Агоніст аполіпопротеїну а-і (apoa-i), мультимірний apoa-i (варіанти), комплекс агоніста apoa-i і ліпіду та спосіб лікування дисліпідемічних порушень

1. Агоніст аполіпопротеїну A-I (АроА-І), що включає (і) пептид із 14-22 залишків або пептидний аналог, який утворює амфіпатичну a -спіраль в присутності ліпідів і який має формулу (І): Z1-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14Х15-Х16-Х17-Х18 , де Х1 представлений проліном (Р), аланіном (А), гліцином (G), аспарагіном (N), глутаміном (Q) або Dпроліном (р); X2 представлений аліфатичною амінокислотою; Х3 представлений лейцином (L); Х4 представлений кислою амінокислотою; Х5 представлений лейцином (L) або фенілаланіном (F); Х6 представлений лейцином (L) або фенілаланіном (F); Х7 представлений основною амінокислотою; X8 представлений кислою амінокислотою; Х9 представлений лейцином (L) або триптофаном (W); Х10 представлений лейцином (L) або триптофаном (W); Х11 представлений кислою амінокислотою або аспарагіном (N); Х12 представлений кислою амінокислотою; 2 (19) 1 3 71554 4 Х5 представлений лейцином (L) або фенілаланіХ3 представлений лейцином (L); ном (F); X4 представлений аспарагіновою кислотою (D) або Х6 представлений лейцином (L) або фенілаланіглутаміновою кислотою (Е); ном (F); Х5 представлений лейцином (L) або фенілаланіХ9 представлений лейцином (L) або триптофаном ном (F); (W); Х6 представлений лейцином (L) або фенілаланіХ10 представлений лейцином (L) або триптофаном ном (F); (W); Х7 представлений аргініном (R), лізином (К) або Х13 представлений лейцином (L), триптофаном (W) орнітином; або фенілаланіном (F); X8 представлений аспарагіновою кислотою (D) або Х17 представлений лейцином (L); і глутаміновою кислотою (Е); принаймні один із залишків Х4 , Х7, X8, Х11 , Х12, Х14, Х9 представлений лейцином (L) або триптофаном Х15, Х16 і X18 замінений по консервативному типу (W); на інший залишок. Х10 представлений лейцином (L) або триптофаном 6. Агоніст Аро А-І за п. 3, в якому гідрофільні зали(W); шки фіксовані у відповідності зі структурною форХ11 представлений глутаміновою кислотою (Е) або мулою (І), а принаймні один нефіксований залишок аспарагіном (N); замінений по консервативному типу на інший заХ12 представлений глутаміновою кислотою (Е); лишок. Х13 представлений лейцином (L), триптофаном (W) 7. Агоніст АроА-І за п. 6, в якому: або фенілаланіном (F); Х4 представлений аспарагіновою кислотою (D) або Х14 представлений аргініном (R), лізином (К) або глутаміновою кислотою (Е); орнітином; Х7 представлений аргініном (R), лізином (К) або Х15 представлений глутаміном (Q) або аспарагіном орнітином; (N); Х8 представлений аспарагіновою кислотою (D) або Х16 представлений аргініном (R), лізином (К) або глутаміновою кислотою (Е); орнітином; Х11 представлений аспарагіном (N) або глутаміноХ17 представлений лейцином (L); і вою кислотою (Е); X18 представлений аргініном (R), лізином (К) або Х12 представлений глутаміновою кислотою (Е); орнітином. Х14 представлений лізином (К), аргініном (R) або 15. Агоніст АроА-І за п. 1, який вибирають з групи, орнітином; що включає: Х15 представлений глутаміном (Q) або аспарагіном (N); Х16 представлений лізином (К), аргініном (R) або орнітином; Х18 представлений аспарагіном (N) або глутаміном (Q); і принаймні, один із залишків Х1, Х2, Х3, Х5 , Х6, Х9 , Х10, Х13 і Х17 замінений по консервативному типу на інший залишок. 8. Агоніст Аро А-І за п. 6, в складі якого Х3 представлений лейцином (L), Х6 представлений фенілаланіном (F), Х9 представлений лейцином (L) або триптофаном (W), Х10 представлений лейцином (L) або триптофаном (W) і принаймні один із залишків Х1 , Х2, Х5 , Х13 і Х17 замінений по консервативному типу на інший залишок. 9. Агоніст АроА-І за пп. 5 або 7, в складі якого замінюючий залишок класифікується в ту ж підгрупу, що і залишок, що замінюється. 10. Агоніст АроА-І за п. 1, що є делетованою формою формули (І). 11. Агоніст АроА-І за п. 10, в складі якого один виток спіралі пептиду або пептидного аналога делетований. 12. Агоніст АроА-І за п. 1, що є пептидом, що складається з 18 амінокислот або пептидним аналогом структурної формули (І). 13. Агоніст Аро А-І за п. 12, в складі якого: знак «-» між залишками означає групу -C(O)NH-; Z1 представлений H2N-; і Z2 представлений -С(O)ОН або відповідною сіллю. 14. Агоніст Аро А-І за п. 13, в якому: Х1 представлений проліном (Р), аланіном (А), гліцином (G), аспарагіном (N) або D-проліном (р); Х2 представлений аланіном (А), валіном (V) або лейцином (L), 5 71554 6 кожний LL незалежно представлений біфункціональним лінкером; кожний m незалежно є цілим числом від 0 до 1; кожний n незалежно є цілим числом від 0 до 8; Nya і Nyb незалежно є багатофункціональною зв'язуючою складовою, де уа і yb представляють число функціональних груп, відповідно, в Nya і N yb; кожний уа або yb незалежно є цілим числом від 3 до 8; р є цілим числом від 0 до 7; і кожний знак «-» незалежно означає ковалентний зв'язок. 24. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 23, в складі якого біфункціональний лінкер є таким, що розщеплюється. 25. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 23, в якому n дорівнює 0. 26. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 25, в якому m дорівнює 0. 27. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 23, в якому кожний НН незалежно один від одного є пептидом або в заблокованих за N-кінцем і (або) С-кінцем, за п. 13. або в незаблокованих по них формах. 28. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 23, в якому 16. Мультимірний агоніст АроА-І, який виявляє кожний НН незалежно один від одного є пептидом принаймні 38%-у активність по активації ферменту за п. 14. LCAT в порівнянні з АроА-І людини і який характе29. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 23, в якому ризується структурною формулою (II): кожний НН незалежно один від одного є пептидом HH-[LLm-HH]-nLLm-HH, (II) за п. 15. або його фармацевтично прийнятна сіль, де: 30. Мультимірний агоніст АроА-І, який виявляє кожний показник m незалежно один від одного є принаймні 38%-у активність по активації ферменту цілим числом від 0 до 1, n є цілим числом від 0 до LCAT в порівнянні з АроА-І людини і який характе10; ризується формулою (IV) або (V): кожний НН незалежно представляє пептид або пептидний аналог за п. 1; кожний LL незалежно представляє біфункціональний лінкер; і кожний знак «-» незалежно означає ковалентний зв'язок. 17. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 16, в складі якого біфункціональний лінкер є таким, що розщеплюється. 18. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 16, в якому n дорівнює 0. 19. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 18, в якому m дорівнює 0. 20. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 16, в якому кожний НН незалежно один від одного є пептидом IV за п. 13. або 21. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 16, в якому кожний НН незалежно один від одного є пептидом за п. 14. 22. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 16, в якому кожний НН незалежно один від одного є пептидом за п. 15. 23. Мультимірний агоніст АроА-І, який виявляє принаймні 38%-у активність по активації ферменту LCAT в порівнянні з АроА-І людини і який характеризується структурною формулою (III): X-N ya-X( ya-1)-(N yb-X( yb-1)) p, (III) або його фармацевтично прийнятна сіль, де: кожний Х незалежно представлений HH-(LLmHH)nLL m-НН, де V кожний НН незалежно представлений базовим або його фармацевтично прийнятна сіль, де: пептидом формули (І) або його аналогом, або мукожний Х незалежно представлений HH-(LLm -HH)тованим, укороченим, делетованим по внутрішnLL m-HH, де кожний HH незалежно представлений ньому положенню або добудованим варіантом пептидом або пептидним аналогом за п. 1; відповідно до описаного в даному тексті; 7 71554 8 кожний LL незалежно представлений біфункціона49. Фармацевтична композиція за п. 45, в якій агольним лінкером; ніст Аро А-І є пептидом за п. 15. кожний n незалежно є цілим числом від 0 до 1; 50. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. кожний m незалежно є цілим числом від 0 до 8; 45 - 49, в якій агоніст АроА-І знаходиться в формі R1 є -OR або -NRR; і комплексу з ліпідом, при тому, що згаданий комкожний R незалежно представлений Н, С1-С6плекс складається з агоніста АроА-І і ліпіду. алкілом, С1-С6-алкенілом, С1-С6-алкінілом, С5-С2051. Фармацевтична композиція за п. 50, в якій комарилом, С6-С26-алкарилом, 5-20-атомним гетероплекс агоніста АроА-І і ліпіду знаходиться в формі арилом або 6-26-атомним алкгетероарилом. ліофілизованого порошку. 31. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 30, в складі 52. Спосіб лікування суб'єкта, що страждає на заякого біфункціональний лінкер є таким, що розщехворювання, пов'язане з дисліпідемією, який відплюється. різняється тим, що згаданий спосіб включає етап 32. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 30, в якому n введення такому пацієнту ефективної кількості дорівнює 0. агоніста АроА-І за п. 1. 33. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 32, в якому 53. Спосіб за п. 52, який відрізняється тим, що m дорівнює 0. згаданим суб'єктом є людина. 34. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 30, в якому 54. Спосіб за п. 52, який відрізняється тим, що кожний НН незалежно один від одного є пептидом згаданому суб'єкту вводять від приблизно 0,5 мг/кг за п. 13. до приблизно 100 мг/кг агоніста АроА-І. 35. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 30, в якому 55. Спосіб за п. 52, який відрізняється тим, що кожний НН незалежно один від одного є пептидом агоніст АроА-І знаходиться в формі фармацевтичза п. 14. ної композиції, при тому, що згадана композиція 36. Мультимірний агоніст АроА-І за п. 30, в якому містить агоніст АроА-І і фармацевтично прийняткожний НН незалежно один від одного є пептидом ний носій, наповнювач або розчинник. за п. 15. 56. Спосіб за п. 52, який відрізняється тим, що 37. Комплекс агоніста АроА-І і ліпіду, що включає агоніст АроА-І знаходиться в формі комплексу агоагоніст АроА-І і ліпід, при тому, що агоніст АроА-І є ніста АроА-І і ліпіду, при тому, що згаданий компептидом або пептидним аналогом за п. 1, мульплекс складається з агоніста АроА-І і ліпіду. тимірним агоністом АроА-І за п. 16, мультимірним 57. Спосіб за п. 52, який відрізняється тим, що агоністом АроА-І за п. 23 або мультимірним агоніспов'язаним з дисліпідемією захворюванням є гітом АроА-І за п. 30. перхолестеринемія. 38. Комплекс агоніста АроА-І і ліпіду за п. 37, в 58. Спосіб за п. 52, який відрізняється тим, що якому агоніст АроА-І є пептидом за п. 12. пов'язаним з дисліпідемією захворюванням є сер39. Комплекс агоніста АроА-І і ліпіду за п. 37, в цево-судинне захворювання. якому агоніст АроА-І є пептидом за п. 13. 59. Спосіб за п. 52, який відрізняється тим, що 40. Комплекс агоніста АроА-І і ліпіду за п. 37, в пов'язаним з дисліпідемією захворюванням є атеякому агоніст АроА-І є пептидом за п. 14. росклероз. 41. Комплекс агоніста АроА-І і ліпіду за п. 37, в 60. Спосіб за п. 52, який відрізняється тим, що якому агоніст АроА-І є пептидом за п. 15. пов'язаним з дисліпідемією захворюванням є рес42. Комплекс агоніста АроА-І і ліпіду за п. 37, в теноз. якому ліпідом є сфінгомієлин. 61. Спосіб за п. 52, який відрізняється тим, що 43. Комплекс агоніста АроА-І і ліпіду за п. 37, який пов'язаним з дисліпідемією захворюванням є дезнаходиться в формі ліофілізованого порошку. фіцит HDL або АроА-І. 44. Комплекс агоніста АроА-І і ліпіду за п. 37, який 62. Спосіб за п. 52, який відрізняється тим, що знаходиться в формі розчину. пов'язаним з дисліпідемією захворюванням є гі45. Фармацевтична композиція, що містить агоніст пертригліцеридемія. АроА-І і фармацевтично прийнятний носій, напов63. Спосіб за п. 52, який відрізняється тим, що нювач або розчинник, при тому, що агоніст АроА-І пов'язаним з дисліпідемією захворюванням є меє пептидом або пептидним аналогом за п. 1, мультаболічний синдром. тимірним агоністом АроА-І за п. 16, мультимірним 64. Спосіб лікування пацієнта, що страждає від агоністом АроА-І за п. 23 або мультимірним агоніссептичного шоку, який відрізняється тим, що згатом АроА-І за п. 30. даний спосіб включає етап введення такому су46. Фармацевтична композиція за п. 45, в якій агоб'єкту е фективної кількості агоніста АроА-І за п. 1. ніст Аро А-І є пептидом за п. 12. 65. Спосіб за п. 64, який відрізняється тим, що 47. Фармацевтична композиція за п. 45, в якій агозгаданим суб'єктом є людина. ніст Аро А-І є пептидом за п. 13. 66. Спосіб за п. 64, який відрізняється тим, що 48. Фармацевтична композиція за п. 45, в якій агозгаданому суб'єкту вводять від приблизно 0,5 мг/кг ніст Аро А-І є пептидом за п. 14. до приблизно 100 мг/кг агоніста АроА-І. 1. Вступ Даний винахід стосується композицій агоністів аполіпопротеїну А-І (АроА-І) для лікування захворювань, пов'язаних із дисліпопротеїнемією, включаючи гіперхолестеринемію, серцево-судинні захворювання, атеросклероз, рестеноз і інші захворювання, такі як септичний шок. 2. Передумови для винаходу Холестерин, що циркулює в організмі, переноситься плазматичними ліпопротеїнами - комплекс 9 71554 10 ними частками, що складаються з білку і ліпіду, що VLDL, є апопротеїн В-100 і апопротеїн Е. Коли забезпечують транспорт ліпідів у крові. НизькомоVLDL досягає капілярів жирової тканини або м'я лекулярні ліпопротеїни (LDL) і високомолекулярні зів, тригліцериди що містяться в ньому, екстрагуліпопротеїни (HDL) є основними переносниками ються з утворенням нового типу часток, які харакхолестерину. Вважається, що LDL відповідають за теризуються зменшеним розміром і збагачені доставку холестерину з печінки (де він синтезуєтьефірами холестерину, але які зберігають обидва ся або з'являється з харчових джерел) до «поза«своїх» апопротеїна, - ці частки називають протеїпечінкові» тканин тіла. Термін «оборотний транснами із середньою щільністю (IDL). порт холестерину» характеризує транспорт У людини приблизно половина часток IDL холестерину з «позапечінкових» тканин назад в швидко виводиться з циркулюючої крові (протягом печінку, де він катаболізується і елімінується. Вва2-6 годин після їх утворення), оскільки вони тісно жається, що частки плазматичних HDL грають визв'язуються з клітинами печінки, які екстрагують значальну роль у процесі оборотного транспорхолестерин, з утворенням нових VLDL і жовчних ту, діючи по типу «прибиральника» тканинного кислот. Частки IDL, що не відбираються печінкою, холестерину. залишаються в кров'яному руслі довше. У цей час Доказів зв'язку між підвищенням рівня сироваапопротеїн Ε відщеплюється від часток, що циркуткового холестерину з ішемічною хворобою серця люють, перетворюючи їх у тип часток LDL, до безліч. Наприклад, атеросклероз є повільно проскладу яких входить єдиний білок - апопротеїн гресуючим захворюванням, що характеризується В-100. накопиченням холестерину в стінках артерії. ЗіУ першу чергу, печінка відбирає і розщеплює ставлення наявних доказів підтверджує концепцію, більшу частин у холестерину в жовчні кислоти, які є відповідно до якої ліпіди, що відкладаються в атекінцевими продуктами в метаболізмі холестерину. росклеротичних бляшках, є первинними продуктаПоглинання часток, що містять холестерин, опосеми плазматичних LDL; це пояснює популярне поредковується LDL-рецепторами, які присутні на значення LDL як «поганий холестерин». З іншого поверхні гепатоцитів у великій кількості. Рецептор боку, рівень сироваткових HDL зворотно пропорLDL зв'язує обидва апопротеїна - Ε та В-100, - і ційно корелює із ішемічною хворобою серця - дійвідповідає за зв'язування і вилучення як IDL, так і сно, високий рівень сироваткових HDL розглядаLDL із кровообігу. Проте, афінність апопротеїна Ε ється як її негативний фактор ризику. по відношенню до LDL-рецептора вища у порівПередбачається, що високий рівень плазматичнонянні з афінністю апопротеїна В-100. Отже, частки го HDL є не тільки чинником захисту від ішемічної LDL характеризуються більшою тривалістю життя хвороби серця, але і ще може обумовлювати розв циркулюючій крові у порівнянні з частками IDL смоктування атеросклеротичних бляшок (наприLDL знаходяться в ній у середньому 2,5 дня перед клад, див. Badimon et al., 1992, Circulation, 86, зв'язуванням на LDL-рецепторах у печінці та інших suppl. Ill, 86-94). Таким чином, традиційно HDL тканинах. Високій рівень сироваткового LDL («поназивають «добрим холестерином». ганий холестерин») «позитивно пов'язаний» із 2.1. Транспортування холестерину ішемічною хворобою серця. Наприклад, при атеСистема транспортування жирів може бути росклерозі холестерин похідний від циркулюючих підрозділена на дві підсистеми (механізму): екзоLDL накопичується в стінках артерій, що призвогенний механізм, призначений для холестерину і дить до утворення великих за розміром бляшок, тригліцеридів, що всмоктуються через стінки киякі порушують протік крові до утворення тромбів шечнику, і ендогенний механізм, призначений для включно, внаслідок чого просвіт артерії закривахолестерину і тригліцеридів, що потрапляють у ється, що обумовлює інфаркт або інсульт. кров'яне русло з печінки та інших «позапечінкоЗрештою кількість внутрішньоклітинного холевих» тканин. стерину, що визволяється з LDL, є чинником контПри екзогенному механізмі харчові жири упаролю метаболізму клітинного холестерину. Накоковуються в ліпопротеїнові частки, які називаються пичення клітинного холестерину, похідного від хіломікронами, що потрапляють у кров'яне русло і часток VLDL і LDL, контролює три процеси: попереносять тригліцериди, що містяться в них, у перше, воно обумовлює зниження синтезу клітинжирову тканину (для накопичення) і до м'язів (для ного холестерину за рахунок «вимикання» синтезу окислювання з виділенням енергії). Залишки хілоHMG-Ko A-редуктази, що є ключовим ферментом у мікронів, що містять ефіри холестерину, віддалябіосинтезі холестерину. По-друге, приток похідного ються з крові за рахунок ι активності специфічних від LDL-часток холестерину стимулює накопиченрецепторів, що знаходяться на поверхні гепатоциня холестерину за участю активуючої АС АТ - клітів. Такий холестерин потім стає доступним знову тинного ферменту, що перетворює холестерин на для клітинного метаболізму або для повторного ефіри холестерину, які і відкладаються у вигляді переносу до «позапечінкових» тканин у вигляді жирових крапель. По-третє, накопичення холестеплазматичних ліпопротеїнів. рину в клітинах забезпечує роботу механізму по При ендогенному механізмі печінка секретує типу зворотного зв'язку, що придушує клітинний значну частку екстранизькомолекулярного ліпопсинтез нових LDL-рецепторів. Отже, клітини контротеїна (VLDL) у кров'яне русло. Основу часток ролюють кількість своїх LDL-рецепторів на такому VLDL складають в основному тригліцериди, синтерівні, щоб кількість холестерину була достатньою зовані в печінці при наявності невеликої кількості для покриття потреб метаболізму, але без його ефірів холестерину (або синтезованих у печінці, перевантаження (огляд, див. Brown & Goldstein, або поновлених із хіломікронів). Двома переваж1990, In "The Pharmacological Basis of ними білками, що знаходяться на поверхні часток 11 71554 12 Therapeutics", 8-th ed., eds. Goodman & Gilman, 22-амінокислотних залишків, які розділені лінкерPergamon Press, NY, Ch. 36, pp.874-896). ними складовими, в ролі яких часто виступає про2.2. Зворотній транспорт холестерину лін,а в деяких випадках містять своєрідний мотив, У цілому, периферичні (непечінкові) клітини складений декількома залишками. АроА-І разом із одержують холестерин за рахунок сполучення ліпідами утворює три базових типи комплексів: місцевого синтезу і поглинання преформованого невеликі комплекси з низьким вмістом ліпідів, що стеролу з VLDL і LDL. З іншого боку зворотній позначаються як «пре-b1-HDL», сплощені дискотранспорт холестерину (ЗТХ) є механізмом, за