більше того, певні властивості, структури і характеристики можуть матися на увазі у різних прийнятних комбінаціях в описі одного або різних варіантів реалізації. В подальшому описі для більш повного розуміння різних варіантів реалізації винаходу наведені деякі конкретні деталі. Проте, фахівцям у даній галузі буде очевидно, що застосування винаходу не вимагає опису цих деталей. Крім того, слід розуміти, що окремі вектори або групи векторів, що є похідними описаних у цій заявці різних комбінацій структур і замісників, вважаються об'єктами винаходу так само, як якби вони були описані окремо. Таким чином, вибір певних векторних структур або певних замісників також входить в обсяг винаходу. C. Вірусні вектори Випробування показали, що ретровірусні і лентивірусні вектори є переносниками, які з високою долею надійності забезпечують інтегрування генів, що представляють інтерес, наприклад, кодуючі терапевтичні поліпептиди, у широкий спектр клітин-мішеней. Зокрема, цей винахід відноситься до поліпшеної системи доставки векторів у популяції клітин, що вводяться суб'єктам у рамках проведення генної терапії. Цей винахід забезпечує вектори-переносники, застосовні в способах згідно з винаходом. Фахівцям у даній галузі техніки очевидно, що такого роду вектори-переносники можуть бути отримані з різних вірусних векторів; згідно з конкретними варіантами реалізації, векторпереносник являє собою ретровірусний або лентивірусний вектор, зокрема тому, що лентивірусні вектори здатні забезпечити ефективну доставку, інтеграцію і тривалу експресію трансгенів у клітинах, що перебувають у стані спокою як in vitro, так і in vivo. У даній галузі техніки відомі різні лентивірусні вектори, див. Naldini et al., (1996a, 1996b, and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, патенти США №№ 6,013,516 і 5,994,136, будь-який з котрих може застосовуватися для одержання вектора-переносника згідно з цим винаходом. Як правило, зазначені вектори конструюються на основі плазмід або вірусів таким чином, щоб забезпечувати перенесення і доставку послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують терапевтичні поліпептиди, у клітину-мішень. Згідно з типовими варіантами реалізації, ретровірусний вектор являє собою лентивірусний вектор. Таким чином, вектори можуть бути похідними ВІЛ-1, ВІЛ-2, вірусу імунодефіциту мавп (SIV), вірусу імунодефіциту котячих (FIV), вірусу імунодефіциту великої рогатої худоби (BIV), вірусу хвороби Джембрана (JDV), вірусу інфекційної анемії коней (EIAV), вірусу артритуенцефаліту кіз (CAEV) і т.п. Основні кодуючі послідовності вектора-похідного ВІЛ (тобто, цисдіючі елементи ланцюга і гени gag, pol і rev ВІЛ), як правило, є кращими згідно з більшістю аспектів цього винаходу через те, що ВІЛ-Конструкти відрізняються найбільшою ефективністю в трансдукції клітин людини. Незважаючи на те, що окремі типові варіанти реалізації включають більш детальний опис векторів, композицій і способів, застосовних для терапії порушень кровотворення, наприклад, гемоглобінопатій, винахід не обмежується зазначеними описами. Фахівцям у даній галузі техніки очевидно, що принципи, описані в цій заявці, можуть застосовуватися в генній терапії інших систем організму, наприклад, нервової системи, включаючи око, центральну і периферичну нервову систему; системи кровопостачання; м'язового апарату; кісткової системи; органів, включаючи шкіру, серце, легені, підшлункову залозу, печінку, нирки, кишечник і т.п. Відповідно до одного з варіантів реалізації, цей винахід забезпечує вектори, наприклад, лентивірусні вектори, що містять послідовності, що регулюють експресію полінуклеотидів, що представляють інтерес, наприклад, генів глобіну, у певних клітинах або клітинних лініях. Застосування послідовностей, що регулюють експресію і специфічних до типу клітин або лінії клітин, забезпечує додаткову безпеку, дозволяючи експресувати полінуклеотиди лише в певну стадію диференціації клітин у клітинній лінії; таким чином, вектори згідно з винаходом знижують імовірність ектопічної експресії в клітинах, для яких експресія цих полінуклеотидів нехарактерна. Відповідно до одного з їхніх прикладів, що не обмежують застосування винаходу, послідовність, що регулює експресію, може являти собою універсальну послідовність, як зазначено в цій заявці. Згідно з іншим прикладом, що не обмежує застосування винаходу, послідовність, що регулює експресію, може мати специфічність до стовбурових клітин і стимулювати експресію 20 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 полінуклеотидів, що представляють інтерес, в ембріональних стовбурових клітинах, стовбурових клітинах нервової тканини, мезенхімальних стовбурових клітинах, стовбурових клітинах печінки, стовбурових клітинах підшлункової залози, стовбурових клітинах серця, стовбурових клітинах нирок або стовбурових кровотворних клітинах. Згідно з іншим прикладом, що не обмежує застосування винаходу, послідовність, що регулює експресію, може мати специфічність до певних клітин або клітинних ліній і стимулювати експресію полінуклеотидів, що представляють інтерес, у кровотворних стовбурових клітинах, кровотворних клітинах-попередниках, мієлоїдних клітинах, лімфоїдних клітинах, клітинахпопередниках тромбоцитів, гладких клітинах, клітинах-попередниках еритроцитів, клітинахпопередниках гранулоцитів і клітинах-попередниках моноцитів. Згідно з конкретними варіантами реалізації, вектор згідно з винаходом може застосовуватися для експресії полінуклеотиду, наприклад, полінуклеотиду, що представляє інтерес, у кровотворних клітинах одного або декількох типів, включаючи, але не обмежуючись: кровотворні стовбурові клітини, кровотворні клітини-попередники, мієлоїдні клітинипопередники, лімфоїдні клітини-попередники, клітини-попередники тромбоцитів, клітинипопередники еритроцитів, клітини-попередники гранулоцитів, клітини-попередники моноцитів, мегакаріобласти, промегакаріоцити, мегакаріоцити, тромбоцити, проеритробласти, базофільні еритробласти, поліхроматичні еритробласти, ортохроматичні еритробласти, поліхроматичні еритроцити, еритроцити (червоні кров'яні клітини), базофільні промієлоцити, базофільні мієлоцити, базофільні метамієлоцити, базофіли, нейтрофільні промієлоцити, нейтрофільні мієлоцити, нейтрофільні метамієлоцити, нейтрофіли, еозинофільні промієлоцити, еозинофільні мієлоцити, макрофаги, дендритні клітини, лімфобласти, пролімфоцити, натуральні кілери (NKклітини), малі лімфоцити, Т-лімфоцити, В-лімфоцити, плазматичні клітини і лімфоїдні дендритні клітини. Згідно з кращими варіантами реалізації, вектор згідно з винаходом може застосовуватися для експресії полінуклеотидів, наприклад, генів, що представляють інтерес, в одному або декількох типах еритроїдних клітин, наприклад, у проеритробластах, базофільних еритробластах, поліхроматичних еритробластах, ортохроматичних еритробластах, поліхроматичних еритроцитах і еритроцитах (червоних кров'яних клітинах). Відповідно до одного з варіантів реалізації, вектор містить промотор, енхансер або промотор/енхансер кровотворних клітин, функціонально зв'язаний з геном, що представляє інтерес, наприклад, глобіном. Застосовні послідовності, що регулюють експресію, специфічні до певних клітин або типів клітин, включають, але не обмежуються: послідовності, що регулюють експресію, специфічні до кровотворних клітин, наприклад, промотор стовбурових кровотворних клітин і промотор кровотворних клітин-попередників. Згідно з варіантами реалізації, де експресія генів, що викликають інтерес, повинна відбуватися в одному або декількох типах еритроїдних клітин, застосовна послідовність, що регулює експресію, може включати, не обмежуючись: промотор, специфічний до еритроїдних клітин, і, можливо, енхансер, специфічний до еритроїдних клітин, промотор β-глобіну людини, LCR-послідовність β-глобіну людини, енхансер HS40 α-глобіну людини і промотор анкірину-1. Відповідно до одного з варіантів реалізації, послідовності, що регулюють експресію, специфічні до типу клітин або до клітинної лінії, включають, але не обмежуються клітинами мікроглії. Згідно з конкретними варіантами реалізації, промотор включає промотор MND (синтетичного промотору, що містить область U3 LTR-послідовності, або його транскрипційно активний фрагмент, функціонально зв'язаний з геном, що представляє інтерес, наприклад, ABCD1. Застосування послідовностей, що регулюють експресію і специфічних до типу клітин або лінії клітин, забезпечує додаткову безпеку, дозволяючи експресувати полінуклеотиди лише в певну стадію диференціації клітин у клітинній лінії; таким чином, вектори згідно з винаходом знижують імовірність ектопічної експресії в клітинах, для яких експресія цих полінуклеотидів нехарактерна. Відповідно до одного з варіантів реалізації, винахід забезпечує вектор, що включає одну або декілька LTR-послідовностей і послідовність, що регулює експресію, функціонально пов'язані з геном, що представляє інтерес. Згідно з супутнім варіантом реалізації, послідовність, що регулює експресію, представляє собою послідовність, специфічну до еритроїдних клітин, включаючи: промотор β-глобіну людини, LCR-послідовність β-глобіну людини, енхансер α-глобіну HS40 людини і промотор анкірину-1. Згідно з різними варіантами реалізації, вектор сконструйований таким чином, щоб забезпечити лікування, профілактику або поліпшити перебіг певних захворювань, порушень і станів кровотворної системи. Наприклад, цей винахід забезпечує вектори для генної терапії 21 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гемоглобінопатій, пов'язаних з генами, що представляють інтерес, обраними із групи, що складається з: α-глобіну людини, β-глобіну людини, дельта-глобіну людини, γ-глобіну людини, а також їх біологічно активних варіантів і фрагментів. Відповідно до одного з варіантів реалізації, ген глобіну вибирають із групи, що складається з: гена β-глобіну дикого типу, гена β-глобіну людини з однією або декількома делеціями інтронних послідовностей і мутованого гену βглобіну людини, що кодує щонайменше один амінокислотний залишок, що запобігає серпоподібно-клітинній анемії. Згідно з певним варіантом реалізації, де стан, при якому застосовується генна терапія – серпоподібна-клітинна анемія, ген, що представляє інтерес, може кодувати білок, що запобігає серпоподібноклітинній анемії. У цій заявці, "білок, що запобігає серпоподібно-клітинній анемії" відноситься до поліпептиду, що запобігає або сприяє усуненню патологічних процесів, що ведуть до утворення серпоподібно-клітинних форм еритроцитів. Відповідно до одного з варіантів реалізації винаходу, трансдуційовані клітини забезпечують доставку білків, що запобігають серпоподібно-клітинній анемії, суб'єктові, що страждає серпоподібно-клітинною анемією. Білки, що запобігають серпоподібно-клітинній анемії, також включають мутовані форми β-глобіну, що містять амінокислотні залишкиь, які запобігають серпоподібно-клітинній анемії. Згідно з кращим варіантом реалізації, одним із зазначених варіантів глобіну є ген βA-глобіну людини із заміною треоніну на глутамін у позиції 87 (βA-T87Q) або ген βA-глобіну людини (де зріла форма поліпептиду піддалася процесінгу з відщепленням N-кінцевого метіоніну, кодон 87 зрілого поліпептиду кодує треонін; у нерозщепленому поліпептиді