Спосіб регуляції ненасиченості жирних кислот олії насіння

Реферат: Винахід належить до способу регуляції ненасиченості жирних кислот в олії насіння, який включає одержання рослини, що продукує олійне насіння, і знижувальну регуляцію, із застосуванням щонайменше одного із способів мутагенезу і рекомбінантних ДНК, експресії або активності щонайменше однієї фосфатидилхолін:діацилгліцеролхолінфосфотрансферази (PDCT) в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, і де щонайменше один із способів мутагенезу або рекомбінантних ДНК напряму знижує експресію або активність щонайменше однієї PDCT. Також винахід належить до скорочених PDCTполіпептидів, які містять N-кінцеву частину поліпептиду, та до нуклеїнових кислот, які кодують такі скорочені поліпептиди. UA 108597 C2 (12) UA 108597 C2 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Аспекти цього винаходу стосуються загалом біосинтезу жирних кислот, мембранних ліпідів і олій із насіння рослин і, конкретніше, біосинтезу ненасичених жирних кислот і споріднених ацилгліцеринів і композицій і способів для диференціальної регуляції ненасиченості жирних кислот в олії насіння і мембранних ліпідах рослин на основі модуляції раніше невідомого біосинтетичного шляху, що включає в себе нову фосфатидилхолін:діацилгліцеролхолінфосфотрансферазу (PDCT), яка регулює біосинтез фосфатидилхоліну в олійних рослинах, що розвиваються (наприклад, Arabidopsis, сої (Glycine max), каноли (Brassica napus або В. rapa) соняшника (Helianthus annuus), і т.ін.). Конкретні аспекти стосуються поліпептидів PDCT, що мають ознаку винаходу, які включають у себе, наприклад, варіанти, делеції, мутеїни, злиті білки та їхні ортологи (сукупно білки PDCT), кодуючих їх виділених нуклеїнових кислот, рослин, що містять такі білки PDCT або позбавлених таких білків PDCT, і способів генерування рослин, що мають змінену експресію і/або активність PDCT або що не мають експресії і/або активності PDCT, що включає в себе, але що не обмежується ними, способи, що передбачають мутагенез, сайленсинг генів, антисмислові способи, коротку інтерферуючу РНК (siRNA), рекомбінантну ДНК, трансгенні рослини і т.ін.). ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ Ця заявка заявляє пріоритети попередньої заявки на патент США з порядковим номером 61/149288, поданої 02 лютого 2009 року та озаглавленої КОМПОЗИЦІЇ І СПОСОБИ ДЛЯ ДИФЕРЕНЦІАЛЬНОЇ РЕГУЛЯЦІЇ НЕНАСИЧЕНОСТІ В ЖИРНИХ КИСЛОТАХ у МЕМБРАННИХ ЛІПІДАХ І ОЛІЇ НАСІННЯ, і Попередньої заявки на патент США із порядковим номером 61/033742, поданої 04 березня 2008 року з тією ж самою назвою, обидві з яких включені тут посиланням в їхньому повному обсязі. ЗАЯВА СТОСОВНО ФЕДЕРАЛЬНО ФІНАНСОВАНОГО ДОСЛІДЖЕННЯ Цей винахід був зроблений, принаймні частково, із підтримкою Держави з використанням грантів 2006-35318-17797 і 97-35301-4426, присуджених Міністерством сільського господарства Сполучених Штатів (USDA), і, отже, Уряд Сполучених Штатів має певні права в цьому винаході. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Багато видів рослин, у тому числі, наприклад, Arabidopsis thaliana, запасають триацилгліцериди (TAG) в своєму насінні як запас вуглецю. Ці TAG є головним джерелом енергії і вуглецевого матеріалу, які підтримують розвиток проростків під час ранніх стадій життя рослини. Рослинні олії з сої (Glycine max), каноли (Brassica napus або В. rapa), соняшника (Helianthus annuus) і багатьох інших олійних сільськогосподарських культур також є важливим джерелом олії для харчового раціону людини або промислових застосувань, що включають у себе, але не обмежуються ними, біологічні палива, зм'якшувальні компоненти рослинного походження, попередники найлону і сировинних матеріалів для детергентів (миючих засобів). Ступінь і/або кількість поліненасичених жирних кислот рослинних олій є характерними і визначальними властивостями стосовно застосувань олій у харчовій або нехарчовій промисловості. Конкретніше, ці характерні і корисні властивості рослинних олій визначаються значним ступенем складом їхніх жирних кислот у TAG. Основні рослинні олії складаються насамперед з пальмітинової (16:0), стеаринової (18:0), 9 9,12 9,12,15 олеїнової (18:1cis  ), лінолевої (18:2cis  ) і -ліноленової (18:3cis  ) кислот. Пошуки модифікацій складів жирних кислот робилися протягом принаймні сторіччя для забезпечення оптимальних масляних продуктів для харчування людини і хімічних (наприклад, олеохімічних) застосувань (1-3). Зокрема, поліненасичені жирні кислоти (18:2 і 18:3) привернули значну увагу, оскільки вони є головними чинниками, які впливають на поживну цінність і стабільність олій. Однак, хоч ці дві жирні кислоти забезпечують важливі нутрієнти для людей і тварин, вони збільшують нестабільність олії, оскільки вони містять множинні подвійні зв'язки, які можуть легко окислюватися під час обробки і зберігання. Недоліки цієї галузі. Десатурація 18:1 у 18:2 є критичною стадією для синтезу поліненасичених жирних кислот. Відомо, що під час біосинтезу ліпідів ця реакція каталізується десатуразою жирних кислот, FAD2, мембранозв'язаним ферментом, локалізованим на ендоплазматичному ретикулумі (ендоплазматичній сітці) (ER) (4). Субстрат FAD2 18:1 повинен бути естерифікований у положенні sn-2 фосфатидилхоліну (PC) (5, 6), який є головним мембранним фосфоліпідом клітин рослин. Таким чином, недивно, що знижувальна регуляція генів FAD2 (і FAD3) стає переважною стратегією для уникнення необхідності гідрогенізації рослинних олій і супутнього утворення небажаних транс-жирних кислот. Наприклад, соя має як насінняспецифічну, так і конститутивну FAD2-десатурази, так що сайленсинг гена насінняспецифічної форми дозволив одержання високоолеатних культиварів (>88 % 18:1 в олії), в яких мембранна ненасиченість і продуктивність рослин були не порушені значною мірою. Однак важливим є те, що такі стратегії сайленсингу гена FAD2 є по суті обмеженими, оскільки, 1 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, канола та інші олійні культури мають тільки конститутивні ферменти FAD2. Таким чином, в канолі та інших культурах із конститутивним FAD2 сайленсинг або знижувальна регуляція FAD2 змінюють не тільки склад жирних кислот запасного триацилгліцерину (TAG) у насінні, але також і клітинних мембран, що у сильному ступені порушує ріст та урожай рослини. Наприклад, дефектний FAD2 у мутанті Arabidopsis fad2 змінює склад жирних кислот у насінні, а також у тканинах рослини і у сильному ступені порушує ріст рослини (4). Мутації і сайленсинг FAD2, які викликають найвищі рівні 18:1 у цій олії, також зменшують мембранну ненасиченість у вегетативних тканинах і тканинах насіння, призводячи до рослин, які погано проростають і ростуть. У результаті, можливою є тільки часткова знижувальна регуляція експресії FAD2, що утворює приблизно 70-75 % 18:1 в олії комерційних сортів, таких як Nexera/Natreon (Dow AgroSciences) і Clear Valley 75 (Cargill). Таким чином, у даній галузі існує явна необхідність у нових композиціях і способах для диференціальної регуляції ненасиченості жирних кислот в олії насіння і мембранних ліпідах рослин і в життєздатних рослинах (наприклад, канолі і т.ін.), що мають зменшену ненасиченість жирних кислот в оліях насіння, без шкідливих змін у ненасиченості компонентів мембранних ліпідів. СУТЬ ПРИКЛАДОВИХ ВАРІАНТІВ Конкретні аспекти забезпечують нові композиції і способи для диференціальної регуляції ненасиченості жирних кислот в олії насіння і мембранних ліпідах без шкідливих змін у ненасиченості компонентів мембранних ліпідів. Додаткові аспекти забезпечують композиції і способи для диференціальної регуляції ненасиченості жирних кислот в олії насіння і мембранних ліпідах рослин на основі модуляції раніше невідомого шляху, що включає в себе нову фосфатидилхолін:діацилгліцеролхолінфосфотрансферазу (PDCT), яка регулює біосинтез фосфатидилхоліну в олійних рослинах, що розвиваються (наприклад, Arabidopsis, сої (Glycine max), канолі (Brassica napus або В. rapa), соняшнику (Helianthus annuus), і т.ін.). Додаткові аспекти забезпечують поліпептиди PDCT, що мають ознаки винаходу, у тому числі, наприклад, варіанти, делеції, мутеїни, злиті білки та їхні ортологи (разом білки PDCT). Інші додаткові аспекти забезпечують рослини, що містять такі послідовності або білки PDCT або позбавлені таких білків і послідовностей PDCT або виснажені стосовно таких білків і послідовностей PDCT, і способи генерування рослин, що мають змінену експресію і/або активність PDCT, або що не мають експресії і/або активності PDCT, у тому числі, але не тільки, способи, що передбачають мутагенез, сайленсинг генів, антисмислові способи, використання короткої інтерферуючої РНК (siRNA), рекомбінантної ДНК, трансгенних рослин і т.ін.). Конкретні аспекти забезпечують спосіб регуляції ненасиченості жирних кислот в олії насіння, що передбачає: одержання рослини, яка виробляє олійне насіння, і модуляцію експресії або активності принаймні однієї фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікуються стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. У деяких варіантах здійснення, модуляція експресії або активності принаймні однієї PDCT передбачає знижувальну регуляцію експресії або активності, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується або зменшується. Переважно, цей спосіб передбачає диференціальну регуляцію ненасиченості жирних кислот в олії насіння щодо ненасиченості жирних кислот в одному або декількох мембранних ліпідах. Переважно, ненасиченість жирних кислот в олії насіння стосовно ненасиченості жирних кислот в одному або декількох мембранних ліпідах зменшується диференціально в олії насіння. Додаткові аспекти забезпечують спосіб одержання рослини, що продукує олійне насіння, або її частини, що передбачає передачу в зародкову плазму сорту рослини, що продукує олійне насіння, мутації або генетичної зміни, яка модифікує експресію або активність принаймні однієї PDCT в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. Наступні варіанти включають у себе рослину, що виробляє олійне насіння, або її частину, що містить мутацію або генетичну зміну, яка модифікує експресію або активність принаймні однієї фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. Хоч ця мутація або генетична зміна можуть бути мутацією або генетичною зміною, яка модулює експресію і/або активність PDCT, у конкретних аспектах ця мутація включає в себе мутацію принаймні однієї послідовності PDCT, яка 2 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 модифікує її експресію або активність в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. Додаткові аспекти забезпечують насінину або насіння чистих ліній, одержане із рослин, що продукують олійне насіння, або їхніх частин, забезпечених тут. Наступні аспекти забезпечують олію, одержану з рослин, що продукують олійне насіння, або їхніх частин, забезпечених тут. Інші додаткові варіанти забезпечують паливо (наприклад, біопаливо) на основі, принаймні частково, принаймні однієї олії, одержаної з рослин, що продукують олійне насіння, або їхніх частин, забезпечених тут. СТИСЛИЙ ОПИС ФІГУР Фігури 1A-1D показують синтез ліпідів у насінні Arabidopsis, що розвивається. Насіння, що розвивається, мітили радіоактивним ацетатом (для мічення жирних кислот) (ФІГУРИ 1C і 1D) і радіоактивним гліцерином (для мічення ліпідного скелета) (ФІГУРИ 1A і 1B). Після 15 хвилин 14 імпульсного мічення [ С]-міченим гліцерином (С) або ацетатом (D), проводили витіснення протягом 180 хвилин. Радіоактивність PC, DG і TG визначали у часових точках 0, 30, 60 і 180 хвилин. Фігури 1E-1H показують порівняння складу жирних кислот між rod1 і WT у TG, DG, PC і PE із насіння, що розвивається, на день 9 після зацвітання. Фігури 2A-2C показують, що ген ROD1 був ідентифікований як At3g15820 в Arabidopsis. Фігура 2D показує ідентифікацію на основі картирування локусу ROD1 на хромосомі 3 Arabidopsis. Фігури 3A-3C показують, що ROD1 функціонує як фосфатидилхолін:діацилгліцеролхолінфосфотрансфераза. Фігура 4 показує укорочену амінокислотну послідовність мутанта ROD1 (SEQ ID NO:5) у DH4. Згідно з конкретними аспектами, кодуюча послідовність (SEQ ID NO:4) мутанта (rod1) фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) містить заміну GА в положенні 228 нуклеотидів, призводячи до передчасної термінації білка PDCT з утворенням укороченої мутантної послідовності, що складається з 75 амінокислот ROD1 (SEQ ID NO:5). Фігура 5 показує, згідно з конкретними аспектами прикладів, взаємовідносини первинних послідовностей між членами сімейства LPT. Згідно з конкретними аспектами, ROD1 належить до сімейства фосфатаз/фосфотрансфераз ліпідів. ЗМІНЕНА СТОРІНКА Фігура 6 показує, згідно з конкретними аспектами прикладів, відомі послідовності, гомологічні ROD1 Arabidopsis, у різних організмах. Згідно з конкретними аспектами, ROD1 регулює рівновагу між діацилгліцеролом і фосфатидилхоліном в олійному насінні. Фігура 7 показує, згідно з конкретними аспектами прикладів, ЗТ-ПЛР ROD1 і експресію At3g15830 у клітках Arabidopsis і дріжджів. Доріжки 1-8 є результатами для ROD1, а доріжки 9-16 для At3g15830. Проби ЗТ-ПЛР є загальною РНК із проростків (1,9), що проростають, молодого листя (2, 10), квіток (3,11), стручків (4, 12) Arabidopsis дикого типу (WT) і стручків із rod1мутантних рослин (5, 13); клітин дріжджів, що містять p424GPD (7, 15) або p424ROD1 (8) і p424At3g15830 (16); і геномної ДНК з rod1 (6, 14). Фігура 8 показує, згідно з конкретними аспектами прикладів, цифровий Нозерн-аналіз гена ROD1 в Arabidopsis. Дані, що використовуються для створення цифрового Нозерн-аналізу, одержували з AtGenExpress у сайті Genevestigator (genevestigator.ethz.ch/). Інтенсивність сигналів усереднювали для всіх стадій, які включені в цю фігуру. Фігури 9A-9G показують, згідно з конкретними аспектами прикладів, що ROD1 має активність фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінтрансферази (PDCT). (А) ТШХ-зображення аналізів CPT. (У) ТШХ-зображення аналізів PDCT. Використали мікросоми клітин DBY746 (WT) і HJ091 S. cerevisiae, трансформованих p424GPD (V) або p424ROD1 (R), і системою розчинників ТШХ у 14 всіх експериментах є: хлороформ/метанол/вода = 65/25/4 за об'ємом. Субстрат є CDP-[ С]холін 14 і діолеїн для CPT, і [ С-гліцерол]ди18:1-DG і PC (0 або 1 мМ) для PDCT, відповідно, b = прокип'ячені мікросомні білки. (С) PDCT-активності мікросом ROD1-трансформованих дріжджів 14 у реакціях [ С-гліцерол]ди18:1-DG із PC (0 або 1 мМ), CDP-холін, фосфохолін і лізо-РС, відповідно. (D) Мікросоми клітин HJ091, трансформованих вектором p424GPD (V) або 14 p424ROD1, інкубували з ди14:0-РС [ С-холін] і ди18:1-DG для аналізів PDCT. (Е) Дія рН на активність PDCT). (F-H) Лінійність активності PDCT залежно від часу інкубації, доданого мікросомного білка і РС, відповідно. Дані представляють середні величини і стандартні відхилення трьох незалежних реакцій. 