Варіанти поліпептидів рецептора іів активіну та їх використання

Реферат: Даний винахід надає поліпептиди стабілізованого рецептора активіну ІІВ і протеїни, здатні до зв'язування й інгібування активності активіну А, міостатину, РДФ-11. Даний винахід також надає полінуклеотиди, вектори й клітини хазяїна, здатні до продукування стабілізованих поліпептидів або протеїнів. Крім того представлені композиції й способи для лікування м'язової дистрофії й метаболічних порушень. UA 107921 C2 (12) UA 107921 C2 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявлено пріоритет попередніх заявок США, реєстраційний номер 61/200,250, поданої 26 листопада 2008 і U.S. Provisional Application Serial та реєстраційний номер 61/259,060, поданої 6 листопада 2009, повний опис яких включено в даному документі як посилання. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Галузь техніки даного винаходу відноситься до членів сімейства трансформуючого ростового фактору β (ТРФ–β) і розчинним рецепторам ТФР–β з поліпшеними властивостями, так само як і до способів модулювання активності членів сімейства ТФР–β для лікування різних порушень. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Сімейство протеїнів трансформуючого ростового фактору β (ТФР–β) включає трансформуючий ростовий фактор β (ТРФ–β), активіни, кісткові морфогенетичні білки (КМБ), ростові фактори нервів (РФН), нейротрофічний фактор головного мозку (НФГМ), і ростові/диференціальні фактори (РДФ). Ці члени сімейства беруть участь у регуляції широкого діапазону біологічних процесів, включаючи клітинну проліферацію, диференціацію й інші функції. Ростовий /диференціальний фактор 8 (РДФ-8), також названий як міостатин, є членом сімейства ТРФ–β, вираженим здебільшого в клітинах, що розвиваються, і в дорослих тканинах кістякових м'язів. Виявляється, що міостатин відіграє істотну участь у негативному контролюванні зростання кістякового м'яза (McPherron et al., Nature (London) 387, 83-90 (1997), Zimmers et al., Science 296:1486-1488 (2002)). Було показано, що антагонізуючий міостатин збільшує суху м'язову масу у тварин. Інший член сімейства протеїнів ТРФ–β є зв'язаним ростовим/диференціальним фактором 11 (РДФ-11). Приблизно 90 % послідовності РДФ-11 ідентичні до амінокислотної послідовності міостатину. РДФ-11 відіграє роль в аксіальному структуруванні у тварин, що розвиваються (Oh et al., Genes Dev 11:1812-26 (1997)), і також показано, що він відіграє роль у розвитку й зростанні кістякових м'язів. Активіни А, В, і АВ є гомодимерами й гетеродимерами двох поліпептидних ланцюгів, βA і βB відповідно (Vale et al., Nature 321, 776-779 (1986), Ling et al., Nature 321, 779-782 (1986)). Активіни були споконвічно відкриті як гонадні пептиди, що беруть участь у регуляції синтезу фоллікулостимулюючого гормону, і зараз вважається, що він бере участь у регуляції ряду біологічних процесів. Активін А є домінуючою формою активіну. Активін, міостатин, РДФ–11 і інші члени суперсімейства ТРФ–β зв'язують і сигналізують за допомогою комбінації рецепторів активіну типу II і активіну типу IIВ, обоє з яких є трансмембранними серин/треонин кіназами (Harrison et al., J. Biol. Chem. 279, 28036-28044 (2004)). Перехресні дослідження визначили, що міостатин здатний на зв'язування рецепторів ActRIIA і ActRIIB активіну типу II in vitro (Lee et al., PNAS USA 98:9306-11 (2001)). Є також доказ, що РДФ-11 зв'язується з обома ActRIIA і ActRIIB (Oh et al., Genes Dev 16:2749-54 (2002)). Відомо, що експресія протеїну ТРФ–β пов'язана з різними захворюваннями й порушеннями. Отже, здатність терапевтичних молекул до антагонізму декількох ТРФ–β протеїнів одночасно може бути надзвичайно ефективна для лікування цих захворювань і порушень. Продукування лікувальних білків у промисловому масштабі має потребу в таких протеїнах, які можуть бути ефективно експресовані, і очищені без порушення цілісності білка. Технологічність може бути описана як здатність до експресії й очищення протеїну досить ефективним способом, щоб створити рентабельне продукування білка. У промисловому оточенні, технологічність повинна бути визначена для кожного потенційного лікувального білка. Хоча процеси експресії й очищення білка можуть бути оптимізовані для білка, виявилося, що з таким же успіхом технологічність є функцією внутрішніх властивостей протеїну. Даний винахід надає біологічно активні лікувальні білки, що мають поліпшені технологічні властивості, здатність до ефективного антагонізму протеїнів ТРФ–β. СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід представляє ізольовані білки, що включають стабілізовані поліпептиди рецептора IIB активіна людини (позначений svActRIIB) здатні на зв'язування та інгібування активності активіну, РДФ-11 і міостатину, і характеризовані за допомогою поліпшених технологічних властивостей. Протеїни стабілізованого ActRIIB описують за допомогою наявності амінокислотних замін у позиціях 28 і 44, що стосується SEQ ID NO: 2. У даному варіанті виконання винаходу, ізольований білок включає поліпептид, що має послідовність, викладену в SEQ ID NO: 2, за винятком одиничної амінокислотної заміни в позиції 28, одиничної амінокислотної заміни в позиції 44, де заміна в позиції 28 відібрана з W або Y, і заміна в позиції 44-T. В іншій модифікації, поліпептид має послідовність, запропоновану в амінокислотах 19-134 SEQ ID NO: 2, крім одиничної амінокислотної заміни в позиції 28, 1 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одиничної амінокислотної заміни в позиції 44, де заміна в позиції 28 відібрана з W або Y, і заміна в позиції 44-T. В іншій модифікації, поліпептид має послідовність, запропоновану в амінокислотах 23-134 SEQ ID NO: 2, крім одиничної амінокислотної заміни в позиції 28, одиничної амінокислотної заміни в позиції 44, де заміна в позиції 28 відібрана з W або Y, і заміна в позиції 44-T. В іншій модифікації, поліпептид має послідовність, запропоновану в амінокислотах 25-134 SEQ ID NO: 2, крім одиничної амінокислотної заміни в позиції 28, одиничної амінокислотної заміни в позиції 44, де заміна в позиції 28 відібрана з W або Y, і заміна в позиції 44-T. В іншій модифікації, поліпептид має послідовність із щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % ідентичністю до будь-якого вищезгаданого поліпептиду, де поліпептид має одиничну амінокислотну заміну в позиції 