глобіну треонін кодує кодон 88). Згідно з цим винаходом, як амінокислотні залишки, що запобігають серпоподібно-клітинній анемії, можуть служити й інші залишки, відомі в даній галузі. Наприклад, див. патент США № 6,051,402; патент США № 5,861,488; патент США № 6,670,323; патент США № 5,864,029; патент США № 5,877,288; Levasseur et al., Blood 102:4312-4319 (2003), зміст яких включено в даний опис шляхом посилання. Згідно з конкретними варіантами реалізації, вектор, що містить послідовність, що регулює експресію в еритроїдних клітинах, застосовується для лікування, профілактики або поліпшення перебігу великої кількості порушень, крім гемоглобінопатій. Попередники червоних кров'яних клітин являють собою зручну для застосування клітинну популяцію для експресії поліпептидів, які можуть бути введені в циркуляцію і, у такий спосіб доставлені до клітин-мішеней системно. Такого роду доставку білка in vivo забезпечує, наприклад, фактор IX людини - фактор згортання крові, що не виробляється у пацієнтів, що страждають від гемофілії B, див., наприклад, A. H. Chang, et al., Molecular Therapy (2008), включений у цю заявку шляхом посилання. Відповідно до одного з варіантів реалізації, клітини, трансдуційовані згідно з винаходом, можуть застосовуватися як "фабрики" по секреції білків in vitro, ex vivo або in vivo. Наприклад, вектор, що включає послідовність, що регулює експресію в еритроїдних клітинах, може застосовуватися для одержання білків еритроїдних клітин, диференційованих з стовбурових кровотворних клітин або стовбурових ембріональних клітин, у великих кількостях in vitro. Полінуклеотиди, що представляють інтерес, які експресуються зазначеним способом, включають, але не обмежуються: аденозиндеаміназу, ферменти, пов'язані з лізосомними хворобами накопичення, аполіпопротеїн Е, нейротрофічний фактор головного мозку (BDNF), кістковий морфогенетичний білок 2 (BMP-2), кістковий морфогенетичний білок 6 (BMP-6), кістковий морфогенетичний білок 7 (BMP-7), кардіотрофін 1 (CT-1), CD22, CD40, циліарний нейротрофічний фактор (CNTF), CCL1-CCL28, CXCL1-CXCL17, CXCL1, CXCL2, CX3CL1, фактор росту ендотелію судин (VEGF), допамін, еритропоетин, фактор IX, фактор VIII, епідермальний фактор росту (EGF), естроген, FAS-ліганд, фактор росту фібробластів 1 (FGF-1), фактор росту фібробластів 2 (FGF-2), фактор росту фібробластів 4 (FGF-4), фактор росту фібробластів 5 (FGF-5), фактор росту фібробластів 6 (FGF-6), фактор росту фібробластів 7 (FGF-7), фактор росту фібробластів 10 (FGF-10), Flt-3, гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (GM-CSF), гормон росту, фактор росту гепатоцитів (HGF), інтерферон альфа (IFN-a), інтерферон бета (IFN-b), інтерферон γ (IFНг), інсулін, глюкагон, інсуліноподібний фактор росту 1(IGF-1), інсуліноподібний фактор росту 2 (IGF-2), інтерлейкін 1 (IL-1), інтерлейкін 2 (IL-2), інтерлейкін 3 (IL-3), інтерлейкін 4 (IL-4), інтерлейкін 5 (IL-5), інтерлейкін 6 (IL-6), інтерлейкін 7 (IL-7), інтерлейкін 8 (IL-8), інтерлейкін 9 (IL9), інтерлейкін 10 (IL-10), інтерлейкін 11 (IL-11), інтерлейкін 12 (IL-12), інтерлейкін 13 (IL-13), інтерлейкін 15 (IL-15), інтерлейкін 17 (IL-17), інтерлейкін 19 (IL-19), макрофагальний колонієстимулюючий фактор (M-CSF), білок хемотаксису моноцитів 1 (MCP-1), макрофагальний білок запалення 3a (MIP-3a), макрофагальний білок запалення 3b (MIP-3b), фактор росту нервової тканини (НГF), нейротрофін 3 (NT-3), нейротрофін 4 (NT-4), паратиреоїдний гормон, 22 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фактор росту тромбоцитів AA (PDGF-AA), фактор росту тромбоцитів AB (PDGF-AB), фактор росту тромбоцитів BB (PDGF-BB), фактор росту тромбоцитів CC (PDGF-CC), фактор росту тромбоцитів DD (PDGF-DD), хемокін, що виділяється Т-клітинами при активації RANTES, фактор стовбурових клітин (SCF), фактор стромальних клітин 1 (SDF-1), тестостерон, що трансформує фактор росту альфа (TGF-a) трансформуючий фактор росту бета (TGF-b), фактор некрозу пухлин альфа (TNF-a), Wnt1, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt14, Wnt15, Wnt16, їжак Сонік (Sonic hedgehog), ефіопський їжак (Desert hedgehog) і індійський їжак (Indian hedgehog). Відповідно до одного з варіантів реалізації, вектор згідно з винаходом містить щонайменше одну модифіковану або немодифіковану ретровірусну LTR-послідовність, наприклад, лентивірусну LTR-послідовність, промотор β-глобіну і локус контролюючу область β-глобіну, функціонально пов'язані з полінуклеотидом, що представляє інтерес, наприклад, що кодує поліпептид глобіну. Можливі модифікації LTR-послідовностей включають, але не обмежуються: заміну 5'-кінцевої LTR-послідовності гетерологічним промотором, наприклад, промотором цитомегаловірусу, промотором вірусу саркоми Рауса, промотором тимідинкінази, промотором вірусу SV40; а також одну або кілька модифікацій, вставок і/або делецій 3'-кінцевої LTRпослідовності, як описано в цій заявці. Згідно з певним варіантом реалізації, експресія полінуклеотиду в еритроїдних клітинах забезпечується за допомогою використання промотору β-глобіну людини, локус контролюючої області β-глобіну людини, що містить надчуттєві до ДНКази I сайти 2, 3 і 4, і/або 3'-кінцевий енхансер β-глобіну. Згідно з різними варіантами реалізації, вектор згідно з винаходом включає один або кілька елементів з групи, що складається з: псі-послідовності для упаковки (Ψ+), центрального поліпуринового тракту /ДНК-флеп елементу(cPPT/FLAP), елементу експорту ретровірусу, посттранскрипційного регулюючого елемента, маркера, що селектується, і апоптотичного гена, як описано в цій заявці. Згідно з різними варіантами реалізації, вектори