3 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ВІДОМОСТІ, ЩО ПІДТВЕРДЖУЮТЬ МОЖЛИВІСТЬ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ Конкретні аспекти забезпечують нові композиції і способи для диференціальної регуляції ненасиченості жирних кислот в олії насіння і мембранних ліпідах без шкідливих змін у ненасиченості компонентів мембранних ліпідів. Додаткові аспекти забезпечують композиції і способи для диференціальної регуляції ненасиченості жирних кислот в олії насіння і мембранних ліпідах, засновані на модуляції раніше невідомого біосинтетичного шляху, що включає в себе нову фосфатидилхолін:діацилгліцеролхолінфосфотрансферазу (PDCT), яка регулює біосинтез фосфатидилхоліну в розвитку олійних рослин (наприклад, Arabidopsis, сої (Glycine max), каноли (Brassica napus або В. rapa), соняшника (Helianthus annuus), і т.ін.). Додаткові аспекти забезпечують послідовності і поліпептиди PDCT, що мають ознаки винаходу, у тому числі, наприклад, мутанти (наприклад, SEQ ID NO:4 і 5), варіанти, делеції, мутеїни, злиті білки та їхні ортологи (разом білки PDCT). Інші додаткові аспекти забезпечують рослини, що містять такі білки PDCT або позбавлені їх, або виснажені щодо таких послідовностей або білків і/або активності PDCT, і способи генерування рослин, що мають змінені експресію і/або активність PDCT або не мають експресії і/або активності PDCT, що включає в себе, але що не обмежується ними, загальноприйняті в даній галузі способи, що включають у себе мутагенез, сайленсинг генів, антисмислову РНК, коротку інтерферуючу РНК (siRNA), рекомбінантну ДНК, трансгенні рослини і т.ін.). Інформація щодо мутагенів і мутагенізації насіння або пилка, представлена, наприклад, в IAEA's Manual on Mutation Breeding (IAEA, 1977). У деяких варіантах здійснення, мутагенез включає в себе хімічний мутагенез (наприклад, що передбачає обробку насіння етилметансульфонатом (EMS). Різні способи селекції рослин є також застосовними в забезпеченні рослин, що мають ознаки винаходу, і описані тут детальніше нижче. Як описано тут нижче, конкретні аспекти прикладів даного винаходу забезпечують генетичну і біохімічну характеристику мутантної рослини Arabidopsis зі зменшеною десатурацією в жирних кислотах насіння (див. таблицю 1 прикладу 2 нижче). Ця мутантна рослина, спочатку ідентифікована і названа DH4 (7), не відрізнялася від рослин Co1-0 її батьківського дикого типу, що вирощуються за стандартних умов. Автори цього винаходу описують тут ген ROD1 (Зменшена десатурація олеату 1), що кодує PDCT, мутація якого в мутанті DH4 Arabidopsis викликає зменшені рівні десатурації олеату в оліях насіння. Алель rod1 у DH4 є єдиною рецесивною менделевською мутацією, як визначено генетичним аналізом. Як показано тут, (робочий приклад 2), дефектна активність PDCT у rod1-мутанті призводила до порушеного перенесення жирної кислоти 18:1 у фосфатидилхолін (PC) під час синтезу триацилгліцерину в насінні, що розвивається. Ці результати показують, що PDCT є головним чинником, який регулює входження ліпіду в фосфатидилхолін, в якому більшість модифікацій жирних кислот мають місце в олійному насінні. Істотним є те, що в порівнянні з мутантом fad2 (5, 7), зміна складу жирних кислот у DH4 обмежується олією насіння. Як описано в робочому прикладі 3 тут нижче, конкретні аспекти прикладів цього винаходу показують, що локус rod1 мутанта Arabidopsis DH4 опосередкував зменшену десатурацію олеату в олії насіння внаслідок зменшеного перенесення 18:1 у PC через de novo синтез із діацилгліцерину (DAG). Згідно з додатковими аспектами, описаними в прикладі 4 тут нижче, виконували витончене картирування мутанта rod1 Arabidopsis DH4, і At3g15820 (SEQ ID NO:2) був ідентифікований тут як локус мутанта rod1 (SEQ ID NO:4), і було уперше показано, що він є не тільки фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферазою (PDCT), але також PDCT, яка високо експресується в насінні, що розвивається, із найвищим рівнем на стадії 6 розвитку насіння, яка співпадає з максимальною стадією відкладення про запас. Істотно, що At3g15820 (SEQ ID NO:2) був раніше анотований як можливий білок, подібний до фосфатази фосфатидної кислоти типу 2 (PAP2)-like protein. Однак, несподівано, після аналізу авторами даного винаходу, він не виявив сильної гомології з відомими охарактеризованими генами РАР в Arabidopsis (AtLPP1, AtLPP2 і AtLPP3) (13, 14), і був зроблений висновок, що він кодує іншу функцію. Автори цього винаходу тестували ROD1 на активність PDCT, експресією кДНК At3g15820 під контролем промотору GAL1, що індукується в подвійному мутантному штамі дріжджів HJ091 (17), позбавленому всіх CDP-холін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферазних активностей. Як описано детально тут (приклад 4), ці результати вказують на те, що ROD1 не має РАфосфатазної активності, і по суті підтверджують, що ROD1 швидше додає активність PDCT, що 4 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 узгоджується з тим фактом, що мутант ROD1 є дефектним у синтезі РС у насінні, що розвивається. Згідно з додатковими аспектами, як описано в прикладі 5 тут нижче, були ідентифіковані ортологи ROD1 (At3g15820), які мають значну гомологію/ідентичність послідовності. Таблиці 2 і 3 приклади 5 показують нуклеотидну схожість (% ідентичність) і схожість (% ідентичність) послідовності білка, відповідно, для ортологів ROD1 із Brassica (SEQ ID NО:6; SEQ ID NO:7), моху (SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17), ялини (SEQ ID NO:14; SEQ ID NO:15), винограду (SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:13), рису (SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11) і рицини (SEQ ID N0:8; SEQ ID N0:9), що виявляють діапазон ідентичності нуклеїнових кислот від приблизно 46 до 80 % і діапазон ідентичності послідовностей білка від приблизно 42 до 85 %. Згідно з наступними аспектами, як описано тут у прикладі 6 нижче, уніген Bna.6194 Brassica napus ідентифікований як справжній гомолог ROD1 Arabidopsis (At3g15820). Автори цього винаходу назвали Bna.6194 геном BnROD1. Кількісна ЗТ-ПЛР показала, що BnROD1 високо експресується в насінні каноли, яке розвивається. Brassica napus є амфідиплоїдом, що включає в себе два субгеноми Brassica rapa і Brassica oleracea. Зіставлення послідовностей також дозволяє передбачити, що BnROD1 може бути справжнім гомологом унігена Bra.2038 Brassica rapa і ES948687 Brassica oleracea. Згідно з наступними аспектами, як описано тут у прикладі 7 нижче, біологічні матеріали (наприклад, олії насіння рослин), забезпечені тут, які містять відносно високі концентрації жирів із довгим ланцюгом із помірною ненасиченістю, забезпечують поліпшені початкові матеріали для одержання біодизельного палива і споріднених продуктів, а також харчових олій. Конкретні переважні прикладові варіанти Конкретні аспекти забезпечують спосіб регуляції ненасиченості жирних кислот в олії насіння, що передбачає: одержання рослини, що несе олійне насіння, і модуляцію експресії або активності принаймні однієї фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифіковані стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. У деяких варіантах здійснення, модуляція експресії або активності принаймні однієї з PDCT передбачає знижувальну регуляцію експресії або активності, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується або зменшується. Переважно, цей спосіб передбачає диференціальну регуляцію ненасиченості жирних кислот в олії насіння щодо ненасиченості жирних кислот в одному або декількох мембранних ліпідах. Переважно, ненасиченість жирних кислот в олії насіння щодо ненасиченості жирних кислот в одному або декількох мембранних ліпідах зменшується диференціально в олії насіння. У конкретних варіантах здійснення, принаймні одна PDCT містить принаймні одну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO:3, послідовності, що має принаймні 46 %, принаймні 48 %, принаймні 58 %, принаймні 64 %, принаймні 71 % або принаймні 85 % ідентичність послідовності з нею, і її PDCT-активні частини. У деяких варіантах здійснення, ця принаймні одна PDCT містить принаймні одну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO:7, 9, 11, 13, 15, 17, і її PDCT-активні частини. У деяких варіантах здійснення, модуляція експресії або активності цієї принаймні однієї PDCT передбачає застосування принаймні одного зі способів мутагенезу або рекомбінантних ДНК, що включають у себе, але що не обмежуються ними, застосування принаймні сайленсингу генів, антисмислових способів, способів із використанням короткої інтерферуючої РНК (siRNA), трансгенних способів. Додаткові аспекти забезпечують спосіб одержання рослини, що продукує олійне насіння, або її частини, що передбачає передачу в зародкову плазму сорту рослини, що продукує олійне насіння, мутації або генетичної зміни, яка модифікує експресію або активність принаймні однієї PDCT в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. Конкретні варіанти здійснення цього способу передбачають: забезпечення зародкової плазми сорту рослини, що продукує олійне насіння; обробку цієї зародкової плазми мутагеном для одержання мутагенізованої зародкової плазми; відбір з цієї мутагенізованої зародкової плазми насінини рослини, що продукує олійне насіння, що містить генотип, зумовлений цим мутагеном, який модифікує експресію або активність принаймні однієї фосфатидилхолін:діацилгліцеролхолінфосфотрансферази (PDCT) в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, де рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння є модифікованим щодо олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння; і вирощування з цієї насінини рослини, що продукує олійне насіння. У конкретному здійсненні 5 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цього способу, одержання мутагенізованої зародкової плазми передбачає одержання мутації принаймні однієї послідовності фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT), яка модифікує експресію або активність в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. Додаткові варіанти здійснення включають у себе рослину, що виробляє олійне насіння, або її частину, що містить мутацію або генетичну зміну, яка модифікує експресію або активність принаймні однієї фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. Хоч ця мутація або генетична зміна можуть бути мутацією або генетичною зміною, яка модулює експресію і/або активність PDCT прямо або опосередковано, у конкретних аспектах ця мутація включає в себе мутацію принаймні однієї послідовності PDCT, яка модифікує її експресію або активність в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. У деяких аспектах, ця рослина, що продукує олійне насіння, може бути іншою, ніж Arabidopsis. Переважно, у таких рослинах модуляція експресії або активності принаймні однієї PDCT включає в себе знижувальну регуляцію експресії або активності, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії насіння модифікується або зменшується. Переважно, модуляція експресії або активності включає в себе диференціальну регуляцію ненасиченості жирних кислот в олії насіння щодо ненасиченості жирних кислот в одному або декількох мембранних ліпідах. Конкретні варіанти рослин містять дві або більше різних мутацій або генетичних змін, які модифікують рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння, причому принаймні одна з цих двох або більше різних мутацій або одна з цих двох або більше змін є мутацією або генетичною зміною, яка модифікує експресію або активність принаймні однієї фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається. У конкретних варіантах таких рослин, принаймні одна з цих двох або більше різних мутацій є мутацією десатурази FAD2, яка зменшує або елімінує активність або кількість FAD2 у насінні або насінні, що розвивається. У деяких аспектах, ця принаймні одна PDCT містить принаймні одну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO:3, послідовності, що має принаймні 46 %, принаймні 48 %, принаймні 58 %, принаймні 64 %, принаймні 71 % або принаймні 85 % ідентичність послідовності з нею, і її PDCT-активні частини. У конкретних варіантах здійснення, ця принаймні одна PDCT містить принаймні одну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NOS:7, 9, 11, 13, 15, 17, і її PDCT-активні частини. Додаткові аспекти забезпечують насіння чистої лінії, утворене з рослин, що продукують олійне насіння, або їхніх частин, забезпечених тут. Додаткові аспекти забезпечують олію, зроблену з рослин, що продукують олійне насіння, або їхніх частин, забезпечених тут. Інші додаткові варіанти здійснення забезпечують паливо на основі, принаймні частково, олії, зробленої з рослин, що продукують олійне насіння або їх частин, забезпечених тут. Рослини і поліпшення сортів рослин Конкретні аспекти забезпечують рослину, що виробляє олійне насіння, що містить мутацію або генетичну модифікацію, яка модифікує експресію або активність принаймні однієї фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, де ці рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. Хоча ця мутація або генетична модифікація може бути будь-якою мутацією або модифікацією, яка модифікує експресію і/або активність PDCT, у переважному аспекті ця мутація включає в себе мутацію принаймні однієї послідовності фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази PDCT, яка модифікує її експресію або активність в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. Різні способи поліпшення сортів рослин також є застосовними в створенні корисних сортів рослин на основі таких мутацій або генетичних модифікацій. Селекція рослин 6 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Додаткові аспекти включають у себе способи для застосування, у поліпшенні сортів рослин, рослини, що продукує олійне насіння, що має мутацію, яка модифікує експресію або активність принаймні однієї фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) (забезпеченої тут) в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. Одним таким варіантом здійснення є спосіб схрещування конкретного PDCT-мутантного сорту з іншим сортом цієї рослини з утворенням популяції першої генерації F1 рослин. Ця популяція першої генерації F1 рослин, одержана цим способом, є також варіантом цього винаходу. Ця перша генерація популяції F1 