28, одиничну амінокислотну заміну в позиції 44, де заміна в позиції 28 відібрана з W або Y, і заміна в позиції 44-T, і де поліпептид здатний на зв'язування міомтатину, активіну А або РДФ-11. В іншій модифікації, заміною вищезгаданих поліпептидів у позиції 28 є W і заміною в позиції 44 є T, де поліпептид здатний на зв'язуванням з міостатином, активіном А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу, ізольований протеїн містить у собі стабілізований рецепторний активін IIB поліпептиду, у якому поліпептид має послідовність, викладену в групі, що складається з SEQ ID NO: 4, 6, 12 і 14. В іншому варіанті виконання винаходу протеїн містить поліпептид, що має щонайменше 80 % послідовності, ідентичної до SEQ ID NO: 4, 6, 12 або 14, у якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, і в якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу протеїн містить поліпептид, що має щонайменше 90 % послідовності, ідентичної до SEQ ID NO: 4, 6, 12 або 14, у якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, і в якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіна А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу протеїн містить поліпептид, що має щонайменше 95 % послідовності, ідентичної до SEQ ID NO: 4, 6, 12 або 14, у якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, і в якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В одній модифікації, заміщення в позиції 28 на W і заміщення в позиції 44 на Т, у якому поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. У подальшому варіанті виконання винаходу білок svActRIIB далі містить гетерологічний білок. В одному варіанті виконання винаходу гетерологічний білок - Fc домен. У подальшому варіанті виконання винаходу, Fc домен - людський IgG Fc домен. У подальшому варіанті виконання винаходу гетерологічний білок прикріплений до лінкеру або шарнірного лінкеру пептиду. В одному варіанті виконання винаходу лінкер або шарнірний лінкер обрані із групи, що містить амінокислотну послідовність, викладену в групі, що складається з SEQ ID NO: 25, 27, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 49 і 50. У подальшому варіанті виконання винаходу шарнірні лінкери викладені в SEQ ID NO: 27, 38, 40, 42, 44, 45, або 46 єднальні людський IgG2 Fc (SEQ ID NO: 22) з білком svActRIIB. В іншому варіанті виконання винаходу шарнірний лінкер викладений в SEQ ID NO: 48, 49, або 50 єднальні людський IgG1 Fc (SEQ ID NO: 23) або модифікований IgG1 Fc (SEQ ID NO: 47) з поліпептидом svActRIIB. У подальшому варіанті виконання винаходу білок містить поліпептид, що має послідовність, викладену в групі, що складається з SEQ ID NO: 8, 10, 16 і 18. В іншому варіанті виконання винаходу протеїн містить поліпептид, що має, щонайменше, 80 % послідовності, ідентичної SEQ ID NO: 8, 10, 16 або 18, у якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, і в якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу протеїн містить поліпептид, що має, щонайменше, 90 % послідовності, ідентичної до SEQ ID NO: 8, 10, 16 або 18, у якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, і в якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу протеїн містить поліпептид, що має, щонайменше, 95 % послідовності, ідентичної до SEQ ID NO: 8, 10, 16 або 18, у якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, і в якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. У подальшому варіанті виконання винаходу, заміщення поліпептидів вище в позиції 28 на W і заміщення в позиції 44 на Т, у якому поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. У подальшому варіанті виконання винаходу білок містить поліпептиди, перераховані вище, у яких амінокислотний залишок у позиції 64 - аланін. В іншому аспекті цей винахід надає ізольовану молекулу нуклеїнової кислоти, що містить полінуклеотид, що кодує стабілізований білок ActRIIB. В іншому варіанті виконання винаходу полінуклеотид кодує поліпептидну послідовність, викладену в SEQ ID NO: 2, крім одиничного амінокислотного заміщення в позиції 28, і одиничного амінокислотного заміщення в позиції 44, у якій заміщення в позиції 28 обране з W або Y, і заміщення в позиції 44-Т. В іншому варіанті виконання винаходу полінуклеотид кодує поліпептид, що має послідовність, викладену в 2 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 амінокислотах 19-134 SEQ ID NO: 2, крім одиничного амінокислотного заміщення в позиції 28, і одиничного амінокислотного заміщення в позиції 44, у якій заміщення в позиції 28 обране з W або Y, і заміщення в позиції 44-Т. В іншому варіанті виконання винаходу полінуклеотид кодує поліпептид, що має послідовність, викладену в амінокислотах 23-134 SEQ ID NO: 2, крім одиничного амінокислотного заміщення в позиції 28, і одиничного амінокислотного заміщення в позиції 44, у якій заміщення в позиції 28 обране з W або Y, і заміщення в позиції 44-Т. В іншому варіанті виконання винаходу полінуклеотид кодує поліпептид, що має послідовність, викладену в амінокислотах 25-134 SEQ ID NO: 2, крім одиничного амінокислотного заміщення в позиції 28, і одиничного амінокислотного заміщення в позиції 44, у якій заміщення в позиції 28 обране з W або Y, і заміщення в позиції 44-Т. В іншому варіанті виконання винаходу полінуклеотид кодує поліпептид, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % ідентичну до будь-якого поліпептиду вище, у якій поліпептид має одиничне амінокислотне заміщення в позиції 28, і одиничне амінокислотне заміщення в позиції 44, у якій заміщення в позиції 28 обране з W або Y, і заміщення в позиції 44-Т, і в якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу полінуклеотиди вище кодують поліпептид, у якому заміщення в позиції 28-W і заміщення в позиції 44-Т, у якому поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, що має послідовність, викладену в групі, що складається з SEQ ID NO: 4, 6, 12 і 14. В іншому варіанті виконання винаходу молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, що має, щонайменше, 80 % послідовності, ідентичної до SEQ ID NO: 4, 6, 12 або 14, у якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, у якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, що має, щонайменше, 90 % послідовності, ідентичної до SEQ ID NO: 4, 6, 12 або 14, у якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, у якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, що має, щонайменше, 95 % послідовності, ідентичної до SEQ ID NO: 4, 6, 12 або 14, у якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, у якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу поліпептиди вище кодують поліпептид, у якому заміщення в позиції 28-W і заміщення в позиції 44-Т, у якому поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що має послідовність, обрану із групи, що складає з SEQ ID NO: 3, 5, 11 і 13 або їй комплементарну. В іншому варіанті виконання винаходу молекула ізольованої нуклеїнової кислоти містить полінуклеотиди викладені вище, і далі містить полінуклеотид, що кодує, щонайменше, один гетерологічний білок. В іншому варіанті виконання винаходу молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, що має послідовність, викладену в групі, що складається з SEQ ID NO: 8, 10, 16 і 18. В іншому варіанті виконання винаходу молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, що має, щонайменше, 80 % послідовності ідентичної до SEQ ID NO: 8, 10, 16 або 18, у якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, і в якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, що має, щонайменше, 90 % послідовності ідентичної до SEQ ID NO: 8, 10, 16 або 18, в якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, і в якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, що має, щонайменше, 95 % послідовності ідентичної до SEQ ID NO: 8, 10, 16 або 18, у якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, і в якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу полінуклеотиди вище кодують поліпептид, у якому заміщення в позиції 28-W і заміщення в позиції 44-Т, в якій кодований поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що має послідовність, обрану із групи, що складає з SEQ ID NO: 7, 9, 15 і 17 або їй комплементарну. В іншому варіанті виконання винаходу молекула нуклеїнової кислоти далі містить полінуклеотиди, що кодують лінкери або шарнірні лінкери, викладені в групі, що складається з SEQ ID NO: 25, 27, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 49 і 50. 3 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому варіанті виконання винаходу молекула нуклеїнової кислоти далі містить транскрипційну або трансляційну регуляторну послідовність. В іншому варіанті виконання винаходу пропонується рекомбінантний вектор, що містить полінуклеотид, що кодує стабілізований білок ActRIIB або поліпептид. В іншому варіанті виконання винаходу пропонуються клітини хазяїну, що містять рекомбінантні вектори й пропонуються способи продукування стабілізованих білків ActRIIB і поліпептидів вирощуванням клітин хазяїна в умовах, що стимулюють експресію білків і поліпептидів. Даний винахід далі надає композицію, що містить, щонайменше, один стабілізований поліпептид або протеїн ActRIIB цього винаходу. В іншому варіанті виконання винаходу пропонується композиція лікарського препарату до складу якого входить стабілізований поліпептид або протеїн ActRIIB у суміші з фармацевтичними прийнятними носіями. В іншому варіанті винахід пропонує спосіб зменшення або блокування активності міостатину, активіну А або РДФ-11 з застосуванням протеїнів або поліпептидів svActRIIB, або лікарських препаратів, що містять їх, до суб'єкта, що потребує такого лікування. В іншому варіанті, винахід пропонує спосіб збільшення безжирової м'язової маси або збільшення відсотку безжирової м'язової маси до маси жиру у суб'єкта, що потребує лікування застосуванням ефективної кількості композиції або лікарського препарату, що містить протеїни або поліпептиди svActRIIB, до суб'єкта. В іншому аспекті, винахід пропонує спосіб лікування або попередження м'язової атрофії у суб'єктів, що страждають цим порушенням, застосуванням терапевтичного засобу, що містить поліпептид або протеїн svActRIIB, до суб'єкта. М'язова атрофія включає, але не обмежуючись, наступні умови: ракове виснаження, м'язову дистрофію, міотрофічний латеральний склероз, застійну обструкційну хворобу легенів, хронічну серцеву недостатність, хімічне виснаження, виснаження від ВІЛ/СНІД, ниркову недостатність, уремію, ревматоїдний артрит, вікову саркопенію, вікову хворобливість, атрофію органів, зап'ястний синдром, недостатність андрогенів, м'язову атрофію через нерухливість від тривалого постільного режиму, ушкодження спинного мозку, удару, перелому кістки, опіку, старіння, резистентності до інсуліну та інших порушень. М'язова атрофія може також бути результатом стану невагомості в космічних польотах. З іншої сторони, цей винахід представляє спосіб лікування станів, у яких активін гіперекспресує у суб'єкта, якому необхідно таке лікування, за допомогою введення суб'єктові ефективної кількості терапевтичного засобу, що містить svActRIIB білки або поліпептиди. У даному варіанті, таким захворюванням є рак. З іншого боку, цей винахід представляє спосіб лікування метаболічного порушення, що включає введення терапевтичного засобу, що містить svActRIIB білки або поліпептиди суб'єктові, якому необхідно таке лікування, де метаболічне порушення відібране серед остеопорозу, діабету, ожиріння, порушення толерантності до глюкози, гіперглікемії й метаболічного синдрому. З іншого боку, цей винахід представляє спосіб генної терапії для лікування м'язової атрофії або метаболічних або активін-зв'язаних порушень, що включає введення вектора, що кодує svActRIIB поліпептид або протеїн цього винаходу суб'єктові, що потребує лікування, де вектор здатний на експресію svActRIIB протеїну або поліпептиду в суб'єкті. З іншого боку, цей винахід представляє спосіб детектування й проведення кількісного аналізу міостатину, активіну або РДФ-11 з використанням будь-яких svActRIIB білків або поліпептидів як захоплюючих або єднальних агентів у будь-якій кількості аналізів. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР Фігура 1 представляє порівняння між ActRIIB-Fc (E28W) і svActRIIB-Fc (E28W, S44T) на колоні ексклюзійної хроматографії. svActRIIB-Fc (E28W, S44T) представляє одиничний пік, у порівнянні з ActRIIB-Fc (E28W), що показує три піки. Фігура 2 показує збільшення в масі тіла в період більш 14 днів у 10 C57Bl/6 мишей, яким вводили одиничну дозу 10 мг/кг svActRIIB-Fc (E28W, S44T) у порівнянні з 10 мишами, яким вводили 10 мг/кг фізіологічного розчину з фосфатним буфером. Фігура 3 показує дозозалежну зміну в безжировій масі тіла по закінченні тривалого часу для C57Bl/6 одержань одиничної дози 0,3 мг/кг, 3 мг/кг, 10 мг/кг і 30 мг/кг svActRIIB-Fc (E28W, S44T). ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід представляє ізольований білок, що включає поліпептид стабілізованого рецептора IIB активіну людини (svActRIIB). Протеїн або поліпептид винаходу характеризували за допомогою їхньої здатності до зв'язування, щонайменше, одного або трьох протеїнів ТРФ–β, міостатину (РДФ-8), активіну А або РДФ-11, до інгібування активності щонайменше одного із цих протеїнів, і володіння поліпшеними технологічними властивостями в порівнянні з іншими ActRIIB розчинними рецепторами. Поліпептид стабілізованого рецептора IIB активіну людини характеризували за 4 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомогою амінокислотних замін у позиціях E28 і S44 щодо позаклітинного домену ActRIIB, як викладено в SEQ ID NO: 2. В іншому варіанті, поліпептид стабілізованого рецептора IIB активіну людини може мати подальші заміни аланіну в позиції 64, що стосується SEQ ID NO: 2. Як визначалось в даному документі, термін "члени сімейства ТРФ–β" або "ТРФ–β білки" посилається на структурно родинні ростові фактори сімейства трансформуючого ростового фактору, включаючи активіни й білки ростового й диференціючого фактору (РДФ) (Kingsley et al. Genes Dev. 8: 133-146 (1994), McPherron et al., Growth factors and cytokines in health and disease, Vol. 1B, D. LeRoith and C. Bondy. ed., JAI Press Inc., Greenwich, Conn, USA: pp 357-393). РДФ-8, іменований також як міостатин, є негативним регулятором тканини кістякового м'яза (McPherron et al. PNAS USA 94:12457-12461 (1997)). Міостатин синтезується як неактивний білок у довжину приблизно 375 амінокислот, що має GenBank Accession №: AAB86694 (SEQ ID NO: 35) для людини. Попередник протеїну активують протеолітичним розщепленням у чотирьохатомному сайті процесингу для продукування N-кінцевого інактивованого продомену й приблизно 109 амінокислотного С-кінцевого білку, що димеризується з формуванням гомодимеру розміром близько 25 кда. Цей гомодимер є зрілим, біологічно активним протеїном (Zimmers et al., Science 296, 1486 (2002)). Як визначалось в даному документі, термін "продомен" або "пропептид" означає інактивований N-кінцевий протеїн, що розщеплювали для вивільнення активного Стермінального протеїну. Як визначалось в даному документі, термін "міостатин" або "зрілий міостатин" посилається на зрілий, біологічно активний С-термінальний поліпептид, у мономірній, димірній або іншій формі, так само як і біологічно активні фрагменти або родинні поліпептиди, що включають алельні варіанти, сплайс-варіанти або злиті пептиди або поліпептиди. Повідомляють, що 100 % послідовності зрілого міостатину ідентичні серед багатьох видів, включаючи людський, мишачий, курячий, свинячий, індичий й щурячий (Lee et al., PNAS 98, 9306 (2001)). Як визначалось в даному документі, РДФ-11 означає кістковий морфогенетичний білок, що має обліковий номер Swissprot O95390 (SEQ ID NO: 36), так само як і варіанти й види гомлогів цього білка. РДФ-11 включений у регулювання передньозаднього структурування аксіального кістяка (McPherron et al., Nature Genet. 22 (93): 260-264 (1999); Gamer et al., Dev. Biol. 208 (1), 222-232 (1999)), але постнатальні функції невідомі. Активін А - гомодимер поліпептидних ланцюгів βA. Як визначалось в даному документі термін "активін А" посилається на білок активіну, що має обліковий номер GenBank NM_002192 (SEQ ID NO: 34). Активіни А, В і АВ - гомодимери й гетеродимер відповідно із двома поліпептидними ланцюгами, βA і βB. Як визначалось в даному документі, "активін" посилається на активін А, В і АВ, так само як і варіанти й види гомлогів білку. Рецепторні поліпептиди Як визначалось в даному документі, термін рецептор активіну типу ІІВ (ActRIIB) означає людські рецептори активіну, що мають обліковий номер NP_001097 або його варіанти, такі як ті, що мають аргінін у позиції 64, заміщений аланіном. Термін розчинного ActRIIB (дикий тип) відноситься до позаклітинного домену ActRIIB, амінокислоти від 1 до 134 (із сигнальною послідовністю), або амінокислоти 19-134 SEQ ID NO: 2 (без сигнальної послідовності). Поліпептиди стабілізованого рецептора Даний винахід представляє ізольований протеїн, що містить стабілізований рецептор ActIIB поліпептиду (згаданий тут як "поліпептид svActRIIB"). Як визначалось в даному документі термін "протеїн svActRIIB" відноситься до протеїну, що містить стабілізований ActRIIB поліпептид. Як визначалось в даному документі термін "ізольований" відноситься до молекули протеїну або поліпептиду, очищену до певного рівня від ендогенного матеріалу. Ці поліпептиди й протеїни характеризуються тим, що мають здатність зв'язувати й інгібувати активність будь-якого активіну А, міостатину або РДФ-11, на додаток до здатності поліпшувати технологічні характеристики. Стабілізований ActRIIB поліпептид характеризується тим, що має амінокислотні заміщення в обох позиціях 28 і 44 стосовно SEQ ID NO: 2. Для послідовності, амінокислотні позиції в стабілізованих ActRIIB поліпептидах і протеїнах завжди називали відповідно до позицій в SEQ ID NO: 2, незалежно від того зрілий поліпептид або усічений. Як визначалось в даному документі, термін "зрілий" відноситься до поліпептиду або пептиду без сигнальної послідовності. Як визначалось в даному документі, термін "усічений" відноситься до поліпептидів, у яких N-термінальні амінокислоти або С-термінальні амінокислоти вилучені. В іншому варіанті виконання винаходу, ізольований стабілізований поліпептид рецептора активіну IIB (svActRIIB) має поліпептидну послідовність, викладену в SEQ ID NO: 2, крім одиничного амінокислотного заміщення в позиції 28, і одиничного амінокислотного заміщення в 5 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 позиції 44, у якій заміщення в позиції 28 обране з W або Y, і заміщення в позиції 44-Т. В іншому варіанті виконання винаходу поліпептид має послідовність, викладену в амінокислотах 19-134 SEQ ID NO: 2, крім одиничного амінокислотного заміщення в позиції 28, і одиничного амінокислотного заміщення в позиції 44, у якій заміщення в позиції 28 обране з W або Y, і заміщення в позиції 44-Т. В іншому варіанті виконання винаходу поліпептид має послідовність, викладену в амінокислотах 