подібні частки, що включають полярні ліпіди (фояким холестерин периферичних клітин може бути сфоліпіди і холестерин), що позначаються як «преповернутий у печінку для повторного переносу до b2-HDL»; і сферичні частки, що включають полярні «позапечінкових» тканин або екскреції до кишечі неполярні ліпіди, що позначаються як сферичні нику у вигляді жовчі, як у модифікованій формі, так або зрілі HDL (HDL3 і HDL2). Більшість HDL у попуі в окисленій формі у вигляді жовчних кислот. Меляції, що циркулює, включають Аро А-І і Аро А-ІІ ханізм ЗТХ надає єдиний спосіб видалення холес(другий основний білок HDL): у даному тексті для терину з більшості «позапечінкових» тканин і є них прийняте позначення «фракції AI/AII-HDL» у основним для підтримки структури і функцій більзагальній популяції HDL. Проте, фракція HDL, у шості клітин тіла. складі яких є тільки АроА-І (у даному тексті познаМе ханізм ЗТХ включає три базових етапи: (1) чається як «фракція AI-HDL»), очевидно, є більш вихід холестерину, тобто вихідне виділення холесефективною з точки зору механізму ЗТХ. Деякі терину з різноманітних груп периферичних кліепідеміологічні дослідження підтверджують гіпотетин; (2) етерифікація холестерину в результаті зу, відповідно до якої фракція AI-HDL є «антиатеактивності ферменту лецирогенною» (Раrrа et al., 1992, Arteriosclerosis & тин/холестеринацилтрансферази (LCAT), що заThrombosis, 12, 701-707; Decossin et al., 1997, Eur. побігає попаданню холестерину, що вийшов, наJ. Clin. Invest., 27, 299-307). зад в клітини; і (3) поглинання і доставка HDLХоча механізм переносу холестерину з клітинасоційованого ефіру холестерину в гепатоцити. ної поверхні (тобто «вихід холестерину з клітин») Ме ханізм ЗТХ опосередковується частками HDL. невідомий, вважається, що комплекс із низьким Термін «HDL» позначає ліпопротеїнові частки, які вмістом ліпідів, тобто «пре-b1-HDL», є кращим характеризуються високою щільністю. Основними акцептором для холестерину, який переноситься ліпідними компонентами HDL-комплексів є різновід периферичних тканин у механізмі ЗТХ (див. манітні фосфоліпіди, холестерин (ефір) і тригліцеDavidson et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 22975риди. Основними аполіпопротеїновими компонен22982; Bielicki et al., 1992, J. Lipid Res., 33, 1699тами є А-І і А-ІІ, що визначають функціональні 1709; Rothblad et al., 1992, J. Lipid Res., 33, 1091характеристики HDL; також є невелика кількість 1097; Kawano et al., 1993, Biochemistry, 32, 5025аполіпопротеїнів С-І, С-ІІ, С-ІII, D, Е, J та ін. Розмі5028; Kawano et al., 1997, Biochemistry, 36, 9816ри HDL можуть суттєво варіюватися і характеризу9825). У ході процесу вилучення холестерину з ватися різноманітним складом згаданих вище комклітинної поверхні пре-b1-HDL-частки швидко пепонентів, що залежить від характеру участі в ретворюються в частки пре-b2-HDL. Білок PLTP метаболічному каскаді процесу ЗТХ. може збільшувати швидкість утворення дископодіКлючовим ферментом, який залучений до мебних часток пре-b2-HDL, проте дані про роль PLTP ханізму ЗТХ, є фермент LCAT. LCAT в основному в ЗТХ відсутні. Фермент LCAT переважно активний виробляється в печінці і циркулює в плазмі крові у відношенні дископодібних і сферичних HDL, перазом із фракцією HDL. Фермент LCAT перетвореносячи 2-ацильну групу лецитина або інших форює клітинний холестерин в ефіри холестерину, сфоліпідів на вільний гідроксильний залишок у які опиняються в HDL, що призначені для видамолекули холестерину з утворенням складних лення. Внесок у подальше перетворення популяції ефірів холестерину (що залишаються в складі HDL, що циркулюють, вносять білки СЕТР (білокHDL) і лізолецитина. У реакції, контрольованої переносник ефірів холестерину) і PLTP (білокLCAT, у якості активатора необхідна участь АроАпереносник фосфоліпідів). СЕТР може переносити І: тобто АроА-І є природним кофактором ферменту ефіри холестерину, утворені в результаті активноLCAT. Перетворення холестерину в його складний сті LCAT, в інші ліпопротеїнові комплекси, зокрема ефір, що залишається в HDL, запобігає зворотнов АроВ-містячі ліпопротеїни, такі як VLDL і LDL. му потраплянню холестерину в клітини, у резульБілок PLTP забезпечує HDL лецитином. Тритаті чого ефіри холестерину призначаються до гліцериди, що входять до складу HDL, можуть кавидалення. Ефіри холестерину в зрілих частках таболізуватися за участю позаклітинної печінкової HDL у фракції AI-HDL (тобто, що включають АроАтригліцеридліпази, а холестерин, що входить до І, але не мають АроА-ІІ) видаляються печінкою і складу ліпопротеїнів знищується в печінці по кільпроцесуються в жовч більш ефективно, ніж матекох механізмах. ріал, отриманий із HDL, що включає АроА-І і АроАКожна частка HDL містить принаймні одну коІІ (фракція AI/AII-HDL). Це, принаймні почасти, пію (а звичайно від двох до чотирьох копій) АроА-І. може пояснюватися більш ефективним зв'язуванАроА-І синтезується печінкою і тонким кишечником ням часток AI-HDL на мембранах гепатоцитів. Рау вигляді препроаполіпопротеїну, що секретується ніше вже передбачалося існування HDLу вигляді пропротеїна, який швидко розщеплюрецептора, і нещодавно рецептор-«прибиральник» ється з утворенням зрілого поліпептиду, що SR-BI був ідентифікований як такий HDL - рецепскладається з 243 амінокислотних залишків. тор (Acton et al., 1996, Science, 271, 518-520; Xu et АроА-І як правило містить від 6 до 8 різноманітних al., 1997, J. Lipid Res., 38, 1289-1298). Рецептор 13 71554 14 SR-BI у найбільшій кількості експресований у стеконцентрації VLDL і індукція експресії клітинами роїдогенних тканинах (наприклад, у надниркових) і LDL-рецептора, у результаті чого знижується вив печінці (Landshuiz et al., 1996, J. Clin. In vest., 98, роблення і (або) посилюється катаболізм LDL. З 984-995; Rigotti et al., 1996, J. Biol. Chem, 271, використанням цих лікарських засобів пов'язані 33545-33549). такі побічні ефекти, як дисфункція печінки і нирок Виявилося, що білок-переносник СЕТР не грає (Physicians Desk Ref., Med. Economics Co. Inc., істотної ролі в процесі ЗТХ, але при цьому залучеMontvale, NJ, 1997). Нещодавно FDA дозволило ний у метаболізм ліпідів, похідних від VLDL і LDL. препарат аторвастатин (інгібітор HMG-KoAПроте, зміни активності СЕТР або його акцепторів редуктази, розроблений фірмою Parke-Davis, - VLDL і LDL - відіграє роль у процесах перетвоWarner Lambert), призначений для лікування рідкірення популяції HDL. Наприклад, у відсутність сних, але потребуючих інтенсивного втр учання СЕТР частки HDL перетворюються в збільшені випадків сімейної гіперхолестеринемії (1995, Scrip, частки, що не виводяться (див. огляди по ЗТХ і 20 [19], 10). HDL: Fielding & Fielding, 1995, J. Lipid Res., 36, 211Нікотинова кислота (ніацин) є водорозчинним 228; Barrans et al., 1996, Biochem. Biophys. Ada, В-вітамінним комплексом, використовуваним у 1300, 73-85; Hirano et al., 1997, Arteriosclerosis, якості харчової добавки й антигіперліпідемічного Thrombosis & Vascular Biol., 17, 1053-1059). засобу. Ніацин обумовлює придушення вироблен2.3. Сучасні засоби лікування дисліпопротеїня VLDL і ефективний у зниженні LDL. У деяких немій випадках він застосовується разом із полімерами, В даний час доступними є ряд засобів лікуванщо зв'язують жовчні кислоти. Ніацин при викорисня, націлених на зниження рівнів сироваткових танні його в адекватних дозах може збільшува ти холестерину і тригліцеридів (див., наприклад. вміст HDL, проте його застосування обмежується Brown & Goldstein, цит. вище). Проте, для кожного серйозними побічними ефектами при використанні з цих засобів характерні «свої» обмеження і склатаких високих доз. дності з погляду їхньої ефективності, виникнення Фібрати являють собою клас лікарських засопобічних ефектів і придатності для конкретної грубів, що забезпечують зниження рівня ліпідів, припи пацієнтів. значених для лікування різноманітних форм гіперПолімери, що зв'язують жовчну кислоту, предліпідемій (тобто випадків підвищення рівня ставляють клас лікарських засобів, що переривасироваткових тригліцеридів), що також можуть ють повторну циркуляцію жовчних кислот із тонкобути асоційовані з гіперхолестеринемією. Вважаго кишечнику в печінку - наприклад, холестирамін ється, що фібрати обумовлюють зниження вмісту фракції VLDL і істотне підвищення HDL - проте, (Questran LightÒ, Bristol-Myers Squibb) і xoлестипола гідрохлорид (Colestid, The Up John вплив цих препаратів на рівень сироваткового холестерину змінюється. У Сполучених Штатах АмеCo.). При пероральному застосуванні ці полімери, рики фібрати дозволені для використання в якості що характеризуються позитивним зарядом, зв'яантиліпідемічних засобів, проте, як засоби проти зуються в кишечнику з негативно зарядженими гіперхолестеринемії, вони не сертифіковані. Нажовчними кислотами. Оскільки такі полімери не можуть усмоктуватися з просвітку кишечнику, то приклад, клофібрат (AtromidÒ, WyatfrAyerst Lab.) є вони виводяться з організму разом із зав'язаними антиліпідемічним засобом, що обумовлює (по не на них жовчними кислотами. Проте, використання встановленому механізмі) зниження сироваткових таких полімерів у кращому випадку знижує рівень тригліцеридів за рахунок придушення фракції сироваткового холестерину приблизно на 20% і VLDL. Хоча рівень сироваткового холестерину при цьому асоціюється з виникненням побічних може бути знижений у деяких груп пацієнтів, біохіефектів у стравоварильному тракті, включаючи мічна реакція на цей препарат виявляється різнозапори і виникнення дефіциту по деяких вітамінах. манітною, і при цьому не завжди можна визначиБільше того, оскільки ці полімери зв'язують і інші ти, хто з пацієнтів досягне найбільш ефективних лікарські препарати, інші перорально ввідні медирезультатів. каменти повинні вводитися не менше ніж за 1 гоЯк було показано, препарат Atromid-SÒ не видину або ж через 4-6 годин після введення такого являє ефективності щодо ішемічної хвороби серполімеру: таким чином, ускладнюється режим ця. Споріднений по хімічних і фармакологічних прийому ліків пацієнтами-сердечниками. властивостях лікарський засіб - гемфіброзил Знижуючими рівень холестерину засобами є (LopidÒ, Parke-Davis) - є препаратом, що регулює статини: ці сполуки блокують синтез холестерину вміст ліпідів, що у середньому ступені знижує рівнаслідок придушення активності HMG-KoAвень сироваткових тригліцеридів і пов'язаного з редуктази - ключового ферменту в біосинтетичноVLDL холестерину й у середньому ступені збільму механізмі холестерину. Статини, наприклад, шує пов'язаний із HDL холестерин - тобто збільловастатин (MevacorÒ, Merck & З. Inc.) і правасташується вміст фракцій HDL2 і HDL3, так само як і тин (PravacholÒ, Bristol-Myers Squibb Co.), іноді фракції, що включає й АроА-І, і Аро А-ІІ (тобто використовуються в сполученні з полімерами, що фракції AI/AII-HDL). Проте, «ліпідна відповідь» зв'язують жовчні кислоти. Статини істотною мірою виявляється різноманітним, особливо при порівзнижують рівень сироваткового холестерину і рінянні різних груп пацієнтів. Більше того, оскільки вень LDL у сироватці крові, забезпечуючи зниженпрофілактика ішемічної хвороби серця була досяня прогресії коронарного атеросклерозу. Проте, гнута в популяції чоловіків у віці 40-55 років, в яких рівень сироваткового HDL холестерину збільшуішемічної хвороби не було ні в аналізі, ні по симпється лише середньою мірою. У механізмі ефекту томатиці, те незрозуміло, якою мірою можна ексзниження LDL може бути задіяне зниження траполювати ці дані на інші групи пацієнтів 15 71554 16 (наприклад, на жінок і чоловіків молодшого і старокремими варіантами HDL і зниженим ризиком шого віку). Дійсно, не спостерігалося скількирозвитку атеросклерозу в людини (Miller, 1987, небудь значимого ефекту стосовно групи пацієнтів Amer. Heart, 113, 589-597; Cheung et al., 1991, Lipid із наявною ішемічною хворобою серця. ЗастосуRes., 32, 383-394; Fruchart & Ailhaud, 1992, Clin, вання фібратів супроводжується серйозними побіChem., 38, 79). чними ефектами -наприклад, токсичністю, що веде По-друге, дослідження на тваринних моделях до злоякісних новоутворень (особливо до раку підтверджують захисну роль АроА-І (HDL). Лікушлунково-кишкового тракту), захворюваннями вання кроликів, раціон яких включав холестерин, жовчного пухиря і збільшенням рівня смертності шляхом введення АроА-І або HDL призводило в від причин, не пов'язаних із коронарними порутаких тварин до придушення розвитку і прогресушеннями. Ці лікарські засоби не призначені для вання бляшок (жирових нашарувань) (Koizumi et лікування пацієнтів, в яких єдиною аномалією меal., 1988, J. Lipid Res., 29, 1405-1415; Badimon et таболізму ліпідів є підвищений вміст LDL або зниal., 1989, Lab. Invest, 60, 455-461; Badimon et al., жений вміст HDL (Physician's Desk Ref., Med. 1990, J. Clin. Invest, 85, 1234-1241). Проте, ефекEconomics Co. Inc., Montvale, NJ, 1997). тивність такого лікування варіювалася в залежносТерапія на основі перорального заміщення есті від джерела HDL (Beitz et al., 1992, трогенів може бути застосована у випадках гіперProstaglandins, Leukotrienes & Essential Fatty Acids, холестеринемії середнього ступеня в жінок у пост47, 149-152; Mazdour et al., 1995, Atherosclerosis, клімактеричний період. Проте, збільшення вмісту 113, 237-246). HDL може супроводжуватися збільшенням рівня По-третє, прямий доказ ролі АроА-І було тригліцеридів. Лікування естрогенами, звичайно, отримано в експериментах на трансгенних твариобмежено конкретною групою пацієнтів (жінки піснах. Експресія людського гена, що кодують АроА-І, ля клімаксу) і пов'язане з проявом серйозних побіперенесеного мишам, генетично схильним до інчних ефектів, включаючи індукцію злоякісних нодукованого харчовими компонентами атеросклевотворів, захворювання жовчного пухиря, розу, забезпечувала захист від ушкоджень аорти тромбоемболію, аденому печінки, підвищений (Rubin et al., 1991, Nature, 353, 265-267). Трансген кров'яний тиск, непереносимість до глюкози і АроА-І також, як було показано, придушує атерогіперкальціємію. склероз у мишей, що характеризуються дефіцитом Таким чином, є необхідність у розробці більш апопротеїна Е, і в мишей, трансгенних за Арно(а) безпечних лікарських засобів, які б були ефективні (Paszty et al., 1994, J. Clin. Invest., 94, 899-903; в зниженні рівня сироваткового холестерину, збіPlump et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, льшенні вмісту HDL у сироватці крові, профілакти9607-9611; Liu et al., 1994, J. Lipid Res., 35, 2263ці ішемічної хвороби серця і (або) лікуванні вже 2266). Подібні результати були отримані при винаявної такої хвороби, а особливо атеросклерозу. вченні трансгенних кроликів, що експресують 2.4. Аро А-І, як мішень АроА-I людини (Duverger, 1996, Circulation, 94, 713Жоден з доступних у даний час лікарських за717; Duverger et al., 1996, Arteriosclerosis, Thromb. собів, призначених для зниження рівня холестериVascular Biol., 16, 1424-1429), і трансгенних пацюну, не забезпечує безпечного підвищення рівня ків, в яких підвищені рівні людського АроА-І забезHDL і стимулювання ЗТХ - більшість із них вплипечували захист від атеросклерозу і придушення ває на механізм транспорту холестерину, модурестеноза внаслідок балонної ангеопластики люючи усмоктування їжі, повторне циркулювання, (Burkey et al., 1992, Circulation, suppl. I, 86, 1-472, синтез холестерину й утворення популяції VLDL. Abstr. 1876; Burkey et al., 1995, J. Lipid Res., 36, Оскільки бажаним є створити лікарські засоби, 1463-1473). які б стимулювали вихід холестерину і його вивеУ механізмі ЗТХ більш ефективним вважаєтьдення, а також через наявність декількох можлися AI-HDL у порівнянні з фракцією AI/AII-HDL. Дових мішеней у системі ЗТХ - таких як LCAT, HDL і слідження, проведені на трансгенних мишах, що їхні х різноманітних компонентів (АроА-І, Аро А-II і несуть гени АроА-І або АроА-І+АроА-ІІ (АІ/АII) люфосфоліпіди), PLTP і СЕТР, то невідомо, яка з цих дини, показали, що білковий склад HDL істотною мішеней буде найбільш ефективною з погляду мірою впливає на його прояви - при цьому більш досягнення бажаного складу ліпопротеїнів і захисістотний антиатерогенний ефект був характерний ного ефекту. Зміна будь-якого одного компонента для AI-HDL у порівнянні з AI/AII-HDL (Schultz et al., в механізмі ЗТХ неминуче призведе до зміни скла1993, Nature, 365, 762-764). Паралельні досліду ліпопротеїнів, що циркулюють, і, відповідно, дження з використанням трансгенних мишей, що вплине на ефективність ЗТХ. експресують ген LCAT людини, показали, що деДеякі доказові дані, що засновуються на мояке зростання активності LCAT у значній мірі зміделях in vivo, указують на HDL і на його основні нює рівні пов'язаного з ліпопротеїнами холестерибілкові компоненти, яким є АроА-І, як на чинники ну і що LCAT має відчутну перевагу над фракцією запобігання атеросклеротичних ушкоджень і потеHDL, що включає АроА-I (Francone et al., 1995, J. нційного розсмоктування бляшок, тобто роблять їх Clin. Invest., 96, 1440-1448; Berard et al., 1997, привабливими мішенями для терапевтичного Nature Med, 3 [7], 744-749). У той час як ці дані втр учання. По-перше, є зворотна кореляційна запідтверджують важливу роль Аро А-І в активації лежність між концентрацією в сироватці АроА-І LCAT і стимуляції механізму ЗТХ, додаткові дослі(HDL) і процесами атерогенеза в чоловіків (Gordon дження вказують на наявність більш складного & Rifkind, 1989, New England J. Med., 321, 1311сценарію: основними компонентами, що забезпе1316; Gordon et al., 1989, Circulation, 79, 8-15). чують зміну виходу клітинного холестерину, є Дійсно, був встановлений взаємозв'язок між 17 71554 18 фосфоліпіди (Fournier et al., 1996, J. Lipid Res, 37, 634-644; Sparrow & Gotto, 1980, Ann. NY Acad. Sci., 1704-1711). 