рослин буде містити по суті повний набір алелів цього конкретного PDCT-мутантного сорту. Фахівець зі звичайною кваліфікацією в даній галузі зможе використати або керівництва з селекції, або молекулярні способи для ідентифікації конкретної F1-рослини, одержаної з використанням цього конкретного PDCT-мутантного сорту, і будь-яка така індивідуальна рослина також включена в цей винахід. Ці варіанти здійснення включають у себе також застосування трансгенних конверсій або конверсій зворотного схрещування конкретних PDCT-мутантних сортів для одержання рослин F1 першої генерації. Інші додаткові аспекти включають у себе спосіб розвитку конкретного PDCT-мутантної рослини-нащадка, що передбачає схрещування конкретного PDCT-мутантного сорту з другою рослиною, і виконання способу поліпшення сорту (селекції) також є варіантом цього винаходу. Загальні способи поліпшення сортів і селекції Огляд. Поліпшення сортів рослин є генетичною маніпуляцією над рослинами. Завданням поліпшення сортів рослин є виведення нових, унікальних і поліпшених сортів рослин. У практичному застосуванні програми поліпшення сортів рослин і як обговорюється тут детальніше нижче, селекціонер спочатку вибирає і схрещує дві або більше батьківських ліній із подальшим "самоопиленням", що повторюється, і відбором, з одержанням численних нових генетичних комбінацій. Селекціонер може теоретично генерувати більйони різних генетичних комбінацій за допомогою схрещування, "самоопилення" і природно індукованих мутацій. Селекціонер не має прямого контролю на клітинному рівні, і, отже, два селекціонери ніколи не розвинуть точно одну і ту ж лінію. Кожний рік, рослинник-селекціонер відбирає зародкову плазму для поліпшення наступної генерації. Ця зародкова плазма може бути вирощена за унікальних і різних географічних, кліматичних і ґрунтових умов, і подальші відбори можуть проводитися під час і в кінці вегетаційного періоду. Належне тестування може детектувати великі дефекти і встановлювати рівні переваги або поліпшення в порівнянні з існуючими сортами. Нарівні з виявленням поліпшеної продуктивності, бажано, щоб існувала потреба в новому сорті. Цей новий сорт повинен бути оптимально сумісним із промисловими стандартами або створювати новий ринок. Введення нового сорту може спричинити додаткові витрати для насінника, фермера, власника виробництва і споживача, на особливу рекламу і маркетинг, змінені технології виробництва насіння і комерційного виробництва та утилізацію нового продукту. Тестування, що передує випуск нового сорту, повинно враховувати витрати на дослідження і розвиток, а також технічну перевагу кінцевого сорту. В ідеалі, повинна бути створена можливість легкого та економічного одержання насіння. Термін "гомозиготна рослина" визначається тут як рослина з гомозиготними генами в 95 % або більше його локусів. Термін "інбредна" стосується в даному контексті гомозиготної рослини або колекції гомозиготних рослин. Вибір способів поліпшення сортів або селекції. Вибір способів поліпшення сортів або селекції залежить від способу репродукції рослини, успадкованості ознаки, що поліпшується, (ознак, що поліпшуються), і типу сорту, що використовується комерційно (наприклад, гібридний сорт F1, сорт чистої лінії і т.ін.). Для високоуспадковуваних ознак, вибір переважних індивідуальних рослин, що оцінюються в єдиному місцеположенні, буде ефективним, у той час як для ознак із низькою успадкованістю селекція повинна бути заснована на середніх величинах, одержаних з оцінювань сімейств споріднених рослин, що повторяються. Комплексність успадкування також впливає на вибір способу розведення. Поліпшення сорту звичайно починається з перехресної гібридизації двох генотипів ("перехресного схрещування"), кожен з яких має одну або декілька бажаних характеристик, які відсутні в іншому з них, або які доповнюють інший із них. Якщо дві вихідні рослини не забезпечують всі бажані характеристики, можуть бути включені інші джерела виконанням більшої кількості схрещувань. У кожній успішній дочірній генерації (наприклад, F1F2; F2F3; F3F4; F4F5, і т.ін.), рослини "самоопилюються" для збільшення гомозиготності цієї лінії. Звичайно в програмі поліпшення 7 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сорту для одержання гомозиготної рослини практикуються п'ять або більше генерацій селекції і "самоопилення". Кожна програма поліпшення сорту рослин повинна включати в себе періодичне, об'єктивне оцінювання ефективності процедури поліпшення сорту. Критерії оцінювання варіюються залежно від завдання і цілей, але повинні включати в себе збільшення (приріст) від селекції з розрахунку на рік на основі порівнянь із придатним стандартом, загальну кількість поліпшених селекціонованих ліній і кількість успішних сортів, одержана на одиницю витрат на виробництво (наприклад, на рік, на витрачені долари і т.ін.). Перетворення за допомогою зворотного схрещування Один додатковий варіант включає в себе перетворення зворотним схрещуванням (або є перетворенням зворотним схрещуванням) рослини, що продукує олійне насіння, що містить мутацію, яка модифікує експресію або активність принаймні однієї фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) (забезпеченої тут) в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. Перетворення зворотним схрещуванням має місце, коли ДНК-послідовності вводять за допомогою традиційних (не трансформацією) способів розведення, таких як зворотне (поворотне) схрещування. ДНКпослідовності, що природно-зустрічаються, або трансгени, можуть бути введені з використанням цих традиційних способів поліпшення сорту. Бажані ознаки, які переносять за допомогою цього способу, включають у себе, але не обмежуються ними, поліпшення харчування, промислові поліпшення, стійкість до хвороб, стійкість до комах, стійкість до гербіцидів, агрономічні поліпшення, поліпшення якості зерна, восковидний крохмаль, збільшення поліпшення сорту і чоловічу стерильність. Наступний варіант включає в себе спосіб (або є способом) розвитку перетвореної зворотним схрещуванням рослини, який передбачає зворотне схрещування з такими PDCT-мутаціями, яке повторяється. Кількість зроблених зворотних схрещувань може дорівнювати 2, 3, 4, 5, 6 або більше, і конкретна кількість зворотних схрещувань, що використовуються буде залежати від генетики батьківської рослини-донора і від того, чи використовуються в програмі зворотного схрещування молекулярні маркери. По суті виведені сорти Іншим варіантом здійснення цього винаходу є по суті виведений сорт рослини, яка продукує олійне насіння, що містить мутацію, яка модифікує експресію або активність принаймні однієї фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) (забезпеченої тут) в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. Як визначено UPOV Convention, по суті виведені сорти можуть бути одержані, наприклад, селекцією природного або індукованого мутанта або сомаклонального варіанту, селекцією варіантного індивідуума з рослин вихідного сорту, зворотним схрещуванням або трансформацією з використанням генної інженерії. По суті виведений сорт таких PDCT-мутантів додатково визначається як сорт, одержання якого вимагає його повторюваного застосування, або як сорт, який переважно виробляється з генотипу конкретного PDCT-мутанта. International Convention for the Protection of New Varieties of Plants, as amended on Mar. 19, 1991, Chapter V, Article 14, Section 5(с). Конструкції ДНК Даний винахід розглядає також виготовлення конструкцій ДНК (наприклад, експресуючих векторів, антисмислових конструкцій, siRNA-конструкцій і т.ін.), що включають у себе виділену послідовність нуклеїнової кислоти, що містить генетичний елемент і/або кодуючу послідовність з описаних мутантних сортів PDCT, функціонально пов'язану з регуляторними послідовностями експресії генів рослин. "Конструкції ДНК", як визначено тут, є сконструйованими (що не зустрічаються в природі) молекулами ДНК, застосовними для введення ДНК у клітині-хазяїні, і цей термін включає в себе химерні гени, експресійні касети і вектори. У даному контексті, "функціонально пов'язані" стосується зв'язування послідовностей ДНК (що включає в себе порядок цих послідовностей, орієнтацію цих послідовностей і відносне просторове розміщення різних послідовностей) таким чином, що експресується кодований білок. Способи функціонального зв'язування регуляторних послідовностей експресії з кодуючими послідовностями добре відомі в даній галузі. Див., наприклад, Maniatis et al., Molecular Cloning: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; і Sambrook et al., Molecular Cloning: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. "Регуляторними послідовностями експресії" є послідовності ДНК, що беруть участь якимнебудь чином у регуляції транскрипції або трансляції. Придатні регуляторні послідовності експресії і способи їх виготовлення і застосування добре відомі в даній галузі. 8 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Регуляторні послідовності експресії переважно включають у себе промотор. Промотор може бути індукованим або конститутивним. Він може бути таким, що природно-зустрічається, може бути складений із частин різних промоторів, що природно-зустрічаються, або може бути частково або повністю синтетичним. Посібник для конструювання промоторів забезпечений дослідженнями структури промоторів, наприклад, Harley and Reynolds, Nucleic Acids Res., 15, 2343-2361, 1987. Крім того, місцеположення промотору щодо старту транскрипції може бути оптимізоване. Див., наприклад, Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:760-764, 1979. Багато придатних промоторів для використання в рослинах добре відомі в даній галузі. Наприклад, придатні конститутивні промотори для використання в рослинах включають у себе промотори вірусів рослин, такі як промотор колімовирусу хлоротичної смугастості (стріка) арахісу (PC1SV) (Патент США № 5850019); промотори 35S і 19S із вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV) (Odell et al., I 313:3810-812, 1985); промотори генів метилтрансферази вірусу Chlorella (Патент США № 5563328); промотор повнорозмірного транскрипта з вірусу мозаїчноїхвороби норичника (FMV) (Патент США № 5378619); промотори з таких генів, як генів актину рису (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171(1990)), ген убіквітину (Christiansen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989), і (Christiansen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992), pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991), MAS (Velten et al., Embo J. 3:2723-2730, 1984), ген гістону пшениці (Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231:276-285, 1992), і Atanassova et al., Plant Journal 2:291-300, 1992), Brassica napus ALS3 (International Publication No. WO 97/41228); і промотори різних генів Agrobacterium (див. Патенти США з номерами 4771002; 5102796; 5182200 і 5428147). Придатні промотори, що індукуються для використання в рослинах, включають у себе: промотор із системи ACE1, який відповідає на мідь (Mett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:45674571, 1993): промотор гена In 2, який відповідає на бензолсульфоноамідні гербіцидні агенти (safeners) (Патент США № 5364780 і Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994) і промотор репресора Tet із Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991). Згідно з одним варіантом здійснення, промотором для використання в рослинах є промотор, який відповідає на індуковуваний агент, до якого рослини в нормі є нечутливими. Зразковим індуковуваним промотором цього типу є індуковуваний промотор з гена стероїдного гормону, транскрипційна активність якого індукується глюкостероїдним гормоном (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:10421, 1991) або застосуванням химерного активатора транскрипції, XVE, для використання в системі експресії рослин, що індукується, на основі рецептора естрогену, що активується естрадіолом (Zou et al., Plant J. 24 265-273, 2000). Інші індуковувані промотори для використання в рослинах описані в Європейському патенті № 332104, Міжнародній публікації № WO 93/21334 і Міжнародній публікації № WO 97/06269, та обговорюються в Gatz and Lenk Trends Plant Sci., 3:352-358, 1998 і Zou and Chua, Curr. Opin. Biotechnol., 11:146-151, 2000. Нарешті, можуть бути використані промотори, що складаються з частин інших промоторів, і частково або повністю синтетичні промотори. Див., наприклад, Ni et al., Plant J. 7:661-676, 1995 і Міжнародну публікацію № WO 95/14098, які описують такі промотори для використання в рослинах. Промотор може включати в себе або може бути модифікований, щоб включати в себе один або декілька енхансерних елементів. Переважно, цей промотор буде включати в себе безліч енхансерних елементів. Промотори, що містять енхансерні елементи, забезпечують більш високі рівні транскрипції в порівнянні з промоторами, які у себе їх не включають. Придатні енхансерні елементи для використання в рослинах включають у себе енхансерний елемент PC1SV (Патент США № 5850019), енхансерний елемент CaMV 35S (Патенти США з номерами 5106739 і 5164316) і енхансерний елемент FMV (Maiti et al., Transgenic Res., 6:143-156, 1997). Див. також Міжнародну публікацію № WO 96/23898 і Enhancers and Eukaryotic Expression (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1983). Для ефективної експресії, ці кодуючі послідовності переважно також функціонально пов'язані з 3-нетрансльованою послідовністю. Ця 3-нетрансльована послідовність переважно буде включати в себе послідовність термінації транскрипції і послідовність поліаденілування. 3нетрансльована ділянка може бути одержана з фланкуючих ділянок генів із Arabidopsis, вірусів рослин, рослин та інших еукаріотів. Придатні 3-нетрансльовані послідовності для застосування в рослинах включають у себе послідовності гена 35S вірусу мозаїчної хвороби цвітної капусти, гена запасного білка насіння фазеоліну, гена Е9 малої субодиниці рибулозо-1,5біфосфаткарбоксилази, гена запасного білка 7S пшениці, гена октопінсинтази і гена нопалінсинтази. Може бути необов'язково використана також 5-нетрансльована лідерна послідовність. 