Рекомбінантний мікроорганізм з роду escherichia, що виробляє l-амінокислоту, та спосіб одержання l-амінокислоти

Реферат: Винахід стосується рекомбінантного мікроорганізму з роду Esherichia, що виробляє Lамінокислоту, в якому щонайменше один з NfrA та NfrB є інактивованим, та способу одержання L-амінокислоти за допомогою даного рекомбінантного мікроорганізму. UA 114997 C2 (12) UA 114997 C2 UA 114997 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ [1] Даний винахід стосується рекомбінантного мікроорганізму, що виробляє L-амінокислоту, та способу одержання L-амінокислоти із застосуванням рекомбінантного мікроорганізму. ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ [2] Для масового одержання корисних метаболітів, наприклад, амінокислот, застосовувалися різноманітні способи бродіння із застосуванням мікроорганізмів, і, крім того, для успішного бродіння із застосуванням мікроорганізмів була розроблена низка методик, у тому числі розробка штамів, встановлення умов бродіння тощо. Зокрема, для розробки штаму-хазяїна для масового одержання корисних метаболітів було здійснено багато спроб індукції надекспресії або низької експресії конкретного гена. [3] Проте у ферментативному виробництві із застосуванням бактерій вироблення корисних метаболітів може знижуватися у зв'язку із забрудненням фагами. Забруднення фагами спричинене, головним чином, рецепторами для фагів, що являють собою білки, ліпополісахариди тощо, які здатні забезпечувати прикріплення фагів до поверхні бактеріальної клітини. У випадку Escherichia coli (E. coli) E. coli зазнає атаки з боку різноманітних фагів, і, відповідно, дослідження рецепторів для кожного з фагів було порівняно успішним. Проте дослідження взаємозв'язку між рецепторами для фагів та виробленням L-амінокислот донині не було проведене в достатньому обсязі. [4] У зв'язку з цим автори даного винаходу відібрали гени, які являють собою добре відомі рецептори для фагів, і згодом інактивували кожен з генів для зменшення ризику зниження вироблення L-амінокислот, розглядаючи при цьому цей ризик як вразливість E. coli. Після цього було підтверджено вплив на вироблення L-амінокислот, і такий відбір та інактивацію генів застосовували щодо штамів, які виробляють L-амінокислоти, довершуючи цим даний винахід. РОЗКРИТТЯ ВИНАХОДУ ТЕХНІЧНА ЗАДАЧА [5] У даному винаході представлено рекомбінантний мікроорганізм, який має здатність до вироблення L-амінокислот та інактивований рецептор для фага. [6] У даному винаході представлено спосіб одержання L-амінокислоти із застосуванням мікроорганізму. ВИРІШЕННЯ ЗАДАЧІ [7] В одному аспекті в даному винаході представлено рекомбінантний мікроорганізм, що виробляє L-амінокислоту, в якому щонайменше один з NfrA та NfrB є інактивованим. [8] Вираз "NfrA", використовуваний у даному документі, стосується білка, який утворює рецептор для бактеріофага N4 та може являти собою мембранний білок бактерій. Наприклад, NfrA може являти собою субодиницю білка зовнішньої мембрани. NfrA може містити, наприклад, амінокислотну послідовність під SEQ ID NO: 40. NfrA може містити, наприклад, амінокислотну послідовність під SEQ ID NO: 40 або амінокислотну послідовність, яка характеризується приблизно 80 % або більшою, 85 % або більшою, 90 % або більшою або 95 % або більшою ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю під SEQ ID NO: 40. Послідовність гена, який кодує NfrA, може включати в себе полінуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність під SEQ ID NO: 40. Послідовність гена, який кодує NfrA, може включати в себе, наприклад, послідовність гена nfrA (ID гена в NCBI: 12930896). Наприклад, послідовність гена, який кодує NfrA, може включати в себе полінуклеотидну послідовність під SEQ ID NO: 39 або полінуклеотидну послідовність, яка характеризується приблизно 80 % або більшою, 85 % або більшою, 90 % або більшою або 95 % або більшою ідентичністю послідовності з полінуклеотидною послідовністю під SEQ ID NO: 39. [9] Вираз "NfrB", використовуваний у даному документі, стосується білка, який утворює рецептор для бактеріофага N4 та може являти собою мембранний білок бактерій. Наприклад, NfrB може являти собою субодиницю білка внутрішньої мембрани. NfrB може містити, наприклад, амінокислотну послідовність під SEQ ID NO: 42. NfrB може містити, наприклад, амінокислотну послідовність під SEQ ID NO: 42 або амінокислотну послідовність, яка характеризується приблизно 80 % або більшою, 85 % або більшою, 90 % або більшою або 95 % або більшою ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю під SEQ ID NO: 42. Послідовність гена, який кодує NfrB, може включати в себе полінуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність під SEQ ID NO: 42. Послідовність гена, який кодує NfrB, може включати в себе, наприклад, послідовність гена nfrB (ID гена в NCBI: 12933943). Наприклад, послідовність гена, який кодує білок NfrB, може включати в себе полінуклеотидну послідовність під SEQ ID NO: 41 або полінуклеотидну послідовність, яка характеризується приблизно 80 % або більшою, 85 % або більшою, 90 % або більшою або 95 % або більшою ідентичністю послідовності з полінуклеотидною послідовністю під SEQ ID NO: 41. 