348, 187-211; Saprrow & Gotto, 1982, CRC Crit. Rev. З точки зору ймовірної ролі HDL, тобто АроА-І, Biochem., 13, 87-107; Sorci-Tho-mas et al., 1993, J. і асоційованого з ним фосфоліпіда, у захисті від Biol. Chem., 268, 21403-21409; Wang et al., 1996, атеросклерозу, були здійснені клінічні іспити на Biochim. Biophys. Acta, 174-184; Minnich et al., людині з використанням рекомбінантного АроА-І, 1992, J. Biol. Chem., 267, 16553-16560; Holvoet et що були припинені і потім відновлені компанією al., 1995, Biochemistry, 34, 13334-13342; SorciUCB (Бельгія) (Pharma-projects, 27 жовтня 1995 p.; Thomas et al., 1997, J. Biol. Chem., IMS R&D Focus, 30 червня 1997p.; Drug Status 272(11)7278-7284; Frank et al., 1997, Update, 1997, Atherosclerosis, 2(6), 261-265; також Biochemistry, 36, 1798-1806). див. M. Eriksson, "The Role of HDL in "Disease В одному з досліджень Фукусіма із співавт. Prevention", Конгрес, 7-9 листопада, 1996, Fort (Fukushima et al.) синтезували 22-амінокислотний Worth; Lacko & Miller, 1997, J. Lipid Res., 38, 1267пептид, що цілком складається з залишків Glu, Lys 1273; і міжнародна патентна заявка WO94/13819), і Leu, взаєморозташованих таким чином, щоб а також проводилися і були потім припинені Bioутворювати амфіпатичну a-спіраль із рівними гідTech (Pharma projects, 7 квітня 1989p.). Також порофільною і гідрофобною поверхнями (тобто чиналися іспити, у яких АроА-І використовували «ELK-пептид») (Fukushima et al., 1979, J. Amer. для лікування септичного шоку (Opal., Chem. Soc, 101(13) 3703-3704; Fukushima et al., "Reconstituted HDL as a Treatment Strategy for 1980, J. Biol. Chem., 255, 10651-10657). ELKSepsis", IBC's 7th Intern. Conf. on Sepsis, April 28пептид характеризується 41%-ою гомологією із 30, 1997, Washington, D.C.; Gouni et al., 1993, J. ділянкою амінокислот 198-219 у складі АроА-І. При Lipid Res., 94, 139-146; Levine, міжнародна патентпроведенні аналізу методом кількісної ультрафільна заявка WO96/04916). Проте, все це пов'язане з трації, гель-хроматографії і кругового дихроїзму існуванням різноманітних «пасток», пов'язаних з для цих ELK-пептидів було продемонстровано одержанням і застосуванням АроА-І, що не робефективне асоціювання з фосфоліпідами і забезлять його, неідеальним лікарським засобом: напечення імітації деяких фізичних і хімічних властиприклад, АроА-І є великим білком, одержання яковостей Аро А-І (Kaiser et al., 1983, Proc. Natl. Acad. го трудомістке і недешеве; при виробництві і Sci. USA, 80, 1137-1140; Kaiser et al -, 1984, відновленні повинні бути вирішені проблеми, поScience, 223, 249-255; Fukushima et al., 1980, цит. в'язані з можливістю тривалого збереження, довище; Nakagawa et al., 1985, J. Amer. Chem. Soc, ставкою активного компонента і часом на півжиття 107, 7087-7092). За результатами такого аналізу in vivo. Йокояма із співавт. дійшли висновку, що основним Беручи до уваги ці проблеми, були початі чинником забезпечення активності ферменту спроби для одержання пептидів, які б імітували LCAT є проста присутність великої амфіпатичної активність АроА-І. Оскільки ключовим для прояву структури (Yokoyama et al., 1980, J. Biol. Chem., активності АроА-І є наявність множинних повторів 255(15), 7333-7339). Пізніше було виявлено, що унікальної вторинної організації цього білку - амдимер такого 22-амінокислотного пептиду в більшій мірі імітує власти вості АроА-І у порівнянні з фіпатичної a-спіралі Α-класу (Segrest, 1974, FEBS Lett., 38, 247-253), - то основні зусилля при консвідповідним мономером: базуючись на отриманих труюванні пептидів, які б імітували активність даних було підтверджено, що такий 44-мерний АроА-І, були зосереджені на конструюванні пептипептид, що переривається у своїй середині «руйнівником» спіралі (або гліцином, або проліном), дів, які б і утворювали такі амфіпатичні a-спіралі являє собою мінімальний функціональний домен А-класу. білка АроА-І (Nakagawa et al., 1985, цит. ви ще). Амфіпатичні a-спіралі Α-класу є унікальними в В інших дослідженнях у якості моделі використому, що залишки позитивно заряджених амінокитовували амфіпатичні пептиди, названі «LAPслот кластеризовані в зоні гідрофобнопептидами» (Pownall et al., 1980, Proc. Natl. Acad. гідрофільного «інтерфейсу» (тобто зіткнення двох Sci. USA, 11(6), 3154-3158; Sparrow et al., 1981, In типів поверхонь білку), а залишки негативно заря"Peptides: Synthesis-Structure-Function", eds. Roch джених амінокислот сконцентровані на поверхні & Gross, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, pp.253гідрофільного сегмента. Далі, пептиди що мають 256). Базуючись на параметрах зв'язування ліпідів a-спіралі Α-класу характеризуються розміром гідіз фрагментами нативних аполіпопротеїнів, були рофобного кута, меншого за 180° (Segrest et al., сконструйовані декілька LAP-пептидів, позначених 1990, Proteins: Structure, Function & Genetics, 8, LAP-16, LAP-20 і LAP-24 (включають, відповідно, 103-117). Вихідні нові стратегії конструювання імі16, 20 і 24 амінокислотних залишки). Ці модельні таторів Аро А-І засновувалися не на первинних амфіпатичні пептиди не виявляють подібності поамінокислотних послідовностях аполіпопротеїнів, слідовності з аполіпопротеїнами і були сконструщо природно зустрічається, а на включення цих йовані так, щоб мати гідрофільні поверхні, органіунікальних спіралей Α-класу до складу послідовзовані відмінно від таких поверхонь, наявних у ності пептидних аналогів, так само як і деяких інскладі амфіпатичних спіралей Α-класу в аполіпопших властивостях доменів, наявних у складі АроАротеїнів (Segrest et al., 1992, J. Lipid Res., 33, 141І (див., наприклад, Davidson et al., 1996, Proc. Natl. 166). Виходячи з даних цих досліджень, автори Acad. Sci. USA, 93, 13605-13610; Rogers et al., роботи дійшли висновку, що наявність 20 аміноки1997, Biochemistry, 36, 288-300; Lins et al., 1993, слот є мінімально необхідним для забезпечення Biochim. Biophys. Acta, biomembranes, 1151, 137властивостей по зв'язуванню з ліпідами при моде142; Ji & Jonas, 1995, J. Biol. Chem., 270, 11290люванні амфіпатичних пептидів. 11297; Collet et al., 1997, J. of Lipid Res., 38, 19 71554 20 Дослідження, проведені на матеріалі мутант585-596). Послідовність була сконструйована шляних варіантів LAP20, в яких залишок проліну захом впливу найбільш кращого залишку по кожному ймав в амінокислотній послідовності різноманітні положенню гіпотетичних спіралей у складі АроА-І положення, показали, що є прямий взаємозв'язок людини. Як і у випадку з описаними вище пептиміж зв'язуванням ліпідів і активацією LCAT, але дами, спіраль, утворена даним пептидом, харакпри цьому ще і те, що сам по собі спіральний потеризується наявністю кластера позитивно зарятенціал такого пептиду не викликає активації ферджених амінокислот на гідрофільно-гідрофобній менту LCAT (Ponsin et al., 1986, J. Biol. Chem., поверхні і негативно заряджених амінокислот по 261(20) 9202-9205). Більше того, присутність такоцентру гідрофільної поверхні і розміром гідрофобго «руйнівника» спіралі (пролін) поблизу від сереного кута менше 180°. При тому, що димер такого дини даного пептиду знижує його афінність стосопептиду до деякої міри ефективний по активації вно фосфоліпідів, так само як і спроможність LCAT, що відповідає мономер виявляє слабкі влаактивувати LCAT. При тому, що деякі LAPстивості по зв'язуванню ліпідів (Venkatachalapathi пептиди, як було показано, зв'язуються з фосфоet al., 1991, цит. ви ще). ліпідами (Sparrow et al., цит. вище), проте залишаБазуючись у першу чергу на дослідженнях in ється спірним питання про той ступінь, із яким vitro, проведених на матеріалі описаних вище пепLAP-пептиди зберігають спіральну організацію в тидів, були сформульовані деякі «правила» консприсутності ліпідів (Buchko et al., 1996, J. Biol. труювання пептидів, які б імітували функції білку Chem., 271(6),3039-3045; Zhong et al., 1994, АроА-І. Істотним є те, що наявність амфіпатичної Peptide Res., 7(2), 99-106). a-спіралі, що має позитивно заряджені залишки, Сегре із співавт. (Segrest et al.) синтезували кластеризовані в області гідрофобно-гідрофільної пептиди, що складаються з 18-24 амінокислот, що поверхні, і негативно заряджені амінокислоти, клане виявляють гомології зі спіральними ділянками стеризовані по центру гідрофільної поверхні, неАроА-І (Kannelis et al., 1980, J. Biol. Chem, 255(5), обхідно для прояву ліпідної афінності й активації 11464-11472; Segrest et al., 1983, J. Biol. Chem, LCAT (Venkatachalapathi et al., 1991, цит. вище). 258, 2290-2295). Конкретні послідовності були скоТакож Анантарамайях із співавт. (Anantharamaiah нструйовані таким чином, щоб імітувати амфіпатиet al) встановили, що негативно заряджені залишчні спіральні домени Α-класу аполіпопротеїнів по ки глутамінової кислоти в 13-м положенні в складі таких параметрах, як гідрофобний момент консенсусного 22-амінокислотного пептиду, що (Eisenberg et al., 1982, Nature, 299, 371-374) і роззнаходиться в межах гідрофобної поверхні aподіл заряду (Segrest et al., 1990, Proteins, 8, 103спіралі, грає важливу роль в активації LCAT 117; патент США №4643988). Один із 18(Anantharamaiah et al., 1991, цит. вище). Більш амінокислотних пептидів, позначений як «пептидтого, Брассер (Brasseur) показав, що гідрофобний 18А», був сконструйований у якості моделі aкут (кут «pho») менше 180° є необхідною умовою спіралі Α-класу (Segrest et al., 1990, цит. вище). для оптимальної стабільності ліпіда і аполіпопроДослідження на матеріалі таких пептидів і інших теїна, а також для утворення дископодібних часпептидів, що характеризуються протилежним розток, в яких пептиди розташовані навколо краю ліподілом заряду, таких як «пептид-18К», чітко покапідного бішару (Brasseur, 1991, J. Biol. Chem., зали, що розподіл заряду є критичним для функці66(24) 16120-16127). Россено із співавт. (Rosseneu ональності параметром: пептиди з ревертованим et al.) також продемонстрували, що гідрофобний розподілом заряду виявляють знижену ліпідну кут менше 180° необхідний для активації ферменафінність порівнянну з імітаторами 18А Α-класу і ту LCAT (заявка WO93/25581). меншу спіральну складову в присутності ліпідів Проте, незважаючи на ці «правила», нікому не (Kanellis et al., 1980, J. Biol. Chem., 25, 11464вдалося сконструювати і виробити пептид, що був 11473; Anantharamaiah et al., 1985, J. Biol. Chem, би настільки ж активний, як і АроА-І - у найкращо260, 10248-10255; Chung et al., 1985, J. Biol. Chem, му варіанті була відзначена менше чим 40%-а від 260, 10256-10262; Epand et al., 1987, J. Biol. Chem, нативного АроА-І активність, що було визначено в 262, 9389-9396; Anantharamaiah et al., 1991, Adv. описаному в даній заявці тесті на активацію LCAT. Exp. Med. Biol, 285, 131-140). Жодний з описаних у науковій літературі пептидІнші синтетичні пептиди, що не мають подібних «імітаторів» не підходив для застосування ності з послідовністю аполіпопротеїнів, що були його в якості лікарського засобу. подані як такі, що мають обмежену ефективність, З урахуванням викладеного вище, є необхідвключають димери і тримери пептиду 18А ність розробки стабільного агоніста АроА-І, який (Anantharamaiah et al., 1986, Proteins Biol. Fluids, би імітував активність АроА-І і який би міг бути 34, 63-66), пептиди GALA і EALA (Subbarao et al., вироблений за допомогою відносно простої і не1988, Proteins: Structure, Function & Genet, 3, 187дорогої процедури. Проте, «правила» конструю198) і пептиди ID (Labeur et al., 1997, вання ефективних імітаторів АроА-І не були встаArteriosclerosis, Thrombosis & Vascular Biol, 17, 580новлені, а також залишилися невідомими 588) і пептид 18АМ4 (Brasseur et al., 1993, Biochim. принципи конструювання органічних молекул, що Biophys. Acta, 1170, 1-7). володіють функціями АроА-І. Також на базі послідовності спіралей АроА-І 3. Резюме винаходу людини був сконструйований «консенсусний» пепДаний винахід стосується агоністів АроА-І, тид, що складається з 22 амінокислот спроможних утворювати амфіпатичні a-спіралі, що (Anantharamaiah et al., 1980, Arteriosclerosis, 1001: забезпечують імітацію активності АроА-І, при тому, 95-105; Venkatachalapathi et al., 1991, Моl. щоб конкретні рівні активності, наприклад, одиниці Conform, and Biol. Interact, Ind. Acad. Sci., ser. B, активності (обумовлені відношенням активації 21 71554 22 LCAT до одиниці молекулярної маси) відповідали 3.1. Скорочення або перевищували такі показники нативної молекули. Зокрема, агоністами АроА-І по даному винаПо використанню в даному тексті прийняті ходу є пептиди або пептидні аналоги, які: утворютакі стандартні скорочення для генетично детерють амфіпатичні спіралі (в присутності ліпідів), мінованих L-амінокислот: зв'язують ліпіди, утворюють пре-b-подібні або HDL-подібні комплекси, активують LCAT, обумовОднолітерний Стандартна Амінокислота люють підвищення сироваткових рівнів фракцій символ абревіатура HDL і сприяють виходові холестерину з клітин. Аланін А Ala Даний винахід засновується, зокрема, на виАргінін R Arg конаних заявниками дослідженнях і відкриттях Аспарагін N Asn пептидів, які імітують функції АроА-І. Пептиди по Аспарагінова киD Asp даному винаходу були сконструйовані на основі слота передбачуваної спіральної структури й амфіпатиЦистеїн С Cys чних параметрів 22-амінокислотної консенсусної Глутамін Q Gin послідовності, що є похідною від спіральних поГлутамінова кисвторів у складі АроА-І. До подиву, пептиди по даΕ Glu лота ному винаходу мають специфічну активність, що Гліцин G Gly перевершує активність похідних від АроА-І пептиГістидин Η His дів, описаних у науковій літературі. Дійсно, деякі Ізолейцин I Ile варіанти по даному винаходу забезпечують 100% Лейцин L Leu активності нативного АроА-І, при тому, що деякі Лізин К Lys суперагоністи, подані тут, перевершують специфіМетіонін Μ Met чну активність нативного АроА-І. Один з аспектів даного винаходу також частФенілаланін F Phe ково ґрунтується на виявленні заявниками того, Пролін Ρ Pro що амінокислотні залишки 14-17 у складі консенСерин S Ser сусної 22-мерної послідовності Сегре можуть бути Треонін Τ Thr делетовані без втрати спроможності до активуТриптофан w Trp вання ферменту LCAT. У деяких випадках делетуТирозин Υ Tyr вання цих амінокислот призводить до посилення Валін ν Val активації LCAT. В іншому аспекті даного винаходу інші залишки в складі консенсусної послідовності Скорочення, використовувані для позначення можуть бути також делетовані з посиленням актиD-енантіомерів генетично детермінованих аміновності. Крім того, у деяких варіантах делетування кислот, є рядковими аналогами однолітерних поможе бути застосоване спільно зі змінами амінозначень. Наприклад, позначення «R» відповідає Lкислотних залишків. У деяких переважних варіанаргініну, а позначення «r» - D-аргініну. тах делетування чотирьох залишків із складу кон3.2. Визначення сенсусного 22-мерного пептиду Сегре По використанню в даному тексті такі терміни використовується в сполученні з замінами залишповинні прийматися в таких значеннях: ків 5, 9 і 13 на гідрофобні залишки лейцину. «Алкіл»: означає насичений розгалужений, неДаний винахід проілюстрований експерименрозгалужений або циклічний вуглеводневий радитальними прикладами, в яких описана структура, кал. Типовими алкільними групами, тим самим не готування і застосування конкретних амфіпатичних обмежуючись, є метил, етил, пропіл, ізопропіл, пептидів, що утворюють спіралі (в присутності лібутил, ізобутил, трет-бутил, пентил, ізопентил, підів), зв'язують ліпіди, утворюють комплекси і гексил і подібне. У переважних варіантах алкільпідвищують активність LCAT. Базуючись на струкною групою є С 1-С6-алкіл. турі й активності наведених у прикладах варіантів, «Алкеніл»: означає ненасичений розгалужезаявники розробили «звід правил», що може бути ний, нерозгалужений або циклічний вуглеводневий використаний для конструювання змінених або радикал, у складі якого є, принаймні, один міжвугмутованих форм, що також входять в обсяг даного лецевий подвійний зв'язок. Цей радикал може хавинаходу. рактеризуватися або цис-, або трансТакож даний винахід стосується фармацевтиконформацією щодо подвійного(подвійних) зв'язку чних композицій, що містять такі агоністи АроА-І (зв'язків). Типовими алкенільними групами, тим (або у вигляді самих пептидів, або у вигляді ліпопсамим не обмежуючись, є етеніл, пропеніл, ізоротеїнових комплексів) у якості активного компопропеніл, бутеніл, ізобутеніл, трет-бутеніл, пентенента, так само як і засобів одержання таких комніл, гексеніл іподібне. У переважних варіантах позицій і їхнього застосування для лікування алькенільною групою є С1-С6-алкеніл. захворювань, асоційованих із дисліпопротеїнемією «Алкініл»: означає ненасичений розгалужений, (наприклад, із серцево-судинними захворюваннянерозгалужений або циклічний вуглеводневий рами, атеросклерозом, метаболічним синдромом), дикал, у складі якого є принаймні один міжвуглерестенозом або появою в крові ендотоксинів (нацевий потрійний зв'язок. Типовими алкінільними приклад, як при септичному шоці). групами, тим самим не обмежуючись, є етиніл, пропініл, бутиніл, ізобутиніл, пентиніл, гексиніл і 23 71554 24 подібне. У переважних варіантах алькінільною іншим заступником. Переважними заступниками є групою є С 1-С6-алкініл. групи -OR, -SR, -NRR, -NO2, -CN, галоген, -C(O)R, «Арил»: означає ненасичений циклічний вугC(O)OR і -C(O)NR, де кожний R представлений Н, леводневий радикал, що характеризується кон'юалкілом, алкенілом, алкінілом, арилом, алкарилом, гованою електронною π-системою. Типовими аригетероарилом або алкгетероарилом. льними групами, тим самим не обмежуючись, є 4. Стислий опис креслень пента-2,4-дієн, феніл, нафтил, антрацил, азуленіл, На Фігурі 1А показана кругова схема структури хризеніл, короненіл, флуорантеніл, індаценіл, ідеспіралі Шиффера-Едмундсона ідеалізованої амфініл, оваленіл, периленіл, феналеніл, фенантреніл, патичної a-спіралі, в якої незафарбовані кільця піценіл, плейаденіл, піреніл, пірантреніл, рубіценіл позначають гідрофільні амінокислотні залишки, а і подібне. У переважних варіантах арильною затінені кільця представляють гідрофобні амінокигрупою є С5-С20-арил, а більш переважним є слотні залишки. С5-С10-арил. На Фігурі 1В показана схема ідеалізованої «Алкарил»: означає алкільну, алкенільную або амфіпатичної спіралі Фіг.1А у вигляді спіральної алкінільную групи з нерозгалуженим ланцюгом, у решітки. котрої один з атомів водню, приєднаних до. кінцеНа Фігурі 1С показана схема ідеалізованої вого атому вуглецю, заміщений арильною складоамфіпатичної спіралі Фіг.1А у вигляді спірального вою. Типовими алкарильними групами є, тим сациліндра. мим не вичерпуючись, бензил, бензилиден, На Фігурі 2А кругова схема структури спіралі бензилидин, бензолбензил, нафтенбензил і подібШиффера-Едмундсона для базового пептиду зі не. У переважних варіантах алкарильною групою є структурою (І), що ілюструє амфіпатичні властивоС6-С26алкарил, тобто алкільною, алкенільною або сті спіралі (незафарбовані кільця позначають гідалкінільною складовою алкарильної групи є С 1-С6рофільні амінокислотні залишки, затінені кільця алкіл, а арильною складовою є С 5-С20-арил. В представляють гідрофобні амінокислотні залишки, особливо переважних варіантах алкарильною груа кільця з похилим штрихуванням позначають пою є (С6-С13)алкарил, тобто алкільною, алкенільабо гідрофільні, або гідрофобні амінокислотні ною або алкінільною складовою алкарильної грузалишки). пи є (С1-С3)алкініл, а арильною складовою є На Фігурі 2В показана схема у вигляді спіраль(С5-С10)арил. ної решітки для базового пептиду зі структурою (І), «Гетероарил»: позначає арильную складову, що ілюстр ує гідрофобну поверхню спіралі. при тому, що один або декілька атомів вуглецю На Фігурі 2С показана схема у вигляді спіразаміщені іншим атомом, таким як N, Р, О, S, As, льної решітки для базового пептиду формули (І), Se, Si, Те і т.