5нетрансльована лідерна послідовність є частиною мРНК, яка тягнеться від 5-САР-сайта до 9 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кодона ініціації трансляції. Ця ділянка мРНК є необхідною для ініціації трансляції в рослинах і відіграє роль у регуляції експресії генів. Придатна 5-нетрансльована лідерна послідовність для застосування в рослинах включає в себе послідовність вірусу мозаїчної хвороби люцерни, білка оболонки мозаїчної хвороби огірка і гена вірусу мозаїчної хвороби тютюну. Конструкція ДНК може бути "вектором". Цей вектор може містити одну або декілька систем реплікації, які дозволяють йому реплікуватися в клітинах-хазяїнах. Саморепліковані вектори включають у себе плазміди, косміди і вірусні вектори. Альтернативно, цей вектор може бути вектором, що інтегрується, який робить можливою інтеграцію в хромосому клітини-хазяїна послідовності ДНК, що кодує продукт гена стійкості до кореневої гнилизни. Цей вектор переважно має також унікальні сайти рестрикції для вбудовування ДНК-послідовностей. Якщо вектор не має унікальних сайтів рестрикції, він може бути модифікований для введення або елімінації сайтів рестрикції, щоб зробити його більш зручним для подальшого маніпулювання. Вектори, придатні для застосування в експресії нуклеїнових кислот, які, при експресії в рослині, модулюють експресію або активність принаймні однієї фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) (забезпеченої тут), в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння, включають у себе, але не обмежуються ними, pMON979, pMON977, pMON886, pCaMVCN і вектори, одержані з плазміди, що індукує пухлину (Ti) Agrobacterium tumefaciens, описаної Rogers et al., Meth. Enzymol., 153:253-277, 1987. Нуклеїнову кислоту вбудовують у цей вектор таким чином, що вона функціонально пов'язана з придатним, активним у рослині промотором. Придатні активні в рослині промотори для застосування з цими нуклеїновими кислотами, включають у себе, але не обмежуються ними, промотори CaMV35S, ACTJN, FMV35S, NOS і PCSLV. Вектори, що містять цю нуклеїнову кислоту, можуть бути інсертовані в клітину рослини з використанням різних відомих способів. Наприклад, ДНК-трансформація клітин рослин включає в себе, але не обмежується ними, Agrobacterium-опосередковану трансформацію рослин, трансформацію протопластів, електропорацію, перенесення генів у пилок, ін'єкцію в репродуктивні органи, ін'єкцію в незрілі зародки і бомбардування частинками. Ці способи описані більш повно в Патенті США № 5756290 і в особливо добре підготовленому протоколі для пшениці, описаному в Патенті США № 6153812 і посиланнях, що цитуються в ньому. Для зменшення копійності і випадкової інтеграції нуклеїнової кислоти в геном рослини можуть бути також використані сайтспецифічні системи рекомбінації. Наприклад, система Cre/lox може бути використана для опосередкування lox-сайт-специфічної рекомбінації в клітинах рослин. Цей спосіб може бути знайдений у Choi et al., Nuc.Acids Res. 28:B19, 2000. Трансгени Молекулярно-біологічні способи дозволяють виділяти і характеризувати генетичні елементи зі специфічними функціями, такими як кодування конкретних білкових продуктів. Вчені, що працюють у галузі біології рослин, виявили сильну цікавість до інженерії генома рослин для змісту та експресії чужорідних генетичних елементів або модифікованих версій природних або ендогенних генетичних елементів для зміни ознак рослини специфічним чином. Будь-які послідовності ДНК, із різних видів або з одного і того ж виду, які інсертують у геном із використанням трансформації називають сукупно "трансгенами". Були розроблені декілька способів для одержання трансгенних рослин, і цей винахід, зокрема, варіанти здійснення цього винаходу, стосується також трансформованих версій генотипів цього винаходу, і/або трансформовані версії, що містять один або декілька трансгенів, модифікують прямо або опосередковано експресію або активність принаймні однієї фосфатидилхолін:діацилгліцеролхолінфосфотрансферази (PDCT) (забезпеченої тут), в одній або декількох насінинах або насінні цієї рослини, яке розвивається, причому рівень, кількість або розподіл ненасиченості жирних кислот в олії цього насіння модифікується стосовно олії насіння рослин із нормальною експресією PDCT насіння. Були розвинені численні способи трансформації рослин, що включають у себе біологічні і фізичні протоколи трансформації рослин. Див., наприклад, Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pages 67-88. Крім того, доступні експресуючі вектори і способи культури in vitro для трансформації клітин і тканин рослин. Див., наприклад, Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pages 89-119. 10 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Найбільш переважаючі типи трансформації рослин включають у себе конструювання експресуючого вектора. Такий вектор містить послідовність ДНК, яка містить ген під контролем регуляторного елемента, наприклад, промотору, або функціонально пов'язана з регуляторним елементом, наприклад, промотором. Цей вектор може містити один або декілька генів і один або декілька регуляторних елементів. Ці елементи включають у себе, але не обмежуються ними, гени; кодуючі послідовності (у смисловій або антисмисловій орієнтації; індуковані, конститутивні і тканиноспецифічні промотори; енхансерні послідовності і сигнальні і спрямовуючі послідовності. Генетична ознака, яка була введена генною інженерією в конкретну рослину з використанням способів трансформації, могла б переміщатися в іншу лінію з використанням традиційних способів поліпшення сортів, які добре відомі в галузі поліпшення сортів. Наприклад, для переміщення трансгена з рослини, що продукує олійне насіння, в елітний сорт рослини міг би використовуватися підхід зворотного схрещування, й одержане потомство могло б містити трансген. У даному контексті, "схрещування" може стосуватися простого схрещування Х'Y, або способу зворотного схрещування, залежно від контексту. Термін "зворотне схрещування" виключає процеси самоопилення або схрещування сибсів. З трансгенними рослинами за даним винаходом, сторонній білок і/або модифікована експресія ендогенного білка або продукту (наприклад, олії) можуть бути одержані в комерційних кількостях. Таким чином, способи для селекції і розмноження трансформованих рослин, які добре відомі в даній галузі, дають безліч трансгенних рослин, які збирають загальноприйнятим способом, і потім продукт рослин може бути екстрагований із тканини, що становить інтерес, або із загальної біомаси. Екстракція білка та олії з біомаси рослин може виконуватися відомими способами, які обговорюються, наприклад, Heney and Orr, Anal. Biochem. 114:92-96, 1981. Згідно з переважним варіантом здійснення, трансгенною рослиною, що забезпечується для комерційного одержання стороннього білка, є канола (наприклад, Brassica napus або В. rapa), соя (наприклад, Glycine max) або соняшник (наприклад, Helianthus annuus). В іншому переважному варіанті здійснення, біомасою, що становить інтерес, є насіння. Може бути генерована генетична карта, первинно з використанням загального аналізу RFLP, PCR і SSR, який ідентифікує наближене хромосомне місцеположення інтегрованої молекули ДНК. Відносно зразкових методологій у зв'язку з цим, див. Glick and Thompson, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology 269-284 (CRC Press, Boca Raton, 1993). Інформація карти щодо хромосомного місцеположення застосовна для патентного захисту трансгенної рослини, що розглядається. Якщо робиться неправомірне розмноження і проводяться схрещування з іншою зародковою плазмою, карта ділянки інтеграції може бути порівняна зі схожими картами для гаданих рослин для визначення, чи має вона загальне походження з рослиною, що розглядається. Карта порівнянь може включати в себе гібридизації, RFLP, PCR, SSR і секвенування, всі з яких є загальноприйнятими способами. Введення трансформацією трансгенів, що становлять агрономічний інтерес У трансформованих рослинах можуть бути експресовані гени, що становлять агрономічний інтерес. Наприклад, рослини можуть бути генетично сконструйовані для експресії різних фенотипів, що становлять агрономічний інтерес, або, альтернативно, трансгени можуть бути введені в рослину схрещуванням із рослиною, яка має цей трансген. За допомогою трансформації рослини, експресія генів може бути модульована для збільшення стійкості до хвороб, стійкості до комах, стійкості до гербіцидів, стійкості до водного стресу, викликаного недоліком води, і агрономічних ознак, а також ознак якості насіння. Трансформація може бути також використана для інсертування ДНК-послідовностей, які регулюють або допомагають регулювати чоловічу стерильність. ДНК-послідовності, нативні щодо конкретних рослин, а також ненативні ДНК-послідовності можуть бути трансформовані і використані для модуляції рівнів нативних або ненативних білків. Елементи антисмислової технології, siRNA технології, різні промотори, що націлюють послідовності, енхансерні послідовності та інші ДНК-послідовності можуть бути інсертовані в конкретний геном із метою модуляції експресії білків. Багато які зразкові гени, залучені в зв'язку з цим, відомі в даній галузі. Варіанти нуклеїнових кислот і білків фосфатидилхолін:діацилгліцеролхолінфосфотрансферази (PDCT) У даному контексті, термін "біологічна активність" стосується функції поліпептиду, що включає в себе, але не обмежується ними, комплексоутворювання, димеризацію, мультимеризацію, рецептор-асоційоване зв'язування ліганду і/або ендоцитоз, рецепторасоційовану протеазну активність, фосфорилування, дефосфорилування, автофосфорилування, здатність утворення комплексів з іншими молекулами, зв'язування лігандів, каталітичну або ферментативну активність, активацію, у тому числі автоактивацію або 11 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активацію інших поліпептидів, інгібування або модуляцію функції іншої молекули, стимуляцію або інгібування трансдукції сигналів і/або клітинних реакцій, таких як проліферація клітин, міграція, диференціювання і ріст, деградація, мембранна локалізація і мембранне зв'язування. Біологічна активність може оцінюватися описаними тут аналізами і будь-якими придатними аналізами, відомими кваліфікованим у даній галузі фахівцям, що включають у себе, але що не обмежуються ними, аналізи in vitro, у тому числі аналізи на основі клітин, аналізи in vivo, у тому числі аналізи в моделях конкретних захворювань тварин. Переважно, фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансфераза (PDCT) (або її варіанти) містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3 (або SEQ ID NO:5, що має від 1 до приблизно 3, до приблизно 5, до приблизно 10 або до приблизно 20 консервативних амінокислотних замін), або фрагмент послідовності SEQ ID NO:3 (або SEQ ID NO:5, що має від 1 до приблизно 3, до приблизно 5, до приблизно 10 або до приблизно 20 консервативних амінокислотних замін). Переважно, фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансфераза (PDCT), або її варіант, містить послідовність SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:5 або її варіант, що містить консервативні амінокислотні заміни. Функціональними варіантами фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) є білки, які виявляють одну або декілька біологічних активностей (або позбавлені однієї або декількох біологічних активностей) фосфатидилхолін:діацилгліцеролхолінфосфотрансферази (PDCT). У даному контексті, термін "ROD1 або PDCT", означає алель ROD1, що природнозустрічається або PDCT, що виявляється в рослинах, які кодують функціональний білок ROD1 або PDCT. На відміну від цього, термін "мутантний ROD1 або PDCT" стосується в даному контексті алеля ROD1 або PDCT, який не кодує функціональний білок ROD1 або PDCT, тобто алель ROD1 або PDCT, що кодує нефункціональний білок ROD1 або PDCT, який стосується в даному контексті білка ROD1 або PDCT, що не має біологічної активності або має значуще зменшену біологічну активність у порівнянні з відповідним функціональним білком ROD1 або PDCT дикого типу, або взагалі не кодуючому білок ROD1 або PDCT. Такий "мутантний алель ROD1 або PDCT" (що також називають "повним нокаутом" або "нуль”-алелем) є алель ROD1 або PDCT дикого типу, який містить одну або декілька мутацій у його послідовності нуклеїнових кислот, за допомогою чого ця мутація (ці мутації) переважно призводять до значуще зменшеної (абсолютної або відносної) кількості функціонального білка ROD1 або PDCT у цій клітині in vivo. Мутантні алелі кодуючих білок ROD1 або PDCT послідовностей нуклеїнових кислот позначають тут як "rod1 або pdct". Мутантні алелі можуть бути або алелями "природного мутанта", які є мутантними алелями, що виявляються в природі (наприклад, продукованими спонтанно без застосування людиною мутагенів), або "індукованих мутантними алелями", які індуковані втручанням людини, наприклад, за допомогою мутагенезу. У даному контексті, термін "ROD1 або PDCT дикого типу" означає алель ROD1, що природно-зустрічається або PDCT, що виявляється в рослинах, які кодують функціональний білок ROD1 або PDCT. На відміну від цього, у конкретних аспектах, термін "мутантний ROD1 або PDCT" стосується в даному контексті алеля ROD1 або PDCT, який не кодує функціональний білок ROD1 або PDCT, тобто алель ROD1 або PDCT, що кодує нефункціональний білок ROD1 або PDCT, який, у даному контексті, стосується білка ROD1 або PDCT, що не має біологічної активності або що має значуще зменшену біологічну активність у порівнянні з відповідним функціональним білком ROD1 або PDCT дикого типу, або взагалі що не кодує білок ROD1 або PDCT. Таким "мутантним алелем ROD1 або PDCT" (який також називають "повним нокаутом" або "нуль”-алелем) є алель ROD1 або PDCT дикого типу, який містить одну або декілька мутацій у його послідовності нуклеїнових кислот, за допомогою чого ця мутація (ці мутації) переважно призводять до значуще зменшеної (абсолютної або відносної) кількості функціонального білка ROD1 або PDCT у цій клітині in vivo. Мутантні алелі кодуючих білок ROD1 або PDCT послідовностей нуклеїнових кислот позначають тут як "rod1 або pdct" herein. Мутантні алелі можуть бути або алелями "природного мутанта", які є мутантними алелями, що виявляються в природі (наприклад, продукованими спонтанно без застосування людиною мутагенів), або "індукованих мутантними алелями", які індуковані втручанням людини, наприклад, за допомогою мутагенезу. Для аспектів даного винаходу застосовуються варіанти фосфатидилхолін:діацилгліцеролхолінфосфотрансферази (PDCT). Варіанти можуть бути такими, що природно-зустрічаються і що не зустрічаються природно. Варіанти, що природно-зустрічаються (наприклад, поліморфізм), виявляються в різних видах і містять амінокислотні послідовності, які по суті ідентичні до амінокислотної послідовності, показаної в SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO:5. Видові гомологи цього білка можуть бути одержані з використанням субгеномних полінуклеотидів цього винаходу, як 12 UA 108597 C2 5 10 15 