23-134 SEQ ID NO: 2, крім одиничного амінокислотного заміщення в позиції 28, і одиничного амінокислотного заміщення в позиції 44, у якій заміщення в позиції 28 обрано з W або Y, і заміщення в позиції 44-Т. В іншому варіанті виконання винаходу поліпептид має послідовність, викладену в амінокислотах 25-134 SEQ ID NO: 2, крім одиничного амінокислотного заміщення в позиції 28, і одиничного амінокислотного заміщення в позиції 44, у якій заміщення в позиції 28 обране з W або Y, і заміщення в позиції 44-Т. В іншій модифікації, поліпептид має послідовність, по меншій мірі, на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % ідентичну до будь-якого вищезгаданого поліпептиду, де поліпептид має одиничну амінокислотну заміну в позиції 28, одиничну амінокислотну заміну в позиції 44, де заміна в позиції 28 відібрана з W або Y, і заміна в позиції 44-T, і де поліпептид здатний на зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншій модифікації, заміною вищезгаданих поліпептидів у позиції 28 є W та заміною в позиції 44 є T, де поліпептид здатний на зв'язування з міостатином, активіном А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу, поліпептид svActRIIB додатково включає сигнальну послідовність, наприклад, SEQ ID NO: 4, 8, 12 і 16. У любому випадку, різні сигнальні пептиди можуть бути використані в готуванні поліпептидів в цієї заявці. Сигнальні пептиди можуть мати послідовність, викладену в амінокислотах від 1 до 19 SEQ ID NO: 4, наприклад, або сигнальні послідовності, викладені в SEQ ID NO: 31 і 32. Можуть бути використані будь-які інші сигнальні пептиди, корисні для експресії svActRIIB поліпептидів. В іншій модифікації, сигнальна послідовність вилучена, залишаючись зрілим пептидом. Зразки svActRIIB поліпептидів з відсутньою сигнальною послідовністю включають, наприклад, SEQ ID NO: 6, 10, 14 і 18. В іншій модифікації, протеїн включає стабілізований поліпептид рецептора активіну IIB, де поліпептид відібраний із групи, що складається з поліпептидів, що мають послідовність, представлену в групі, що складається з SEQ ID NO: 4, 6, 12 і 14. Ці поліпептиди представляють собою амінокислоти від 25 до 134 SEQ ID NO: 2, де поліпептид має одиничну амінокислотну заміну в позиції 28, одиничну амінокислотну заміну в позиції 44, де заміна в позиції 28 відібрана з W або Y, або заміна в позиції 44-T, де поліпептид здатний на зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11, з або без сигнальної послідовності, відмінної від тієї, котра показана в SEQ ID NO: 2. В іншому варіанті виконання винаходу протеїн включає поліпептид, що має, щонайменше, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % послідовності, ідентичної до SEQ ID NO: 4, 6, 12 або 14, де поліпептид має W або Y у позиції 28 і T у позиції 44, і де поліпептид здатний на зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. У даній модифікації заміною в позиції 28 є W і заміною в позиції 44 є T, де поліпептид здатний на зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу svActRIIB протеїн далі включає гетерологічний білок. У даній модифікації, гетерологічним білком є Fc домен. У подальшій модифікації, Fc доменом є людський IgG Fc домен. У даній модифікації, протеїн включає поліпептид, що має послідовність, представлену в групі, що включає SEQ ID NO: 8, 10, 16 і 18. в іншій модифікації, протеїн включає поліпептид, що має, щонайменше, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % послідовності, ідентичної до SEQ ID NO: 8, 10, 16 або 18, де поліпептид має W або Y у позиції 28 і T у позиції 44, де поліпептид здатний на зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. У даній модифікації, заміною в позиції 28 є W і заміною в позиції 44 є T, де поліпептид здатний на зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому варіанті виконання винаходу, протеїн містить будь-який один з поліпептидів, описаних вище, де амінокислотним залишком у позиції 64 є аланін. В іншому варіанті виконання винаходу, термін поліпептид або протеїн svActRIIB охоплює протеїни, що містять фрагменти SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12 і 14, включаючи N і С кінцеві усікання, де позицією 28 є W або Y і позицією 44 є T, поліпептид здатний на зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. Як визначалось в даному документі "похідне" svActRIIB поліпептиду відноситься до прикріплення, щонайменше, однієї додаткової хімічної частини, або, щонайменше, одного додаткового поліпептиду для формування ковалентних або агрегатних кон'югатів, таких як глікозильні групи, ліпіди, ацетильні групи, С-кінцеві або N-кінцеві фузійні поліпептиди, з'єднання до ПЕГ молекул, і інші модифікації, які описані нижче. Стабілізовані поліпептиди ActRIIB рецептора можуть також включати додаткові модифікації й похідні, включаючи модифікації в С і 6 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 N кінцях, які походять із процесингу через експресію в різних клітинних типах як клітини ссавців, E. coli, дріжджі та інші рекомбінантні клітини хазяїна. Протеїни svActRIIB цього винаходу можуть додатково включати гетерологічні поліпептиди, прикріплені до svActRIIB поліпептиду безпосередньо або через лінкерну послідовність для формування гібридного білка. Як використано в даному документі термін "гібридних білок" відноситься до білку, що має гетерологічний поліпептид, прикріплений за допомогою технологій рекомбинантної ДНК. Гетерологічні поліпептиди включають, але не обмежені Fc поліпептидами, його мітками або доменами лейцинової застібки, щоб стимулювати олігомеризацію або подальшу стабілізацію стабілізованого ActRIIB поліпептиду як описано, наприклад, в WO 00/29581, що тут включений у посилання. У модифікації гетерологічний білок - Fc поліпептид або домен. У модифікації, Fc домен відбирають із людського IgG1 Fc (SEQ ID NO: 23), модифікованого IgG1 Fc (SEQ ID NO: 47), IgG2 Fc (SEQ ID NO: 22), і IgG4 Fc (SEQ ID NO: 24) домена. Білок svActRIIB може далі містити всі або частину шарнірної послідовності IgG1 (SEQ ID NO: 29), IgG2 (SEQ ID NO: 28), або IgG4 (SEQ ID NO: 30). Типовий svActRIIB білок обраний з поліпептидів, що містять послідовності як викладене в SEQ ID NO: 8, 10, 16 і 18, так само як і ті поліпептиди, що мають значну подібність у цих послідовностях, у яких заміщення в позиціях 28 і 44 збережено. Як визначалось у даному