п. Типовими гетероарильними групащо ілюстр ує гідрофільну поверхню спіралі. ми є, тим самим не обмежуючись, акридарсин, На Фігурі 3А показана схема у вигляді спіральакридин, арсантридин, арсиндол, арсиндолин, ної решітки, що відображає гідрофільну поверхню карбазол, b-карболін, хромен, цинолін, фуран, пептиду 18А Сегре (DWLKAFYDKVAEKLKEAF; імідазол, індазол, індол, індолізин, ізоарсиндол, SEQ ID NO 244). ізоарсинолін, ізобензофуран, ізохромен, ізоіндол, На Фігурі 3В показана схема у вигляді спіральізофосфоіндол, ізофосфінолін, ізохінолін, ізотіаної решітки, що відображає гідрофільну поверхню зол, ізоксазол, нафтиридин, перимідин, фенантривзятого в якості прикладу базового пептиду 210 дин, фенантролин, феназин, фосфоіндол, фосфі(PVLDLFRELLEELKQKLK; SEQ ID NO 210). нолін, фталазин, птеридин, пурин, піран, піразин, На Фігурі 3С показана схема у вигляді спірапіразол, піридазин, піридин, піримідин, пірол, пірольної решітки, що ілюструє гідрофільну поверхню лізин, хіназолін, хінолін, хінолізин, хіноксалин, секонсенсусного 22-амінокислотного пептиду Сегре ленофен, телурофен, тіофен і ксантен. У перева(PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO 75). жних варіантах гетероарильною групою є 5-20На Фігурі 4А показана схема у вигляді спіральатомний гетероарил, а більш переважним є 5-10ної решітки, що відображає гідрофобну поверхню атомний гетероарил. пептиду 18А Сегре (SEQ ID NO 244). «Алкгетероарил»: позначає алкільну, алкеніНа Фігурі 4В показана схема у вигляді спіральльну або алкінільну групи з нерозгалуженим ланної решітки, що відображає гідрофобну поверхню цюгом, в якій один з атомів водню, приєднаних до взятого в якості прикладу базового пептиду 210 кінцевого атому вуглецю, заміщений гетероариль(SEQ ID NO 210). ною складовою. У переважних варіантах алкгетеНа Фігурі 4С показана схема у вигляді спірароарильна група подана 6-26-атомним алкгетерольної решітки, що ілюструє гідрофобну поверхню арилом, тобто в його складі алкільна, алкенільна консенсусного 22- амінокислотного пептиду Сегре або алкінільна складова алкгетероарила є С 1-С6(SEQ ID NO 75). групою, а гетероарил є 5-20-атомним гетероариНа Фігурі 5А показана схема у вигляді кругової лом. У конкретних переважних варіантах алкгетеспіралі по Шифферу-Едм ундсону для пептиду 18А роарилом є 6-13-атомний алкгетероарил, тобто Сегре (SEQ ID NO 244). алкільна, алкенільна або алкінільна складова На Фігурі 5В показана схема у вигляді кругової представляє собою 5-10-атомний гетероарил. спіралі по Шифферу-Едмундсону для обраного в «Заміщені алкіл, алкеніл, алкініл, арил, алкаякості прикладу 210 (SEQ ID NO 210). рил, гетероарил або алкгетероарил»: позначає На Фігурі 6А показана схема даного винаходу алкільну, алкенільну, алкінільну, арильну, алкариз розгалуженнями третього порядку. льну, гетероарильну або алкгетероарильну гр упу, в якій один або декілька атомів водню заміщені 25 71554 26 На Фігурі 6В показана схема даного винаходу Даний винахід проілюстрований робочими з розгалуженнями четвертого порядку. прикладами, в яких показано, що агоністи АроА-І На Фігурі 6С показана схема даного винаходу по даному винаходу є винятково ефективними по з розгалуженнями змішаних порядків. активації ферменту LCAT., що тим самим стимуНа Фігурі 6D показаний приклад схеми даного лює процес ЗТХ. Застосування агоністів Аро А-І по винаходу з розгалуженнями по залишках лізину. даному винаходу в тваринних моделях in vi vo На Фігурі 7А приведений графік, що відобраобумовлює підвищення концентрації сироватковожає розходження між виявленим хімічним зсувом го HDL. Більш докладно даний винахід описаний в Нa і хімічним зсувом Нa, табульованим для випадокремих розділах нижче, включаючи: склад і струкових спіралей, виявлених для пептиду 210 (SEQ ктуру пептидних агоністів Аро А-І, стр уктурні і фунID NO 210) і для консенсусного 22-амінокислотного кціональні характеристики, засоби одержання непептиду Сегре (SEQ ID NO 75). На Фігурі 7В приведений графік, що відобрарозфасованих і стандартних доз і засоби застосування. жає розходження між виявленим хімічним зсувом 5.1. Структура і функція пептиду для протона в складі аміду і хімічний зсув для проАгоністи Аро А-І по даному винаходу звичайно тона в складі аміду, табульованим для випадкових є пептидами або їхніми аналогами, що спроможні спіралей, виявлених для пептиду 210 (SEQ ID NO 210) і для консенсусного 22-амінокислотного пепутворювати амфіпатичні a-спіралі в присутності тиду Сегре (SEQ ID NO 75). ліпідів і які імітують активність АроА-І. Агоністи На Фігурі 8А показана схема, що відображає включають в якості своїх основних компонентів різноманітні стани агрегації і ліпопептидні комплебазовий («серцеподібний») пептид, що складаєтькси, що можуть бути отримані з використанням ся з 15-22 амінокислотних залишків, переважно з агоністів АроА-І по даному винаходу. Злі ва: процес 18 амінокислотних залишків, або вони є аналогами мультимеризації пептидів, що обумовлюється взатаких пептидів, при тому, що, принаймні, один аміємодією декількох пептидних спіралей і призводний зв'язок в пептиді замінений на заміщений дить до утворення олігомерів в умовах встановамід, на ізостери аміду або міметики аміду. люваних концентрації пептиду, рН і іонної, сили Агоністи АроА-І по даному винаходу почасти розчину. У центрі: взаємодія пептидів (у будьзасновані на результатах досліджень, що провоякому стані агрегації) із ліпідним компонентом (тадилися заявниками, які встановили, що зміна і ким як SUV), що призводить до реорганізації ліпі(або) видалення (делетування) визначених амінодів. Справа: шляхом зміни молярного відношення кислотних залишків у первинній послідовності 22ліпіда і пептиду можуть бути отримані різноманітні мерного консенсусного пептиду, визначеної в ротипи ліпопептидних комплексів - від ліпопептидних ботах Venkatachalapathi et al., 1991, Моl. Conform. коміцел при низькому співвідношенні «лі&Biol. Interactions, Ind. Acad. Sci., ser. B, 585-596 під/пептид» до дископодібних часток і нарешті до (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO 75; тут значних мультимерних комплексів при збільшенні і далі вона позначається як «консенсусна 22співвідношення «ліпід/пептид». мерна послідовність Сегре» або «консенсусний На Фігурі 8В показана базова модель дископо22-мерний пептид»), що здогадно є істотним для дібних ліпопептидних комплексів, що утворюються прояву активності синтетичних пептидів, забезпепри точно встановлених співвідношеннях «лічує синтетичним пептидам активність, рівну, а в під/пептид». Кожний пептид, що оточує край диска, деяких експериментах і перевищуючу активність знаходиться в тісному контакті з двома його найнативного АроА-І. В одному з аспектів даного виближчими сусідами. находу чотири амінокислотних залишки консенсу5. Докладний опис винаходу сного 22-мерного пептиду, такі як залишки 14-17, Агоністи Аро А-І по даному винаходу імітують делетують з утворенням 18-мерних пептидів, функціонування й активність АроА-І. Вони утвоспроможних активувати LCAT. В інших додаткових рять амфіпатичні спіралі (в присутності ліпідів), варіантах делетують чотири інших залишки. В деяких варіантах три заряджених амінокислотних зв'язують ліпіди, утворюють пре-b-подібні або залишки, що здогадно є істотними для прояву акHDL-подібні комплекси, активують фермент LCAT, тивності (Glu-5, Lys-9 і Glu-13) заміняють на гідрообумовлюють підвищення концентрації сироваткофобний залишок, такий як залишок лейцину. вого HDL і сприяють виходові холестерину з кліПоза зв'язком із будь-якими теоретичними потин. Біологічна функція пептидів корелює з їхньою будовами вважається, що спіраль, утворена агоніспіральною структурою або з перетворенням у стами АроА-І по даному винаходу, у більш вираспіральні структури в присутності ліпідів. женому ступені імітує структурні і функціональні Агоністи Аро А-І по даному винаходу можуть властивості ділянки амфіпатичної спіралі в складі бути о тримані у ви гляді стабільних нерозфасованативного АроА-І, що дуже важливо з точки зору них або стандартних доз, наприклад, у вигляді ефективного зв'язування ліпідів, виходу холестеліофілізованих продуктів, що можуть бути знову рину з клітин і активації LCAT, у порівнянні з тим, реконституйовані перед безпосереднім застосуванням in vivo або включені до складу нового прещо характерно для a-спіралей, утворених пептипарату. Даний винахід включає фармацевтичні дами-міметиками АроА-І, раніше описаними в наукомпозиції і застосування таких композицій для ковій літературі, тим самим визначаючи в резульлікування гіперліпідемії, гіперхолестеринемії, ішетаті пептиди, які характеризуються істотно більш мічної хвороби серця, атеросклерозу й інших стависокою АроА-І-подібною активністю в порівнянні з нів, таких як поява ендогенних токсинів, що обуцими раніше охарактеризованими пептидами. Діймовлюється септичним шоком. сно, при тому, що більшість агоністів АроА-І по 27 71554 28 даному винаходу виявляють рівну, а в деяких ваабо з заміщеним амідом. Отже, при тому, що різріантах навіть перевищуючу активність нативного номанітні залишки Хn у формулі (І) відповідають АроА-І, кращі по характеристиках з описаних в амінокислотам, а переважні варіанти даного виналітературі міметиків АроА-І - пептид 18АМ4 ходу подані пептидами, для спеціаліста в даній (EWLEAFYKKVLEK-LKELF; SEQ ID NO 246) області техніки буде зрозуміло, що у варіантах із (Corinjn et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta, 1170, 8неамідними зв'язками термін «амінокислота» або 16; Labeur et al., жовт., 1994, Arteriosclerosis: «залишок» по використанню в даному тексті поAbstracts 186 & 187) і N-ацетильований Сзначає інші біфункціональні складові, що включаамідований пептид 18АМ4 (SEQ ID NO 239) ють групи, подібні за структурою бічним ланцюгам (Brasseur, 1993, Biochim. Biophys. Acta, 1170, 1-7) – амінокислот. виявляють менше ніж 4% і 11% активності, відпоЗаміщені аміди в цілому включають, тим савідно, від активності АроА-І, на що вказують дані мим не вичерпуючись, групи формули -C(O)NR-, в вимірів у тесті на активацію ферменту LCAT, опиякій R представлений С1-С6-алкілом, заміщеним саному в даній заявці. С1-С6-алкілом, С1-С6-алкенілом, заміщеним С 1-С6В одному з ілюстративних прикладів даного алкенілом, С1-С6-алкінілом, заміщеним С1-С6винаходу базові пептиди (або їхні аналоги), що алкінілом, С5-С20-арилом, заміщеним С5-С20складають агоністи АроА-І згідно з даним винаарилом, С6-С26-алкарилом, заміщеним С6-С26ходом, характеризуються такою стр уктурною алкарилом, 5-20-атомним гетероарилом, заміформулою (І): щеним 5-20-атомним гетероарилом, 6-26-атомним Χ1—Х2—Х3—Х4—X5—Х6—Х7—X8—Х9—Х10— алкгетероарилом і заміщеним 6-26-атомним (I) — Х11—Х12—Х13—Х14—Х15—Х16—Х17—Х18, алкгетероарилом. де Ізостери аміду в цілому включають, тим самим Х1 представлений проліном (Р), аланіном (А), не обмежуючись, групи -CH 2NH-, -CH2S-, -СН2СН2-, гліцином (G), аспарагіном (Ν), глутаміном (Q) або -СН=CН- (цис- і транс-), -С(О)СН2-, -СН(ОН)СН2- і D-проліном (р); CH2SO-. Сполуки, що мають такі неамідні зв'язки, і Х2 представлений аліфатичною амінокислозасоби одержання таких сполук добре відомі в тою; даній області техніки (див., наприклад, Spatola, Х3 представлений лейцином (L); March 1983, Vega Data Vol. 1, Issue 3; Spatola, Х4 представлений кислою амінокислотою; 1983, "Peptide Backbone Modifications", In Х5 представлений лейцином (L) або фенілала"Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, ніном (F); Peptides & Proteins", ed. Weinstein, Marcel Dekker, Х6 представлений лейцином (L) або фенілалаNew York, p.267 (general review); Morley, 1980, ніном (F); Trends Pharm. Sci., 1, 463-468; Hudson et al., 1979, Х7 представлений основною амінокислотою; Intern. J. Prot. Res., 14, 177-185 (-CH2NH- і Х8 представлений кислою амінокислотою; CH2CH2-).; Spatola et al., 1986, Life Sci., 38, 1243Х9 представлений лейцином (L) або трипто1249 (-CH2S-): Hann, 1982, J. Chem. Soc. Perkin фаном (W); Trans., 1.1, 307-314 (-CH=CH- -цис- і транс-); Χ10 представлений лейцином (L) або триптоAlmquist et al., 1980, J. Med. Chem., 23, 1392-1398 фаном (W); (-COCH2-); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett., Х11 представлений кислою амінокислотою або 23, 2533 (-COCH2-); європейська патентна заявка аспарагіном (Ν); ЕР45664(1982)СА97, 39405 (-СН(ОН)СН2-); Х12 представлений кислою амінокислотою; Holladay et al., 1983, Tetrahedron Lett., 24, 4401Х13 представлений лейцином (L), триптофаном 4404 (-CH(OH)CH2-); та Hruby, 1982, Life Sci, 31, (W) або фенілаланіном (F); 189-199 (-CH2-S-). Х14 представлений основною амінокислотою Крім того, один або декілька амідних зв'язків або лейцином (L); можуть бути замінені імітуючими пептид або імітуХ15 представлений глутаміном (Q) або аспараючими амід складовими, що у скільки-небудь істогіном (Ν); тному ступені не порушують структуру або активХ16 представлений основною амінокислотою; ність пептидів. Придатними амідоміметиками є ті, Х17 представлений лейцином (L); і що описані, наприклад, Олсоном із співавт. (Olson Х18 представлений основною амінокислотою. et al., 1993, J. Med. Chem, 36, 3039-3049). Базові пептиди, що мають формулу (1)р почаІстотною властивістю базових пептидів форсти визначені не конкретними амінокислотами, а мули (І), є їхня спроможність утворювати в присутїхніми класами. Характеристики різноманітних ності ліпідів амфіпатичну a-спіраль. Під поняттям класів подані в даному тексті в зв'язку з описом «амфіпатична» розуміється те, що така a-спіраль мутантних і змінених варіантів формули (І). характеризується наявністю спрямованих у різні У базових пептидах формули (І), символ «-» сторони гідрофільної і гідрофобної поверхонь, між амінокислотними залишками Хn у цілому ознаорієнтованих уздовж їхньої довгої осі: тобто одна чає функцію послідовного зв'язку осьової струкповерхня такої спіралі складена в основному гідтури пептиду. Отже, символ «-» відповідає рофільними бічними ланцюгами амінокислот, у той пептидному зв'язку або амідному зв'язку час як протилежна поверхня складена в основно(-C(O)NH-). Повинно бути, проте, зрозуміло, що му гідрофобними бічними ланцюгами. На Фіг.1А і даний винахід представляє пептидні аналоги, в 1В показані дві схематичні версії протилежних яких один або декілька амідних зв'язків необов'язгідрофобної і гідрофільної поверхонь у взятій в ково може бути замінена на інший ніж з амідом якості прикладу ідеалізованої амфіпатичної aзв'язок, переважно на зв'язок з ізостерами аміду спіралі. На Фіг.1А показана кругова схема спіралі 29 71554 30 по Шифферу-Едм ундсону (Schiffer & Edmundson, ної базовими пептидами формули (І), є важливими 1967, Biophys. J., 1, 121-135). У цьому «колі» довга для прояву активності. Ці властивості включають вісь спіралі перпендикулярна площині аркушу парівень амфіпатичності, загальний рівень гідрофоперу. Починаючи з N-кінця, наступні амінокислотні бності, середній розмір гідрофобності, гідрофобзалишки (подані у вигляді кільців) розподілені по ний і гідрофільний кути, гідрофобний момент, сепериметру окружності з інтервалом приблизно в редній розмір гідрофобного моменту і сумарний 100°. Таким чином, амінокислотний залишок «n+1» заряд a-спіралі. відхилений від залишку «n» на 100°, залишок При тому, що зображена на Фіг.2А кругова «n+2» відхилений на 100° від залишку «n+1» і т.д. схема представляє стандартний підхід до відоПоказник у 100° відповідає наявності 3,6 залишків браження амфіпатичної природи базових пептидів амінокислот з розрахунку на один виток, що звиформули (І), рівень амфіпатичности (суть ступінь чайно для ідеалізованих (a-спіралей. На Фіг.1А асиметрії гідрофобності) може бути стандартним протилежні гідрофільна і гідрофобна поверхніспішляхом обчислена шляхом визначення гідрофобралі виразно видні: гідрофільні амінокислоти поканого моменту (mΗ) спіралі. Засоби обчислення mΗ зані у вигляді незафарбованих кільців, а гідрофодля конкретної пептидної послідовності добре вібні залишки амінокислот показані у вигляді домі в даній області техніки й описані, наприклад затінених кільців. Ейзенбергом (Eisenberg, 1984, Ann. Rev. Biochem., На Фігурі 1В показана схема ідеалізованої 53, 595-623). Реальний розмір mΗ, обчислений для амфіпатичної спіральної решітки, зображеної і на конкретного пептиду, буде залежати від загальноФіг.1А, (Lim, 1978, FEBS Lett., 89, 10-14). На звиго числа амінокислотних залишків, що складають чайній схемі у вигляді спіральної решітки a-спіраль даний пептид. Отже, у принципі не є інформативзображується у вигляді циліндра, що зрізаний узним порівняння показників mΗ для пептидів неоддовж центральної осі своєї гідрофільної поверхні і накової довжини. сплощений. Таким чином, центральна частина Амфіпатичність пептидів неоднакової довжини гідрофобної поверхні, визначена за розміром гідможе бути піддана прямому порівнянню за ознарофобного моменту спіралі (Eisenberg et al., 1982, кою усередненого гідрофобного моменту (). Nature, 299, 371-374), знаходиться в центрі схеми Середній гідрофобний момент може бути визнай орієнтована таким чином, щоб як би підніматися чений співвіднесенням розміру mΗ до загального над поверхнею сторінки. Схема циліндра спіралі числа амінокислот у складі спіралі (тобто до «розрізування й сплощення» показана на =mΗ/Ν). У цілому, базові пептиди, що характеФіг.1С. При перетинах циліндра різними площинаризуються розміром у межах від 0,55 до 0,65 ми можуть бути отримані різноманітні плани однієї з урахуванням оцінки цього показника на основі і тієї ж амфіпатичної спіралі: відповідно, може бути нормалізованої шкали гідрофобності за Ейзенберотримана різноманітна інформація про властивості гом (Eisenberg, 1984, J. Моl. Віоl., 179, 125-142), отриманої спіралі. розглядаються як такі, що потрапляють в обсяг Амфіпатична природа a-спіралі, утвореної в даного винаходу, при тому, що переважним діапаприсутності ліпідів базовими пептидами формули зоном розмірів є діапазон 0,58-0,62. (І), продемонстрована на Фіг.2. На Фіг.2А показана Загальний або повний рівень гідрофобності кругова схема по Шифферу-Едм ундсону, а на (НO) пептиду може бути стандартним шляхом обФіг.2В показана схема у вигляді спіральної решітчислена як алгебраїчна сума розмірів гідрофобноки, що ілюструє гідрофобну поверхню і на Фіг.2С сті кожного з амінокислотних залишків у складі показана схема у вигляді спіральної решітки, що æ N ö ілюструє гідрофільну поверхню. На кожній із даного пептиду ç т.е. HO = å Hi ÷ де N - число аміФіг.2А, 2В і 2С гідрофільні залишки подані незаç ÷ è i =1 ø фарбованими кільцями, а гідрофобні залишки нокислотних залишків у пептиді, a Hi - розмір гідзатіненими кільцями, а залишки, що можуть бути рофобності і-ого амінокислотного залишку). Серегідрофільними або гідрофобними, - частково затідня гідрофобність () - це гідрофобність, неними кільцями. Як буде обговорюватися більш співвіднесена до числа амінокислотних залишків докладно нижче при розгляді змінених або муто(тобто =HO/N). У цілому, базові пептиди, що ваних форм пептидів формули (І), деякі амінокисхарактеризуються середнім розміром гідрофобнолотні залишки можуть бути замінені іншими аміності в межах від -0,150 до -0,070 з урахуванням оцікислотними залишками таким чином, що нки цього показника на основі нормалізованої конгідрофільна і гідрофобна поверхні спіралі, утворесенсусної шкали гідрофобності за Ейзенбергом ної конкретним пептидом, можуть і не складатися (Eisenberg, 1984, J. Моl. Віоl., 179, 125-142), розцілком із, відповідно, гідрофільних і гідрофобних глядаються як такі, що потрапляють в обсяг даноамінокислот. Таким чином, повинно бути зрозуміго винаходу, при тому, що переважним діапазоном ло, що при описі амфіпатичної a-спіралі, утвореної розмірів середньої гідрофобності є діапазон від базовими пептидами по даному винаходу, вираз 0,130 до -0,050. «гідрофільна поверхня» вказує на ту поверхню Загальна гідрофобність гідрофобної поверхні цієї спіралі, що характеризується сумарною (HOpho) амфіпатичної спіралі може бути визначена гідрофільністю. Вираз «гідрофобна поверхня» як сума розмірів гідрофобностей гідрофобних аміозначає те, що поверхня пептиду характеризуєтьнокислотних залишків, що потрапляють усередину ся сумарною гідрофобністю. гідрофобного кута відповідно до визначеного Не торкаючись конкретних теоретичних побунижче дов, можна вважати, що деякі структурні і (або) фізичні властивості амфіпатичної спіралі, утворе 31 71554 32 22-мерного пептиду Сегре (залишки 5, 9 і 13) NH ö æ ç ÷ (Фіг.3С), затінені. Як очевидно з показаного на т.