1 UA 114997 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [10] Крім того, в рекомбінантному мікроорганізмі, що виробляє L-амінокислоту, додатково може бути інактивованим щонайменше один з Tsx та FhuA. [11] Вираз "Tsx", використовуваний у даному документі, стосується білка, який утворює канал для нуклеозидів, тобто канал, специфічний для нуклеозиду, і може являти собою компонент, який утворює рецептор для фага T6 та коліцину K. Tsx може містити, наприклад, амінокислотну послідовність під SEQ ID NO: 45 або амінокислотну послідовність, яка характеризується приблизно 80 % або більшою, 85 % або більшою, 90 % або більшою або 95 % або більшою ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю під SEQ ID NO: 45. Послідовність гена, який кодує Tsx, може включати в себе полінуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність під SEQ ID NO: 45. Послідовність гена, який кодує Tsx, може включати в себе, наприклад, послідовність гена tsx (ID гена в NCBI: 12934188). Наприклад, послідовність гена, який кодує Tsx, може включати в себе полінуклеотидну послідовність під SEQ ID NO: 44 або полінуклеотидну послідовність, яка характеризується приблизно 80 % або більшою, 85 % або більшою, 90 % або більшою або 95 % або більшою ідентичністю послідовності з полінуклеотидною послідовністю під SEQ ID NO: 44. [12] Вираз "FhuA", використовуваний у даному документі, стосується багатофункціонального білка у зовнішній мембрані бактерій, який транспортує (Fe3+)-ферихром або антибіотики, такі як альбоміцин та рифаміцин, і може являти собою рецептор для фагів T1, T5 та phi80. FhuA може містити, наприклад, амінокислотну послідовність під SEQ ID NO: 47 або амінокислотну послідовність, яка характеризується приблизно 80 % або більшою, 85 % або більшою, 90 % або більшою або 95 % або більшою ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю під SEQ ID NO: 47. Послідовність гена, який кодує FhuA, може включати в себе полінуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність під SEQ ID NO: 47. Послідовність гена, який кодує FhuA, може включати в себе, наприклад, послідовність гена fhuA (ID гена в NCBI: 12930751). Наприклад, послідовність гена, який кодує FhuA, може включати в себе полінуклеотидну послідовність під SEQ ID NO: 47 або полінуклеотидну послідовність, яка характеризується приблизно 80 % або більшою, 85 % або більшою, 90 % або більшою або 95 % або більшою ідентичністю послідовності з полінуклеотидною послідовністю під SEQ ID NO: 47. [13] Вираз "ідентичність", використовуваний у даному документі, стосується схожості двох амінокислотних послідовностей, яку можна визначити за допомогою способу, добре відомого з рівня техніки, наприклад, алгоритму BLAST 2.0, який визначає параметри, такі як вага, ідентичність та подібність двох амінокислотних послідовностей. [14] Вираз "рекомбінантний мікроорганізм", використовуваний у даному документі, стосується мікроорганізму, який є генетично модифікованим. Рекомбінантний мікроорганізм може являти собою мікроорганізм, створений за допомогою генної інженерії, і, наприклад, у мікроорганізм може бути введена екзогенна нуклеїнова кислота згідно зі способами генної інженерії, або в мікроорганізмі можуть бути трансформованими послідовність або місце розташування ендогенного гена. [15] Вираз "L-амінокислота", використовуваний у даному документі, стосується основної структурної одиниці білка, яка складає тіло організму та має як аміногрупу, так і групу карбонової кислоти, приєднані до одного й того самого атома вуглецю. Наприклад, Lамінокислота може бути вибрана з групи, яка складається з L-лейцину, L-фенілаланіну, Lлізину, L-треоніну, L-валіну, L-ізолейцину, L-триптофану та L-метіоніну. Наприклад, Lамінокислота може являти собою L-триптофан або L-треонін. [16] Вираз "фермент або білок є інактивованим" або "інактивація ферменту або білка", використовуваний у даному документі, стосується випадку, в якому описаний вище білок взагалі не експресується в мікроорганізмі, випадку, в якому описаний вище білок експресується, але не має жодної активності, або випадку, в якому описаний вище білок експресується, але його активність є слабкою порівняно з властивою активністю. Вираз "властива активність", використовуваний у даному документі, стосується активності мікроорганізму в природному стані, тобто активності, яка від початку існує в мікроорганізмі, або активності білка, який не був генетично модифікованим. [17] Інактивація білка NfrA, білка NfrB, білка Tsx та білка FhuA може бути спричинена мутацією, делецією або руйнуванням генів, кожен з яких кодує білок NfrA, білок NfrB, білок Tsx та білок FhuA. Вираз "мутація, делеція або руйнування генів", використовуваний у даному документі, стосується випадку, в якому частину генів або регуляторних факторів у промоторних або термінаторних ділянках генів або всіх їх піддають мутації, заміні, делеції або вставці щонайменше однієї основи, так що гени не експресуються, або гени експресуються незначною мірою, або гени експресуються, не демонструючи ферментативну активність або маючи знижену ферментативну активність. Мутацію, делецію або руйнування генів можна здійснити за 2 UA 114997 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомогою генетичної маніпуляції, такої як гомологічна рекомбінація, мутагенез або молекулярна еволюція. Якщо клітина містить