документі, "значна подібність" відноситься до послідовностей, які, щонайменше, на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ідентичні до кожної з SEQ ID NO: 8, 10, 16, і 18, у яких поліпептиди зберігають W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, і в яких поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. У модифікації заміщення позиції 28-W і заміщення в позиції 44-Т, у якій поліпептид здатний до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. Білок svActRIIB може факультативно містити послідовність "лінкеру". Лінкери служать головним чином як спейсери між поліпептидом і вторинним гетерологічним поліпептидом, або іншим типом злиття між двома або більше стабілізованими ActRIIB поліпептидами. У модифікації лінкер складається з амінокислот, зв'язаних разом пептидними зв'язками, переважно від 1 до 20 амінокислот зв'язані пептидними зв'язками, у яких амінокислоти відібрані від 20 амінокислот, що зустрічаються в природі. Одна або більше цих амінокислот можуть бути глікозильовані, як розуміють фахівці. У модифікації, від 1 до 20 амінокислоти можуть бути відібрані із гліцину, аланіну, проліну, аспарагіну. глутаміну й лізину. У модифікації лінкер складається з більшості амінокислот, які стерічно вільні, такі як гліцин і аланін. Типові лінкери полігліцини (зокрема (Gly) 5, (Gly)8, полі(Gly-Ala),) і поліаланіни. Один типовий прийнятний лінкер, як показано в прикладах нижче - (Gly)4Ser (SEQ ID NO: 25). У подальшій модифікації, svActRIIB може містити "шарнірний лінкер", лінкерна послідовність якого забезпечує прилягаючий до шарнірної області або частковій шарнірній області IgG, як показано на прикладі в SEQ ID NO: 27. Шарнірна послідовність включає IgG2 Fc (SEQ ID NO: 28), IgG1 Fc (SEQ ID NO: 29), і IgG4 Fc (SEQ ID NO: 30). Шарнірна лінкерна послідовність може також бути сконструйована для поліпшення технологічності й стабільності білків svActRIIB-Fc. У модифікації шарнірні лінкери SEQ ID NO: 27, 38, 40, 42, 44, 45, і 46 сконструйовані для поліпшення технологічності з IgG2 Fc (SEQ ID NO: 22), коли прикріплені до поліпептидів svActRIIB. У модифікації шарнірні лінкерні послідовності сконструйовані для поліпшення технологічності, коли поліпептиди svActRIIB прикріплюються до людських IgG1 Fc (SEQ ID NO: 23) або модифікованим людським IgG1 Fc (SEQ ID NO: 47), наприклад, шарнірні лінкери утримуючі SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 і SEQ ID NO: 50. Поліпшена технологічність цих поліпептидів описана нижче в прикладі 4. Лінкери можуть також бути не пептидними лінкерами. Наприклад, аліфатичний лінкер такий як –NH–(CH2)s–C(O)–, у якому може бути використане s=2–20. Ці аліфатичні лінкери можуть далі бути заміщеними будь-якою нестерильною шарнірною групою такою як нижчий алкіл (наприклад, C1-C6), нижчий ацил, глоген (наприклад, Cl, Br), CN, NH2, феніл, і т.д. Поліпептиди svActRIIB описані в цьому документі також можуть бути прикріплені до непептидної молекули для того, щоб додати бажані властивості, такі як зменшення деградації й/або збільшення час напіврозпаду, зменшення токсичності, зменшення імуногенності та/або збільшення біологічної активності поліпептидів svActRIIB. Типові молекули включають але й не обмежені лінійними полімерами, такими як поліетиленгліколь (ПЕГ), полілізин, декстран; ліпід; холестеролова група (така як стероїдна); карбогідрат, або молекула олігосахариду. Протеїни й поліпептиди svActRIIB мають поліпшені технологічні характеристики в порівнянні з іншими ActRIIB розчинними поліпептидами. Як визначалось в даному документі, термін "технологічність" відноситься до стабільності специфічного протеїну протягом рекомбінантної експресії й очищення цього протеїну. Є думка, що технологічність є такою завдяки властивим властивостям молекули в умовах експресії й очищення. Зразки поліпшених технологічних 7 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 характеристик викладені в Прикладах нижче й включають однакове гліколізування протеїну (Приклад 2), збільшений клітинний титр, зростання і експресію протеїну протягом рекомбінантного продукування протеїну (Приклад 1), поліпшені властивості очищення (Приклад 2) і поліпшену стабільність при низькому рН (Приклад 1). Протеїни й поліпептиди svActRIIB цього винаходу демонструють поліпшену технологічність, поряд із утриманням активності in vitro і in vivo (Приклади 2 і 3), у порівнянні з іншими розчинними поліпептидами ActRIIB. Далі, додаткова послідовність шарнірного лінкера може надавати додаткову технологічну вигоду, як показано в Прикладі 4 нижче. Як визначалось в даному документі, термін "svActRIIB поліпептидна активність" або "біологічна активність розчинного ActRIIB поліпептиду" відноситься до однієї або більше in vitro або in vivo активностям поліпептидів svActRIIB, що включають, але не обмежених цим, представлені в Прикладі нижче. Активності svActRIIB поліпептидів включають, але не обмежені властивістю зв'язування міостатину або активіну А або РДФ–11 і здатності інгібувати або нейтралізувати активність міостатину або активіну А або РДФ–11. Як визначалось в даному документі, термін "здатність до зв'язування" міостатину, активіну А або РДФ–11 відноситься до зв'язування способами відомими в цій галузі, такими як спосіб KinExA™, показаний у Прикладах нижче. Інгібування in vitro міостатину, активіну А або РДФ–11 може бути порівняно з використанням, наприклад, аналізу на pMARE C2C12 на клітинній основі, який описано в Прикладі нижче. Активність in vitro, продемонстрована у Прикладі 3 нижче, де показана збільшенням безжирової м'язової маси в моделях мишей. Активність in vitro поліпептидів і протеїнів svActRIIB включає, але не зводиться до збільшення маси тіла, збільшення безжирової м'язової маси або збільшенням відношення безжирової м'язової маси до маси жиру. Терапевтична активність далі включає зменшення або попередження виснаження, у результаті конкретних типів пухлин, попередження росту конкретних типів пухлин і збільшення виживання конкретних моделей тварин. Подальше обговорення активності svActRIIB протеїну й поліпептиду наведено нижче. В іншому варіанті виконання, цей винахід надає ізольовану молекулу нуклеїнової кислоти, що містить полінуклеотид, що кодує svActRIIB поліпептид цього винаходу. Як визначалось в даному документі термін "ізольований" відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, які