згідно з винаходом містять промотор, функціонально зв'язаний з генами, що кодують поліпептид, який забезпечує лікування гемоглобінопатій у кровотворних клітинах. Вектори можуть містити одну або декілька LTRпослідовностей, що піддалися одній або декільком модифікаціям, таким як одна або кілька замін, вставок або делецій нуклеотидів. Крім того, вектори можуть містити один або кілька додаткових елементів для підвищення ефективності трансдукції (наприклад, центральний поліпуриновий тракт/ДНК-флеп елемент(cPPT/FLAP), псі-послідовність для упаковки (Ψ+), елемент, що зв'язується з білком rev (RRE-структуру) і/або інші елементи, що підвищують рівень експресії терапевтичних генів (наприклад, полі-А послідовності). Відповідно до одного з варіантів реалізації, вектор містить: ретровірусний лівий (5') довгий кінцевої повтор (LTR-послідовність), псі-послідовність для упаковки (Ψ+), центральний поліпуриновий тракт/ДНК-флеп елементу(cPPT/FLAP), елемент експорту ретровірусу, промотор β-глобіну і локус контролюючу область (LCR) β-глобіну і, можливо, 3'-кінцевий енхансер βглобіну, функціонально зв'язані з полінуклеотидом, що представляє інтерес, і ретровірусний правий (3') довгий кінцевої повтор (LTR-послідовність), що включає один або декілька інсуляторів або полі-А послідовність. Згідно з певним варіантом реалізації, вектор згідно з винаходом являє собою лентивірусний вектор, що складається з: лівого (5') довгого кінцевого повтору (LTR-послідовності) ВІЛ-1; псіпослідовності для упаковки (Ψ+); центрального поліпуринового тракту ВІЛ-1/ДНК-флеп елемента(cPPT/FLAP); елемента, що зв'язується з білком rev (RRE-структури); промотору βглобіну і локус контролюючої області (LCR) β-глобіну, функціонально зв'язаних з геном, що представляє інтерес, і правого (3') довгого кінцевого повтору (LTR-послідовності), що включає: один або декілька інсуляторів і полі-А послідовність β-глобіну кролика (rβgpA). Згідно з різними варіантами реалізації, вектори згідно з винаходом містять промотор, функціонально зв'язаний з генами, що кодують поліпептид, який забезпечує лікування адренолейкодистрофій і/або адреномієлонейропатій у клітинах мікроглії. Вектори можуть містити одну або декілька LTR-послідовностей, що піддалися одній або декільком модифікаціям, таким як одна або кілька замін, вставок або делецій нуклеотидів. Крім того, вектори можуть містити один або кілька додаткових елементів для підвищення ефективності трансдукції (наприклад, центральний поліпуриновий тракт/ДНК-флеп елемент(cPPT/FLAP), псіпослідовність для упаковки (Ψ+), елемент, що зв'язується з білком rev (RRE-структуру) і/або інші елементи, що підвищують рівень експресії терапевтичних генів (наприклад, полі-А послідовності). 23 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно з певним варіантом реалізації, вектор-переносник згідно з винаходом містить: ретровірусний лівий (5') довгий кінцевої повтор (LTR-послідовність), центральний поліпуриновий тракт/ДНК-флеп елемента(cPPT/FLAP), елемент експорту ретровірусу, промотор, активний у клітинах мікроглії, функціонально зв'язаний з полінуклеотидом, що кодує АТФ-зв'язувальну касету підродини D (ALD), поліпептид (ABCD1), і ретровірусний правий (3') довгий кінцевої повтор. Згідно з певним варіантом реалізації, винахід забезпечує лентивірусний вектор, що складається з: лівого (5') довгого кінцевого повтору (LTR-послідовності) ВІЛ-1; псі-послідовності для упаковки (Ψ+); центрального поліпуринового тракту ВІЛ-1/ДНК-флеп елемента (cPPT/FLAP); елемента, що зв'язується з білком rev (RRE-структури); промотору MND (синтетичного промотору, що містить область U3 довгого кінцевого повтору (LTR-послідовності), функціонально зв'язаний з полінуклеотидом, що кодує поліпептид ABCD1 людини; правого (3') довгого кінцевого повтору (LTR-послідовності) ВІЛ-1, що самоінактивується, і полі-А послідовності β-глобіну кролика (rβgpA). Фахівцеві в даній галузі техніки очевидно, що різні інші варіанти реалізації можуть бути сформульовані на основі варіантів реалізації згідно з цим винаходом, у яких, наприклад, терапевтичний трансген або ген, що представляє інтерес експресуються в клітинах-мішенях або в клітинних лініях, відмінних від лінії кровотворних клітин, наприклад, у лінії клітин нервової тканини. D. Способи трансдукції Цей винахід забезпечує, зокрема, способи і композиції, що суттєво підвищують ефективність трансдукції клітин-мішеней. Не обмежуючись ніякою певною теорією, мається на увазі, що способи і композиції згідно з винаходом можуть застосовуватися для трансдукції суттєво більшого числа клітин, використовуючи суттєво менше число вірусів, у такий спосіб мінімізуючи ризик геномних змін і/або активації протоонкогенів у геномі терапевтичних клітин. Мінімалізація ризику активації протоонкогенів при інтеграції в геном та інших геномних змін у терапевтичних клітинах є важливим чинником при створенні застосовного протоколу генної терапії, оскільки це мінімалізує імовірність того, що трансдуційовані клітини, що мають характеристики, схожі з раковими клітинами, будуть клонально розмножуватися in vivo і дадуть початок злоякісним і доброякісним пухлинам або захворюванням, що характеризуються аномальною клітинною проліферацією. Крім того, у даній галузі відзначено, що трансдукція великим числом вірусів, як правило, має цитотоксичний ефект у відношенні трансдуційованих клітин. Таким чином, композиції і способи згідно з цим винаходом також підвищують виживаність і життєздатність трансдуційованих клітин. Відповідно до цього, цей винахід забезпечує більш безпечні і ефективні способи застосування генної терапії. Застосування