багато однакових генів або щонайменше два гомологічні гени, один або декілька генів у клітині можна піддати делеції або руйнуванню. З метою інактивації генів, представлених у варіанті здійснення даного винаходу, можна здійснювати способи одержання мутанта із застосуванням рекомбінази Red фага лямбда. [18] У рекомбінантного мікроорганізму усунено або знижено активність кожного з білків, представлених у даному документі, або білків у комбінації. Відповідно, рекомбінантний мікроорганізм може мати підвищену здатність до вироблення L-амінокислоти порівняно з випадком, у якому активність білків не є інактивованою, та, отже, рекомбінантний мікроорганізм можна відповідним чином застосовувати з метою одержання L-амінокислоти. [19] Рекомбінантний мікроорганізм може являти собою мікроорганізм з роду Escherichia, з роду Enterobacter, з роду Erwinia, з роду Serratia, з роду Providencia, з роду Corynebacterium та з роду Brevibacterium. Наприклад, рекомбінантний мікроорганізм може являти собою мікроорганізм з роду Escherichia. Мікроорганізм з роду Escherichia може являти собою Escherichia coli (E. coli), наприклад, KCCM11501P. KCCM11501P являє собою штам KCCM10910PΔnfrAB, одержаний шляхом застосування штаму, що виробляє треонін (KCCM10910P), як материнського штаму та здійснення делеції генів як nfrA, так і nfrB. У цьому випадку було виявлено, що здатність KCCM11501P E. coli до споживання цукру є вищою, ніж у материнського штаму (KCCM10910P). KCCM11501P одержав назву "E.Coli CA03-8253P" і згодом був депонований в Корейському центрі культур мікроорганізмів (який далі в даному документі згадується як "KCCM") 13 грудня 2013 р. згідно з Будапештським договором. [20] [21] Відповідно до іншого аспекту даного винаходу розкрито спосіб одержання Lамінокислоти, при цьому спосіб включає культивування рекомбінантного мікроорганізму, що виробляє L-амінокислоту; та збирання L-амінокислоти з продукту культури. [22] Рекомбінантний мікроорганізм, що виробляє L-амінокислоту, визначається так само, як описано вище. [23] L-амінокислота може бути вибрана з групи, яка складається з L-лейцину, Lфенілаланіну, L-лізину, L-треоніну, L-валіну, L-ізолейцину, L-триптофану та L-метіоніну. Наприклад, L-амінокислота може являти собою L-треонін або L-триптофан. Культивування рекомбінантного мікроорганізму можна здійснювати відповідно до належного культурального середовища та умов культивування, добре відомих з рівня техніки. Крім того, середній фахівець в даній галузі може відповідним чином регулювати склад культурального середовища та умови культивування відповідно до обраного мікроорганізму. Спосіб культивування може включати періодичне культивування, безперервне культивування, періодичне культивування з підживленням або їх комбінацію. [24] Культуральне середовище може містити різноманітні джерела вуглецю, джерела азоту та інгредієнти, що являють собою слідові елементи. [25] Джерела вуглецю можуть включати, наприклад, вуглеводи, такі як глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крохмаль та целюлоза; жири, такі як соєва олія, соняшникова олія, рицинова олія та кокосова олія; жирні кислоти, такі як пальмітинова кислота, стеаринова кислота та лінолева кислота; спирт, такий як гліцерин та етанол; та органічні кислоти, такі як оцтова кислота, або їх комбінацію. Культивування рекомбінантного мікроорганізму можна здійснювати шляхом застосування глюкози як джерела вуглецю. Джерела азоту можуть включати, наприклад, органічні джерела азоту, такі як пептон, екстракт дріжджів, підлива, екстракт солоду, кукурудзяний екстракт (CSL) та соєве борошно; і неорганічні джерела азоту, такі як сечовина, сульфат амонію, хлорид амонію, фосфат амонію, карбонат амонію та нітрат амонію; або їх комбінацію. Культуральне середовище може містити дигідрофосфат калію або гідрофосфат калію як джерело фосфору. Крім того, культуральне середовище може містити відповідні натрійвмісні солі як джерело фосфору та солі металів, такі як сульфат магнію або сульфат заліза. Крім того, культуральне середовище може містити амінокислоти, вітаміни та відповідні попередники. Середовище або окремі інгредієнти середовища можна додавати до культурального середовища періодично або безперервно. [26] Крім того, до культурального середовища під час культивування рекомбінантного мікроорганізму можна відповідним чином додавати сполуки, такі як гідроксид амонію, гідроксид калію, аміак, фосфорна кислота та сірчана кислота, для регулювання pH культурального середовища. Крім того, під час культивування рекомбінантного мікроорганізму можна застосовувати протиспінювачі, такі як складний ефір полігліколю та жирної кислоти, для пригнічення утворення повітряних бульбашок. З метою підтримання аеробних умов у культуральному середовищі в культуральне середовище можна вводити кисень або 3 UA 114997 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кисневмісний газ (наприклад, повітря). У цьому випадку температура культурального середовища зазвичай може перебувати в діапазоні від приблизно 20℃ до приблизно 45℃. Період культивування рекомбінантного мікроорганізму може тривати, допоки не буде одержана бажана кількість L-амінокислоти, і, наприклад, культивування рекомбінантного мікроорганізму може тривати від приблизно 10 годин до