очищені до певного рівня від ендогенного матеріалу. В іншому варіанті виконання винаходу, полінуклеотид кодує поліпептид, що має послідовність, викладену в SEQ ID NO: 2, крім одиничного амінокислотного заміщення в позиції 28, і одиничного амінокислотного заміщення в позиції 44, у якій заміщення в позиції 28 обране з W або Y, і заміщення в позиції 44-Т. В іншому варіанті виконання винаходу полінуклеотид кодує поліпептид, що має послідовність, викладену в амінокислотах 19-134 SEQ ID NO: 2, крім одиничного амінокислотного заміщення в позиції 28, і одиничного амінокислотного заміщення в позиції 44, у якій заміщення в позиції 28 обране з W або Y, і заміщення в позиції 44-Т. В іншому варіанті виконання винаходу полінуклеотид кодує поліпептид, що має послідовність, викладену в амінокислотах 23-134 SEQ ID NO: 2, крім одиничного амінокислотного заміщення в позиції 28, і одиничного амінокислотного заміщення в позиції 44, у якій заміщення в позиції 28 обрано з W або Y, і заміщення в позиції 44-Т. В іншому варіанті виконання винаходу полінуклеотид кодує поліпептид, що має послідовність, викладену в амінокислотах 25-134 SEQ ID NO: 2, крім одиничного амінокислотного заміщення в позиції 28, і одиничного амінокислотного заміщення в позиції 44, у якій заміщення в позиції 28 обране з W або Y, і заміщення в позиції 44-Т. В іншій модифікації, полінуклеотид кодує поліпептид, що має послідовність, щонайменше, на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % ідентичну до будь-якого вищезгаданого поліпептиду, де поліпептид має одиничну амінокислотну заміну в позиції 28, одиничну амінокислотну заміну в позиції 44, де заміна в позиції 28 відібрана з W або Y, і заміна в позиції 44-T, і де поліпептид здатний на зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11. У модифікації, полінуклеотид модифікацій вище кодує поліпептид, у якому заміщенням у позиції 28 є W і заміною в позиції 44 є T. В іншому варіанті виконання винаходу молекула ізольованої нуклеїнової кислоти цього винаходу містить полінуклеотид, що кодує поліпептид який має послідовність, викладену в групі, що складається з SEQ ID NO: 4, 6, 12, і 14. В іншому варіанті виконання винаходу, нуклеїнова кислота містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, що має, щонайменше, на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % ідентичну послідовність до SEQ ID NO: 4, 6, 12 або 14, у якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, і в якій поліпептид здатний зв'язувати активін А, РДФ-11, або міостатин. У модифікації полінуклеотид модифікацій вище кодує поліпептид, у якому заміщення в позиції 28-W і заміщення в позиції 44-Т, і в якому поліпептид здатний до зв'язування активіну А, РДФ-11 або міостатину. 8 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому варіанті виконання винаходу молекула ізольованої нуклеїнової кислоти далі містить полінуклеотид, що кодує, щонайменше, один гетерологічний протеїн. В іншому варіанті виконання винаходу гетерологічний протеїн це Fc домен, у ще одному варіанті виконання винаходу, Fc домен це людський IgG Fc домен. В іншому варіанті виконання винаходу, молекула нуклеїнової кислоти далі містить полінуклеотиди, що кодують лінкери й шарнірні лінкери, викладені в SEQ ID NO: 25, 27, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 49 або 50. В іншому варіанті виконання винаходу такі полінуклеотиди мають послідовності, відібрані із групи, що складає з SEQ ID NO: 26, 37, 39, 41, і 43. В іншому варіанті виконання винаходу молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, що складається з послідовності, викладеної в групі, що складається з SEQ ID NO: 8, 10, 16 і 18. В іншому варіанті виконання винаходу нуклеїнова кислота містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, що має, щонайменше, на 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ідентичну послідовність групі, що складається з SEQ ID NO: 8, 10, 16 і 18, у якій поліпептид має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, у якій поліпептид здатний до зв'язування активіну А, РДФ-11, або міостатину. У модифікації, полінуклеотид модифікацій вище кодує поліпептид, у якому заміщення в позиції 28-W і заміщення в позиції 44-Т, і в якому поліпептид здатний зв'язувати міостатин, активін А або РДФ-11. У модифікації молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що має послідовність, відібрану із групи, що складає з SEQ ID NO: 3, 5, 11 або 13 або їй комплементарну. В інших модифікаціях молекула ізольованої нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що має послідовність, відібрану із групи, що складає з SEQ ID NO: 7, 9, 15 і 17 або їй комплементарну. В іншому варіанті виконання винаходу молекула ізольованої нуклеїнової кислоти гібридизована в суворих або помірних умовах з SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 або 17, у якій кодований поліпептид по суті аналогічний до SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, або 18, у якому поліпептид містить амінокислотну послідовність, що має W або Y у позиції 28 і Т у позиції 44, і в якій кодований поліпептид здатний зв'язувати або інгібувати міостатин, активін А або РДФ-11. Молекули нуклеїнової кислоти винаходу включають ДНК в обох однонитковій і двохнитковій формах, так само як і РНК їй комплементарна. ДНК включає, наприклад, кДНК, геномну ДНК, синтетичну ДНК, ДНК ампліфіковану ПЦР і їх комбінації. Геномна ДНК може бути ізольована звичайними способами обробки, такими як з використанням ДНК SEQ ID NO: 3, 5, 11 або 13, або прийнятних фрагментів цього, як випробування. Геномну ДНК що кодує ActRIIB поліпептиди одержують з геномних бібліотек, які придатні для багатьох видів. Синтетична ДНК придатна з хімічного синтезу накладення олігонуклеотидних фрагментів слідом за складанням фрагментів у реконструйовану частину або всю область, що кодує, і фланкуючу послідовність. РНК може бути отримана із прокаріотичного вектору експресії, що безпосередньо інтенсивно синтезує мРНК, такі як вектори, що використовують Т7 промотори й РНК полімерази. кДНК одержують з бібліотек, приготовлену з ізольованої мРНК із різних тканин, що виділяють ActRIIB. Молекули кДНК винаходу включають всю довжину генів, як і їх полінуклеотиди й фрагменти. Повна довжина гена може включати послідовності, що кодують N-Термінальну