ретровірусних або лентивірусних векторів для доставки генів або інших полінуклеотидів за допомогою інфікування вірусом, а не за допомогою трансфекції відомо як "трансдукція". Відповідно до одного з варіантів реалізації, ретровірусні вектори трансдуціюються в клітини шляхом інфікування та інтеграції провірусів. Згідно з конкретними варіантами реалізації, клітина, наприклад, клітина-мішень, є "трансдуційованою", якщо вона містить послідовність гена або іншого полінуклеотиду, доставлену в клітину шляхом інфікування вірусним або ретровірусним вектором. Згідно з конкретними варіантами реалізації, трансдуційована клітина містить одну або кілька послідовностей гену або іншого полінуклеотиду, доставленого в клітинних геном ретровірусним або лентивірусним вектором. Згідно з конкретними варіантами реалізації, клітини-хазяї або клітини-мішені, трансдуційовані вірусним вектором згідно з винаходом, експресують терапевтичний поліпептид і вводять суб'єктові для лікування і/або профілактики захворювань, порушень або патологічних станів. Одержання інфекційних вірусних частинок і вихідних розчинів вірусу може здійснюватися стандартними способами. Способи одержання вихідних розчинів вірусів відомі в даній галузі техніки і описані, наприклад, Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633 і N.R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113. Згідно з конкретними варіантами реалізації, вірусні частинки-похідні ВІЛ-1 можуть бути отримані шляхом одночасної експресії пакувальних елементів віріону і вектора-переносника в клітині-продуценті. Зазначені клітини можуть бути тимчасово трансфіційовані різними плазмідами. Як правило, для трансфекції застосовують три-чотири плазміди, але це число може зрости залежно від ступеня роздроблення лентивірусних компонентів на окремі одиниці. Наприклад, одна плазміда може кодувати корові і ферментні компоненти віріону-похідного ВІЛ1. Таку плазміду називають пакувальною плазмідою. Інша плазміда, як правило, кодує оболонкові білки (білок), найчастіше, білок G вірусу везикулярного стоматиту (VSV G), через 24 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 його високо стабільність і широкий тропізм. Ця плазміда може називатися плазмідою експресії оболонки. Ще одна плазміда кодує геном, що переноситься у клітину-хазяїн, тобто, власне вектор, і називається вектором-переносником. Пакувальні плазміди можуть бути доставлені в клітину-хазяїн стандартними способами, включаючи кальцій-фосфатну трансфекцію, ліпофекцію або електропорацію. За допомогою цього способу, а також його варіантів, можна досягнути титру рекомбінантних вірусів порядку декількох мільйонів трансдуціюючих одиниць на мілілітр (TU/мл). Після центрифугування, можна одержати вихідні концентрації порядку 8 9 10 11 12 13 приблизно 10 TU/мл, 10 TU/мл, 10 TU/мл, 10 TU/мл, 10 TU/мл або 10 TU/мл. Інфекційні вірусні частинки можуть бути виділені з пакувальних клітин стандартними способами. Наприклад, інфекційні частинки можна виділити за допомогою лізису клітин або з надосадової рідини клітинної культури, як відомо в даній галузі. При необхідності, виділені вірусні частинки можуть піддатися додатковому очищенню. Застосовні способи очищення добре відомі фахівцям у даній галузі. Віруси можуть застосовуватися для інфікування клітин способами, добре відомими в даній + галузі техніки in vivo, ex vivo або in vitro. Зокрема, коли клітини, наприклад, CD34 клітини, дендритні клітини, клітини периферійної крові або стовбурові клітини трансдуціюються ex vivo, векторні частинки можуть інкубуватися з клітинами в дозах з величиною множинності зараження 5 5 5 (MOI) порядку 1-50, 110 -5010 трансдуціюючих одиниць вірусного вектора на 10 клітин. Очевидно, що ця величина відповідає числу векторних одиниць у межах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 і 50 MOI. Також віруси можуть вводитися суб'єктові in vivo, безпосередньо шляхом ін'єкції в клітини, тканини і органи, що потребують терапії. Множинність зараження при прямій ін’єкції повинна 5 5 становити порядку 1-50, що також відповідає 110 -5010 трансдуціюючим одиницям вірусного 5 вектора на 10 клітин. Також віруси можуть доставлятися з урахуванням вірусного титру (TU/мл), що вимірюється, наприклад, із застосуванням комерційно доступного антигену р24, тобто, ІФА вірусного оболонкового білка р24. Наступна формула може застосовуватися для вимірювання величини пг/мл р24: у наявності приблизно 2000 молекул р24 на одну фізичну частинку (РР) лентивірусу: (2×103)  (24×103 Да p24 на PP), 48×106/число Авогадро = (48×106) / (6×1023) = 8×10-17 г p24 на PP, приблизно 1 PP на 1×10-16 г p24, 1×104 PP на пг p24. Належним чином упакований, псевдотипований VSV-G лентивірусний вектор буде мати індекс інфективності від 1 TU на 1000 фізичних частинок (PP) до 1 TU на 100 PP (або менше). Таким чином, границі інтервалу визначаються величинами приблизно від 10 до 100 TU/пг p24. Таким перетворенням можна одержати величину в TU/мл. Ґрунтуючись на отриманому досвіді, кількість лентивірусу, що безпосередньо вводиться визначається величиною загального TU і може варіювати залежно від припустимого об'єму композиції, що вводиться, і від типу тканини, куди лентивірус вводиться. Наприклад, у мозкову тканину припустиме введення досить невеликого об'єму композиції, що містить лентивірус, тому 6 7 6 8 кращий високий титр, з величиною TU порядку приблизно 110 -110 , приблизно 110 -110 , 6 9 7 10 8 11 8 12 110 -110 , приблизно 110 -110 , 110 -110 , приблизно 110 -110 , або приблизно 10 12 110 -110 або більше, для кожної ін'єкції. У свою чергу, системне введення дозволяє 8 9 