20 описано нижче, для приготування придатних зондів або праймерів для скринінгу бібліотек експресії кДНК із інших видів, таких як миші, мавпи, дріжджі або бактерії, ідентифікацією кДНК, які кодують гомологи цього білка, та експресією цієї кДНК, як відомо в даній галузі. Тут забезпечені ортологи. Варіанти, що не зустрічаються в природі, які зберігають ті ж самі біологічні активності, що і варіанти білка, що природно-зустрічаються (або позбавлені їх), також включені тут. Переважно варіанти, що природно-зустрічаються або що не зустрічаються в природі, мають амінокислотні послідовності, які є принаймні на 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більш ніж на 99 % ідентичними до амінокислотної послідовності, показаної у SEQ ID NO:3 або 5. Переважніше, ці молекули є принаймні на 98 %, 99 % або більш ніж на 99 % ідентичними. Відсоткову ідентичність визначають із використанням будь-якого способу, відомого в даній галузі. Не обмежуючим прикладом є алгоритм пошуку гомології Сміта-Уотермана, що використовує пошук афінного пропуску з пенальті (штрафом) відкриття 12 і пенальті (штрафом) подовження пропуску 1. Алгоритм пошуку гомології Сміта-Уотермана описаний у Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482-489, 1981. У даному контексті, термін "амінокислотний залишок" стосується амінокислоти, що утворюється після хімічного розщеплення (гідролізу) поліпептиду в його пептидних зв'язках. Описані тут амінокислотні залишки звичайно знаходяться в ізомерній L-формі. Залишки в ізомерній D-формі можуть замінювати будь-який L-амінокислотний залишок, поки цей поліпептид зберігає бажану функціональну властивість. NH2 стосується вільної аміногрупи, що знаходиться на аміно-кінці поліпептиду. СООН стосується вільної карбокси-групи, що знаходиться на карбоксильному кінці поліпептиду. Зі збереженням стандартної номенклатури поліпептидів, описаної в J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) і прийнятої в 37 C.F.R. §§ 1.8211.822, абревіатури для амінокислотних залишків показані в таблиці 2: 25 ТАБЛИЦЯ 2 Таблиця відповідності СИМВОЛ 1-літерний Y G F M А S I L Т V Р K Н Q Е Z W R D N У С X 30 АМІНОКИСЛОТА Тирозин Гліцин Фенілаланін Метіонін Аланін Серин Ізолейцин Лейцин Треонін Валін Пролін Лізин Гістидин Глутамін Глутамінова кислота Glu і/або Gln Триптофан Аргінін Аспарагінова кислота Аспарагіни Asn і/або Asp Цистеїн Невідома або інша 3-літерний Tyr Gly Phe Met Ala Ser Ile Leu Thr Val Pro Lys His Gln Glu Glx Trp Arg Asp Asn Asx Cys Xaa Потрібно зазначити, що всі послідовності амінокислотних залишків, представлені тут формулою, мають ліву або праву орієнтацію в загальноприйнятому напрямку аміно-кінець – карбоксильний кінець. Крім того, фраза "амінокислотний залишок" визначається як такий, що 13 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включає в себе амінокислоти, перераховані в таблиці відповідності, і модифіковані і незвичайні амінокислоти, такі як амінокислоти, наведені в 37 CF. R. §§ 1.821-1.822, і включені тут як посилання. Крім того, потрібно зазначити, що тире на початку або кінці послідовності амінокислотних залишків означає пептидний зв'язок із додатковою послідовністю одного або декількох амінокислотних залишків або з аміно-кінцевою групою, такою як NH2, або з карбоксильною кінцевою групою, такою як COOH. Посібник з визначення, які амінокислотні залишки можуть бути замінені, інсертовані або делетовані без знищення біологічної або імунологічний активності, може бути знайдений із використанням комп'ютерних програм, добре відомих у даній галузі, таких як програмне забезпечення DNASTAR. Переважно, амінокислотні зміни у варіантах білків, описаних тут, є консервативними амінокислотними змінами, тобто замінами однаково заряджених або незаряджених амінокислот. Консервативна амінокислотна зміна включає в себе заміну однієї з сімейства амінокислот, які є спорідненими в їхніх бічних ланцюгах. Амінокислоти, що природно-зустрічаються, звичайно розділені на чотири сімейства: кислі (аспартат, глутамат), основні (лізин, аргінін, гістидин); неполярні (аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан) і незаряджені полярні (гліцин, аспарагін, глутамін, цистин, серин, треонін, тирозин) амінокислоти. Фенілаланін, триптофан і тирозин класифікуються іноді разом як ароматичні амінокислоти. Переважно, амінокислотні зміни у варіантах поліпептиду свинячої фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) є консервативними амінокислотними змінами, тобто замінами однаково заряджених або незаряджених амінокислот. Резонно чекати, що ізольована заміна лейцину ізолейцином або валіном, аспартату глутаматом, треоніну серином, або подібна заміна амінокислоти структурно спорідненою амінокислотою не буде сильно впливати на біологічні властивості одержаного варіанту. Властивості і функції білка поліпептиду фосфатидилхолін:діацилгліцеролхолінфосфотрансферази або варіантів поліпептиду є властивостями того ж самого типу, що і властивості білка, що містить амінокислотну послідовність, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною в SEQ ID NO:3 і 5, хоча властивості і функції варіантів можуть відрізнятися за їхнім ступенем. Варіанти поліпептиду фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT), описані тут, включають у себе глікозильовані форми, агрегувальні кон'югати з іншими молекулами і ковалентні кон'югати з неспорідненими хімічними частинами молекул (наприклад, пегільованими молекулами). Ковалентні варіанти можуть бути одержані зв'язуванням функціональних груп із групами, які виявляються в амінокислотному ланцюгу або в N- або Скінцевому залишку, як відомо в даній галузі. Варіанти включають у себе також алельні варіанти, видові варіанти і мутеїни. Укорочення або делеції ділянок, які впливають або не впливають на функціональну активність, також є варіантами. Ковалентні варіанти можуть бути одержані зв'язуванням функціональних груп із групами, які виявляються в амінокислотному ланцюгу або в N- або С-кінцевому залишку, як відомо в даній галузі. Субпопуляція мутантів, що називанють мутеїнами, є групою поліпептидів, в якій нейтральні амінокислоти, такі як серини, замінюють залишки цистеїну, які не беруть участь у дисульфідних зв'язках. Ці мутанти можуть бути стабільними протягом більш широкого діапазону температур, ніж нативні секретовані білки (див., наприклад, Mark et al, Патент США № 4959314). У даній галузі буде зрозуміло, що деякі амінокислотні послідовності поліпептидів фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) цього винаходу можуть варіюватися без значущої дії на структуру або функцію цього білка. Якщо передбачаються такі відмінності в послідовності, потрібно пам'ятати, що на цьому білку є критичні зони, які визначають активність. Загалом, можна замінювати залишки, які утворюють третинну структуру, за умови, що використовуються залишки, що виконують схожу функцію. В інших випадках, тип залишку може бути абсолютно неважливим, якщо ця зміна відбувається в некритичній ділянці цього білка. Заміна амінокислот може також змінювати селективність зв'язування ліганду з рецепторами поверхні клітин (Ostade et al., Nature 361:266-268, 1993). Таким чином, поліпептиди фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) цього винаходу можуть включати в себе амінокислотні заміни, делеції або додавання або з природних мутацій, або внаслідок маніпулювання, що виконується людиною. Амінокислоти в поліпептидах фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) даного винаходу, які є незамінними для функції, можуть бути ідентифіковані способами, відомими в даній галузі, такими як сайт-спрямований мутагенез або аланін-скануючий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Остання процедура вводить окремі мутації аланіну при кожному залишку в цій молекулі. Потім одержані мутантні молекули тестують на біологічну активність, таку як зв'язування з природним або синтетичним партнером 14 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язування. Сайти, які є критичними для зв'язування ліганд-рецептора, можуть бути також визначені структурним аналізом, таким як кристалізація, ядерний магнітний резонанс або фотоафінне мічення (Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) і de Vos et al. Science 255:306312 (1992)). Як зазначалося, зміни в конкретних аспектах є переважно змінами мінорного характеру, наприклад, консервативні амінокислотні заміни, які не впливають значуще на фолдинг або активність цього білка. Звичайно, кількість амінокислотних замін, яку міг би проводити кваліфікований у даній галузі фахівець, залежить від багатьох чинників, у тому числі чинників, описаних тут. Інші варіанти включають у себе неконсервативні заміни. Взагалі кажучи, кількість замін для будь-якого конкретного поліпептиду фосфатидилхолін:діацилгліцеролхолінфосфотрансферази (PDCT) повинна бути не більшою, ніж 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5 або 3. Злиті білки Можуть бути також сконструйовані злиті білки, що містять білки або поліпептидні фрагменти поліпептиду фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT). Злиті білки є застосовними для генерування антитіл проти амінокислотних послідовностей і для застосування в різних системах націлення та аналізу. Наприклад, злиті білки можуть бути використані для ідентифікації білків, які взаємодіють із поліпептидом фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) цього винаходу або які перешкоджають його біологічній функції. Для цієї мети можуть бути також використані фізичні способи, такі як афінна хроматографія білків або аналізи на основі бібліотек на взаємодії білокбілок. Такі способи добре відомі в даній галузі і можуть бути також використані як скринінги лікарські засоби. Можуть бути використані злиті білки, що містять сигнальну послідовність. Злитий білок містить два білкових сегменти, злитих разом за допомогою пептидного зв'язку. Амінокислотні послідовності для застосування в злитих білках цього винаходу можуть використати амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3 або 5, або можуть бути одержані з біологічно активних варіантів SEQ ID NO:3 або 5, таких як описані тут. Перший білковий сегмент може включати в себе повнорозмірний поліпептид фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT). Інші перші білкові сегменти можуть складатися з приблизно функціональних частин SEQ ID NO:3 і 5. Другий білковий сегмент може бути повнорозмірним білком або поліпептидним фрагментом. Білки, що звичайно використовуються в конструюванні злитих білків, включають у себе галактозидазу, -глюкуронідазу, зелений флуоресцентний білок (GFP), автофлуоресцентні білки, у тому числі синій флуоресцентний білок (BFP), глутатіон-S-трансферазу (GST), люциферазу, пероксидазу хріну (HRP) і хлорамфенікол-ацетилтрансферазу (CAT). Додатково, у конструкціях злитих білків можуть бути використані епітопні мітки, ті, що включають у себе гістидинові (His) мітки, FLAG-мітки, мітки гемаглютиніну грипу (HA), Myc-мітки, VSV-G-мітки і тіоредоксинові (Trx) мітки. Інші злиті конструкції можуть включати в себе мальтозузв'язуючий білок (MBP), S-мітку, зливання Lex-ДНК-зв'язуючий домен (DBD), зливання GAL4-ДНКзв'язуючий домен і зливання з вірусними білками. Це зливання може бути одержане, наприклад, ковалентним зливанням двох білкових сегментів або стандартними у даній галузі процедурами молекулярної біології. Для одержання злитих білків можуть бути використані способи рекомбінантних ДНК, наприклад, одержанням ДНК-конструкції, яка містить кодуючу ділянку для послідовності білка SEQ ID NOS:3 і 5 у правильній рамці зчитування з полінуклеотидом, що кодує другий білковий сегмент, і експресією цієї ДНК-конструкції в клітині-хазяїні, як відомо в даній галузі. Багато які набори для конструювання злитих білків доступні з компаній, які забезпечують дослідницькі лабораторії засобами для експериментів, у тому числі, наприклад, Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), Clontech (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL International Corporation (MIC; Watertown, MA), and Quantum Biotechnologies (Montreal, Canada; 1-888-DNA-KITS). Послідовності нуклеїнових кислот, кодуючі мутантні білки ROD1 або PDCT Іншим варіантом цього винаходу є послідовності нуклеїнових кислот, що містять одну або декілька делецій, інсерцій або замін щодо послідовностей нуклеїнових кислот дикого типу, як і фрагменти таких мутантних молекул нуклеїнових кислот. Такі мутантні послідовності нуклеїнових кислот (що названі послідовностями ROD1 або PDCT), можуть бути генеровані і/або ідентифіковані з використанням різних відомих способів, як описано додатково нижче. Знову, такі молекули нуклеїнових кислот забезпечені як в ендогенній формі, так і у виділеній формі. В одному варіанті здійснення, мутація (мутації) призводить до однієї або декількох змін (делецій, інсерцій і/або замін) в амінокислотній послідовності білка, що кодується ROD1 або 15 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 PDCT (тобто ця мутація не є "мутацією, що мовчить"). В іншому варіанті здійснення, ця мутація (ці мутації) у послідовності нуклеїнової кислоти призводять до значуще зменшеної або повністю знищеної біологічної активності кодованого білка ROD1 або PDCT стосовно білка дикого типу. Таким чином, ці молекули нуклеїнових кислот можуть містити одну або декілька мутацій, таких як: (a) "місенс-мутація", яка є зміною в послідовності нуклеїнової кислоти, яка призводить до заміни однієї амінокислоти іншою амінокислотою; (b) "нонсенс-мутація" або "мутація СТОП-кодона", яка є зміною в послідовності нуклеїнової кислоти, яка призводить до введення передчасного СТОП-кодона і, отже термінації трансляції (призводячи до укороченого білка); гени рослин містять стоп-кодони "TGA" (UGA у РНК), "TAA" (UAA у РНК) і "TAG" (UAG у РНК); отже, будь-яка нуклеотидна заміна, інсерція, делеція, яка призводить до одного з цих кодонів, що знаходиться в зрілій трансльованій мРНК (у рамці зчитування) буде термінувати трансляцію; (с) "інсерційна" мутація однієї або декількох амінокислот внаслідок того, що в кодуючій послідовності цієї нуклеїнової кислоти були додані один або декілька кодонів; (d) "делеційна мутація" однієї або декількох амінокислот внаслідок того, що в кодуючій послідовності цієї нуклеїнової кислоти були делетовані один або декілька кодонів; (е) "мутація зі зсувом рамки", що призводить до трансляції цієї послідовності нуклеїнової кислоти в іншій рамці зчитування праворуч від цієї мутації. Мутація зі зсувом рамки може мати різні причини, такі як інсерція, делеція або подвоєння одного