е. HOpho = å Hi ÷ ç ç Фіг.3В, позитивно заряджені амінокислотні залишi=1 ÷ è ø ки кластеризовані на останньому С-кінцевому витде ку спіралі (С-кінцева частина орієнтована к верху NH - число гідрофобних амінокислотних залималюнка). Не прив'язуючись до якоїсь конкретної шків у складі гідрофобної поверхні, a Hi визначетеорії, можна вважати, що кластер основних заний вище). Середня гідрофобність гідрофобної лишків у С-кінцевій частині (залишки 14, 16 і 18) pho рho поверхні () - це відношення НO /NH в якостабілізує спіраль за рахунок електростатичних му NH визначений вище. У цілому, базові пептиди, взаємодій у зарядженому (NH3+)-спіральному диpho що характеризуються розміром у межах полі. Також передбачається, що стабілізація має від 0,90 до 1,20 з урахуванням оцінки цього показмісце за рахунок гідрофобних взаємодій між бічника на основі нормалізованої шкали гідрофобноними ланцюгами лізину і серцеподібною частиною сті за Ейзенбергом (Eisenberg, 1984, цит. вище; спіралі (див. Groebke et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Eisenberg et al., 1982, цит. вище), розглядаються Sci. USA, 93, 4025-4029; Esposito et al., 1997, як такі, що потрапляють в обсяг даного винаходу, Biopolymers, 41, 27-35). при тому, що переважним діапазоном розмірів За винятком С-кінцевої частини, у якій кластеpho є діапазон від 0,950 до 1,10. ризований позитивний заряд (залишки 14, 16 і 18), Гідрофобний кут (кут «pho») звичайно визнапо іншій частині гідрофільної поверхні розподілені чається як кут або дуга, утворена найбільше тринегативні заряди при наявності, принаймні, одного валою ланкою, гідрофобних амінокислотних залинегативно зарядженого (кислого) амінокислотного шків у випадку, коли такий пептид зображений у залишку в розрахунку на виток, в результаті чого вигляді кругової спіралі за Шифферомутвориться безупинна ланка негативних зарядів по Едмундсоном (тобто число розташованих підряд гідрофільній поверхні спіралі. гідрофобних залишків у такій схемі множиться на На Фіг.4В показана схема спіральної решітки, 20°). Гідрофільний кут (кут «phi») є різницею між що ілюструє гідрофобну поверхню амфіпатичної 360° і кутом «pho» (тобто кут 360° мінус «pho»). спіралі, утвореної обраним в якості прикладу баДля спеціаліста в даній області техніки буде зрозовим пептидом 210 (SEQ ID NO 210). На Фіг.4В зуміло, що розмір кутів «pho» і «phi» буде частково циліндр розсічений уздовж центральної осі гідрозалежати від числа амінокислотних залишків у фільної поверхні і сплощений. Гідрофобна поверпептиді. Наприклад, беручи до уваги зображене на хня базового пептиду включає по два гідрофобних Фіг.5А і 5В, можна бачити, що в одній круговій спізалишку на 1 оборот спіралі, за винятком останралі схеми Шиффера-Едмундсона знаходиться нього С-кінцевого витка, в якому переважають тільки 18 амінокислот. Зменшення числа амінокиосновні залишки. Аналіз методом ядерного магнітслот призводить до утворення розриву в колі, а ного резонансу показує, що амінокислотні залишки більша кількість амінокислот призведе до того, що 3, 6, 9 і 10 аналогічного 22-мерного пептиду окремі положення кола будуть зайняті більш ніж (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; SEQ ID NO 4) фоодним амінокислотним залишком. рмують гідрофобний кластер поблизу від NУ тому випадку, коли пептиди складаються кінцевої частини спіралі. У центрі цього кластера більш ніж із 18 амінокислотних залишків, поняття знаходиться залишок фенілаланіна, що займає 6-е «безупинна ланка», складене гідрофобними аміположення: вважається, що він грає важливу роль нокислотними залишками, означає те, що принайу стабілізації гідрофобного кластера. мні одна амінокислота в положеннях по периметру Не залучаючи будь-яку конкретну теорію, моокружності, що включають більш однієї амінокисжна вважати, що гідрофобний кластер, утворений лоти, є гідрофобною амінокислотою. залишками 3, 6, 9 і 10, є істотним з точки зору заЗвичайно базові пептиди, що складаються з 18 безпечення ефективного зв'язування ліпідів і актиабо меншого числа амінокислот, що характеризувації ферменту LCAT. Амфіпатичні пептиди, як ються кутом «pho» у межах від 120° до 160°, розочікується, зв'язують фосфоліпіди шляхом розміглядаються як такі, що входять в обсяг даного вищення гідрофобних поверхонь у відношенні алкінаходу, при тому, що значення кута «pho» у льних ланцюгів у складі ліпідних складових. Отже, діапазоні 130° -150° є переважними. Варіанти, що вважається, що даний високогідрофобний кластер складаються більш ніж із 18 амінокислот, звичайно забезпечує високий рівень афінності стосовно ліхарактеризуються кутом «pho» у діапазоні від 160° підів, характерний для базових пептидів за даним до 220°, при тому, що переважними є значення винаходом. Оскільки зв'язування ліпідів є умовою кута «pho» у діапазоні 180° -200°. для активації LCAT, можна вважати, що даний Деякі структурні і (або) фізичні характеристики гідрофобний кластер також є істотним з точки зору базових пептидів формули (І) проілюстровані на активації LCAT. Фіг.3 і 4. На Фігурі 3В показана схема у вигляді Ароматичні амінокислоти часто розглядаютьспіральної решітки обраного як приклад базового ся, як важливі чинники прикріплення пептидів і пептиду по даному винаходу - пептиду 210 білків до ліпідів (De Kruijff, 1990, Biosci. Rep., 10, (PVLDLFRELLEELKQKLK; SEQ ID NO 210): вона 127-130; O'Neil & De Grado, 1990, Science, 250, показує розподіл заряду уздовж гідрофільної по645-551; Blondelle et al., 1993, Biochim. Biophys. верхні спіралі. На Фіг.3В спіральний циліндр був Acta, 1202, 331-336). Таким чином, далі можна розсічений уздовж центральної осі гідрофобної вважати, що залишок фенілаланіна-6, що знахоповерхні і сплощений. Три гідрофобних залишки диться в центрі гідрофобного кластера, також молейцину (L), що заміняють залишки консенсусного 33 71554 34 же грати ключову роль у прикріпленні базових пеТакож у принципі можна вважати прийнятим, птидів формули (І) до ліпідів. що утворення межмолекулярного водневого зв'язВзаємодії між базовими пептидами по даному ку або сольового «містку» між кислим і основним винаходу і ліпідами призводять до утворення пепзалишками, відповідно, за положеннями поліпептидноліпідних комплексів. Як показано на Фіг.8А, тидної спіралі «і» та «і+3» стабілізує цю спіральну характер такого комплексу, що утворився, (коміцеструктур у (Marqusee et al., 1985, Proc. Natl. Acad. ли, дископодібні структури, пузиркоподібні струкSci. USA, 84, 8898-8902). Один позитивний заряд тури і багатошарові утворення) залежить від моспіввідносять із 7-им залишком, який здогадно лярного відношення в парі «ліпід/пептид», при бере участь у забезпеченні стабільності спіралі за тому, що коміцели в цілому утворюються при нирахунок утворення сольового «містка» із кислим зькому молярному відношенні в комплексі «лізалишком в сусідньому витку спіралі. під/пептид», а три інших типи комплексів утворюТаким чином, додаткові ключові параметри ються при послідовному зростанні молярних базових пептидів формули (І) пов'язані з їхньою відношень у комплексів «ліпід/пептид». Цей параспроможністю утворювати межмолекулярні воднеметр був о характеризований для амфіпатичних ві зв'язки один з одним, коли вони взаємо розтапептидів (Epand, "The Amphipathic Helix", 1993) і шовуються в антипаралельній орієнтації, при тому, для апопротеїна АроА-І (Jones, 1992, "Structure що їхні гідрофобні поверхні орієнтуються в тому and Function of Apolipoproteins", Ch.8, pp.217-250). самому напрямку, тобто так, як це повинно відбуМолярне відношення в комплексі «ліпід/пептид» ватися при зв'язуванні пептидів із ліпідами, а татакож є чинником, що визначає розмір і склад також із їхньою спроможністю утворювати межмолеких комплексів (див. далі розділ 5.3.1). кулярні водневі зв'язки або сольові «містки» поруч із N- і С-кінцевими ділянками спіралі. Вважається, Довга вісь a-спіралі, утвореної базовими пептидами формули (І), в цілому має викривлену фощо спроможність базових пептидів формули (І) щільно упаковуватися і взаємодіяти за іонним тирму. Для типових амфіпатичних спіралей було пом з утворенням внутрішньо- і (або) межмолекувстановлено, що довжина водневих зв'язків на лярних сольових «містків» і (або) водневих зв'язків гідрофільній і гідрофобній поверхнях варіюється у процесі зв'язування з ліпідами в антипаралельтаким чином, що гідрофобна сторона спіралі є увігн утою (Barlow & Thornton, 1988, J. Моl. Biol., ній орієнтації, є важливою властивістю базових пептидів за даним винаходом. 201, 601-619; Zhou et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc, Спроможність базових пептидів здійснювати 33, 11174-11183; Gesell et al., 1997, J. Biomol. кращі межмолекулярні пептидпептидні взаємодії NMR, 9, 127-135). Поза зв'язком із якоюсь конкреттакож розглядається як важливий чинник у відсутною теорією, можна вважати, що загальне викривлення гідрофобної поверхні в спіралі може бути ності ліпідів. Базові пептиди по даному винаходу можуть самоасоціюватися, зокрема, через високі важливим чинником у процесі зв'язування дископодібних комплексів - викривлена спіраль дозвозначення їх , і гідрофобного рогу (див. ляє пептиду краще «приладжуватися» до країв табл.1). Явище самоасоційованості залежить від дископодібних часток, тим самим збільшуючи статаких параметрів як рН, концентрація пептиду й більність пептидно-дископодібного комплексу. іонної сили розчину і може призводити до утвоУ принципі в складі прийнятої структурної морення декількох типів зв'язків - від мономерних до декількох мультимерних форм (Фіг.10А) . Гідрофоделі АроА-І амфіпатичні a-спіралі упаковуються бна серцевина пептидної агрегації сприяє гідронавколо країв дископодібних HDL (див. Фіг.8В). У фобним взаємодіям із ліпідами. Спроможність пецій моделі спіралі, як вважається, укладаються птидів агрегуватися навіть за дуже низьких так, щоб їхні гідрофобні поверхні розташовувалися концентрацій може сприяти їхньому зв'язуванню з навпроти ацильних ланцюгів ліпідів (Brasseur et al., ліпідами. Передбачається, що в серцевинній час1990, Biochim. Biophys. Acta, 1043, 245-252). Спітині агрегації пептидів межпептидні взаємодії таралі організовані в антипаралельній орієнтації, а кож мають місце і можуть конкурувати з пептиднокооперована дія таких спіралей розглядається як ліпідними взаємодіями. важливий чинник стабільності дископодібних комНа додаток до описаних вище властивостей, плексів HDL (Brasseur et al., цит. вище). Передбаінші параметри, як можна припустити, важливі з чається, що одним із чинників, що забезпечують погляду активності, включаючи такі властивості як стабільність дископодібних комплексів HDL, є існузагальне число гідрофобних залишків, загальне вання іонних взаємодій між кислими й основними число заряджених залишків і кумулятивний заряд залишками, у результаті чого утворюються межпептидів. молекулярні сольові «містки» або водневі зв'язки Узагальнення переважних фізичних і структуміж залишками на сусідніх антипаралельних спірних властивостей базових пептидів формули (І) ралях. У такій моделі пептиди розглядаються не як подані нижче в таблиці 1. окремі елементи, а як чинники взаємодії принаймні двох пептидних молекул, що знаходяться поряд (Фіг.8В). 35 71554 36 Таблиця 1 Фізичні властивості переважних агоністів АроА-І формули (І) Властивість Діапазон Переважний діапазон Доля гідрофобних аміноксилот, % 40-70 50-60 від-0,150 до-0,070 від -0,130 до-0,050 0,90-1,2 0,95-1,10 0,55-0,65 0,58-0,62 Кут «pho» 120°-160° 130°-150° № позитивно заряджених амінокислот 3-5 4 № негативно заряджених амінокислот 3-5 4 Сумарний заряд від -1 до +1 0 Гідрофобний кластер в положеннях 3, 6, 9 и 10 знаходяться гідрофобні амінокислоти принаймні, 1 кисла амінокислота на 1 виток за виключенням Кислий кластер останніх 5 С-кінцевих амінокислот принаймні, 2 основні амінокислоти з 5 останніх С-кінцевих аміноОсновний кластер кислот Властивості амфіпатичних a-спіралей, утворених базовими пептидами за даним винаходом, істотною мірою відрізняються від властивостей амфіпатичних a-спіралей Α-класу, зокрема, від aспіралей А-класу, 18А Сегре і від 22-мерного консенсусного пептиду. Ці розходження проілюстровані за допомогою обраного в якості прикладу базового пептиду 210 (SEQ ID NO 210) на Фіг.3-5. Звертаючись до Фіг.4А-4С, можна побачити, що гідрофобна поверхня пептиду 210 характеризується більш потужними гідрофобними властивостями в порівнянні з гідрофобною поверхнею пептиду 18А Сегре і 22-мерного консенсусного пептиду. Зокрема, залишки 9 і 13 (затінені на Фіг.4В) є в послідовності пептиду 210 (SEQ ID NO 210) гідрофобними залишками лейцина (L) у порівнянні із зарядженими залишками, наявними в пептиді ISA (SEQ ID NO 244) і консенсусному 22мерному пептиді (SEQ ID NO 75). Заміна цих двох заряджених залишків у пептиді 18А Сегре й у консенсусномі 22-мерному пептиді на гідрофобні залишки лейцина (L) призводить до прояву істотних розходжень по параметрах амфіпатичності, гідрофобності, розміру кута «pho» та іншим характеристикам даної спіралі. Порівняння фізичних і структурних властивостей пептиду 210 (SEQ ID NO 210), пептиду 18А Сегре (SEQ ID NO 244) і консенсусного 22-мерного пептиду (SEQ ID NO 75) подано нижче в таблиці 2. Таблиця 2 Порівняння властивостей обраних в якості прикладу базових пептиду (SEQ ID NO 210) із консенсусним 22-мерним пептидом (SEQ ID NO 75) і пептидом 18А (SEQ IDNO 244) Сегре Властивість № амінокислот № гідрофільних амінокислот № гідрофобних амінокислот % гідрофобних амінокислот Кут «pho» № позитивно заряджених амінокислот № негативно заряджених амінокислот Сумарний заряд 18А 18 9 9 50 -0,43 0,778 0,485 100° 4 4 0 Ці розходження у властивостях обумовлює істотне розходження їхніх активностей. При тому, що пептид 18А Сегре (SEQ ID NO 244)i консенсусний 22-мерний пептид (SEQ ID NO 75) виявляє, відповідно, тільки 5%-у і 10%-у активацію LCAT у порівнянні з нативним АроА-І у тесті, описаному в даній заявці, пептиди 210 (SEQ ID NO 210) виявляють 46%-і рівні активації LCAT, відповідно, у порівнянні з нативним АроА-І, що оцінювалися в Консенсусный 22-мерний 22 13 9 41 -0,293 0,960 0,425 100° 5 6 -1 Пептид 210 18 9 9 50 -0,125 1,081 0,597 140° 4 4 0 тому ж самому тесті. Пептид 193 (SEQ ID NO 193), що є ацетільованим за N-кінцем й амідованим за С-кінцем варіантом пептиду 210, виявляє 96%-у активацію LCAT, оцінювану в тому ж самому тесті. Деякі амінокислотні залишки в складі базових пептидів формули (І) можуть бути замінені іншими амінокислотними залишками без істотного негативного впливу, а в багатьох випадках і з посиленням активності цих пептидів. Отже, даним 37 71554 38 винаходом також рекомендуються змінені або муності вище 0 у відповідності до стандартної шкали товані форми базових пептидів формули (І), при гідрофобності за Ейзенбергом (Eisenberg et al., тому, що принаймні один визначений амінокислот1984, J. Моl. Віо.1., 179, 125-142). Генетично кодоний залишок у структурі заміняється іншим аміновані гідрофобні амінокислоти включають пролін кислотним залишком. Оскільки одна з істотних (Р), ізолейцин (І), фенілаланін (F), валін (V), лейвластивостей, що впливають на активність базоцин (L), триптофан (W), метіонин (М), аланін (А), вих пептидів за даним винаходом, розглядається гліцин (G) і тирозин (Y). як спроможність утворювати в присутності ліпідів Термін «ароматична амінокислота» означає α-спіралі, що виявляють амфіпатичні й інші власгідрофобну амінокислоту, у бічному ланцюзі якої є, тивості, описані вище, те повинно бути зрозуміло, принаймні, одне ароматичне або гетероциклічне що в переважних варіантах даного винаходу амікільце. Ароматичне або гетероциклічне кільце монокислотні заміни є консервативними, тобто аміже включати один або більше число заступників, нокислотні залишки, що заміняють, характеризутаких як -ОН, -SH, -CN, -F, -СІ, -Вг, -І, -N O2, -NO, ються фізичними і хімічними властивостями, NH2, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, подібними до таких в замінних амінокислотних C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)NRR і подібне, де кожзалишків. ний із R незалежно представлений С1-С6-алкілом, Для цілей визначення консервативних амінозаміщеним С1-С6-алкілом, С1-С6-алкенілом, замікислотних замін амінокислоти можуть бути станщеним С1-С6-алкенілом, С1-С6-алкінілом, заміщедартною чином класифіковані на дві базові категоним С1-С6-алкінілом, С5-С20-арилом, заміщеним рії - гідрофільні і гідрофобні: в першу чергу, поділ С5-С20-арилом, С6-С26-алкарилом, заміщеним С6залежить від фізико-хімічних характеристик бічних С26-алкарилом, 5-20-атомним гетероарилом, заланцюгів амінокислот. Ці дві основні категорії моміщеним 5-20-атомним гетероарилом, 6-26жуть бути далі класифіковані на підгрупи, що атомним алкгетероарилом і заміщеним 6-26більш детально характеризують властивості бічатомним алкгетероарилом. Генетично кодованими них ланцюгів амінокислот. Наприклад, категорія ароматичними амінокислотами є фенілаланін (F), гідрофильних амінокислот може бути далі підрозтирозин (Y) і триптофан (W). ділена на кислі, основні і полярні амінокислоти. Термін «неполярна амінокислота» означає гіКатегорія гідрофобних амінокислот може бути далі дрофобну амінокислоту, що характеризується непідрозділена на неполярні й ароматичні амінокисзарядженим бічним ланцюгом при фізіологічних лоти. Визначення різноманітних категорій амінокизначеннях рН і такою, що має зв'язки, в яких пара слот, що визначають склад формули (І), такі. електронів, що є загальними для двох атомів, знаТермін «гідрофільна амінокислота» означає ходяться на рівній відстані від кожного з цих атомів амінокислоту, що виявляє властивість гідрофоб(тобто бічний ланцюг не є полярним). Генетично ності нижче 0 у відповідності до стандартної шкали кодованими неполярними амінокислотами є лейгідрофобності за Ейзенбергом (Eisenberg et al., цин (L), валін (V), ізолейцин (І), метіонин (М), глі1984, J. Моl. Biol., 179, 125-142). Генетично кодоцин (G) і аланін (А). вані гідрофільні амінокислоти включають треонін Термін «аліфатична амінокислота» означає гі(Т), серин (S), гістидин (Н), глутамінову кислоту дрофобну амінокислоту, що характеризується на(Е), аспарагін (N), глутамін (Q), аспарагінову кисявністю аліфатичного вуглеводневого бічного ланлоту (D), лізин (К) і аргінін (R). цюга. Генетично кодованими аліфатичними Термін «кисла амінокислота» означає гідрофіамінокислотами є аланін (А), валін (V), лейцин (L) і льну амінокислоту, в якої бічний ланцюг характеізолейцин (І). ризується значенням рК, меншим за 7. Кислі аміАмінокислотний залишок цистеїна (С) незвичнокислоти звичайно мають негативно заряджені ний у тому, що він може утворювати дисульфідні бічні ланцюги при фізіологічних значеннях рН чемістки з іншими залишками (С) або іншими амінорез втрату іона водню. Генетично кодованими кикислотами, що містять сульфонільну групу. Спрослими амінокислотами є глутамінова кислота (Е) і можність залишків цистеїна (С) (як і інших амінокиаспарагінова кислота (D). слот, що мають груп у -SH у якості бічного Термін «основна амінокислота» означає гідланцюга) існувати як у відновленій формі -SH, так і рофільну амінокислоту, в якої бічний ланцюг харав окисленому стані у вигляді дисульфідного «містктеризується значенням рК, більшим за 7. Основні ка» впливає на внесок цистеїна (С) у розмір гідроамінокислоти звичайно мають позитивно заряджефобності/гідрофільності пептиду. Якщо цистеїн (С) ні бічні ланцюги при фізіологічних значеннях рН характеризується розміром гідрофобності 0,29 через втрату іона гідроксонію. Генетично кодовавідповідно до нормалізованої шкали за Ейзенберними основними амінокислотами є гістидин (Н), гом (Eisenberg, 1984, цит. вище), то повинно бути аргінін (R) і лізин (К). зрозуміло, що, виходячи з цілей даного винаходу, Термін «полярна амінокислота» означає гідцей залишок (С) класифікується як полярна гідророфільну амінокислоту з незарядженим бічним фільна амінокислота, незалежно від загальних ланцюгом при фізіологічних значеннях рН, але в установок для описаної вище класифікації. який є принаймні один зв'язок, в якому пара електЯк повинно бути зрозуміло спеціалісту в даній ронів, спільна для двох атомів, знаходиться ближобласті техніки, визначені вище категорії не є взаче до одного з цих атомів. Генетично кодованими ємовиключними. Отже, амінокислоти, що характеполярними амінокислотами є аспарагін (N), глутаризуються бічними ланцюгами, що виявляють два і мін (Q), серин (S) і треонін (Т). більше типи фізико-хімічних властивостей, моТермін «гідрофобна амінокислота» означає жуть бути віднесені до «множинних категорій». амінокислоту, що виявляє властивість гідрофобНаприклад, бічні ланцюги амінокислот, що вклю 39 71554 40 чають ароматичні складові, що, крім того, заміщені генетично некодованих амінокислот, а також синполярними заступниками, такі як тирозин (Υ), мотетичних амінокислот. жуть виявляти й ароматичні гідрофобні властивосДеякі звичайно розглядувані амінокислоти, які ті, і полярні або гідрофільні властивості, тобто, представляють перспективний об'єкт для замін до відповідно, можуть бути включені в категорії й складу базових пептидів формули (І), включають, ароматичних, і полярних амінокислот. Конкретна тим самим не обмежуючись, β-аланін (β-Ala) і інші класифікація будь-якої амінокислоти буде очевидw-амінокислоти, такі як 3-амінопропіонова кислота, ної для спеціаліста в даній області техніки, особ2,3-диамінопропіонова кислота (Dpr), 4ливо, у сві тлі докладних описів, включених у даний амінобутирова кислота і т.