приблизно 160 годин. [27] Вираз "продукт культури", використовуваний у даному документі, стосується бульйонної культури, яка містить рекомбінантний мікроорганізм, надосадової рідини культури, з якої видаляють мікробну клітину, або розведеного розчину продукту культури. Культуральне середовище може додатково містити інгредієнт для підвищення ефективності вироблення Lамінокислоти. Наприклад, композиція може додатково містити джерела вуглецю, джерела азоту або інгредієнти, що являють собою слідові елементи. [28] Збирання L-амінокислоти з продукту культури можна здійснювати за допомогою відповідних способів культивування, відомих з рівня техніки, таких як періодичне культивування, безперервне культивування або періодичне культивування з підживленням, для збирання або виділення L-амінокислоти, виробленої в продукті культури. ПЕРЕВАЖНІ ЕФЕКТИ ВИНАХОДУ [29] Відповідно до одного аспекту мікроорганізм з усуненою або зниженою активністю щонайменше одного білка, вибраного з групи, яка складається з білка NfrA, білка NfrB, білка Tsx та білка FhuA, можна застосовувати для одержання L-амінокислоти. [30] Відповідно до іншого аспекту спосіб одержання L-амінокислоти можна застосовувати для ефективного одержання L-амінокислоти. ПРИНЦИП ВИНАХОДУ [31] Далі в даному документі даний винахід буде описано детальніше з посиланням на наступні приклади. Ці приклади слугують лише для ілюстративних цілей та не призначені для обмеження обсягу даного винаходу. [32] Приклад 1. Одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим рецептором для фага шляхом застосування KCCM10910P [33] З метою одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим рецептором для фага штам KCCM10910P (корейський патент №: 10-0966324) застосовували як материнський штам. Згодом одержували касету для інактивації гена кожного рецептора для фага і згодом її застосовували для забезпечення генетичної трансформації. [34] 1-1. Одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном nfrA [35] З метою одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном nfrA одержували касету для інактивації гена nfrA. Касету застосовували у способі одностадійної інактивації, який являє собою методику конструювання мутанта із застосуванням рекомбінази Red фага лямбда, розроблену Datsenko KA et al. (Proc Natl Acad Sci USA, (2000) 97:6640-6645). Для підтвердження вставки касети в ген застосовували ген стійкості до хлорамфеніколу pUCprmfmloxC як маркер (викладена публікація корейського патенту №: 2009-007554). [36] Фрагмент ДНК розміром 1,1 т.п.о., який містить частину послідовності гена nfrA (SEQ ID NO: 39) та частину послідовності основ гена стійкості до хлорамфеніколу pUCprmfmloxC, одержували шляхом застосування набору праймерів під SEQ ID NO: 2 та 3. У цьому випадку полімеразну ланцюгову реакцію (яка далі в даному документі згадується як "ПЛР") проводили шляхом застосування набору готових сумішей для ПЛР (тобто продукту компанії BIONEER, далі в даному документі застосовували той самий продукт) за наступних умов: 27 циклів денатурації за 95℃ протягом 30 секунд, відпалювання за 56℃ протягом 30 секунд та елонгація за 72℃ протягом 1 хвилини. Продукт ПЛР піддавали електрофорезу в 0,8 % агарозному гелі та згодом елюювали. Після цього знову проводили ПЛР шляхом застосування елюйованого продукту як матриці та набору праймерів, викладених під SEQ ID NO: 1 та 4 за тих самих умов, що описані вище, в результаті чого одержували фрагмент ДНК розміром приблизно 1,2 т.п.о. Фрагмент ДНК піддавали електрофорезу на 0,8 % агарозному гелі, елюювали і згодом зрештою застосовували для одержання касети для інактивації гена nrfA. [37] З метою одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном nfrA одержували штам, що виробляє треонін (KCCM10910P), який трансформували плазмідою pKD46 згідно зі способом, розробленим Datsenko KA et al. (Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645), як компетентний штам. Згодом ДНК касети, одержаної для інактивації гена nfrA, вводили у штам для забезпечення трансформації. [38] Одержаний штам піддавали відбору на чашках з LB на наявність стійкості до хлорамфеніколу. Інакше кажучи, набір праймерів під SEQ ID NO: 5 та 6, які мають послідовність ДНК, розташовану за межами двох кінців послідовності касети для геномної інактивації, 4 UA 114997 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гомологічної nfrA, застосовували для відбору за допомогою цього колоній, в яких розмір одержаного в результаті продукту ПЛР зменшувався від 2,8 т.п.о. до 1,5 т.п.о. [39] З первинного рекомбінантного штаму зі стійкістю до хлорамфеніколу видаляли плазміду pKD46, а згодом в нього вводили плазміду pJW168 для видалення маркерного гену стійкості до хлорамфеніколу з мікробних клітин (Gene, (2000) 247,255-264). Згодом проводили ПЛР із застосуванням набору праймерів під SEQ ID NO: 5 та 6 з одержанням ДНК-продукту розміром 0,4 т.п.о., що вказувало на те, що одержаний зрештою штам мав зменшений розмір ДНК. Відповідно, одержували штам, що виробляє L-треонін, з інактивованим геном nfrA (KCCM10910PΔnfrA). [40] 1-2. Одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном nfrB [41] З метою одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном nfrB (SEQ ID NO: 41) одержували касету для інактивації гена nfrB таким же чином, як і при одержанні касети для інактивації гена nfrA з прикладу 1-1. Фрагмент ДНК розміром 1,1 т.