або декількох нуклеотидів. Бажано, щоб мутація (мутації) у послідовності нуклеїнової кислоти призводила переважно до мутантного білка, що містить значуще зменшену біологічну активність або до відсутності біологічної активності in vivo або до відсутності утворення білка. По суті, будь-яка мутація, яка призводить до білка, що містить принаймні одну амінокислотну інсерцію, делецію і/або заміну щодо білка дикого типу, може призводити до значуще зменшеної біологічної активності або до відсутності біологічної активності. Однак зрозуміло, що мутації в певних частинах цього білка з більшою імовірністю призводять до зменшеної функції мутантного білка ROD1 або PDCT, наприклад, мутації, що призводять до укорочених білків, за допомогою яких істотні частини функціональних доменів відсутні. Таким чином, в одному варіанті здійснення, забезпечені послідовності нуклеїнових кислот, що містять один або декілька будь-яких типів мутацій, описаних вище. В іншому варіанті здійснення, забезпечені послідовності ROD1 або PDCT, що містять одну або декілька мутацій стоп-кодона (нонсенс-мутацій), одну або декілька місенс-мутацій і/або одну або декілька мутацій зі зсувом рамки. Забезпечені будь-яка з вищезгаданих мутантних послідовностей нуклеїнових кислот per se (у виділеній формі), як і рослини, і частини рослин, що містять такі послідовності ендогенно. У таблицях, наведених тут нижче, описані найбільш переважні алелі ROD1 або PDCT. Нонсенс-мутація в алелі ROD1 або PDCT є, в даному контексті, мутацією в алелі ROD1 або PDCT, за допомогою якої один або декілька стоп-кодонів трансляції введені в кодуючу ДНК і відповідну мРНК відповідного алеля ROD1 або PDCT дикого типу. Стоп-кодонами трансляції є TGA (UGA в мРНК), TAA (UAA) і TAG (UAG). Таким чином, будь-яка мутація (делеція, інсерція або заміна), яка призводить до генерування стоп-кодона в рамці зчитування в кодуючій послідовності, буде призводити до термінації трансляції та укорочення амінокислотного ланцюга. В одному варіанті здійснення, мутантний алель ROD1 або PDCT, що містить нонсенсмутацію, є алелем ROD1 або PDCT, в якому стоп-кодон у рамці зчитування введений у послідовність кодона ROD1 або PDCT заміною єдиного нуклеотиду, наприклад, мутацією CAG у TAG, TGG у TAG, TGG у TGA або CAA у TAA. В іншому варіанті здійснення, мутантний алель ROD1 або PDCT, що містить нонсенс-мутацію, є алелем ROD1 або PDCT, в якому стоп-кодон в рамці зчитування введений у послідовність кодона ROD1 або PDCT подвійною заміною нуклеотидів, наприклад, мутацією CAG у TAA, TGG у TAA або CGG у TAG або TGA. Ще в одному варіанті здійснення, мутантний алель ROD1 або PDCT, що містить нонсенс-мутацію, є алелем ROD1 або PDCT, в якому стоп-кодон в рамці зчитування введений у послідовність кодона ROD1 або PDCT потрійною заміною нуклеотидів, наприклад, мутацією CGG в TAA. Цей укорочений білок позбавлений амінокислот, кодованих цією кодуючою ДНК праворуч від цієї мутації (тобто С-кінцевої частини білка ROD1 або PDCT), і зберігає амінокислоти, кодовані цією кодуючою ДНК, зліва від цієї мутації (тобто N-кінцевої частини білка ROD1 або PDCT). Таблиці, наведені тут нижче, описують діапазон можливих нонсенс-мутацій у послідовностях ROD1 або PDCT, забезпечених тут: 16 UA 108597 C2 Таблиця 1а Потенційні мутації стоп-кодона в At-ROD1 (SEQ ID NO:1) Ген At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 At_rod1 Положення 199 199 199 226 226 226 265 265 265 325 325 457 475 475 475 481 481 481 496 496 502 502 562 562 577 577 691 691 736 736 Положення 201 201 201 228 228 228 267 267 267 327 327 459 477 477 477 483 483 483 498 498 504 504 564 564 579 579 693 693 738 738 Ініціюючий кодон TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGG CAG CAG CAA TGG TGG TGG TGG TGG TGG CGA CGA CGA CGA CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG Стоп-кодон TAG TAA TGA TGA TAG TAA TGA TAA TAG TAG TAA TAA TAA TAG TGA TAG TGA TAA TGA TAA TGA TAA TAA TAG TAG TAA TAG TAA TAG TAA Таблиця 2b Потенційні мутації стоп-кодона в ортолозі ROD1 з Brassica napus (SEQ ID NO:…) Положення 166 166 166 205 205 205 265 265 397 415 415 415 421 421 421 442 Положення 168 168 168 207 207 207 267 267 399 417 417 417 423 423 423 444 Ініціюючий кодон TGG TGG TGG TGG TGG TGG CAG CAG CAA TGG TGG TGG TGG TGG TGG CGA 17 Стоп-кодон TGA TAG TAATGA TAA TAG TAG TAA TAA TAG TGA TAA TAG TGA TAA TGA UA 108597 C2 442 502 502 517 517 631 631 676 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 444 504 504 519 519 633 633 678 CGA CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAA TAA TAA TAG TAG TAA TAA TAG TAA Очевидно, мутації не обмежуються мутаціями, показаними в наведених вище таблицях, і зрозуміло, що аналогічні мутації в стоп-кодоні можуть бути присутніми в алелях ROD1 або PDCT, інших, ніж алелі, зображені в списку послідовності і що використовуються в наведених вище таблицях. Місенс-мутацією в алелі ROD1 або PDCT є, у даному контексті, будь-яка мутація (делеція, інсерція або заміна) в алелі ROD1 або PDCT, за допомогою якої один або декілька кодонів змінюються в кодуючої ДНК і відповідної послідовності мРНК відповідного алеля ROD1 або PDCT дикого типу, призводячи до заміни однієї або декількох амінокислот у білку ROD1 або PDCT дикого типу однієї або декількома іншими амінокислотами в мутантному білку ROD1 або PDCT. Мутацією зсуву рамки в алелі ROD1 або PDCT є, у даному контексті, мутація (делеція, інсерція, подвоєння і т.ін.) в алелі ROD1 або PDCT, яка призводить до послідовності нуклеїнової кислоти, що транслюється у рамці зчитування праворуч від цієї мутації, що відрізняється. Знижувальна регуляція ROD1 У даній галузі доступні декілька способів одержання молекули РНК, що викликає сайленсинг, тобто молекули РНК, яка при експресії зменшує експресію конкретного гена або групи генів, що передбачають так звані "смислову" або "антисмислову" технології РНК. Антисмислова технологія. Так, в одному варіанті здійснення, інгібіторна РНК-молекула, що кодує химерний ген, заснована на так званій антисмисловій технології. Іншими словами, кодуюча ділянка цього химерного гена містить нуклеотидну послідовність принаймні з 19 або 20 послідовних нуклеотидів комплементу нуклеотидної послідовності ROD1 або її ортолога. Такий химерний ген може бути сконструйований функціональним зв'язуванням ДНК-фрагмента, що містить принаймні 19 або 20 нуклеотидів із кодуючого ROD1 гена або його ортолога, виділеного або ідентифікованого, як описано в іншому місці в цій заявці, у спрямованій орієнтації стосовно експресованого в рослині промотору та утворюючої 3-кінець ділянки, що бере участь у термінації і поліаденілуванні транскрипції. Технологія косупресії. В іншому варіанті здійснення, ця інгібіторна РНК-молекула, що кодує химерний ген, заснована на так званій технології косупресії. Іншими словами, кодуюча ділянка цього химерного гена містить нуклеотидну послідовність принаймні з 19 або 20 послідовних нуклеотидів нуклеотидної послідовності кодуючого ROD1 гена або її ортолога (або в деяких варіантах здійснення гена целюлозо-селективної -1,3-ендоглюканази). Такий химерний ген може бути сконструйований функціональним зв'язуванням ДНК-фрагмента, що містить принаймні 19 або 20 нуклеотидів із кодуючого ROD1 гена або його ортолога, у прямій орієнтації щодо експресованого в рослині промотору і створюючого 3-кінець ділянки, що бере участь в термінації і поліаденілуванні транскрипції. Ефективність вищезгаданих химерних генів у зменшенні експресії кодуючого ROD1 гена або його ортолога (або в деяких варіантах здійснення гена целюлозо-селективної -1,3ендоглюканази) може бути додатково збільшена включенням ДНК-елемента, який призводить до експресії аберантних, неполіаденілованих інгібіторних РНК-молекул або призводить до утримування цих інгібіторних молекул в ядрі цих клітин. Одним таким ДНК-елементом, придатним для цієї мети, є ділянка ДНК, що кодує самосплайсуючий рибозим, описаний у WO 00/01133 (включеному тут як посилання в його повному обсязі і, зокрема, щодо його описів самосплайсуючих рибозимів). Іншим таким ДНК-елементом, придатним для цієї мети, є ДНКрайон, що кодує сигнал ядерної локалізації або утримання РНК, описаний у PCT/AU03/00292, опублікованому у вигляді WO03/076619 (включеному як посилання). Дволанцюгова РНК (dsRNA) або інтерферуюча РНК (RNAi). Один зручний і дуже ефективний спосіб знижувальної регуляції експресії гена, що становить інтерес, використовує так звану дволанцюгову РНК (dsRNA) або інтерферуючу РНК (RNAi), описані, наприклад, у WO99/53050 (включеному тут як посилання в його повному обсязі і, зокрема, щодо його описів інтерференції РНК (RNAi)). У цій технології РНК-молекулу вводять у клітину рослини, за допомогою чого ця РНК-молекула здатна утворювати ділянку дволанцюгової РНК протягом принаймні приблизно 18 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 19 нуклеотидів – приблизно 21 нуклеотиду, за допомогою чого один із ланцюгів цієї дволанцюгової ділянки є приблизно ідентичний за нуклеотидною послідовністю до гену-мішені ("смислова ділянка"), тоді як інший ланцюг є приблизноідентичний за нуклеотидною послідовностю до комплементу гену-мішені або цієї смислової ділянки ("антисмислова ділянка"). Очікується, що для сайленсингу експресії цього гена-мішені, нуклеотидна послідовність із 19 послідовних нуклеотидних основ може мати одне помилкове спарювання або ці смислова та антисмислова ділянки можуть розрізнюватися в одному нуклеотиді. Для одержання конструкції таких молекул РНК або кодуючих химерних генів можна використати вектор, описаний у WO 02/059294. Таким чином, в одному варіанті здійснення, забезпечений спосіб регуляції ненасиченості жирних кислот в олії насіння, що передбачає стадію введення химерного гена в клітину рослини, де цей химерний ген містить наступні функціонально пов'язані елементи ДНК: (a) експресований у рослині промотор; (b) транскрибовану ділянку ДНК, яка при транскрипції дає дволанцюгову молекулу РНК, здатну специфічно зменшувати експресію ROD1 або його ортолога, і ця молекула РНК містить першу і другу ділянку РНК, де i) ця перша ділянка РНК містить нуклеотидну послідовність принаймні 19 послідовних нуклеотидів, що має принаймні приблизно 94 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю ROD1 або його ортолога; ii) ця друга ділянка РНК містить нуклеотидну послідовність, комплементарну принаймні 19 послідовним нуклеотидам першої ділянки РНК; iii) ці перша і друга ділянки РНК здатні утворювати дволанцюгову молекулу РНК між принаймні 19 послідовними нуклеотидами першої і другої ділянки; і (с) 3-кінцева ділянка, що містить сигнали термінації транскрипції і сигнали поліаденілування в клітинах цієї рослини. Довжина першої або другої ділянки РНК (смислової або антисмислової ділянки) може варіюватися від приблизно 19 нуклеотидів (нт) до довжини (у нуклеотидах) ендогенного гена, що бере участь у видаленні калози. Таким чином, загальна довжина смислової або антисмислової нуклеотидної послідовності може бути принаймні 25 нт або принаймні приблизно 50 нт, або принаймні приблизно 100 нт, або принаймні приблизно 150 нт, або принаймні приблизно 200 нт, або принаймні приблизно 500 нт. Очікується, що немає верхньої межі стосовно загальної довжини смислової або антисмислової нуклеотидної послідовності. Однак за практичними причинами (такими як, наприклад, стабільність химерних генів) очікується, що довжина смислової або антисмислової нуклеотидної послідовності не повинна перевищувати 5000 нт, зокрема, не повинна перевищувати 2500 нт і може бути обмежена до приблизно 1000 нт. Буде зрозуміло, що чим довша смислова або антисмислова ділянки, тим менш суворими є вимоги ідентичності послідовності між цими ділянками і відповідною послідовністю в гені ROD1 і ортологах або їхніх комплементах. Переважно, нуклеїнова кислота, що становить інтерес, повинна мати ідентичність принаймні приблизно 75 % із відповідною послідовностю-мішенею, зокрема, бути принаймні приблизно на 80 %, більш переважно принаймні приблизно на 85 %, особливо переважно приблизно на 90 %, зокрема, приблизно на 95 %, більш переважно приблизно на 100 %, ще більш переважно бути повністю ідентичною відповідній частині послідовності-мішені або її комплементу. Однак, переважно, щоб нуклеїнова кислота, що становить інтерес, завжди включала в себе послідовність приблизно 19 послідовних нуклеотидів, зокрема, приблизно 25 нт, конкретніше приблизно 50 нт, особливо переважно приблизно 100 нт, ще більш переважно приблизно 150 нт із 100 % ідентичністю послідовності з відповідною частиною нуклеїнової кислоти-мішені. Переважно, для розрахунку ідентичності послідовності і конструювання відповідної смислової або антисмислової послідовності число генів повинно бути мінімізоване, зокрема, для більш коротких смислових послідовностей. Дволанцюгова РНК (dsRNA), що кодує химерні гени за даним винаходом, може містити інтрон, такий як гетерологічний інтрон, розташований, наприклад, у спейсерної послідовності між смисловою та антисмисловою ділянками РНК, відповідно до опису WO 99/53050 (включеного тут як посилання). Синтетичні мікроРНК (miRNA). Застосування синтетичних мікроРНК для знижувальної регуляції експресії конкретного гена в клітині рослини забезпечує дуже високу специфічність послідовності гена-мішені і, отже, дозволяє зручним чином розрізнювати близькоспоріднені алелі як гени-мішені, експресія яких повинна регулюватися знижувальним чином. Так, в іншому варіанті здійснення цього винаходу, молекула біологічно активної РНК або молекула, що викликає сайленсинг РНК, або молекула інгібіторної РНК може бути мікроРНК 19 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекулою, сконструйованою, синтезованою і/або модульованою стосовно мішені, і спричиняти розщеплення кодуючого ROD1 гена або його ортолога в рослині. Були описані різні способи для генерування і застосування мікроРНК (miRNA) для конкретного гена-мішені (що включають у себе, але що не обмежуються ними, Schwab et al. (2006, Plant Cell, 18(5): 1121-1133), WO2006/044322, WO2005/047505, EP 06009836, всі вони включені тут як посилання в їхньому повному обсязі та особливо стосовно відповідних описів, що стосуються miRNA). Звичайно, існуючий каркас (скафолд) miRNA модифікують у частині, що упізнає ген-мішень таким чином, що генерована miRNA тепер примушує комплекс RISC розщеплювати РНК-молекули, транскрибовані з нуклеїнової кислоти-мішені. Каркаси (скафолди) miRNA можуть бути модифіковані або синтезовані таким чином, що ця miRNA тепер містить 21 послідовний нуклеотид кодуючих ROD1 нуклеотидної послідовності або її