д.; a-аміноізобутирову текст. кислоту (Aib), e-аміногексаноїву кислоту (Aha), dДеякі амінокислотні залишки, що позначаютьаміновалеріанову кислоту (Ava), N-метилгліцин ся як «розриваючі спіраль амінокислоти», мають або саркозин (MeGly), орнитин (Оrn), цитрулин властивість розривати структур у a-спіралей тоді, (Сit), трет-бутилаланін (t-BuA), трет-бутилгліцин (tколи вони знаходяться у внутрішніх положеннях BuG), N-метилізолейцин (Melle), фенілгліцин (Phg), такої спіралі. Амінокислотні залишки, що виявляциклогексилаланін (Cha), норлейцин (Nie), нафтиють такі властивості розривання спіралей, добре лаланін (Nal), 4-хлорфенілаланін (Phe-4-Cl), 2відомі в даній області техніки (див., наприклад, фтор фенілаланін (Phe-2-F), 3-фторфенілаланін Chou & Fasman, Ann. Rev. Biochem., 47, 251-276) і (Phe-3-F), 4-фторфенілаланін (Phe-4-F), пеницивключають пролін (Р), гліцин (G) і потенційно всі Dламин (Pen), 1,2,3,4-тетрагід роізохінолін-3амінокислоти (тоді, коли вони знаходяться в Lкарбонову кислоту (Tic), β-2-тієнілаланін (Тhi), мепептиді; і навпаки, L-амінокислоти розривають тіонинсульфоксид (MSO), гомоаргінін (hArg), Nспіральні структури в складі D-пептиду). Хоча ці ацетилізин (AcLys), 2,4-диамінобутирова кислота «амінокислоти, що розривають спіраль», і потрап(Dbu), 2,3-диамінобутирова кислота (Dab), рляють у позначені вище категорії, ці залишки не амінофенілаланін (Phe-pNHz), N-метилвалін повинні використовуватися для заміни амінокисло(Me Val), гомоцистеїн (hCys), гомофенілаланін тних залишків у вн утрішніх положеннях у межах (hPhe) і гомосерин (hSer), гідроксипролін (Hyp), спіралі - тобто вони можуть бути використані тільгомопролін (hPro), N-метильовані амінокислоти і ки для заміни 1-3 амінокислотних залишків у склапептоїди (N-заміщені гліцини). ді N-кінцевої частини і (або) С-кінцевої частини Класифікації генетично кодованих і звичайних конкретного пептиду. некодованих амінокислот відповідно до категорій, При тому, що в якості прикладів в описаних визначених вище, підсумовані нижче в табл.3. Повище категоріях були приведені генетично кодовавинно бути зрозуміло, що табл.3 приведена тільки ні амінокислоти, проте немає необхідності, а в в якості ілюстративного матеріалу і не покликана деяких конкретних варіантах і переважно немає служити вичерпним списком амінокислот, які б необхідності в замінах, що обмежуються генетично могли бути використані для замін до складу базокодованими амінокислотами. Дійсно, багато з певих пептидів, що подаються даним винаходом. реважних пептидів формули (І) включають генетиІнші, конкретно не обумовлені в даному тексті, чно не кодовані амінокислоти. Отже, на додаток до амінокислоти легко можуть бути класифіковані на таких, що зустрічаються у живій природі генетично основі їх фізичних і хімічних властивостей у світлі кодованих амінокислот, амінокислоти базових пехарактеристик, описаних у даному тексті. птидів формули (І) можуть бути заміщені з використанням таких, що зустрічаються у природі, але Таблиця 3 Класифікація звичайно використовуваних амінокислот Класифікація Генетично кодовані Ароматичні F, Y, W Неполярні L, V, І, М, G, А, Р Алі фатичні А, V, L, І Кислі Основні Полярні «Розриваючи спіраль» D, E H, K, R С, Q, Ν, S, Τ P, G Генетично некодовані Гідрофобні Phg, Nal., Тhi, Tic, Phe(4-|Cl), Phe(2-P), Phe(3-F), Phe(4-F), hPhe t-BuA. t-BuG, Melle, Nie, MeVal., Cha, McGl y, Aib b-Ala, Dpr, Aib, Aha, MeGl y, t-BuA, t-BuG, Melle, Cha, Nie, Me Val Гідрофільні Dpr, Om, hArg, Phe(p-NH;), Dbu, Dab Cit, AcL ys, MSO, bAla, hSer D-Pro та інші D-амінокислоти в складі L-пептидів При тому, що в більшості прикладів амінокислоти базових пептидів формули (І) заміщають із використанням L-енантіомерних амінокислот, заміни не обмежуються L-енантіомерними амінокислотами. Отже, також у поняття «змінені» або «мутовані» форми входять ті форми, що утворені в результаті заміни L-амінокислоти на ідентичну D-амінокислоту (наприклад, L-аргінін ® Dаргінін) або на D-амінокислоту тієї ж категорії або підгрупи (наприклад, L-аргінін ® D-лізин), і навпа 41 71554 42 ки. Дійсно, у деяких переважних варіантах, що є У конкретному переважному варіанті Стакими в зв'язку з пероральним введенням пацієнкінцевий основний кластер (залишки 14, 16 і 18) там-ссавцям, доцільним є входження до складу також є фіксованим відповідно до формули (І) і пептиду, що вводиться принаймні однієї Dтільки залишки 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13 і (або) 17 можуть енантіомерної амінокислоти. Пептиди, що вклюбути замінені. чають такі D-амінокислоти, як вважається, більш В іншому конкретному переважному варіанті стійкі до руйнації чинниками ротової порожнини, гідрофобний кластер (залишки 3, 6, 9 і 10) також кишечнику або сироватки в порівнянні з пептидафіксується відповідно до формули (І) і тільки зами, що складаються винятково з L-амінокислот. лишки 2, 5, 13, 16 і (або) 17 можуть бути замінені. Як відзначалося вище, D-амінокислоти харакЩе в одному конкретному переважному варіанті й основний, і гідрофобний кластери фіксуються теризуються тенденцією до руйнації a-спіралей у і тільки залишки 2, 5, 13 і (або) 17 можуть бути випадку заняття ними внутрішніх положень в aзамінені. спіралі, утвореної L-пептидом. Отже, DВ іншому переважному варіанті даного винаамінокислоти не повинні використовуватися для ходу змінені або мутовані форми базових пептидів заміни L-амінокислот, що знаходяться у внутрішніх даного винаходу одержують шляхом фіксування положеннях: заміни на D-амінокислоти повинні гідрофобних амінокислотних залишків, розташообмежуватися 1-3 амінокислотними залишками в ваних на гідрофобній поверхні спіралі і заміни, N-кінцевий і (або) С-кінцевій частинах пептиду. принаймні, одного нефіксованого амінокислотного Переважно тільки одна амінокислота з N- і (або) Сзалишку на інший амінокислотний залишок, перекінця заміняється на D-амінокислоту. важно на інший залишок із тієї ж категорії або підЗ використанням класифікації амінокислотних групи амінокислот. залишків, поданої вище, у сполученні з круговою Звертаючись до Фіг.2А, можна бачити, що засхемою за Шиффером-Едмундсоном і схемою у лишки 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 16 і 17 розташовані в вигляді спіральної решітки, застосовуваних для межах гідрофобної поверхні. З них всі амінокислобазових пептидів формули (І), а також докладного ти є гідрофобними, за винятком гідрофільного 16опису бажаних властивостей, можуть бути легко го залишку. Отже, в однім із переважних варіантів отримані змінені або мутовані форми базових пепзалишки 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13 і 17 є фіксованими відтидів формули (І), що істотною мірою зберігають повідно до формули (І) і, принаймні, один із залиамфіпатичні й інші властивості спіралі і котрі, отже, шків 1, 4, 7, 8, 11, 12, 14, 15, 16 і 18 замінений на потрапляють в обсяг даного винаходу. інший амінокислотний залишок, переважно на інУ переважномуваріанті за даним винаходом ший амінокислотний залишок із тієї ж самої катезмінені або мутовані форми базових пептидів фогорії або підгрупи. рмули (І) одержують шляхом фіксації гідрофільних У конкретному переважному варіанті Сабо гідрофобних залишків відповідно до формули кінцевий основний кластер (залишки 14, 16 і 18) (І) і заміни, принаймні, одного нефіксованого затакож фіксують, і тільки залишки 1, 4, 7, 8, 11, 12 і лишку на іншу амінокислоту, переважно по консе(або) 15 замінені. рвативному типу, тобто на іншу амінокислоту з тієї В іншому варіанті змінені або мутовані форми ж категорії або підгрупи. Залишки, що складають пептидів формули (І) одержують шляхом фіксації основний і (або) гідрофобні кластери, також мовсіх амінокислотних залишків, що знаходяться в жуть бути фіксовані, відповідно до формули (І), а межах гідрофобної або гідрофільної поверхонь принаймні один нефіксований залишок - замінеданої спіралі, і заміни, переважно по консервативний, переважно консервативно. ній схемі, принаймні, одного амінокислотного заВ іншому переважному варіанті змінені або лишку, що знаходиться на протилежній поверхні, мутовані форми базових пептидів формули (І) на інший амінокислотний залишок. Залишки, що одержують шляхом фіксації гідрофільних амінокивключають гідрофобний кластер і (або) основний слотних залишків, розташованих на гідрофільній кластер, також можуть бути необов'язково фіксоповерхні спіралі відповідно до формули (І) і заміни, ваними відповідно до формули (І) відповідно до принаймні, одного з нефіксованих амінокислотних обговорюваних вище. залишків на іншу амінокислоту, переважно на іншу В іншому варіанті даного винаходу змінені або амінокислоту зі складу тієї ж самої категорії або мутовані форми формули (І) одержують шляхом підгрупи. Звертаючись до Фіг.2А, можна бачити, заміни, принаймні, однієї амінокислоти на іншу що залишки 1, 4, 7, 8, 11, 12, 14, 15 і 18 розташоамінокислоту по неконсервативній схемі. Для спевані на гідрофільній поверхні амфіпатичної спіралі, ціаліста в даній області техніки буде зрозуміло, що утвореної базовими пептидами формули (І). Серед подібні заміни не будуть істотною мірою змінювати цих залишків усі є гідрофільними, за винятком 1-го амфіпатичні і (або) структурні властивості спіралі, залишку, що може бути або гідрофільним, або що розглядалися вище. Отже, у деяких випадках гідрофобним. Отже, в однім із переважних варіанбажаною може бути заміна однієї або декількох тів залишки 4, 7, 8, 11, 12, 14, 15 і 18 є фіксованипар амінокислот таким чином, щоб зберегти сумами відповідно до формули (І) і, принаймні, один із рні властивості всієї спіралі. Додаткові вказівки на залишків 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 16 і 17 замінений на вибір придатних амінокислотних замін представіншу амінокислоту тієї ж самої категорії, переважлені послідовностями пептидів, приведеними в но на іншу амінокислоту тієї ж самої підгрупи. З табл.10 (див. далі розділ 8.3). іншого боку, 1-й залишок також є фіксованим відповідно до формули (І) і принаймні один із залишків 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 16 і 17 замінений відповідно до описаного. 43 71554 44 Ще в одному варіанті даного винаходу перші залишки делетують таким чином, щоб істотною 1-4 амінокислотних залишка по N- і (або) С-кінцю мірою зберегти розташування площини гідрофибазових пептидів формули (І) заміняють на один льно-гідрофобної взаємодії уздовж усієї довгої осі або декілька амінокислотних залишків або на один даної спіралі. або декілька пептидних сегментів, для яких відомі Зручніше за все цього можна досягти шляхом властивості по забезпеченню стабільності ділянок делетування достатнього числа розташованих або нерозташованих підряд амінокислотних залишків повторної структури, що утворюють a-спіраль (залишки або сегменти т.зв. «кінцевих кепов», або таким чином, щоб у результаті був видалений повний виток спіралі. Ідеалізована L-спіраль містить сегменти «кепування»). Такі «що кепують» залиш3,6 залишків на виток. Отже, у переважному варіаки і сегменти добре відомі в даній області техніки нті делетують групи з 3-4 послідовно розташова(див., наприклад, Richardson & Richardson, 1988, них або нерозташованих підряд амінокислот. Буде Science, 240, 1648-1652; Harper et al., 1993, Biochemistry, 32(30), 7605-7609; Dasgupta & Bell, делетуватися 3 амінокислоти, або 4 амінокислоти, буде залежати від положення в межах спіралі 1993, Intern. J. Peptide Protein Res., 41, 499-511; першого із залишків, що делетуються. Визначення Seale et al., 1994, Protein Sci., 3, 1741-1745; Doig et реального числа розташованих або нерозташоваal., 1994, Biochemistry, 33, 3396-3403; Zhou et al., них підряд амінокислотних залишків, що склада1994, Proteins, 18, 1-7; Doig & Baldwin, 1995, Protein Sci., 4, 1325-1336; Odaert et al., 1995, ють один повний виток спіралі, починаючи з будьякої конкретної початкової точки в межах амфіпаBiochemistry, 34, 12820-12829; Petmkhov et al., тичної спіралі, є достатньо простою задачею для 1996, Biochemistry, 35, 387-397; Doig et al., Protein спеціаліста в даній області техніки. Sci., 6, 147-155). 3 іншого боку, перші 1-4 N-кінцеві Через передбачувану важливість основного і (або) С-кінцеві амінокислотні залишки формули (І) можуть бути замінені пептидо-імітуючими склакластера, що знаходиться на С-кінці базових пептидів формули (І) у забезпеченні стабілізації спідовими, що імітують стр уктур у і (або) властивості ралі і важливості гідрофобного кластера в забеззалишків, що кепують, або сегментів. Придатні печенні ефективності зв'язування ліпідів і активації міметики-кепи добре відомі в даній області техніки LCAT, у переважних варіантах даного винаходу й описані, наприклад, у Richardson & Richardson, 1988, Science, 240, 1648-1652; Harper et al., 1993, залишки, що складають основний і гідрофобний кластери, не делетують. Отже, у переважних варіBiochemistry, 32(30) 7605-7609; Dasgupta & Bell, антах залишки 14, 16 і 18 (основний кластер) і за1993, Intern. J. Peptide Protein Res., 41, 499-511; лишки 3, 6, 9 і 10 (гідрофобний кластер) не Seale et al., 1994, Protein Sci., 3, 1741-1745; Doig et делетують. al., 1994, Biochemistry, 33, 3396-3403; Zhou et al., 1994, Proteins, 18, 1-7; Doig & Baldwin, 1995, Базові пептиди формули (І) також можуть бути подовжені по одному зі своїх кінців або добудовані Protein Sci, 4, 1325-1336; Odaert et al., 1995, по внутрішніх положеннях із використанням додатBiochemistry, 34, 12820-12829; Petrukhov et al., кових амінокислотних залишків, що істотною мірою 1996, Biochemistry, 35, 387-397; Doig et al., Protein не порушували б, а в деяких варіантах навіть поSci, 6, 147-155. При тому, що формула (І) включає 18 амінокисилювали б структурні і (або) функціональні параметри пептидів. Дійсно, подовження базових пепслотних залишків у конкретних положеннях повитидів до 19, 20, 21, 22 і навіть більшого числа нно бути зрозуміло, що базові пептиди за даним амінокислотних залишків потрапляє в обсяг даного винаходом можуть включати менше 18 амінокисвинаходу. Переважно, щоб такі подовжені пептиди лотних залишків. Дійсно, укорочені або делетовані по внутрішніх положеннях варіанти формули (І), істотною мірою зберігали загальні параметри амфіпатичності й інші властивості пептидів формули що включають 14-15 амінокислотних залишків, що (І). Звичайно, повинно бути зрозуміло, що додаістотною мірою зберігають основні характеристики вання амінокислот усередині пептида призведе до і властивості амфіпатичної спіралі, утвореної барозгортання площини гідрофобно-гідрофільної зовими пептидами формули (І), розглядаються як вхідні в обсяг даного винаходу. взаємодії в точки вбудовування за тим же типом, як це відбувається в описаних вище випадках внуУкорочені форми пептидів формули (І) одертрішнього делетування. Отже, висновки, зроблені жують шляхом делетування однієї або більшого вище при описі внутрішніх розподілів, в однаковій числа амінокислот із N- і (або) С-кінців формули мірі застосовні і для внутрішніх вставок. (І). Делетовані по внутрішніх ділянках варіанти формули (І) одержують шляхом делетування одніВ одному з варіантів базові пептиди подовжують по N- і (або) С-кінцю, принаймні, на один виток єї або більшого числа амінокислот із внутрішніх спіралі. Переважно, щоб такі добудування обумоположень пептиду формули (І). Делетовані внутвлювали стабілізацію повторної спіральної струкрішні амінокислотні залишки можуть розташовуватури в присутності ліпідів тією ж мірою, що й опитися, а можуть і не розташовуватися підряд. Для спеціалістів у даній області техніки буде сані вище кеповані амінокислотами і сегментами пептиди. зрозуміло, що делетування внутрішнього амінокиУ конкретному переважному варіанті базові слотного залишку з базового пептиду формули (І) пептиди формули (І) добудовують по С-кінцю повинно обумовити розгортання площинної гідроодним амінокислотним залишком, переважно фильно-гідрофобної взаємодії спіралі на 100° у точці делеції. Оскільки таке обертання може прилізином (К). Також в обсяг даного винаходу входять «зазвести до істотних змін амфіпатичних властивосблоковані» форми агоніста АроА-І, тобто такі варітей спіралі, що утвориться в результаті, то в переанти агоністів АроА-І, у яких N- і (або) С-кінець важному варіанті даного винаходу амінокислотні 45 71554 46 блокуються складовими, спроможними реагувати з Базовими пептидами, що утворюють мультиN-кінцевою групою -NH2 або із С-кінцевою групою мери, можуть бути пептиди формули (І), аналоги С(О)ОН. Було встановлено, що видалення N- і формули (І), муто вані варіанти формули (І), укоро(або) С-кінцевого заряду в агоністів АроА-І по дачені або делетовані по внутрішніх положеннях ному винаходу, що складаються з 18 або меншого варіанти формули (І), добудовані варіанти формучисла амінокислотних залишків (шляхлм синтезу ли (І) і (або) їхні сполучення. Базові пептиди моN-ацильованих пептидних аміжуть бути сполучені по типу «голова-до-хвоста» дов/ефірів/гідразидів/спиртів і їхніх заступників) (тобто N-кінець до С-кінця), «голова-до-голови» обумовлює утворення агоністів, що зберігають і в (тобто N-кінець до М-кінця), «хвіст-до-хвоста» деяких варіантах навіть перевершують активність (тобто С-кінец до С-кінця) або шляхом сполучень незаблокованого варіанта конкретного агоніста. цих орієнтацій. Наприклад, при тому, що пептид 210 (SEQ ID NO В одному з варіантів даного винаходу мульти210) виявляє 46%-у активацію LCAT у порівнянні з мери організовані у вигляді тандемних повторів, нативним АроА-І, заблокиована по N-і С-кінцям що складаються з двох, трьох, чотирьох і аж до форма цього пептиду - пептид 193 (SEQ ID NO десятьох базових пептидів. Переважними є муль193) - забезпечує в тому ж тесті активацію LCAT тимери, складені тандемними повторами від двох на рівні 96%. У деяких варіантах при наявності 22 до восьми базових пептидів. Отже, в одному з ваамінокислотних залишків N- або С-кінцеве блокуріантів агоністи АроА-І за даним винаходом вклювання обумовлює одержання агоністів АроА-І, що чають мультимери, що характеризуються такою виявляють меншу активність у порівнянні з незабструктурною формулою: локованими варіантами. Проте, блокування обох HH{LLm-HH}nLLm-HH (II) кінців (N і С) агоністів АроА-І, що складаються з 22 де: амінокислот, як очікується, призведе до віднов- кожний показник m незалежно один від однолення активності. Отже, у переважному варіанті по го є цілим числом від 0 до 1, переважно дорівнює даному винаходу або N- і (або) С-кінец (переважно 1; n є цілим числом від 0 до 10, переважно обидва кінці) базових пептидів, що складаються з від 0 до 8; 18 або меншого числа амінокислот, заблоковані, у - кожний «НН» незалежно представляє базотой час як N- і С-кінці пептидів, що складаються з вий пептид або пептидний аналог формули (І) або більш ніж 18 амінокислот, або обидва заблоковані, її мутован у, скорочену, делетовану по внутрішабо обидва не заблоковані. Звичайно N-кінцеві ньому положенню або добудовану форму відповігрупи, що блокують, включають групу RC(O)-, де R дно до описаного в даній заявці; представлений -Н, С1-С6-алкілом, С1-С6-алкенілом, - кожний «LL» незалежно представляє лінкер; і С1-С6-алкінілом, С5-С20-арилом, С6-С26-алкарилом, - кожний знак «-» незалежно означає ковален5-20-атомними гетероарилом або 6-26-атомними тний зв'язок. алкгетероарилом. Переважними N-кінцевими груУ формулі (II) лінкер LL може бути представпами, що блокують, є ацетил, форміл і дансил. лений будь-якою біфункціональною молекулою, Звичайні С-кінцеві групи, що блокують, включають спроможною забезпечувати ковалентній зв'язок групи -C(O)NRR і -C(O)OR, де R незалежно визнаодного пептида з іншим. Отже, придатні лінкери чаються відповідно до зазначеного вище. Переваце біфункціональні молекули, в яких функціональні жними С-кінцевими групами, що блокують, є ті, у групи спроможні утворювати ковалентний зв'язок яких група R незалежно представлена метилом. із Ν- і (або) С-кінцем пептиду. Функціональні групи, Не торкаючись якоїсь конкретної теорії, можна придатні