п.о. одержували шляхом застосування набору праймерів під SEQ ID NO: 8 та 9 і згодом одержували фрагмент ДНК розміром 1,2 т.п.о. шляхом застосування набору праймерів під SEQ ID NO: 7 та 10. [42] Спосіб одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном nfrB здійснювали за допомогою того ж самого способу, який описаний у прикладі 1-1, де набір праймерів під SEQ ID NO: 11 та 12 застосовували для підтвердження розміру одержаного в результаті продукту ПЛР. Відповідно, зрештою одержували штам, що виробляє L-треонін, з інактивованим геном nfrB (KCCM10910PΔnfrB). [43] 1-3. Одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном nfrAB [44] З метою одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном nfrAB (SEQ ID NO: 43) одержували касету для інактивації гена nfrAB таким же чином, як і при одержанні касети для інактивації гена nfrA з прикладу 1-1. Фрагмент ДНК розміром 1,1 т.п.о. одержували шляхом застосування набору праймерів під SEQ ID NO: 2 та 9 і згодом одержували фрагмент ДНК розміром 1,2 т.п.о. шляхом застосування набору праймерів під SEQ ID NO: 1 та 10. [45] Спосіб одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном nfrAB здійснювали за допомогою того ж самого способу, який описаний у прикладі 1-1, де набір праймерів під SEQ ID NO: 5 та 12 застосовували для підтвердження розміру одержаного в результаті продукту ПЛР. Відповідно, зрештою одержували штам, що виробляє L-треонін, з інактивованим геном nfrAB (KCCM10910PΔnfrAB). [46] 1-4. Одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном tsx [47] З метою одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном tsx (SEQ ID NO: 44) одержували касету для інактивації гена tsx таким же чином, як і при одержанні касети для інактивації гена nfrA з прикладу 1-1. Фрагмент ДНК розміром 1,1 т.п.о. одержували шляхом застосування набору праймерів під SEQ ID NO: 13 та 14 і згодом одержували фрагмент ДНК розміром 1,2 т.п.о. шляхом застосування набору праймерів під SEQ ID NO: 15 та 16. [48] Спосіб одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном tsx здійснювали за допомогою того ж самого способу, який описаний у прикладі 1-1, де набір праймерів під SEQ ID NO: 17 та 18 застосовували для підтвердження розміру одержаного в результаті продукту ПЛР. Відповідно, зрештою одержували штам, що виробляє L-треонін, з інактивованим геном tsx (KCCM10910PΔtsx). [49] 1-5. Одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном fhuA [50] З метою одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном fhuA (SEQ ID NO: 46) одержували касету для інактивації гена fhuA згідно зі способом одноетапної інактивації, описаним вище. З метою одержання фрагмента ДНК з послідовністю основ, яка характеризується гомологією з послідовністю гена fhuA, застосовували набір праймерів під SEQ ID NO: 19 та 20 і набір праймерів під SEQ ID NO: 21 та 22, в результаті чого одержували продукти ПЛР. Крім того, з метою одержання фрагмента ДНК з послідовністю основ, яка зумовлює стійкість до хлорамфеніколу, застосовували набір праймерів під SEQ ID NO: 23 та 24, в результаті чого одержували продукт ПЛР. Відповідно, ці три одержані в результаті продукти ПЛР піддавали електрофорезу на 0,8 % агарозному гелі і згодом елюювали. ПЛР проводили шляхом застосування цих трьох елюйованих продуктів ПЛР як матриць та набору праймерів під SEQ ID NO: 19 та 22 з одержанням касети для інактивації гена fhuA. [51] З метою одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном fhuA одержували касету для інактивації гена fhuA за допомогою того ж самого способу, який описаний у прикладі 1-1, де набір праймерів під SEQ ID NO: 25 та 26 застосовували для підтвердження розміру одержаних в результаті продуктів ПЛР. Відповідно, зрештою одержували штам, що виробляє L-треонін, з інактивованим геном fhuA (KCCM10910PΔfhuA). [52] 1-6. Одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном lamB 5 UA 114997 C2 5 10 15 20 25 [53] З метою одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном lamB (SEQ ID NO: 48) одержували касету для інактивації гена lamB за допомогою того ж самого способу, який описаний у прикладі 1-1. Фрагмент ДНК розміром 1,1 т.п.о. одержували шляхом застосування набору праймерів під SEQ ID NO: 27 та 28 і згодом одержували фрагмент ДНК розміром 1,2 т.п.о. шляхом застосування набору праймерів під SEQ ID NO: 29 та 30. [54] Спосіб одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном lamB здійснювали за допомогою того ж самого способу, який описаний у прикладі 1-1, де набір праймерів під SEQ ID NO: 31 та 32 застосовували для підтвердження розміру одержаного в результаті продукту ПЛР. Відповідно, зрештою одержували штам, що виробляє L-треонін, з інактивованим геном lamB (KCCM10910PΔlamB). [55] 1-7. Одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном btuB [56] З метою одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном btuB (SEQ ID NO: 50) одержували касету для інактивації гена btuB за допомогою того ж самого способу, який описаний у прикладі 1-1. Фрагмент ДНК розміром 1,1 т.п.о. одержували шляхом застосування набору праймерів під SEQ ID NO: 33 та 34 і згодом одержували фрагмент ДНК розміром 1,2 т.