ортолог, наприклад, послідовності, представлені в Списку послідовностей і які допускають помилкові спарювання відповідно до описаних тут нижче правил. Таким чином, в одному варіанті здійснення, цей винахід забезпечує спосіб регуляції ненасиченості жирних кислот в олії насіння, що передбачає стадії: a. Введення химерного гена в клітини рослини, що продукує олійне насіння, причому зазначений химерний ген містить наступні функціонально пов'язані ділянки ДНК: i. Експресований у рослинах промотор; ii. Ділянка ДНК, яка після введення і транскрипції в клітині рослини процесується в miRNA, за допомогою чого ця miRNA здатна впізнавати і спрямовувати розщеплення мРНК кодуючого ROD1 гена або його ортолога цієї рослини; і iii. Необов'язково, 3-ділянка ДНК, що бере участь у термінації трансляції і поліаденілуванні. Згадана ділянка ДНК, процесована в miRNA, може містити нуклеотидну послідовність, яка по суті комплементарна нуклеотидній послідовності принаймні 21 послідовному нуклеотиду кодуючого ROD1 гена або ортолога, за умови, що допускаються один або декілька наступних помилкових спарювань: a. Помилкове спарювання між нуклеотидом у 5-кінці цієї miRNA і відповідною нуклеотидною послідовністю в молекулі РНК; b. Помилкове спарювання між одним з нуклеотидів у положенні 1 – положенні 9 цієї miRNA і відповідною нуклеотидною послідовністю в молекулі РНК; і/або с. Три помилкових спарювання між будь-яким із нуклеотидів у положенні 12 – положенні 21 цієї miRNA і відповідною нуклеотидною послідовністю в молекулі РНК, за умови, що є не більше двох послідовних помилкових спарювань. У даному контексті, "miRNA" є молекулою РНК із довжиною приблизно 20–22 нуклеотидів, яка може завантажуватися в комплекс RISC і спрямовувати розщеплення іншої молекули РНК, де ця інша молекула РНК містить нуклеотидну послідовність, по суті комплементарну нуклеотидній послідовності молекули miRNA, за допомогою чого можуть мати місце одне або декілька з наступних помилкових спарювань: d. Помилкове спарювання між нуклеотидом у 5-кінці зазначеної miRNA і відповідною нуклеотидною послідовністю в молекулі РНК-мішені; е. Помилкове спарювання між одним із нуклеотидів у положенні 1 – положенні 9 зазначеної miRNA і відповідною нуклеотидною послідовністю в молекулі РНК-мішені; f. Три помилкових спарювання між будь-яким із нуклеотидів у положенні 12 – положенні 21 зазначеної miRNA і відповідною нуклеотидною послідовністю в молекулі РНК-мішені, за умови, що є не більше двох послідовних помилкових спарювань; і/або g. Помилкове спарювання не допускається в положеннях 10 і 11 цієї miRNA (всі положення miRNA зазначені як такі, що починаються від 5-кінця цієї молекули miRNA). miRNA процесується з молекули "пре-miRNA" білками, такими як DicerLike (DCL) білки, присутні в будь-якій клітині рослини, і наноситься на комплекс RISC, де вона може спрямовувати розщеплення молекул РНК-мішеней. У даному контексті, молекулою "пре-miRNA" є РНК-молекула з приблизно 100 – приблизно 200 нуклеотидів, переважно приблизно 100 – приблизно 130 нуклеотидів, які можуть приймати вторинну структуру, що включає в себе дволанцюгове РНК-стебло і одноланцюгову РНК-петлю, що містить додатково нуклеотидну послідовність miRNA (або комплементарну їй послідовність) у дволанцюговім РНК-стеблі. Переважно, ці miRNA і її комплемент розташовані приблизно в 10 – приблизно 20 нуклеотидах від вільних кінців дволанцюгового РНК-стебла. Довжина і послідовність одноланцюгової ділянки петлі не є критичними і можуть істотно варіюватися, наприклад, між довжиною 30 і 50 нуклеотидів. Переважно, відмінність у вільній енергії між неспареною і спареною РНК-структурою знаходиться між -20 і -60 ккал/моль, зокрема, біля -40 ккал/моль. Комплементарність між miRNA і цією miRNA* не повинна бути точною і можуть бути 20 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 прийнятні приблизно 1-3 випинання неспарених нуклеотидів. Вторинна структура, що приймається РНК-молекулою, може бути передбачена комп'ютерними алгоритмами, загальноприйнятими в даній галузі, такими як mFOLD. Конкретний ланцюг дволанцюгового РНКстебла з цієї пре-miRNA, який вивільняється DCL-активністю і наноситься на комплекс RISC, визначають за ступенем комплементарності в 5-кінці, за допомогою чого ланцюг, який на її 5кінці є таким, що менше всього бере участь в утворенні водневого зв'язку між нуклеотидами різних ланцюгів розщепленого dsRNA-стебла, наносять на комплекс RISC, і вона буде визначати специфічність послідовності деградації молекули РНК-мішені. Однак, якщо емпірично ця miRNA-молекула з конкретної синтетичної пре-miRNA-молекули не є функціональною (внаслідок того, що "неправильний" ланцюг нанесений на цей комплекс RISC) відразу ж буде очевидно, що ця проблема може бути вирішена обмінюванням положення miRNA-молекули і її комплементу на відповідних ланцюгах dsRNA-стебла пре-miRNA-молекули. Як відомо в даній галузі, зв'язування між А і U, що включає в себе два водневі зв'язки, або G і U, що включає в себе два водневі зв'язки, є менш сильним, ніж зв'язування між G і С, що включає в себе три водневі зв'язки. Молекули miRNA, що природно-зустрічаються, можуть міститися в їхніх пре-miRNAмолекулах, що природно-зустрічаються, але вони можуть бути також введені в існуючі каркаси пре-miRNA-молекул обміном нуклеотидної послідовності молекули miRNA, нормально процесованої з такої існуючої молекули пре-miRNA, на нуклеотидну послідовність іншої miRNA, що становить інтерес. Каркас (скафолд) цієї пре-miRNA може бути також повністю синтетичним. Подібним чином, синтетичні молекули miRNA можуть міститися в існуючих каркасах молекули пре-miRNA або синтетичних каркасах пре-miRNA або процесуватися з них. Молекули пре-miRNA (і, отже, також молекули miRNA) можуть бути відповідним чином введені в клітину рослини із забезпеченням клітин рослини геном, що містить експресований у рослинах промотор, функціонально пов'язаний з ділянкою ДНК, яка, при транскрипції, дає молекулу пре-miRNA. Цим експресованим у рослинах промотором може бути промотор, природно асоційований із молекулою пре-miRNA, або ним може бути гетерологічний промотор. ПРИКЛАД 1 (Матеріали і способи) Рослинні матеріали. Мутантну лінію ROD1 у фенотипі Arabidopsis thaliana Col-0 виділяли з популяції M3 приблизно 3000 рослин після мутагенезу з використанням метансульфонату прямим аналізом складу жирних кислот проб насіння газовою хроматографією (1). Рослини вирощували в ґрунті в камерах з регульованим середовищем при 22 °C при безперервному флуоресцентному освітленні (150 мкмоль квантів/м2/с). Аналіз жирних кислот і ліпідів. Загальні склади жирних кислот насіння та інших тканин визначали, як описано (2). Імпульсне мічення з витісненням мітки проводили в насінні, що розвивається, зібраному зі стручків через дев'ять днів після зацвітання. Це насіння імпульсно мітили [1-14С]гліцерином або [1-14С]ацетатом протягом 15 хвилин. Після мічення мітку тканин витісняли неміченим ацетатом або гліцерином. При різних часових інтервалах, екстрагували загальні ліпіди та аналізували в силікагель-ТШХ і радіоактивність у PC, DG і TG визначали сцинтиляційним підрахунком, як описано (3). Генетичний аналіз і клонування на основі генетичного картирування ROD1. Для визначення генетичної основи мутації rod1, rod1-рослини схрещували з диким типом Col-О (WT). Насіння F1 виявляло профіль жирних кислот, схожий із профілем жирних кислот WT-батьківської рослини. Рослини F1 вирощували і давали їм самоопилятися. З 263 аналізованих рослин F2, 69 мали профіль жирних кислот насіння, схожий із вихідним насінням rod1, тоді як інші 194 мали склад жирних кислот, схожий із WT. Цей характер розщеплення добре узгоджується з гіпотетичним співвідношенням 3:1 (2=0,21, р>0,05). Локус rod1 ідентифікували клонуванням на основі генетичного картирування з використанням 800 рослин F2, одержаних зі схрещування між мутантом rod1 і Landsberg erecta WT. Первинний скринінг за допомогою валового аналізу сегрегантів із використанням набору 20 маркерів поліморфізму довжин простих послідовностей (SSLP), які рівномірно розподілені в геномі Arabidopsis (4), призводив до зв'язування rod1 із маркером NGA 162 у хромосомі 3 (фігура 2D). Для витонченого картирування локусу rod1, ідентифікували 196 індивідуальних рослин F2, які були гомозиготними в локусі rod1, як показано збільшеним вмістом 18:1 у складі жирних кислот. Сегрегаційний аналіз (із використанням доступних поліморфних маркерів SSLP) найближчої ділянки NGA 162 визначив межі мутації rod1 до інтервалу між NGA 162 і NT204. Потім були сконструйовані додаткові маркери з використанням ПЛР-праймерів і потім було визначено місцеположення локусу rod1 у районі хромосоми 3, що охоплюється ВАС-клонами MJK13, MQD17 і MSJ11 (фігура 2D). 21 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У цій ділянці, вісім генів були анотовані як гени, що кодують білки з відомими або можливими функціями в метаболізмі ліпідів. Після розгляду опублікованої інформації (5, 6), заявники ампліфікували, за допомогою ПЛР, геномну ДНК rod1, що відповідає шести з цих генів, що включає в себе At3g15820. У цьому гені була виявлена транзиція G  А, яка передбачена зміною Trp76 у стоп-кодоні. Інші п'ять генів не виявляли змін відносно WT. Для підтвердження At3g15820 в якості локусу rod1, ПЛР-фрагмент 3961 п.н., що містить ген At3g15820, ампліфікували з використанням геномної ДНК, екстрагованої з рослин WT Col-0 WT. Цей геномний фрагмент клонували в бінарний вектор pGate-Phas-DsRed у сайтах AfIII і EcoRI (2) і потім переносили в штам Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90) для трансформації rod1-мутантних рослин. Трансформанти відбирали на основі експресії DsRed (7). Для визначення складу жирних кислот насіння з використанням газової хроматографії використали метиловий ефір жирних кислот, одержаний із індивідуального насіння десяти червоних трансгенних насінин. Аналізи ферментативної активності ROD1. Відкриту рамку зчитування rod1 ампліфікували за допомогою ПЛР і клонували в експресуючий вектор дріжджів p424GPD (8) для експресії у Saccharomyces cerevisiae під контролем промотору гліцеральдегідфосфат-дегідрогенази. Цю одержану конструкцію p424ROD1 і пустий вектор p424GPD трансформували окремо в клітини HJ091 (cptl:LEU2, eptl-), люб'язно надані лікарем C. McMaster (Dalhousie University, NS, Canada). Експресію транскриптів rod1 підтверджували ЗТ-ПЛР (фігура 7). Клітини дріжджів інокулювали з нічних культур і вирощували до середньої логарифмічної фази (OD600=0,5-1,5) із ротаційним струшуванням при 30 °C у рідкому синтетичному мінімальному середовищі, позбавленому урацилу і триптофану, доповненому 2 % глюкозою (Clontech, Mountain View, CA). Для одержання мікросом, клітини дріжджів збирали центрифугуванням протягом 10 хвилин при 1000 g. Осад клітин промивали один раз стерильною водою і ресуспендували в охолодженому на льоду буфері (20 % гліцерин, 50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), 1 мМ ЕДТА) для одержання мембранної фракції з використанням скляних гранул, як описано (9). Проводили аналізи CDP-холін:діацилгліцерол-фосфотрансферази (CPT) (реакції на фігурі 9А), як описано (9), із використанням 0,1 мкмоль діолеїну і 1 нмоль [14C]CDPхоліну як субстрату. Активності фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) у препаратах мембран клітин HJ091, трансформованих p424GPD (пустим вектором) або p424ROD1, визначали як кількість [14C]діолеоїл-РС, продукованого з [14C-гліцерин]діолеїну (реакція А) або [14C-холін]диміристилфосфатидилхоліну (реакція В). Субстрат 1,8 нмоль (200000 імп/хв) [14Cгліцерин]діолеїну (American Radiolabeled Chemicals, St. Louis, MO) і 0,1 мкмоль діолеоїл-РС (реакція А) або 0,1 мкмоль діолеїну і 1 нмоль [14C-холін]ди-14:0-PC і 0,1 мкмоль діолеоїл-РС (реакція В) сушили під струмом газу азоту і ресуспендували в 50 мкл 4х реакційного буфера (кінцеві концентрації: 50 мМ MOPS/NaOH pH 7,5, 20 мМ MgCl2, 0,45 % Тритон X-100) за допомогою бані для обробки ультразвуком (9). Реакції (200 мкл) починали додаванням 20-250 мкг мікросомних білків, суспендованих у буфері GTE. Якщо немає інших вказівок, суміші для аналізу інкубували при 15 °C протягом 15 хвилин і зупиняли додаванням 3 мл суміші хлороформ/етанол (2:1, об/об) і потім 1,5 мл 0,9 % KCl. Пробірки перемішували за допомогою вортекса і розділення фаз полегшували центрифугуванням при 2000 g протягом 2 хвилин. Водну фазу аспірували та органічну фазу промивали двічі 1,5 мл 40 % (об/об) етанолом. Проби аналізували за допомогою ТШХ на пластинках із силікагелем у системі розчинників хлороформ/метанол/вода (65:25:4, за об'ємом) із подальшим аналізом за допомогою приладу для аналізу фосфор-зображення або радіоавтографії. Відповідні смуги вишкрібали і визначали радіоактивність за допомогою сцинтиляційного рахунку. Експресія ROD1 і At3g15830. Дані експресії для бази даних rod1 (affymetrixarrayelement258249_s_at) показані на фігурі 8. Той же самий елемент матриці детектує також транскрипт другого гена, At3g15830, але дані з бази даних Arabidopsis Massively Parallel Signal Sequence (MPSS) (mpss.udel.edu/at/) показують, що цей другий ген експресується тільки в тканинах квіток (дані не показані). Для підтвердження цих даних, заявники одержували РНК із проростаючих проростків, розеткового листя, квіток і зелених стручків рослин WT, а також зелених стручків rod1-мутантних рослин. Із використанням олігонуклеотидних праймерів, специфічних стосовно ROD1 і At3g15830, виконували ПЛР зі зворотною транскриптазою (ЗТПЛР) на кожній із РНК-проб із використанням одностадійної системи Superscript III відповідно до інструкцій виробника (Invitrogen, Carlsbad, CA). Результати, показані на фігурі 7, вказують на те, що експресія At3g15830 обмежується квітками і що транскрипт цього гена міг не детектуватися в стручках, що розвиваються або WT-, або rod1-рослин. Для тестування, чи мав At3g15830 також активність PDCT, кДНК клонували у вектор p424GPD, як описано вище. Потім одержану 22 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 конструкцію p424-At3g15830 трансформували в HJ091 та її експресію підтверджували за допомогою ЗТ-ПЛР (фіг. 7, доріжка 16). PDCT-аналіз, що використовує ті ж самі умови реакції для ROD1, не давав радіоактивно міченого PC, показуючи, що білок At3g15830 не має PDCTактивності (дані не показані). Філогенетичні аналізи. Способи одержання древа "parsimony bootstrap tree" (10), що включають у себе 1000 повторюваних наборів даних початкового завантаження (bootstrap), кожен з яких аналізують із використанням ділильного пополам повторюваного з'єднання древа, самої глибокої доцільності, та інших установок для максимізації детектування глобальних оптимумів або для максимізації критеріїв оптимальності економії ("parsimony"). Способи одержання консенсусного древа Bayes (11) включали в себе попередні установки для найбільш комплексної моделі амінокислотних замін WAG+F+I+G і дозвіл двом ланцюгам Маркова (кожному) пройти протягом 1000000 генерацій (достатніх для конвергенції в одній точці двох окремих проходжень перед взяттям проб другого параметра), із взяттям проб кожні 10000 генерацій при сталості правдоподібності, щоб уникнути автокорелюючих оцінок параметрів. Посилання, що цитуються і включені тут, стосуються наприклад 1: 1. В. Lemieux, M. Miquel, C. Somerville, J. Browse, Theor. Appl. Genetics 80, 234 (1990). 