10 11 використовувати значно більші кількості, з величиною TU порядку 110 , 110 , 110 , 110 , 12 13 14 15 110 , 110 , 110 або 110 . Цей винахід має на увазі способи і композиції, що забезпечують більшу ефективність трансдукції клітин in vitro, ex vivo і in vivo, використовуючи більш низькі титри вірусу для досягнення ефективності трансдукції, порівнянної з описаними вище способами. Певні аспекти цього винаходу виникли завдяки тому, що несподівано було виявлено істотне підвищення ефективності трансдукції in vitro, ex vivo або in vivo у присутності ретровірусу і однієї або декількох сполук, що забезпечують посилення сигнального шляху рецептора простагландіну ЕР, таких як низькомолекулярні сполуки або сполуки, описані в WO 2007/112084 і WO2010/108028, кожна з яких повністю включена в цю заявку шляхом посилання. У цій заявці, термін "підсилює сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР", як правило, відноситься до здатності сполуки підсилювати клітинний сигнальний шлях у напрямку по ходу транскрипції рецептора простагландіну ЕР у клітині в присутності однієї або декількох зазначених сполук у порівнянні з активністю сигнального шляху рецептора простагландіну ЕР у їхній відсутності. Способи вимірювання посилення або стимуляції активності сигнального шляху простагландіну ЕР відомі в даній галузі і описані, наприклад, в WO2010/108028, повністю включеній в цю заявку шляхом посилання. Типові приклади сполук, що підсилюють сигнальний шлях простагландіну ЕР, включають, але не обмежуються зазначеними: низькомолекулярні сполуки, наприклад, низькомолекулярні 25 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 органичні сполуки, простагландіни, агоністи сигнального шляху Wnt, агоністи сигнального шляху цАМФ/фосфоінозитид-3-кінази (PI3K)/серин-треонінової кінази (AKT), агоністи сигнального 2 шляху Ca +, агоністи сигнального шляху NO/ангіотензину та інші сполуки, що підсилюють сигнальний шлях простагландіну, обрані із групи, що складається з: мебеверину; флурандреноліду; атенололу; піндололу; габоксадолу; оксихінолінкарбонової кислоти; гідралазину; тіабендазолу; бікукуліну; везаміколу; перувозиду; іміпраміну; хлорпропаміду; 1,5пентаметилентетразолу; 4-амінопіридину; диазоксиду; бенфотіаміну; 12-метоксидодеценової кислоти; N-форміл-метіоніл-лейцил-фенілаланіну; галаміну; IAA 94 і хлортрианізену, а також їх похідних. Згідно з кращим варіантом реалізації, сполука, що підсилює сигнальний шлях простагландіну, являє собою природну або хімічно синтезовану молекулу або поліпептид, який зв'язується і/або взаємодіє з рецептором ЕР, як правило, активуючи або стимулюючи одну або кілька наступних реакцій сигнального шляху, пов'язаного з рецептором простагладнину ЕР, як описано в цій заявці і відомо в даній галузі техніки. Відповідно до одного з варіантів реалізації, сполука, що підсилює сигнальний шлях простагландіну, обрана із групи, що складається з: PGA2; PGB2; PGD2; PGE1 (альпростадил (Caverjecttm; Edextm; Musetm; Prostin VRTM)); PGE2; PGF2; PGI2 (епопростенол (Flolantm; Prostacyclintm)); PGH2; PGJ2, а також їх попередників, метаболітів, похідних і аналогів. Інші типові сполуки, що підсилюють сигнальний шлях простагландіну, включають, але не обмежуються зазначеними: 15d-PGJ2; дельта12-PGJ2; 2-гідроксигептадекатрієнову кислоту TM (HHT); тромбоксан (TXA2 і TXB2); аналоги PGI2, наприклад, ілопрост (Ventavis ) і трепростиніл TM TM Remodulin ); аналоги PGF2, наприклад, травопрост (Travatan ), карбопрост трометамін TM TM TM TM (Hemabate ), тафлупрост (ZioptanI ), латанопрост (Xalatan ), біматопрост (Lumigan ; TM TM TM TM TM Latisse ), унопростон ізопропіл (Rescula ), клопростенол (Ciosin , Cyclix , Estrumate , TM TM TM Lutaprost , Onsett , Planate ), естрофан і суперфан; аналоги PGE1, наприклад, мізопростол TM (Cytotec ) і бутапрост; також "Corey alcohol-A" [[3α,4α,5β,6α]-(-)-[гексагідро-4-(гідроксиметил)-2оксо-2H-циклопентафуран-5-іл][1,1′-біфеніл]-4-карбоксилат]; "Corey alcohol-B" [2Hциклопентафуран-2-он, 5-(бензоилокси)гексагідро-4-(гідроксиметил)[3aR-(3α,4α,5β,6α)]]; і "Corey diol" ((3aR,4S,5R,6aS)-гексагідро-5-гідрокси-4-(гідроксиметил)-2H-циклопентафуран-2-он). Відповідно до одного з варіантів реалізації, сполука являє собою ліганд рецептора простагландіну ЕР, включаючи, але не обмежуючись зазначеними: простагландін E2 (PGE 2), а також його аналоги і похідні. Як правило, простагландіни відносяться до гормоноподібних молекул-похідних жирних кислот, що складаються з 20 атомів вуглецю, включаючи 5-атомне кільце, як описано в цій заявці і відомо фахівцям у даній галузі. Типові приклади "аналогів" або "похідних" PGE2 включають, але не обмежуються зазначеними: 16,16-диметил PGE2, 16-16 диметил PGE2 p-(p-ацетамідобензамідо) феніловий ефір, 11-дезокси-16,16-диметил PGE2, 9-дезокси-9-метилен-16, 16-диметил PGE2, 9-дезокси-9метилен PGE2, 9-кето флупростенол, 5-транс PGE2, 17-феніл-омега-тринор PGE2, PGE2 сериноламід, метиловий ефір PGE2, 16-феніл тетранор PGE2, 15(S)- 15- метил PGE2, 15 (R)-15метил PGE2, 8-ізо-15-кето PGE2, ізопропіловий ефір 8-ізо PGE2, 20-гідрокси PGE2, 11-дезокси PGEi, "nocloprost", "sulprostone", "butaprost", 15-кето PGE2 і 19-(R)-гідрокси PGE2. Також, аналоги і похідні простагландіну включають сполуки, подібні за будовою з PGE2, де атом галогену є замісником по позиції 9 (див., наприклад, WO 2001/12596, включений у цю заявку повністю шляхом посилання), а також 2- декарбокси-2-фосфініко похідні, наприклад, описані в публікації США № 2006/0247214, включеної в цю заявку шляхом посилання.) Згідно з деякими варіантами реалізації, сполука не являє собою ліганд, відмінний