п.о. шляхом застосування набору праймерів під SEQ ID NO: 35 та 36. [57] Спосіб одержання штаму, що виробляє треонін, з інактивованим геном btuB здійснювали за допомогою того ж самого способу, який описаний у прикладі 1-1, де набір праймерів під SEQ ID NO: 37 та 38 застосовували для підтвердження розміру одержаного в результаті продукту ПЛР. Відповідно, зрештою одержували штам, що виробляє L-треонін, з інактивованим геном btuB (KCCM10910PΔbtuB). [58] Приклад 2. Порівняння ефективності вироблення L-треоніну серед рекомбінантних мікроорганізмів [59] Рекомбінантні мікроорганізми, одержані згідно з прикладом 1, культивували в середовищі для титрування треоніну, яке містило композиції, наведені в таблиці 1 нижче, у колбі Ерленмеєра. Згодом підтверджували наявність у рекомбінантних мікроорганізмів здатності до вироблення L-треоніну. [60] Таблиця 1 Композиція Глюкоза KH2PO4 (NH4)2SO4 MgSO4·H2O FeSO4·H2O MnSO4·H2O DL-метіонін Екстракт дріжджів Карбонат кальцію pH Концентрація (на літр) 70 г 2г 27,5 г 1г 5 мг 5 мг 0,15 г 2г 30 г 6,8 30 [61] 1 платинову петлю кожного з 7 типів штамів E. coli з прикладу 1 та штаму KCCM10910P, які культивували протягом ночі у твердому середовищі LB в інкубаторі за 33℃, інокулювали в 25 мл середовища для титрування, яке містило композиції, наведені в таблиці 1 вище, і згодом культивували в інкубаторі за 33℃ та за 200 об./хв. протягом 48 годин. 35 6 UA 114997 C2 [62] Таблиця 2 Штам KCCM 10910P (материнський штам) KCCM 10910PΔnfrA KCCM 10910PΔnfrB KCCM 10910PΔnfrAB KCCM 10910PΔtsx KCCM 10910PΔfhuA KCCM 10910PΔlamB KCCM 10910PΔbtuB 5 10 15 20 25 30 35 40 Споживання цукру (г/л) 30 годин 22 26 26 26 25 24 20 21 L-треонін (г/л) 48 годин 34,5 34,5 34,4 34,4 34,4 34,5 34,5 34,5 [63] Як показано в таблиці 2 вище, було підтверджено, що показники інтенсивності споживання цукру для штамів, кожен з яких мав інактивовані гени nfrA, nfrB, nfrAB, tsx та fhuA, були вищими, ніж інтенсивність споживання цукру для материнського штаму (KCCM10910P). Також було підтверджено, що продуктивність штамів не знижувалася протягом 48-годинного періоду. У той же час було підтверджено, що показники інтенсивності споживання цукру для штамів, кожен з яких мав інактивовані гени lamB та btuB, були подібними до інтенсивності споживання цукру для материнського штаму або дещо нижчими, ніж інтенсивність споживання цукру для материнського штаму. Також було підтверджено, що всі концентрації L-треоніну, показані для штамів у культурі через 48 годин, були подібними. Штами, кожен з яких мав інактивовані гени nfrA, nfrB та nfrAB, зумовили однакові результати культивування. Інакше кажучи, у випадку, в якому один з двох генів було піддано делеції, та у випадку, в якому обидва гени було піддано делеції, одержали однакові результати. [64] Приклад 3. Одержання штамів з ефективною комбінацією мутацій та порівняння їх здатності до вироблення L-треоніну [65] 3-1. Одержання штамів з одночасно інактивованими генами nfrAB та fhuA, одночасно інактивованими генами nfrAB та tsx і одночасно інактивованими генами nfrAB, tsx та fhuA [66] З метою підтвердження того, що у випадку спільної інактивації генів nfrAB, fhuA та tsx, яка характеризується підвищенням здатності до споживання цукру, штами, що виробляють Lтреонін, набувають додаткової здатності до споживання цукру, одержували штам KCCM10910PΔnfrABΔfhuA, штам KCCM10910PΔnfrABΔtsx та штам KCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuA. З метою одержання цих штамів одержували штами, кожен з яких мав інактивовані гени fhuA та tsx, відповідно до штаму KCCM10910PΔnfrAB з прикладу 1-3 таким же чином, як описано в прикладі 1 (з одержанням у результаті штамів KCCM10910PΔnfrABΔfhuA та KCCM10910PΔnfrABΔtsx). Крім того, одержували штам з інактивованим геном fhuA відповідно до штаму KCCM10910PΔnfrABΔtsx, одержуючи, таким чином, зрештою штам KCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuA. [67] Як показано у таблиці 2, було визначено, що штами з інактивованими генами nfrA, nfrB та nfrAB мають однакові ефекти поміж себе. У зв'язку з цим в одержанні штамів з ефективними комбінаціями мутацій одержували штами з інактивованими генами tsx та fhuA шляхом застосування штаму з інактивованим геном nfrAB. Проте було визначено, що ефекти штамів з інактивованими генами tsx та fhuA є такими ж, що й ефекти штаму з єдиним інактивованим геном nfrA, з єдиним інактивованим геном nfrB або з одночасно інактивованими генами nfrA та nfrB. [68] 3-2. Порівняння здатності штамів з ефективними комбінаціями мутацій до вироблення Lтреоніну [69] З метою порівняння здатності штамів з ефективними комбінаціями мутацій, одержаних вище, до вироблення L-треоніну середовище, яке містило композиції, наведені в таблиці 1 вище, застосовували для культивування штамів таким же чином, як описано вище. Результати показано в таблиці 3 нижче. 