для приєднання до Ν- або С-кінця пептивважати, що такі кінцеві групи, що блокують, стадів, добре відомі в даній області техніки, так само як і відомі придатні хімічні прийоми для забезпебілізують a-спіраль у присутності ліпідів (див., начення ефективного утворення таких зв'язків. приклад, Venkatachelapathi et al., 1993, Proteins: Лінкер може мати гнучку, жорстку або напівSctruct, Funct. & Genet, 15, 349-359). жорстку структур у, що залежить від бажаних власНативная структура Аро А-І включає вісім спіральних одиниць, що, як вважається, діють відпотивостей конкретного мультимера. Придатні лінкери включають, наприклад, амінокислотні залишки, відно до процесу зв'язування ліпідів (Nakagawa et такі як пролін або гліцин, або пептидні сегменти, al., 1985, J. Amer. Chem. Soc, 107, 7087-7092; що включають від приблизно 2 до приблизно 5, 10, Anantharamaiah et al., 1985, J. Biol. Chem., 260, 15 або 20, або навіть більшого числа амінокислот, 10248-10262; Vanloo et al., 1991, J. Lipid Res., 32, 1253-1264; Mendez et al., 1994, J. Clin. Invest., 94, біфункціональні органічні сполуки, такі як H2N(CH2)nCOOH, де n є цілим числом від 1 до 12, і 1698-1705; Palgunari et al., 1996, Arteriosclerosis, подібне. Приклади таких лінкерів, так само як і Thrombosis Vasuclar Biol., 16, 328-338; Demoor et засоби одержання таких лінкерів і пептидів, що al., 1996, Eur. J. Biochem., 239, 74-84). Отже, також включають такі лінкери, добре відомі в даній облав обсяг даного винаходу входять агоністи АроА-І, що є димерами, тримерами, тетрамерами і навіть сті техніки (див., наприклад, Hunig et al., 1974, Chem. Ber., 100, 3039-3044; Basak et al., 1994, полімерами більш високого порядку («мультимеBioconjug. Chem, 5(4) 301-305). ри») базових пептидів, описаних у даній заявці. В переважному варіанті даного винаходу танТакі мультимери можуть бути влаштовані у вигляді демні повтори у внутрішніх своїх ділянках переритандемних повторів, розгалужених конструкцій або сполучати їх. Базові пептиди можуть бути безповаються одиночними залишками проліна. У цьому сенсі в таких варіантах, де базові пептиди закінчусередньо приєднані один до іншого або розділені ються на N- або С-кінці проліном, таких як, наприодним або декількома лінкерами. клад, де Х1 представлений у формулі (І), є 47 71554 48 проліном (Р) або D-проліном (p), то m у формулі кислотній послідовності пептидным сегментам, (II) переважно дорівнює 0. У тих варіантах, в яких пов'язаним із спіралями нативних аполіпопротеїна N- або С-кінці пептиду немає залишку проліна, нів, включаючи, наприклад, АроА-І, АроА-ІІ, ApoAлінкером переважно є пролін (Р) або D-пролін (p), IV, АроС-І, АроС-ІІ, АроС-ІII, АроD, АроЕ і ApoJ, а m переважно дорівнює 1. можуть бути стандартним чином використані для У деяких варіантах даного винаходу бажаним зв'язування базових пептидів. Такі послідовності може бути використовувати розщеплювані лінкедобре відомі в даній області техніки (див., наприри, за допомогою яких можна відокремлювати клад, Rosseneu et al., 1992, "Analysis of the primary один або декілька спіральних сегментів (НН) за and of the secondary structure of the конкретних умов. Придатними розщеплюваними apolipoproteins", In "Structure & Function of лінкерами є пептиди, що характеризуються аміноLipoproteins", Ch.6, pp.159-183, CRC Press Inc.). кислотними послідовностями, що розпізнаються Іншими лінкерами, що забезпечують утворенпротеазами, олігонуклеотиди, що розщеплюються ня міжмолекулярних водневих зв'язків або сольоендонуклеазами, і органічні сполуки, що можуть вих «містків» між тандемними повторами антипабути розщеплені хімічним шляхом, наприклад, в ралельно орієнтованих спіральних сегментів, є умовах кислого або лужного середовища, або в обернені пептидні витки, такі як β-вигини й gінших умовах. Переважно, умови розщеплення вигини, так само як і органічні молекули, що імітуповинні бути достатньо м'якими, щоб не обумовють структури пептидних (β-вигинів і (або) gлювати денатурацію або які-небудь інші порушенвигинів. У цілому, обернені витки - це сегменти ня спіральних сегментів і (або) непризначених до пептидів, що розвертають напрямок поліпептидноррозщеплення лінкерів у складі мультимерних го ланцюжка таким чином, щоб забезпечити одиагоністів АроА-І. нарному поліпептидному ланцюжку можливість Пептидні й олігонуклеотидні лінкери, що мопристосувати такі свої ділянки, як антипаралельна жуть бути вибірним чином розщеплені, а також β-площина або a-спіраль, β-вигин у цілому склазасоби розщеплення лінкерів добре відомі і легко дений чотирма амінокислотними залишками, а gдоступні спеціалістам у даній області техніки. вигин звичайно складений трьома амінокислотниПридатні лінкери у ви гляді органічних сполук, що ми залишками. можуть бути вибірним чином розщеплені, будуть Конформації і послідовності багатьох пептидочевидні для спеціалістів у даній області техніки і них β-вигинів добре відомі в даній області техніки і включають те, що, наприклад, було описано в міжвключають, тим самим не обмежуючись, названі в народній заявці WO94/08051 і в матеріалах, що якості прикладів тип-І, тип-I’, тип-ІІ, тип-ІI’, тип-ІII, цитуються в ній. тип-III’, тип-IV, тип-V, тип-V’, тип-VIa, тип-VIb, типУ переважному варіанті використовуваними VII і тип-VIII (див. Richardson, 1981, Adv. Protein лінкерами є пептиди, що служать субстратами для Chem., 34, 167-339; Rose et al., 1985, Adv. Protein ендогенних ферментів, що циркулюють, що тим Chem, 37, 1-109; Wiimot et al., 1988, J. Mol. Biol, самим забезпечує мультимерним агоністам АроА-І 203, 221-232; Sibanda et al., 1989, J. Mol. Biol, 206, спроможність вибірково розщеплюватися in vivo. 759-777; Tramontano et al., 1989, Proteins: Struct, Ендогенним ферментом, що підходить для розщеFunct. Genet, 6, 382-394). плення таких лінкерів, є, наприклад, пропептидаза Зігнутість конкретних конформацій коротких проаполіпопротеїна А-І. Придатні ферменти, а пептидів з утворенням β-вигіну в першу чергу затакож пептидні сегменти, які служать субстратами лежить від розташування деяких амінокислотних для таких ферментів, добре відомі в даній області залишків у вигині (звичайно Gly, Asn або Pro). Звитехніки (див., наприклад, Edelstein et al., 1983, J. чайно β-вигин типу-І сумісний із будь-яким аміноBiol. Chem., 258, 11430-11433; Zanis, 1983, Proc. кислотним залишком у положенні від 1-го до 4-го, Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2574-2578). за винятком того, що пролін не повинний займати Як обговорювалося вище, ключовою властиві3-е положення. У складі типу-І і типу-ІІ у положенні стю базових пептидів по даному винаходу є їхня 4 переважає гліцин, а в положенні 2 переважає спроможність утворювати міжмолекулярні водневі пролін. У положенні 1 часто знаходяться залишки зв'язки або сольові «містки» при будуванні в антиAsp, Asn, Ser і Cys, при тому, що їхні бічні ланцюги паралельній орієнтації. Отже, у переважному печасто утворюють водневі зв'язки з NH у складі 3-го реважному варіанті даного винаходу лінкери дозалишку. статньої довжини і гнучкості використовуються У вигинах типу-ІІ залишки гліцину й аспарагіну таким чином, щоб забезпечувати спіральним сегнайбільш часто знаходяться в 3-му положенні, ментам (НН) формули (II) можливість вишиковуватому що вони найбільш легко забезпечують притися в антипаралельній орієнтації і в присутності стосовування необхідних куті в у вуглецевому ланліпідів утворювати міжмолекулярні водневі зв'язки цюзі. В ідеальній ситуації вигини типу-I’ мають заабо сольові «містки». лишки гліцину в положеннях 2 і 3, а у вигині типу-ІI’ Лінкери достатньої довжини і гнучкості вклюгліцин знаходиться в положенні 2. У вигині типу-ІII чають, тим самим не обмежуючись, пролін (Р), можуть знаходитися більшість амінокислотних гліцин (G), Cys-Cys, H 2N- (CH2)n-C(O)OH, де n дозалишків, у той час як у типі-III’, як правило, у 2-му рівнює від 1 до 12, переважно від 4 до 6; Н2Nі 3-му положеннях потрібна присутність гліцина. У арил-С(О)ОН і вуглеводи. вигинах типу-VIa і типу-VIb звичайно є цисЗ іншого боку, оскільки нативні аполіпопротеїпептидний зв'язок і є присутнім залишок проліна у ни забезпечують зв'язування між розташованими внутрішньому положенні. Для ознайомлення з антипаралельно спіральними сегментами, пепоглядом, що описує різноманітні типи і послідовтидні лінкери, що відповідають по своїй аміноності β-вигинів у білках і пептидах, читач може 49 71554 50 ознайомитися з роботою Wilmot et al., 1988, J. Mol. «вузли») позначені кільцями (·), де число ліній, що Biol., 203, 221-232. виходять з кільчя, означає «порядок» (або число Конформація і послідовності багатьох пептидфункціональних груп) для багато функціональної них g-вигинів також добре відомі в даній області зв'язуючої складової. техніки (див., наприклад. Rose et al., 1985, Adv. Число «вузлів розгалуження» у даній структурі Protein Chem., 37, 1-109; Wilmer-White et al., 1987, в цілому залежить від загальної бажаної кількості Trends Biochem. Sci., 12, 189-192; Wilmot et al., спіральних сегментів і звичайно складає від 1 до 2. 1988, J. Mol. Biol., 203, 221-232; Sibanda et al., Безумовно, повинно бути зрозуміло, що для дано1989, J. Mol. Biol., 206, 759-777; Tramontano et al., го числа бажаних спіральних сегментів структури, 1989, Proteins: Struct. Fund. Genet., 6, 382-394). Всі що базуються на зв'язуючих складових більш високого порядку, зможуть включати менше число дані типи β-вигинів та g-вигинів і відповідні ним «вузлів». Наприклад, звертаючись до Фіг.7А і 7В, послідовності, так само як і пізніше описані струкструктура 3-го порядку (тобто стр уктура, що вклютури і послідовності пептидних β-вигинів і gчає 3-функціональні зв'язуючі складові) для семи вигинів конкретним чином представляються даспіральних одиниць має три «вузли» (Фіг.7А), у той ним винаходом. час як структура 4-го порядку (тобто структура, що З іншого боку, лінкер (LL) може включати орвключає 4-функціональні зв'язуючі складові) для ганічну молекулу або складову, що імітує стр уктусеми спіральних одиниць має тільки два «вузли» ру пептидного β-вигина або g-вигина. Такі складові, (Фіг.7В). що імітують β-вигини і (або) g-вигини, так само як і Структури можуть характеризуватися однотизасоби синтезу пептидів, що включають такі склапними порядками: тобто в таких структурах усі дові, добре відомі в даній області техніки і вклю«вузли» є, наприклад, 3-функціональними або 4чають, крім іншого, те, що описано в роботах функціональними зв'язуючими складовими, або ж Giannis & Kolter, 1993, Angew. Chem. Intl. Ed. Eng., можуть мати змішані по порядку «вузли розгалу32, 1244-1267; Kahn et al., 1988, J. Mol. Recognition, ження», наприклад, при одночасній наявності 31, 75-79; Kahn et al., 1987, Tetrahedron Lett., 28, функціональних і 4-функціональних зв'язуючих 1623-1626. складових. Звичайно, повинно бути зрозуміло, що Ще в одному варіанті даного винаходу мульнавіть у стр уктура х із розгалуженнями одного потимери мають форму розгалуженої структури рядку зв'язуючі складові не повинні бути ідентич(див., наприклад, Фіг.7). Такі структури стандартними. У структурі з розгалуженнями третього поним чином одержують із використанням багатофурядку можуть використовуватися, наприклад, дві, нкціональних зв'язуючих складових, що забезпетри, чотири або навіть більше різноманітних тричують приєднання до простої зв'язуючої складової функціональних зв'язуючих складових. більш ніж двох спіральних одиниць. Отже, розгаЯк і лінійні мультимери, спіральні сегменти, лужені структури засновані на молекулах, що мащо входять до складу розгалужених структур, моють три, чотири або навіть більші числа функціожуть бути, а можуть і не бути ідентичними. нальних груп, що спроможні ковалентно Приклад такої структури зі змішаними порядприєднуватися до N- і (або) С-кінцю пептиду. Приками розгалуження показаний на Фіг.7С. На Фіг.7С датні зв'язуючі складові, наприклад, включають спіральні сегменти (тобто базові пептиди за даним амінокислотні залишки, що характеризуються бічвинаходом) показані у вигляді циліндрів, а баганими ланцюгами, які несуть гідроксильні, сульфатофункціональні зв'язуючі складові показані у винільні, аміно, карбоксильні, амідні і (або) ефірні гляді кільців (·), де число ліній, що виходять з кіфункціональні групи, такі як, наприклад, Ser (S), льця, відповідає «порядку» (або числу Thr (T), Cys (С), Туг (Υ), Asn (N), Gin (Q), Lys (K), функціональних груп) багатофункціональної зв'яArg (R), Orn, Asp (D) та Glu (E) або інші органічні зуючої складової. Лінії, що зв'язують спіральні семолекули, що включають такі функціональні групи. гменти, подають біфункціональні лінкери LL відпоСпіральні сегменти, приєднані до однієї зв'явідно до раніше описаного. Спіральні сегменти, що зуючої складової, не обов'язково повинні бути складають розгалужені структури, можуть бути приєднані подібними кінцями. Дійсно, у деяких тандемними повторами базових пептидів відповідваріантах спіральні сегменти приєднані до однієї но до раніше описаного. зв'язуючої складової таким чином, щоб забезпечиВ одному з ілюстративних варіантів розгалути антипаралельну орієнтацію, і при цьому деякі жені структури за даним винаходом описуються спіралі приєднані по своїх N-кінцях, а інші - по свотакою формулою: їх С-кінцях. X-N ya-X( ya-1)-(N yb-X( yb-1)) p (III) Спіральні сегменти можуть бути приєднані де безпосередньо до зв'язуючої складової, або мо- кожний X незалежно представлений, HHжуть бути у відділені від зв'язуючої складової за (LLm—HH-)-nLLm—НН; допомогою одного або декількох біфункціональних - кожний НН незалежно представлений базолінкерів (LL) відповідно до описаного вище. вим пептидом формули (І) або його аналогом, або Звертаючись до Фіг.7А і 7В, можна бачити, що мутованим, укороченим, делетованим по внутрішрозгалужена структура може бути описана в терньому положенню або добудованому варіанту відмінах числа «вузлів розгалуження», що складають повідно до описаного в даному тексті; таку стр уктуру, де вузол являє собою багатофунк- кожний LL незалежно представлений біфункцыональну зв'язуючу складову. На Фіг.7А і 7В спіціональним лінкером; ральні сегменти (наприклад, базові пептиди за - кожний m незалежно є цілим числом від 0 даним винаходом) зображені у вигляді циліндрів, а до 1; багатофункціональні зв'язуючі складові (або 51 71554 52 - кожний n незалежно є цілим числом від 0 - кожний m незалежно є цілим числом від 0 до 8; до 1; - Nya і N yb незалежно один від іншого є багато- Ri є -OR або -NRR; і функціональною зв'язуючою складової, де уа й yb - кожний R незалежно представлений -Н, С1представляють число функціональних груп, відпоС6-алкілом, С1-С6-алкенілом, С1-С6-алкінілом, С5відно, у N ya і N yb; С20-арилом, С6-С26-алкарилом, 5-20-атомним гете- кожний уа або уb незалежно є цілим числом роарилом або 6-26-атомним алкгетероарилом. від 3 до 8; 5.1.1. Аналіз структури і функцій - p є цілим числом від 0 до 7; і Структура і функції базових пептидів або пеп- кожний знак «-» незалежно означає ковалентидних аналогів по даному винаходу, так само як і тний зв'язок. агоністи АроА-І, складені такими базовими пептиУ переважному варіанті розгалужена структудами, включаючи мультимерні форми, описані ра включає «лізинове дерево», тобто є структувище, можуть бути протестовані з метою вибору рою, в якої багатофункціональна зв'язуюча склаактивних агоністів або миметиків АроА-І. Напридова є одиночним або серією залишків лізина (К) клад, базові пептиди або пептидні аналоги можуть (див., наприклад, Фіг.7D). бути протестовані по їхній спроможності утворюВ одному ілюстративному варіанті «лізинове вати a-спіралі в присутності ліпідів, зв'язуватися з дерево» в розгалуженій структурі по даному виналіпідами, утворювати комплекси з ліпідами, актиходу описується такою формулою: вувати LCAT, сприяти виходові холестерину з. клітин і т.п. Методи і тести, призначені для аналізу структури і (або) функцій пептидів, добре відомі в даній області техніки. Переважні методи охарактеризовані в прикладах, описаних у даному тексті. Наприклад, тести на основі кругового ди хроїзма (КД) і ядерного магнітного резонансу (ЯМР), описані тут у розділі 7, можуть бути використані для аналізу структури пептидів або пептидних аналогів зокрема, для визначення «ступеня спіральності» в присутності ліпідів. Спроможність зв'язуватися з ліпідами може бути визначена з використанням флуоресцентної спектроскопії, тест на основі якої или описаний тут у розділі 7. Спроможність пептидів і де: (або) пептидних аналогів активувати фермент - кожний X незалежно представлений HHLCAT може бути легко визначена з використанням (LLm—HH-)-nLLm—НН; тесту на активацію LCAT, описаного тут у розділі - кожний НН незалежно представлений базо8. Тести in vitro та in vivo, описані тут у розділах 9, вим пептидом формули (І) або його аналогом, або 10 і 11, можуть бути використані для оцінки часу мутованим, укороченим, делетованим по внутрішполужиття, розподілу, інтенсивності виходу холесньому положенню або добудованому варіанту відтерину і впливи на ЗТХ. повідно до описаного в даному тексті; У цілому, базові пептиди і (або) пептидние - кожний LL незалежно представлений біфунканалоги по даному винаходу, що виявляють власціональним лінкером; тивості, підсумовані в табл.4, розглядаються як - кожний n незалежно є цілим числом від 0 активні. до 8; Таблиця 4 Властивості активних пептидів Властивість % спіральності в присутності ліпідів (Ri=30) (незаблокований 22-амінокислотний пептид) % спіральності в присутності ліпідів (Ri=30) (незаблокований 18-амінокислотний пептид) % спіральності в присутності ліпідів (Ri=30) (заблокований 18-амінокислотний пептид и більш короткі пептиди) Зв'язування ліпідів (в присутності SUV) Активація ферменту LCAT Ri - молярне відношення «ліпід/пептид». Як ілюструється в робочих прикладах даної заявки, базові пептиди, що виявляють високий ступінь активації LCAT (³38%), звичайно виявляють наявність істотно ступеня α-спіральності в Діапазон Переважний діапазон ³60% ³80% ³40% ³60% ³60% ³80% 0,5-10мкМ пептиду (Ri=150) ³38% ³80% присутності невеликих одношарових жирових пухирців (SUV) (³60% спіральних стр уктур у випадку з незаблокованими пептидами, що складаються з 22 або більшого числа амінокислотних залишків і 53 71554 54 заблокованих пептидів, що складаються з 18 або виявляють активацію на рівні 50%, 60%, 70%, 80% або навіть 90%. меншого числа амінокислотних залишків; ³40% спіральності у випадку незаблокованих пептидів, 5.1.2. Переважні варіанти Агоністи АроА-І по даному винаходу далі мощо складаються з 18 або меншого числа амінокижуть бути визначені шляхом позначення переважслот), у той час як пептиди, що виявляють низьку них варіантів. активність в активації LCAT або позбавлені її зоВ одному із переважних варіантів агоністами всім, характеризуються слабкою a-спіральністю. АроА-І є пептиди, що складаються з 18 амінокисПроте, у деяких випадках пептиди, що характерилотних залишків відповідно до формули (І), або їх зуються високою інтенсивністю утворення спіралі ацильовані по М-кінцю і (або) амідовані по Св присутності ліпідів, не були ефективні в активації кінцю, або етерифіковані форми. LCAT. В іншому переважному варіанті агоністами Подібним чином, при тому, що базові пептиди, АроА-І є пептиди, що складаються з 18 амінокисщо забезпечують істотн у активацію LCAT, звичайлотних залишків відповідно до формули (І), або їх но зв'язують ліпіди, у деяких варіантах пептиди, ацильовані по N-кінцю і (або) амідовані по С-кінцю, що виявляють зв'язування ліпідів, не обумовлюабо етерифіковані форми, в яких: ють скільки-небудь істотної активації LCAT. Х2 представлений аланіном (А), валіном (V) Як наслідок, для спеціалістів у даній області або лейцином (L); техніки повинно бути зрозуміло, що, при тому, що Х4 представлений аспарагіновою кислотою (D) спроможність базових пептидів, описаних у даноабо глутаміновою кислотою (Е); му тексті, утворювати a-спіралі (в присутності