від PGE 2. Згідно з конкретними варіантами реалізації, зазначений ліганд вибирають із групи, що складається з агоністов ЕР1, ЕР2, ЕР3 або ЕР4. Згідно з конкретними варіантами реалізації, рецептор простагландіну вибирають із групи, що складається з EP1, EP2, EP3 і EP4. Типові приклади агоністов ЕР1, що не відносяться до похідних PGE2, включають, але не обмежуються зазначеними: ONO-DI-004 і ONO-8713. Типові приклади агоністов ЕР2, що не є похідними PGE2, включають, але не обмежуються зазначеними: CAY10399, ONO_8815Ly, ONOAE1-259 і CP-533,536. Інші приклади агоністів ЕР2, що не відносяться до похідних PGE 2, включають карбазоли і флуорени, описані в WO 2007/071456, повністю описані в даній заявці шляхом посилання. Типові приклади агоністів ЕР3, що не відносяться до похідних PGE 2, включають, але не обмежуються зазначеними: AE5-599, MB28767, GR 63799X, ONO-NT012 і ONO-AE-248. Типові приклади агоністів ЕР4, що не відносяться до похідних PGE2, включають, але не обмежуються зазначеними: ONO-4819, APS-999 Na, AH23848 і ONO-AE 1-329. Інші приклади агоністів ЕР2, що не відносяться до похідних PGE2, описані в WO/2000/038663; 26 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 патенті США № 6,747,037 і U.S. Patent No. 6,610,719, кожний з яких повністю включений у цю заявку шляхом посилання. Відповідно до одного з варіантів реалізації, сполука, що підсилює сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР, являє собою агоніст Wnt. Типові приклади агоністів Wnt включають, але не обмежуються поліпетидами-похідними Wnt і інгібіторами глікоген-синтазикінази-3 (GSK3). Типові приклади поліпептидів-похідних Wnt, застосовні як сполуки, що підсилюють сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР, включають, але не обмежуються: Wnt1, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt14, Wnt15, Wnt15, а також їх біологічно активні фрагменти. Інгібітори GSK3 застосовуються як сполуки, що підсилюють сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР, приєднуючись і знижуючи активність GSK3α або GSK3β. Типові приклади інгібіторів GSK3 включають, але не обмежуються зазначеними: BIO (6-броміндирубін-3´-оксім), LiCl, або інші інгібітори GSK3, як описано в патентах США №№ 6,057,117 і 6,608,063; у заявках на патент США №№ 2004/0092535 і 2004/0209878; АТФ-конкуретні, селективні інгібітори GSK3 CHIR-911 і Chlr-837 (що також позначаються як CT-99021 і CT-9802, відповідно). Chiron Corporation (Emeryville, CA). Згідно з іншим варіантом реалізації, сполука, що підсилює сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР, діє через шлях вторинних месенджерів cAMP/P13K/AKT і його вибирають із групи, що складається з дибутирил цАМФ, форболового ефіру, форсколіну, склареліну (sclareline), 8-бром-цАМФ, холерного токсину (CTx), амінофіліну, 2,4-динітрофенолу (DNP), норепінефрину, епінефрину, ізопротеренолу, ізобутилметилксантину (IBMX), кофеїну, теофіліну (диметилксантину), дофаміну, роліпраму, ілопросту, гіпофізарного пептиду-активатора аденілатциклази (PACAP) і вазоактивного інтестінального поліпептиду (VIP), а також їх похідних. Згідно з іншим варіантом реалізації, сполука, що підсилює сигнальний шлях рецептора 2 простагландіну ЕР, діє через шлях вторинних месенджерів Ca + і її вибирають із групи, що складається з Bapta-AM, фендиліну, нікардипіну і їх похідних. Згідно з іншим варіантом реалізації, сполука, що підсилює сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР, діє через сигнальний шлях NO/ангіотензину і її вибирають із групи, що складається з L-аргініну, нітропрусиду натрію, ванадату натрію, брадикіріну і їх похідних. Відповідно до одного з варіантів реалізації, цей винахід забезпечує спосіб підвищення ефективності трансдукції, що включає культивування популяції клітин у присутності ретровірусу і однієї або декількох сполук, що підсилюють сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР, обраних із групи, що складається з: простагландіну, PGE 2; PGD2; PGI2; лінолевої кислоти; 13(s)HODE; LY171883; мідової кислоти; ейкозатрієнової кислоти; епоксиейкозатрієнової кислоти; ONO-259; Cay1039; агоніста рецептора PGE2; 16,16-диметил PGE2; 19(R)-гідрокси PGE2; 16,16диметил PGE2 p-(p-ацетамідобензамідо) фенілового ефіру; 11-дезокси-16,16-диметил PGE2; 9дезокси-9-метилен-16,16-диметил PGE2; 9-дезокси-9-метилен PGE2; сульпростону; сериноламіду PGE2; метилового ефіру PGE2; феніл-тетранор PGE2; 16-феніл-тетранор PGE2; 15(S)-15-метил PGE2; 15(R)-15-метил PGE2; BIO; 8-бром-цАМФ; форсколіну; ацетоксиметилового ефіру 1,2-біс етан-N,N,N,N-тетраоцтової кислоти; фендиліну; нікардипіну; ніфедипіну; пімозиду; строфантидину; ланатозиду; L-аргініну; нітропрусиду натрію; ванадату натрію; брадикініну; мебеверину; флурандреноліду; атенололу; піндололу; габоксадолу; оксихінолінкарбонової кислоти; гідралазину; тіабендазолу; бікукуліну; везаміколу; перувозиду; іміпраміну; хлорпропаміду; 1,5-пентаметилентетразолу; 4-амінопіридину; диазоксиду; бенфотіаміну; 12-метоксидодеценової кислоти; N-форміл-метіоніл-лейцил-фенілаланіну; галаміну; IAA 94; і хлортрианізену. Згідно з варіантом реалізації, цей винахід забезпечує спосіб підвищення ефективності трансдукції, що включає культивування популяції клітин у присутності ретровірусу і однієї або декількох сполук, що є лігандами рецептора простагландіну ЕР, вибраних із групи, що складається з: 16,16-диметил PGE2; 16,16-диметил PGE2 p-(p-ацетамідобензамідо) фенілового ефіру; 11-дезокси-16,16-диметил PGE2; 9-дезокси-9-метилен-16,16-диметил PGE2; 9-дезокси-9метилен PGE2; 9-кетофлупростенолу, 5-транс PGE2, 17-феніл-омега-тринор PGE2, сериноламіду