7 UA 114997 C2 [70] Таблиця 3 Штам KCCM10910P (материнський штам) KCCM10910PΔnfrAB KCCM10910PΔnfrABΔfhuA KCCM10910PΔnfrABΔtsx KCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuA 5 10 15 20 25 Споживання цукру (г/л) 30 годин 22 26 28 28 29 L-треонін (г/л) 48 годин 34,5 34,4 34,5 34,4 34,5 [71] У результаті тестування ефективності штаму KCCM10910PΔnfrABΔfhuA, штаму KCCM10910PΔnfrABΔtsx та штаму KCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuA, кожен з яких було одержано відповідно до спільної інактивації генів nfrAB, fhuA та tsx, яка характеризується підвищенням здатності до споживання цукру, було підтверджено, що в штаму, в якого було додатково інактивовано ген fhuA або ген tsx на додаток до мутації єдиного гена nfrAB, підвищувалася здатність до споживання цукру. Відповідно, трансформований штам KCCM10910PΔnfrAB E. coli, який демонстрував підвищену здатність до споживання цукру, одержав назву "E. coli CA038253P" і згодом був депонований у Корейському центрі культур мікроорганізмів (KCCM) 13 грудня 2013 р. (номер доступу: KCCM 11501P). [72] Приклад 4. Одержання штаму з інактивованим рецептором для фага шляхом застосування KCCM-10132 та порівняння його здатності до вироблення треоніну [73] 4-1. Одержання штаму з інактивованим рецептором для фага шляхом застосування KCCM-10132 [74] 10 типів штамів, кожен з яких мав інактивований рецептор для фага, одержували шляхом застосування штаму KCCM-10132 (див. таблицю 4 нижче) таким же чином, як описано в прикладах 1 та 3, відповідно до 7 типів касет для інактивації з прикладу 1. Штам KCCM-10132 було розкрито в заявці на корейський патент №: 10-0270510 як штам, що має здатність до вироблення треоніну, який походить від E. coli. [75] 4-2. Одержання штаму з інактивованим рецептором для фага шляхом застосування KCCM-10132 та порівняння його здатності до вироблення треоніну [76] 10 типів штамів, кожен з яких мав інактивований рецептор для фага, які одержували шляхом застосування штаму KCCM-10132 з прикладу 4-1, та материнський штам (KCCM-10132) культивували в середовищі, яке містило композиції, наведені в таблиці 1, за допомогою того ж самого способу, який описаний у прикладі 2. Згодом культивовані штами оцінювали шляхом порівняння їх здатності до вироблення треоніну. [77] 30 Таблиця 4 Штам KCCM-10132 (материнський штам) KCCM-10132ΔnfrA KCCM-10132ΔnfrB KCCM-10132ΔnfrAB KCCM-10132Δtsx KCCM-10132ΔfhuA KCCM-10132ΔlamB KCCM-10132ΔbtuB KCCM-10132ΔnfrABΔfhuA KCCM-10132ΔnfrABΔtsx KCCM-10132ΔnfrABΔtsxΔfhuA 35 Споживання цукру (г/л)30 годин 32 35 35 36 35 36 31 30 38 38 39 L-треонін (г/л) 48 годин 20,2 20,2 20,1 20,2 20,2 20,1 20,2 20,1 20,2 20,1 20,2 [78] Як показано в таблиці 4 вище, було підтверджено, що показники інтенсивності споживання цукру для штамів, кожен з яких мав інактивовані гени nfrA, nfrB, nfrAB, tsx та fhuA, були вищими, ніж інтенсивність споживання цукру для материнського штаму (KCCM-10132). Також було підтверджено, що продуктивність штамів не знижувалася протягом 48-годинного 8 UA 114997 C2 5 10 15 20 25 періоду. У той же час було підтверджено, що показники інтенсивності споживання цукру для штамів, кожен з яких мав інактивовані гени lamB та btuB, були подібними до інтенсивності споживання цукру для материнського штаму або дещо нижчими, ніж інтенсивність споживання цукру для материнського штаму. Також було підтверджено, що всі концентрації L-треоніну, показані для штамів у культурі через 48 годин, були подібними. Також було підтверджено, що штами, кожен з яких мав одночасно інактивовані гени nfrAB, fhuA, nfrAB та tsx, а також одночасно інактивовані гени nfrAB, tsx та fhuA, мали поліпшені показники інтенсивності споживання цукру порівняно з інтенсивністю споживання цукру для штаму з єдиним інактивованим геном nfrAB. [79] Приклад 5. Одержання штаму з інактивованим рецептором для фага шляхом застосування KCCM11166P та порівняння його здатності до вироблення треоніну [80] 5-1. Одержання штаму з інактивованим рецептором для фага шляхом застосування KCCM11166P [81] 7 типів штамів, що виробляють триптофан, кожен з яких мав інактивований рецептор для фага, одержували шляхом застосування KCCM11166P (корейський патент №: 10-1261147) таким же чином, як описано в прикладі 1, відповідно до 7 типів касет для інактивації з прикладу 1. [82] 5-2. Одержання штаму з інактивованим рецептором для фага шляхом застосування KCCM11166P та порівняння його здатності до вироблення треоніну [83] З метою оцінювання здатності до вироблення в 7 типів штамів, що виробляють триптофан, кожен з яких мав інактивований рецептор для фага, одержаних шляхом застосування штаму KCCM11166P з прикладу 5-1, застосовували середовище, яке містило композиції, наведені в таблиці 5 нижче. Інакше кажучи, мікробні клітини інокулювали за допомогою платинової петлі та згодом культивували протягом ночі у твердому середовищі LB. Після цього 1 платинову петлю кожної з мікробних клітин інокулювали в 25 мл середовища для титрування, яке містило композиції, наведені в таблиці 5 нижче, і згодом культивували в інкубаторі за 37℃ та за 200 об./хв. протягом 48 годин. Результати, одержані з ними, показано в таблиці 6 нижче. [84] 30 Таблиця 5 Композиція Глюкоза K2HPO4 (NH4)2SO4 MgSO4·H2O NaCl Цитрат натрію Екстракт дріжджів Карбонат кальцію Фенілаланін Тирозин pH Концентрація (на літр) 60 г 1г 10 г 1г 1г 5г 2г 40 г 0,15 г 0,1 г 6,8 [85] Таблиця 6 Штам KCCM11166P KCCM11166PΔnfrA KCCM11166PΔnfrB KCCM11166PΔnfrAB KCCM11166PΔtsx KCCM11166PΔfhuA KCCM11166PΔlamB KCCM11166PΔbtuB Споживання цукру (г/л) 33 години 56,8 59,5 59,5 59,5 60,2 59,5 57,0 56,2 9 OD 14,0 13,5 13,5 13,5 14,3 13,7 14,0 13,0 L-триптофан (г/л) 48 годин 7,2 7,2 7,2 7,2 7,1 7,1 7,1 7,2 UA 114997 C2 5 10 15 20 25 [86] Як показано в таблиці 6 вище, у випадку делеції кожного з генів nfrA, nfrB, nfrAB, tsx та fhuA було підтверджено, що кількості триптофану, вироблюваного штамами, кожен з яких мав інактивовані гени nfrA, nfrB, nfrAB, tsx та fhuA, були подібними, тоді як показники інтенсивності споживання цукру для штамів, кожен з яких мав інактивовані гени nfrA, nfrB, nfrAB, tsx та fhuA, були дещо вищими, ніж для інших. У той же час у випадку делеції кожного з генів lamB та btuB було підтверджено, що кількості триптофану, вироблюваного штамами, кожен з яких мав інактивовані гени lamB та btuB, або показники інтенсивності споживання цукру для штамів, кожен з яких мав інактивовані гени lamB та btuB, не змінювалися. [87] Приклад 6. Одержання штамів з ефективною комбінацією мутацій та порівняння їх здатності до вироблення L-триптофану [88] 6-1. Одержання штамів, що виробляють L-триптофан, з одночасно інактивованими генами nfrAB та fhuA, одночасно інактивованими генами nfrAB та tsx і одночасно інактивованими генами nfrAB, tsx та fhuA [89] З метою підтвердження того, що у випадку спільної інактивації генів nfrAB, fhuA та tsx, яка характеризується підвищенням здатності до споживання цукру, штами, що виробляють триптофан, набувають додаткової здатності до споживання цукру, одержували штам KCCM11166PΔnfrABΔfhuA, штам KCCM11166PΔnfrABΔtsx та штам KCCM11166PΔnfrABΔtsxΔfhuA. [90] 6-2. Порівняння здатності штамів з ефективною комбінацією мутацій до вироблення Lтриптофану [91] З метою порівняння здатності трьох типів штамів, одержаних згідно з прикладом 6-1, до вироблення L-триптофану середовище, яке містило композиції, наведені в таблиці 5 вище, застосовували для культивування штамів таким же чином, як описано в прикладі 5. Результати показано в таблиці 7 нижче. [92] Таблиця 7 Штам KCCM11166P KCCM11166PΔnfrAB KCCM11166PΔnfrABΔtsx KCCM11166PΔnfrABΔfhuA KCCM11166PΔnfrABΔtsxΔfhuA 30 35 40 Споживання цукру (г/л) 33 години 56,8 59,5 61,0 60,5 62,0 OD L-триптофан (г/л) 48 годин 14,0 13,5 14,0 13,8 14,0 7,2 7,2 7,2 7,1 7,2 [93] У результаті тестування ефективності штамів, що виробляють триптофан, з ефективними комбінаціями мутацій було підтверджено, що в штамів, в яких було додатково інактивовано ген fhuA та/або ген tsx на додаток до мутації єдиного гена nfrAB, підвищувалася здатність до споживання цукру. [94] Слід розуміти, що ілюстративні варіанти здійснення, описані в даному документі, слід розглядати лише в описовому сенсі, а не з метою обмеження. Описи ознак або аспектів у кожному варіанті здійснення зазвичай слід розглядати як застосовні до інших подібних ознак або аспектів в інших варіантах здійснення. Хоча один або декілька варіантів здійснення даного винаходу були описані з посиланням на фігури, середнім фахівцям в даній галузі буде зрозуміло, що в них можна здійснити різноманітні зміни форми та деталей без відступу від сутності та обсягу даного винаходу, визначених наступною формулою винаходу. [95] [Номер доступу] [96] Депозитарій: Корейський центр культур мікроорганізмів (міжнародний) [97] Номер доступу: KCCM11501P [98] Дата депонування: 13 грудня 2013 р. [99] 45 10 UA 114997 C2 [100] БУДАПЕШТСЬКИЙ ДОГОВІР ПРО МПКНАРОДНЕ ВИЗНАННЯ ДЕПОНУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ З МЕТОЮ ПАТЕНТНОЇ ПРОЦЕДУРИ РОЗПИСКА ПРО ОТРИМАННЯ У ВИПАДКУ ПЕРВІСНОГО ДЕПОНУВАННЯ, видана згідно з Правилом 7.1 МПКНАРОДНИМ ОРГАНОМ ПО ДЕПОНУВАННЮ, вказаним у нижній частині даної сторінки Кому: СіДжей ЧейлДжеданг Корпорейшн СІДЖЕЙ ЧЕЙЛДЖЕДАНГ ЦЕНТР, 330, ДОНГХО-РО, ДЖАНГ-ГУ, СЕУЛ 100-400, РЕСПУБЛІКА КОРЕЯ I. ІДЕНТИФІКАЦІЯ МІКРООРГАНІЗМУ Розпізнавальне посилання, присвоєне Реєстраційний номер, присвоєний ДЕПОЗИТОРОМ: МПКНАРОДНИМ ОРГАНОМ ПО CA03-8253P Escherichia coli ДЕПОНУВАННЮ KCCM11501P II. НАУКОВИЙ ОПИС ТА/АБО ЗАПРОПОНОВАНЕ ТАКСОНОМІЧНЕ ПОЗНАЧЕННЯ Мікроорганізм, вказаний у розділі I вище, супроводжувався:  науковим описом  запропонованим таксономічним позначенням (Необхідне відмітити хрестиком) III. РОЗПИСКА ПРО ОТРИМАННЯ ТА ПРИЙОМ Даний Міжнародний орган по депонуванню приймає мікроорганізм, вказаний у розділі I вище, 1 отриманий органом 13 грудня 2013 року (дата первісного депонування) V. МПКНАРОДНИЙ ОРГАН ПО ДЕПОНУВАННЮ Назва: Корейський центр культур Підпис(и) особи (осіб), уповноваженої(их) мікроорганізмів представляти Міжнародний орган по Адреса: Юрім Б/Д депонуванню, або уповноваженої(их) 45, Гондженає-2га-гіл посадової(их) особи (осіб): Содемунгу СЕУЛ 120-861 Республіка Корея Дата: 13 грудня 2013 р. 1 Згідно з Правилом 6.4(d) цією датою є дата отримання статусу від міжнародного органу по депонуванню; у випадку, якщо після отримання статусу від міжнародного органу по депонуванню депонування не проведено згідно з Будапештським договором, та воно перетворюється в депонування згідно з Будапештським договором, то цією датою є дата отримання мікроорганізму Міжнародним органом по депонуванню. Бланк BP/4 Єдина сторінка 11 UA 114997 C2 12 UA 114997 C2 13 UA 114997 C2 14 UA 114997 C2 15 UA 114997 C2 16 UA 114997 C2 17 UA 114997 C2 18 UA 114997 C2 19 UA 114997 C2 20 UA 114997 C2 21 UA 114997 C2 22 UA 114997 C2 23 UA 114997 C2 24 UA 114997 C2 25 UA 114997 C2 26 UA 114997 C2 27 UA 114997 C2 28