2. С. Lu, M. Fulda, J. G. Wallis, J. Browse, Plant J. 45, 847 (2006). 3. C. R. Slack, P. G. Roughan, N. Balasingham, Biochem. J. 170, 421 (1978). 4. W. Lukowitz, C. S. Gillmor, W. R. Scheible, Plant Physiol. 123, 795 (2000). 5. L. Fan, S. Zheng, X. Wang, Plant Cell 9, 2183 (1997). 6. I. Heilmann, S. Mekhedov, B. King, J. Browse, J. Shanklin, Plant Physiol. 136, 4237 (2004). 7. A. R. Stuitje, Plant Biotech. J. 1, 301 (2003). 8. D. Mumberg, R. M?ller, M. Funk, Gene 156, 119 (1995). 9. R. Hjelmstad, R. Bell, J. Biol. Chem. 266, 4357 (1991). 10. D. L. Swofford. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods), Version 4 (Sinauer Associates, Sunderland, MA, 2003). 11. F. Ronquist, J. P. Huelsenbeck, Bioinformatics 19, 1572 (2003). ПРИКЛАД 2 (Показано, що мутант rod1 Arabidopsis має явне зменшення поліненасичених жирних кислот у насінні) Таблиця 1А і 1В показують, що мутант rod1 Arabidopsis DH4 має явне зменшення поліненасичених жирних кислот (PUFA) у насінні. Склад жирних кислот насіння мутанта rod1 відрізняється від складу жирних кислот насіння дикого типу (WT) і мутанта fad2 Arabidopsis thaliana. У порівнянні з мутантом fad2 (5, 7), зміна складу жирних кислот у DH4 обмежується олією насіння. Таблиці 1А і 1В 40 Склад жирних кислот мутанта rod1 відрізняється від складу жирних кислот дикого типу (WT) і мутантна fad 2 Arabidopsis thaliana. TAG, триацилгліцерин; DAG, діацилгліцерин; PC, фосфатидилхолін; PE, фосфатидилетаноламін 45 Як показано в таблицях 1A і 1B, для додаткової характеристики дії rod1 на синтез ліпідів насіння, склад жирних кислот різних класів гліцероліпідів аналізували у зрілому насінні (таблиця 23 UA 108597 C2 5 10 15 1А) і насінні, що розвивається при 9 днях після зацвітання (таблиця 1В), максимальної стадії для синтезу жирних кислот. У порівнянні з диким типом, олія насіння мутанта rod1 Arabidopsis має явне зменшення поліненасичених жирних кислот, але відсутня дія на склад жирних кислот тканин листя або коріння. Мутант rod1 Arabidopsis має збільшений рівень 18:1 як у DAG, так і в TAG, але виявляє зменшену кількість 18:2 і 18:3 (таблиці 1А і 1В). Однак, для жирних кислот у фосфатидилетаноламіні, детектували невелику відмінність між rod1 і диким типом. Цікаво, що аналіз індивідуальних ліпідів із розвиваючого насіння rod1 і дикого типу виявив, що мутант rod1 мав трохи зменшений рівень як 18:1, так і 18:2 у РС у порівнянні з диким типом і збільшення 18:1 відносно дикого типу. Таким чином, недолік 18:2 і 18:3 обмежувався DAG і TAG розвиваючого насіння rod1. Ці відкриття узгоджуються зі зменшеним перенесенням 18:1 у РС і вказує на те, що зменшена десатурація олеату не була викликана активністю десатурації, а була зумовлена зменшеним перенесенням 18:1 у РС або за допомогою синтезу de novo з діацилгліцерину (DAG) (8), або за допомогою обміну ацил-СоА:лізо-РС-ацилтрансферази (9). Ці зміни є схожими зі змінами, але меншими, ніж ці зміни, що спостерігаються в мутантах fad2 (5, 7), представляючи можливість того, що rod1 представляє гіпоморфний алель fad2. У той час як мутації в fad2 зменшують синтез PUFA у листі і корінні, а також насінні, зміни в складі жирних кислот спостерігаються тільки в насінні рослин rod1 (таблиця 1А і В і таблиця 1С). Таблиці 1С 20 Склад жирних кислот в ліпідах листя і корнів rod1 є схожим за складом жирних кислот у ліпідах дикого типу Мол. % різновидів жирних кислот 25 30 35 40 45 50 Схрещування між rod1 і fad2 давало насіння F1 із рівнями PUFA, істотно вищими, ніж рівні будь-якої батьківської рослини, підтверджуючи, що мутація rod1 знаходиться в локусі, що відрізняється від локусу fad2. Ці і додаткові тест-схрещування вказують на те, що rod1 є односайтовою рецесивною Менделевською мутацією. Як показано в таблиці 1А (зріле насіння), тести генетичної комплементації між DH4 і мутантом fad2 підтверджували, що локус мутанта rod1 в DH4 не є алельним щодо fad2. Ця мутація (як обговорюється детальніше в прикладі 4 тут нижче), що має місце в локусі At3gl5820, який, згідно з конкретними аспектами даного винаходу, у нормі (у дикому типі) кодує нову фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферазу (PDCT), як визначено аналізом ферментативної активності з використанням гетерологічної експресії в дріжджах. Автори цього винаходу назвали цей мутантний алель rod1 (reduced oleate desaturation 1, зменшена десатурація олеату 1)), який є односайтовою рецесивною Менделевською мутацією, як визначено стандартним генетичним аналізом (дані не показані). ПРИКЛАД 3 (Було показано, що мутант rod1 Arabidopsis DH4 мав зменшену десатурацію олеату в олії насіння внаслідок зменшеного перенесення 18:1 у РС за допомогою de novo синтезу з діацилгліцерину (DAG)) Ріст, розвиток і утворення насіння рослин rod1 не відрізнялися від WT. Маса зрілого насіння rod1 не відрізнялася від WT (17,7±0,2 і 17,9±0,1 мкг/насіння (середнє ± s.e. (стандартна похибка)), відповідно). Вміст олії насіння rod1 був 4,9±0,32 мкг/насіння (середнє ± s.e.) у порівнянні з 4,6±0,19 мкг/насіння для WT, і таймінг накопичення ліпідів був схожим у цих двох лініях із максимумом 7-9 днів після запилення (дані не показані). Склад жирних кислот різних класів гліцероліпідів із насіння аналізували під час цієї стадії максимального синтезу тригліцеридів. У порівнянні з WT, мутант rod1 мав істотно зменшені рівні PUFA як в обох TG, так і в безпосередньому попередникові дигліцеридів (DG) (фігури 1Е-1Н). Однак, несподівано, РС містив збільшену кількість PUFA із найбільш високо ненасиченою кислотою, 18:3, відповідальною за 31,7 % загальних ацильних груп у порівнянні з 19,9 % у WT. Другий найбільш 24 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 численний фосфоліпід у насінні, фосфатидилетаноламін, не відіграє яку-небудь важливу роль у синтезі TG, і склад жирних кислот цього ліпіду був схожим у пробах WT і rod1. Оскільки РС є субстрат для десатураз FAD2 і FAD3, які перетворюють 18:1 у 18:2 і 18:3 PUFA, ці дані вказують на можливість того, що мутація rod1 зменшує перенесення 18:1 у РС для десатурації. Моделі синтезу TG в олійному насінні відомого рівня техніки передбачають, що 18:1 може входити в пул РС або під дією ацил-СоА:лізо-РС-ацилтрансферази (LPCAT), або під дією CDP-холін:DAG-холінфосфат-трансферази на 18:1-DAG. Для розрізнення, чи викликається зменшена десатурація олеату зменшеним перенесенням 18:1 у РС або за допомогою de novo синтезу з діацилгліцерину (DAG) (8), або за допомогою обміну ацил-СоА:лізо-РС-ацилтрансферази (9), насіння, що розвивається, мітили радіоактивним ацетатом (для мічення жирних кислот) (фігури 1С і 1D) і радіоактивним гліцерином (для мічення ліпідного скелета) (фігури 1А і 1В). В експерименті з витісненням гліцерину, PC був найбільш сильно міченим ліпідом (30 %) у насінні дикого типу, і він залишався відносно стабільним під час періоду витіснення. Схожа кількість мітки (27 %) була присутньою також у DAG у кінці імпульсного мічення, яке зменшувалось у ході витіснення мітки, і потім ця втрачена мітка виявлялася в TAG (фігура 1A). У насінні rod1 тільки 8 % мітки детектували в РС, але DAG містив 51 % загальної радіоактивності в кінці імпульсного мічення. Мітка, присутня в TAG у насінні rod1, була на рівні, схожому з рівнем у дикому типі. Схожі результати вказують на те, що насіння rod1 мало зменшений de novo синтез РС із DAG, оскільки, не можна було чекати, що пошкодження в ацил-СоА:лізо-РС-ацилтрансферазі обмежує входження гліцерину в РС. Фігури 1А-1D показують синтез ліпідів у насінні, що розвивається Arabidopsis. Після 15 хвилин імпульсного мічення [14С] міченим гліцерином або ацетатом проводили витіснення протягом 180 хвилин. Радіоактивність у PC, DAG і TAG визначали при часових точках 0, 30, 60 і 180 хвилин. Насіння, що розвивається, мітили радіоактивним ацетатом (для мічення жирних кислот) (фігури 1С і 1D) і радіоактивним гліцерином (для мічення ліпідного скелета) (фігури 1А і 1В). ПРИКЛАД 4 (Виконували тонке картирування мутанта rod1 Arabidopsis DH4 і тут був ідентифікований At3g15820 як локус мутант rod1, й уперше було показано, що він не тільки є фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферазою (PDCT), але також є PDCT, яка у високому ступені експресується в насінні, що розвивається, із самим високим рівнем у стадії 6 розвитку насіння, що узгоджується зі стадією максимуму відкладення про запас) Відомо, що синтез de novo РС в олійному насінні каталізується CDP-холін:DAGхолінфосфотрансферазами (CPT). У геномі Arabidopsis є два гомологічних гени для CPT (10). Таким чином, автори цього винаходу спочатку (неправильно) передбачили, що rod1 був, ймовірно, мутацією в одному з цих двох генів CDP-холін:DAG-холінфосфотрансферази, At1g13560 (AAPT1) або At3g25585 (AAPT2). Однак, несподівано початкові дані картирування авторів для rod1 вмістили цей ген приблизно на 20 сМ на північ від AAPT2 на хромосомі 3. Конкретно, геномну ДНК, що охоплює ці дві кодуючих СРТ ділянки, секвенували, але в цих генах СРТ не було мутацій послідовності в мутантові rod1. Цей результат показав, що СРТ у rod1 функціонують нормально і що, мабуть, був інший механізм (інші механізми) синтезу РС у насінні, що розвивається. Таким чином, проводили заснований на картируванні підхід клонування для ідентифікації локусу rod1 з використанням рослин F2, одержаних із схрещування між rod1 і Landsberg erecta дикого типу (див. "Генетичний аналіз і клонування на основі генетичного картирування карти ROD1" у розділі "Матеріали і способи" прикладу 1 вище). Цей підхід дозволяв ідентифікувати мутацію в локусі At3g15820 на хромосомі 3. Зміни єдиного нуклеотиду з G в А в першому екзоні At3g15820 призводили до зміни Trp76 у стоп-кодоні (див. фігуру 2С). У порівнянні з послідовністю нуклеїнової кислоти дикого типу (SEQ ID NO:2), ця послідовність нуклеїнової кислоти алеля rod1 (SEQ ID NO:4) кодуючої послідовності цього гена містить мутацію, яка створює стоп-кодон у залишку 76 передбаченої відкритої рамки зчитування. Потім ідентичність ROD1 і At3g15820 підтверджували комплементацією мутанта rod1 геномною послідовністю ~4-т.п.н. (SEQ ID NO:1) дикого типу, що включає в себе кодуючі ділянки At3g15820 і його ендогенний промотор і термінатор (геномний фрагмент 4 т.п.н. ДНК дикого типу, що включає в себе кодуючу ділянку At3g15820 і в цілому 2 т.п.н. 5- і 3-фланкуючої послідовності (фігура 2А). Цей фрагмент ДНК клонували в бінарний трансформуючий вектор рослин, що використовує DsRed як селектований маркер (11). Трансгенне насіння ідентифікували за експресією DsRed, та його ацилметилові ефіри жирних кислот (FAME) аналізували газовою хроматографією і порівнювали з цими ефірами жирних кислот нетрансформованого насіння тих же самих рослин. Склад жирних кислот трансгенного насіння 25 UA 108597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 був майже ідентичним складу жирних кислот насіння дикого типу (фігура 2В), що підтверджує, що мутація rod1 дійсно знаходиться в локусі At3g15820. Фігури 2A-2C показують, що ген rod1 був ідентифікований як At3g15820 в Arabidopsis. (А) Структура гена rod1 з положенням молекулярного пошкодження в цьому мутантові. Для комплементації мутації в rod1 використали ділянку приблизно 4 т.п.н. (SEQ ID NO:1), що виявляє екзони (стрілки жирного шрифту) і нетрансльовані ділянки (бокси). (В) Порівняння складу жирних кислот насіння At3g15820-трансформантів (білі заштриховані) і дикого типу Col (білі) показали, що At3g15820 повністю відновлював мутацію rod1 (чорні), підтверджуючи тим самим ідентичність rod1. (С) Розшифрована амінокислотна послідовність (SEQ ID NO:3) At3g15820, розташована для показу передбачених трансмембранних ділянок, передбачених HMMTOP (підкреслених). Зірочка відмічає положення зміни кодона для Trp 76 у стоп-кодон у мутантній послідовності SEQ ID NO:4 (єдина точкова мутація; G в А у послідовності першого екзону). Передбачуваний мотив фосфатази ліпідфосфату показаний жирним шрифтом і курсивом. Фігура 4 показує укорочену амінокислотну послідовність мутанта rod1 (SEQ ID NO:5) у DH4. Згідно з конкретними аспектами, кодуюча послідовність мутанта фосфатидилхолін:діацилгліцерол-холінфосфотрансферази (PDCT) (rod1) (SEQ ID NO:4) містить зміну G  А в нуклеотидному положенні 228, що призводить до передчасної термінації білка PDCT, для забезпечення укороченої послідовності мутанта rod1 (SEQ ID NO:5), що містить 75 амінокислот. Аналіз публічно доступних даних мікроматриці (https://www.genevestigator.ethz.ch/) (12) показав, що At3g15820 у високому ступені експресується в насінні, що розвивається, із найбільш високим рівнем на стадії 6 розвитку насіння, яка співпадає з максимальною стадією відкладення про запас. Це узгоджується з насінняспецифічною зменшеною десатурацією олеату в мутантові rod1 (таблиця 1). Згідно з додатковими аспектами, єдиним геном в Arabidopsis, який має високу гомологію з At3g15820, є At3g15830, який розташований на 1,2 т.п.н. праворуч. Однак At3g15830 експресується тільки в суцвіттях, і результати авторів цього винаходу також підтвердили, що At3g15830 не експресується в насінні, що розвивається. Істотно, що At3g15820 був анотований як передбачуваний білок, подібний до фосфатази фосфатидної кислоти типу 2 (PAP2), однак, після аналізу, проведеного заявниками, він не виявляє сильної гомології з відомими охарактеризованими генами РАР в Arabidopsis (AtLPP1, AtLPP2 і AtLPP3) (13, 14). ROD1 особливо перевіряли повторно проти бази даних PFAM, і Евеличина для ідентифікації домену PAP2 (0,017) була вище рекомендованої межі. Не тільки збіг послідовностей був слабким, тільки із 8 з 15 найбільш консервативних залишків, присутніми в ROD1, але і зіставлення показало також, що ROD1 мав (повинен був обов'язково мати) делеції в цілому 61 залишки (із 176) у центрі послідовності цього мотиву. Геном Arabidopsis містить принаймні чотири гени з точно ідентифікованими доменами PAP2 (Е-величини