PGE2, метилового ефіру PGE2, 16-фенілтетранор PGE2, 15(S)-15-метил PGE2, 15(R)-15-метил PGE2, 8-ізо-15-кето PGE2, 8-ізопропілового ефіру PGE2, 20-гідрокси PGE2, 11дезокси PGEi, ноклопросту, сульпростону, бутапросту, 15-кето PGE2 і 19-(R)-гідрокси PGE2. Цей винахід також має на увазі, що ефективність трансдукції клітин може бути підвищена шляхом культивування клітин у присутності ретровірусу, сполуки, що підсилює сигнальний шлях 27 UA 114796 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 рецептора простагландіну ЕР, наприклад, PGE2, і одного або декількох інгібіторів деацетилази гістонів (HDAC). Типові приклади інгібіторів HDAC, застосовні відповідно до композицій і способів згідно з цим винаходом, включають, але не обмежуються зазначеними: TSA (трихостатин A) (див., наприклад, Adcock, (2007) British Journal of Pharmacology 150:829-831), VPA (вальпроеву кислоту) (див., наприклад, Munster, et al, (2007) Journal of Clinical Oncology 25:18S: 1065), бутират натрію (NaBu) (див., наприклад, Han, et al., (2007) Immunology Letters 108: 143-150), SAHA (субероїланілід гідроксамової кислоти або воріностат) (див., наприклад, Kelly, et al., (2005) Nature Clinical Practice Oncology 2: 150-157), фенілбутират натрію (див., наприклад, Gore, et al., (2006) Cancer Research 66:6361-6369), депсипептид (FR901228, FK228) (див., наприклад, Zhu, et al., (2003) Current Medicinal Chemistry 3(3): 187-199), трапоксин (TPX) (див., наприклад, Furumai, et al., (2001) PNAS 98(1): 87-92), пептид 1, що містить циклічну гідроксамову кислоту (CHAP1) (див., Furumai supra), MS-275 (див., наприклад, Carninci, et al., WO2008/126932, включений у цю заявку шляхом посилання), LBH589 (див., наприклад, Goh, et al., WO2008/108741, включений у цю заявку шляхом посилання) і PXD-101 (див., Goh, supra). Цей винахід має на увазі, що клітини можуть культивуватися в присутності ретровірусу і сполуки, що підсилює сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР і/або інгібітора HDAC протягом проміжку часу, що приблизно становить від 10 хвилин до 72 годин, від 30 хвилин до 72 годин, від 30 хвилин до 48 годин, від 30 хвилин до 24 годин, від 30 хвилин до 12 годин, від 30 хвилин до 8 годин, від 30 хвилин до 6 годин, від 30 хвилин до 4 годин, від 30 хвилин до 2 годин, від 1 до 2 годин, або рівного будь-якому проміжному значенню в межах, зазначених вище. Цей винахід має на увазі, що клітини можуть культивуватися в присутності ретровірусу і сполуки, що підсилює сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР і/або інгібітора HDAC протягом приблизно 30 хвилин, приблизно 1 години, приблизно 2 годин, приблизно 4 годин, приблизно 5 годин, приблизно 6 годин, приблизно 7 годин, приблизно 8 годин, приблизно 9 годин, приблизно 10 годин, приблизно 11 годин, приблизно 12 годин, приблизно 13 годин, приблизно 14 годин, приблизно 15 годин, приблизно 16 годин, приблизно 17 годин, приблизно 18 годин, приблизно 19 годин, приблизно 20 годин, приблизно 21 години, приблизно 22 годин, приблизно 23 годин, приблизно 24 годин, приблизно 48 годин, приблизно 72 годин, або протягом будь-якого проміжного часового інтервалу в межах, зазначених вище. Цей винахід має на увазі, що клітини можуть культивуватися в присутності однієї або декількох сполук, що підсилюють сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР і/або один або кілька інгібіторів HDAC до культивування з ретровірусом, під час культивування або після нього, або комбінуючи ці альтернативи в будь-якій стадії з описаних процесів. Крім того, цей винахід має на увазі, що клітини можуть культивуватися в присутності однієї або декількох сполук, що підсилюють сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР, і ретровірусу до культивування, під час культивування або після культивування в присутності одного або декількох інгібіторів, або комбінуючи ці альтернативи в будь-якій стадії з описаних процесів. Цей винахід також має на увазі, що клітини можуть культивуватися в присутності ретровірусу до їхнього культивування в присутності сполук, що підсилюють сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР і/або в присутності одного або декількох інгібіторів HDAC, під час їх культивування в присутності сполук, що підсилюють сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР і/або в присутності одного або декількох інгібіторів HDAC або після їхнього культивування в присутності сполук, що підсилюють сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР і/або в присутності одного або декількох інгібіторів HDAC, або комбінуючи ці альтернативи в будь-якій стадії з описаних процесів. Крім того, фахівцям у даній галузі техніки очевидно, способи підвищення ефективності трансдукції згідно з винаходом включають культивування клітин у присутності ретровірусу, однієї або декількох сполук, що підсилюють сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР і/або в присутності одного або декількох інгібіторів HDAC протягом перших 6 годин трансдукції, перших 12 годин трансдукції, перших 24 годин трансдукції, перших 48 годин трансдукції, перших 72 годин трансдукції, або протягом будь-якого проміжного часового інтервалу в межах, зазначених вище. Крім того, цей винахід має на увазі, що клітини можуть трансдуціюватися в присутності ретровірусу і сполуки, що підсилює сигнальний шлях рецептора простагландіну ЕР і/або інгібітора HDAC одноразово, дворазово, триразово або більшу кількість разів. Згідно з іншим варіантом реалізації, цей винахід має на увазі, що клітини можуть трансдуціюватися в присутності ретровірусу одноразово, дворазово, триразово або більшу кількість разів і в 28