ліпіХ7 представлений аргініном (R), лізином (ДО) дів) і зв'язувати ліпіди є істотною для їхньої активабо орнитином; ності, у бага тьох варіантах ці властивості можуть Х8 представлений аспарагіновою кислотою (D) бути недостатніми. Отже, у переважному варіанті або глутаміновою кислотою (Е); базові пептиди по даному винаходу є об'єктами Х11 представлений глутаміновою кислотою (Е) серії тестів, націлених на вибір базових пептидів, або аспарагіном (N); що виявляють виразну фармакологічну активність. Х12 представлений глутаміновою кислотою (Е); На першому етапі базовий пептид тестують поХ14 представлений аргініном (R), лізином (К), його спроможності утворювати a-спіраль в присуторнитином або лейцином (L); ності ліпідів із використанням КД-теста, описаного Х16 представлений аргініном (R), лізином (ДО) тут у розділі 7. Ті пептиди, що характеризуються або орнитином; і (або) принаймні 40%-ою «спіральністю» (для незаблоХ18 представлений аргініном (R), лізином (К) кованих пептидів, що складаються з 18 або менабо орнитином, а шого числа амінокислот) або 60%-ою спіральністю Х1 , Х3, Х5 , Х6, Х9, X10, Х13, Х15 і Х17 відповідають (для заблокованих пептидів, що складаються з 18 раніше визначеному для формули (І). або меншого числа амінокислот, а також для неВ іншому переважному варіанті агоністами заблокованих пептидів, що складаються з 22 або АроА-І є пептиди, що складаються з 18 амінокисбільшого числа амінокислот) в присутності ліпідів лотних залишків відповідно до формули (І), або їх (у концентрації приблизно 5мк і молярному відноацильовані по N-кінцю і (або) амідовані по С-кінцю, шенні «ліпід/пептид» приблизно 30), потім тестуабо етерифіковані форми, в яких Х11 представлеють по їхній спроможності зв'язувати ліпіди з виконий аспарагіном (N), Х14 представлений лейцином ристанням тесту на флуоресценцію, описаного тут (L), а, коли Х11 не є аспарагіном (N), то Х14 не є у розділі 7. Зрозуміло, що тільки ті базові пептиди, лейцином (L). Конкретними переважними варіанщо несуть флуоресціюючі залишки триптофана тами в даному аспекті даного винаходу є такі пеп(W) або Nal., тестують на зв'язування ліпідів у тесті тиди або їх ацильовані по N-кінцю і (або) амідовані на флуоресценцію. Проте, у випадку пептидів, що по С-кінцю, або етерифіковані форми, в яких різне несуть флуоресціюючих амінокислотних залишноманітні залишки Хn у формулі (І) визначаються ків, зв'язування ліпідів очевидно при збільшенні так само, як описано в попередньому абзаці. Існуспіральності в присутності ліпідів. ючим прикладом конкретних переважних варіантів Базові пептиди, що виявляють зв'язування лівідповідно до даного аспекту даного винаходу є підів при SUV (0,5-10мк пептиди; молярне віднопептид 209 (PVLDLFRELLNELLQKLK: SEQ ID NO шення «ліпід/пептид» у діапазоні від 1 до 50), по209) і його ацильовані по N-кінцю і (або) амідовані тім піддають скринінгу на фармакологічну по С-кінцю, або етерифіковані форми. активність. Зрозуміло, що фармакологічна активЩе в одному переважному варіанті агоністами ність, на яку проводиться скринінг, буде залежати АроА-І є змінені або мутовані форми пептидів фовід пропонованого використання конкретних агонірмули (І) або їх ацильовані по N-кінцю і (або) амістів Аро А-І. У переважному варіанті базові пептидовані по С-кінцю, або етерифіковані форми, в ди сканують на їхню спроможність активувати феяких: рмент LCAT, тому що пептиди, спроможні Х1 не є аспарагіновою кислотою (D); активувати LCAT, є конкретно застосовними в Х9 не є гліцином (G); описаних в даному тексті способах. Базові пептиХ10 не є гліцином (G); ди, що виявляють принаймні 38%-у активацію Х12 не є лейцином (L); і LCAT у порівнянні з нативним АроА-І людини (відХ13 не є гліцином (G). повідно до оцінки в тесті на активацію LCAT, опиЩе в одному переважному варіанті агоністи саним тут у розділі 8), є переважними, при тому, АроА-І вибирають із групи пептидів, перераховащо найбільш переажними є базові пептиди, що них нижче: 55 71554 56 пептид 191 PVLDLFRELLEELKQKLK* PVLDLLRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 191); пептид 194 пептид 192 PVLELFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 194); PVLDLFKELLEELKQKLK* пептид 195 (SEQ ID NO 192); пептид 193 PVLELFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 195); PVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 193); пептид 196 пептид 194 PVLDLFRELLEELKNKLK* (SEQ ID NO 196); PVLELFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 194); пептид 197 пептид 195 PLLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 197); PVLELFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 195); пептид 198 пептид 196 GVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 198); PVLDLFRELLEELKNKLK* (SEQ ID NO 196); пептид 199 пептид 197 PVLDLFRELWEELKQKLK* (SEQ ID NO 199); PLLDLFRELLEELKQKLK* пептид 200 (SEQ ID NO 197); пептид 198 NVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 200); GVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 198); пептид 201 пептид 199 PLLDLFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 201); PVLDLFRELWEELKQKLK* (SEQ ID NO 199); пептид 202 пептид 200 PALELFKDLLEELRQKLR* (SEQ ID NO 202); NVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 200); пептид 203 пептид 201 AVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 203); PLLDLFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 201); пептид 204 пептид 202 PVLDFFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 204); PALELFKDLLEELRQKLR* пептид 205 (SEQ ID NO 202); пептид 203 PVLDLFREWLEELKQKLK* (SEQ ID NO 205); AVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 203); пептид 206 пептид 204 PLLELLKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 206); PVLDFFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 204); пептид 207 пептид 205 PVLELLKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 207); PVLDLFREWLEELKQKLK* (SEQ ID NO 205); пептид 208 пептид 206 PALELFKDLLEELRQRLK* (SEQ ID NO 208); PLLELLKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 206); пептид 209 пептид 207 PVLDLFRELLNELLQKLK (SEQ ID NO 209); PVLELLKELLEELKQKLK* пептид 210 (SEQ ID NO 207); пептид 208 PVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO 210); PALELFKDLLEELRQRLK* (SEQ ID NO 208); пептид 211 пептид 209 PVLDLFRELLEELOQOLO* (SEQ ID NO 211); PVLDLFRELLNELLQKLK (SEQ ID NO 209); пептид 212 пептид 210 PVLDLFOELLEELOQOLK* (SEQ ID NO 212); PVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO 210); пептид 213 пептид 211 PALELFKDLLEEFRQRLK* (SEQ ID NO 213); PVLDLFRELLEELOQOLO* (SEQ ID NO 211); пептид 214 пептид 212 pVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO214); PVLDLFOELLEELOQOLK* пептид 215 (SEQ ID NO 212); пептид 213 PVLDLFRELLEEWKQKLK* (SEQ ID NO 215). PALELFKDLLEEFRQRLK* (SEQ ID NO 213); або в заблокованих по N-кінцю і (або) С-кінцю, пептид 214 або в незаблокованих по них формах. PVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 214); Ще в одному переважному варіанті агоністами пептид 215 АроА-І є мультимерні форми відповідно до форPVLDLFRELLEEWKQKLK* (SEQ ID NO 215); мул II, III і (або) IV, в яких кожний НН незалежно пептид 229 один від іншого подані пептидами формули (І) або PVLELFERLLEDLQKKLK (SEQ ID NO 229); їх ацильованими по N-кінці і (або) амідованими по пептид 230 С-кінцю, або етерифікованими формами, або PVLDLFRELLEKLEQKLK будь-яким з переважних пептидів формули (І), (SEQ ID NO 230); пептид 231 описаним у даному розділі. PLLELFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 231); В іншому переважному варіанті базові пептиабо в заблокованих по N-кінцю і (або) С-кінцю, ди, що представляють агоністи АроА-І, не є будьабо в незаблокованих по них формах. яким з перерахованих нижче пептидів: Ще в одному переважному варіанті агоністи пептид 75 (SEQ ID NO 75); PVLDEFREKLNEELEALKQKLK АроА-І вибирають із групи пептидів, перераховапептид 94 них нижче: (SEQ ID NO 94); PVLDEFREKLNEALEALKQKLK пептид 191 пептид 109 PVLDLLRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 191); PVLDEFREKLNERLEALKQKLK (SEQ ID NO 109); пептид 192 пептид 237 PVLDLFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO 192); LDDLLQKWAEAFNQLLKK (SEQ ID NO 237); пептид 193 (SEQ ID NO 193); 57 71554 58 пептид 238 Nakagawa et al., 1985, J. Amer. Chem. Soc., 107, EWLKAFYEKVLEKLKELF* (SEQ ID NO 238); 7087-7092. пептид 241 Агоністи АроА-І, що включають Ν- і (або) СDWFKAFYDKVFEKFKEFF кінцеві блокуючі групи, можуть бути отримані з (SEQ ID NO 241); пептид 242 використанням стандартних методик органічної GIKKFLGSIWKFIKAFVG (SEQ ID NO 242); хімії. Наприклад, методи ацилювання по N-кінцю пептид 243 пептиду або амідування або етерифікування по СDWFKAFYDKVAEKFKEAF (SEQ ID NO 243); кінцю пептиду добре відомі в даній області техніки. пептид 244 Шляхи внесення інших модифікацій по Ν- і (або) СDWLKAFYDKVAEKLKEAF (SEQ ID NO 244); кінцю будуть зрозумілі спеціалістам у даній обласпептид 245 ті техніки, як шляхи захисту будь-якої функціонаDWLKAFYDKVFEKFKEFF (SEQ ID NO 245); льної групи в складі бічних ланцюгів, подібні до пептид 246 необхідності приєднання кінцевих блокуючих груп. EWLEAFYKKVLEKLKELF Фармацевтично прийнятні солі (протиіони) (SEQ ID NO 246); пептид 247 можуть бути стандартним чином отримані за доDWFKAFYDKFFEKFKEFF (SEQ ID NO 247); помогою іон-обмінної хроматографії або за допопептид 248 могою інших методів, добре відомих у даній облаEWLKAFYEKVLEKLKELF (SEQ ID NO 248); сті те хніки. пептид 249 Сполуки по даному винаходу, що знаходяться EWLKAEYEKVEEKLKELF* (SEQ ID NO 249) у вигляді тандемно улаштованих мультимеров, пептид 250 можуть бути синтезовані стандартним чином шляEWLKAEYEKVLEKLKELF* (SEQ ID NO 250) хом додавання лінкера (лінкерів) до пептидного пептид 251 ланцюжка на прийнятному етапі синтезу. З іншого EWLKAFYKKVLEKLKELF* боку, можуть бути синтезовані спіральні сегменти (SEQ ID NO 251) Нарешті, в найбільш переважному варіанті з реагуванням кожного з таких сегментів із лінкеагоністи АроА-І не є будь-яким з пептидів, перераром. Зрозуміло, що конкретний метод синтезу бухованих в табл.10 (розділ 8.3 даного тексту), що де залежати від складу лінкера. Придатні схеми виявляють ефективністьактивації ферменту LCAT захисту і хімічних реакцій добре відомі і будуть на рівні меншем 38% у порівнянні з нативним ясні для спеціалістів у даній області техніки. АроА-І людини. Сполуки по даному винаходу, що знаходяться 5.2. Синтез і очищення пептидних агоністів у вигляді розгалужених структур, можуть бути стаАроА-І ндартним чином синтезовані з використанням Базові пептиди за даним винаходом можуть тримерних і тетрамерних полімерів і хімічних реабути отримані з використанням по суті будь-якої з кцій, описаних у Tarn, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. методик, відомих в даній області техніки, спрямоUSA, 85, 5409-5413 і Demoor et al., 1996, Eur. J. ваних на отримання пептидів. Наприклад, пептиди Biochem., 239, 74-84. Модифікування синтетичних можуть бути отримані з використанням стандартполімерів і стратегії синтезу розгалужених струкного покрокового синтезу пептидів в розчині чі тур ви щих або нижчих порядків або структур, що твердій фазі, або з використанням методик рекомсполучать у своєму складі спіральні сегменти різбінантної ДНК. номанітних базових пептидів, цілком доступні для 5.2.1. Хімічний синтез спеціалістів в області хімії пептидів і (або) органічБазові пептиди можуть бути отримані з виконої хімії. ристанням стандартної процедури покрокового Утворення дисульфідних зв'язків, якщо це є синтезу в розчині або в твердій фазі (див., наприбажаним, звичайно здійснюють в присутності неклад, "Chemical Approaches to the Synthesis of сильних окислювачів. Можуть бути використані Peptides and Proteins", eds. Williams et al., 1997, хімічні окислювачі або ж сполуки можуть просто CRC Press, Boca Raton, FL і цитовані там праці; бути піддані впливу атмосферного кисню з метою "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical досягнення утворення таких зв'язків. Різноманітні Approach", eds. Atherton & Shepard, 1989, IRL методи відомі в даній області техніки, включаючи Press, Oxford, England і цитовані там праці). ті, що описані в Tam et al., 1979, Synthesis, 955З іншого боку, пептиди згідно з даним винахо957; Stewart et al., 1984, "Solid Phase Peptide дом можуть бути отримані шляхом сегментної Synthesis" 2 d ed.. Pierce Chera. Co., Rockford, IL; конденсації згідно з описаним, наприклад, у Liu et Ahmed et al., 1975, J. Biol. Chem., 250, 8477-8482, al., 1996, Tetrahedron Lett, 37(7), 933-936; Baca et i Pennington et al., 1991, Peptides, 1990, 164-166, al., 1995, J. Amer. Chem. Soc, 117, 1881-1887; Tarn eds. Giralt & Andreu, ESCOM Leiden, Нідерланди. et al., 1995, Intern. J. Peptide Protein Res., 45, 209Інші підходи описані в Kamber et al., 1980, Helv. 216; Schnolzer & Kent, 1992, Science, 256, 221-225; Chim. Acta, 63, 899-915. Спосіб, здійснюваний на Liu & Tarn, 1994, J. Amer. Chem. Soc, 116, 4149твердих підложках, описаний у Albericio, 1985, 4153; Liu & Tarn., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Intern. J. Peptide Protein Res., 26, 92-97. Будь-який 91, 6584-6588; Yamashiro & Li, 1988, Intern. J. з цих методів може бути використаний для утвоPeptide Protein Res., 31, 322-334). Метод конденрення дисульфідних зв'язків у пептидах по даному сації сегментів є особливо переважним методом винаходу. синтезу варіантів, усередині яких знаходяться за5.2.2. Рекомбінантний синтез лишки гліцина. Інші методи, які застосовують для Якщо конкретний пептид складається виняткосинтезу пептидів по даному винаходу, описані в во з генетично кодованих амінокислот або в такий спосіб складена його частина, то такий пептид або 59 71554 60 його відповідний фрагмент можуть бути синтезотрансформуються рекомбінантними дріжджовими вані з використанням рекомбінантних методологій, або грибковими експресуючими векторами, що традиційних для генної інженерії. включають придатну послідовність, що кодує; кліДля рекомбінантного синтезу полінуклеотидну тини комах, інфікує рекомбінантними вірусними послідовність, що кодує конкретний пептид, вноекпресуючими векторами, (наприклад, бакуловірусять у придатну експресуючу систему, тобто у вексними), що включають придатну послідовність, що тор, у складі якого є елементи, необхідні для здійкодиує, системи клітин рослин, інфікує рекомбінаснення транскрипції і трансляції вмонтованої нтними вірусними експерсуючими векторами, (накодованої послідовності, або ж, у випадку з вектоприклад, вірусом мозаїки кольорової капусти або ром на основі РНК-вмісного вірусу, є елементи, вірусом тютюнової мозаїки) або що трансформунеобхідні для здійснення реплікації і трансляції. ються рекомбінантними плазмідними експресуюЕкспресуючу систему потім, вносять у придатну чими векторами, (наприклад, Ті-плазмідою), що клітину-мішень, що буде експресувати даний пепвключають придатну послідовність, що кодує; або тид. У залежності від обраної експресуючої систесистеми клітин тварин. ми, пептид, що експресують потім вигляділяють із Пов'язані з забезпеченням експресії елементи застосуванням добре відомих у даній області техв складі експресуючих систем, варіюються по своніки процедур. Методи одержання рекомбінантних їй силі і специфічності. У залежності від викорисбілків і пептидів добре відомі (див., наприклад, товуваної системи «вектор-хазяїн» будь-які з приSambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A датних регуляторів транскрипції і трансляції, Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Lab., NY; включаючи конститутивні і індуцибельні промотоAusubel et al., 1989, "Current Protocols in Molecular ри, можуть бути використані для включення до Biology", Greene Publ. Assoc. & Wiley Intersci., NY складу експресуючого вектора. Наприклад, у виобидва керівництва включені в повному своєму падку клонування в бактеріальну систему, можуть обсязі для довідки у вигляді бібліографічних бути використані індуцибельні промотори, такі як посилань). промотор pL бактеріофага l, промотори plac, ptrp, Для підвищення ефективності одержання поptac (гібридний промотор ptrp-lac) і подібні; у випалінуклеотид може бути сконструйований таким дку клонування в системи клітин комах можуть чином, щоб кодувати множинні одиниці того самобути використані такі промотори, як промотор пого пептиду, розділені сайтами-мішенями для каталігедрозного бакуловіруса; у випадку клонування в літичного розщеплення - за допомогою такого підсистеми рослинних клітин можуть бути використані ходу можуть бути сконструйовані або промотори, похідні від геномів клітин рослин (нагомополімери (повторювані пептидні одиниці), або приклад, промотори генів теплового шоку, промогетерополімери (з'єднані разом різні пептиди). тор гена малої субодиниці фотосинтетичного феОтриманий у результаті поліпептид може бути рменту Rubisco, промотор гена зв'язуючого білку, розщеплений (наприклад, шляхом опрацювання хлорофіла-a/b) або похідні від рослинних вірусів придатним ферментом) із метою виділення пепти(наприклад, промотор 35S-PHK вірусу CaMV, продних одиниць. Це може призвести до посилення мотор гена капсидного білка вірусу TMV); у випадвиходу пептидів, пов'язаних із єдиним промотоку клонування в системи клітин ссавців можуть ром. В переважному варіанті поліцистронний полібути використані промотори, похідні від генома нуклеотид може бути сконструйований так, щоб клітин ссавців (наприклад, промотор гена металотранскрибувалася єдина мРНК, що кодує безліч тіонеїна) або від вірусів ссавців (наприклад, пропептидів (тобто гомополімери або гетерополімемотор пізнього гена аденовірусу або промотор ри), при тому, що кожна ділянка, що кодує, функцігена 7,5К вірусу коров'ячої віспи); у випадку ствоонально сполучена із кеп-незалежною послідовнірення клітинних ліній, які б несли множинні копії стю контролю трансляції: наприклад, внутрішнього продукту, що експресується, можуть бути викориссайта входу в рибосому (IRES). У випадку викоритані вектори на базі вірусів SV40, BPV і EBV, що стання придатної вірусної експресуючої системи, включають придатний селективний маркер. трансляція кожного пептиду, кодованого конкретУ випадку використання рослинних експресуною мРНК, контролюється внутрішніми чинниками ючих векторів, експресія послідовностей, що котранскрипта - наприклад, елементом IRES. Отже, дують пептиди по даному винаходу, може бути поліцистронна конструкція контролює транскриппоставлена під контроль будь-якого з широкого цію єдиної значної поліцистронної мРНК, що, у кола промоторів. Наприклад, можуть бути викорисвою чергу, забезпечує трансляцію безлічі окрестані вірусні промотори, такі як промотори 35Sмих пептидів. Такий підхід дозволяє виключити PHK і 19S-PHK вірусу мозаїки кольорової капусти етапи одержання і каталітичного розщеплення (CaMV) (Brisson et al., 1984, Nature, 310, 511-514) поліпротеїнів і може істотною мірою підвищуваабо промотор гена капсидного білка вірусу TMV ти ви хід пептиду з використанням єдиного (Takamatsu et al., 1987, EMBO J., 6, 307-311); з промотора. іншого боку, можуть бути використані рослинні Для експресії описаних у даній заявці пептидів промотори, такі як, промотор гена малої субодиможуть бути використані різноманітні системи «ханиці Rubisco (Coruzzi et al., 1984, EMBO J., 3, 1671зяїн-експресучий вектор». Вони включають, тим 1680; Broglie et al., 1984, Science, 224, 838-843) самим не вичерпуючись, мікроорганізми, такі як або промотори генів теплового шоку, наприклад, бактерії, що трансформуються реком-бінантною генів hsp17,5-E або hsp17,3-B сої (Gurley et al., фаговою ДНК або плазмідною ДНК експресуючих 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 559-565) . Такі конструкції векторів, що включають придатну послідовність, можуть бути внесені в рослинні клітини з викорисщо кодиує; дріжджи або нітчаті гриби, що танням Ті-плазмид, Ri-плазмид, векторів на основі