сигнальну послідовність. Винахід далі надає молекули нуклеїнової кислоти, описані вище, у яких полінуклеотид функціонально зв'язаний із транскрипційною або трансляційною регуляторною послідовністю. Типові полінуклеотидні й поліпептидні послідовності. svActRIIB (E28W, S44T) із сигнальною послідовністю atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtgagacacggtggtgcatctactacaacgccaactggg agctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacag ctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacc cccaggtgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagcc acccccgacagcccccacc (SEQ ID NO: 3) svActRIIB (E28W, S44T) із сигнальною послідовністю mefglswvflvallrgvqcetrwciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvkkgcwlddfncydrqecvateen pqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptapt (SEQ ID NO: 4) svActRIIB (E28W, S44T) без сигнальної послідовності gagacacggtggtgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagc aggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctagatgacttcaac tgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactc atttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgacagcccccacc (SEQ ID NO: 5) svActRIIB (E28W, S44T) без сигнальної послідовності etrwciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvkkgcwlddfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcnerfthl peaggpevtyeppptapt (SEQ ID NO: 6) 9 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 svActRIIB-Fc (E28W, S44T) полінуклеотидна послідовність із сигнальною послідовністю atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtgagacacggtggtgcatctactacaacgccaactggg agctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacag ctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacc cccaggtgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagcc acccccgacagcccccaccggagggggaggatctgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttcc ccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtcc agttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcag cgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaa aaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtc agcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcat gctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 7) svActRIIB-Fc (E28W, S44T) поліпептидна послідовність із сигнальною послідовністю mefglswvflvallrgvqcetrwciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvkkgcwlddfncydrqecvateen pqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptaptggggsvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpev qfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltcl vkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (SEQ ID NO: 8) svActRIIB-Fc (E28W, S44T) полінуклеотидна послідовність без сигнальної послідовності gagacacggtggtgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagc aggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctagatgacttcaac tgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactc atttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgacagcccccaccggagggggaggatctgtcgagtgcccaccg tgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacg tgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag ccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacac cctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagt gggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcac cgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctc tccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 9) svActRIIB-Fc (E28W, S44T), поліпептидна послідовність без сигнальної послідовності etrwciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvkkgcwlddfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcnerfthl peaggpevtyeppptaptggggsvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkp reeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngq pennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (SEQ ID NO: 10) svActRIIB (E28Y, S44T) із сигнальною послідовністю atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtgagacacggtactgcatctactacaacgccaactggg agctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacag ctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacc cccaggtgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagcc acccccgacagcccccacc (SEQ ID NO: 11) svActRIIB (E28Y, S44T) із сигнальною послідовністю mefglswvflvallrgvqcetryciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvkkgcwlddfncydrqecvateenp qvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptapt (SEQ ID NO: 12) svActRIIB (E28Y, S44T) без сигнальної послідовності gagacacggtactgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagc aggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctagatgacttcaac tgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactc atttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgacagcccccacc (SEQ ID NO: 13) svActRIIB (E28Y, S44T) без сигнальної послідовності etryciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvkkgcwlddfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcnerfthl peaggpevtyeppptapt (SEQ ID NO: 14) svActRIIB-Fc (E28Y, S44T) полінуклеотидна послідовність із сигнальною послідовністю atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtgagacacggtactgcatctactacaacgccaactggg agctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacag ctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacc cccaggtgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagcc acccccgacagcccccaccggagggggaggatctgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttcc 10 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtcc agttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcag cgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaa aaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtc agcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcat gctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 15) svActRIIB-Fc (E28Y, S44T) поліпептидна послідовність із сигнальною послідовністю mefglswvflvallrgvqcetryciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvkkgcwlddfncydrqecvateenp qvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptaptggggsvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqf nwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvk gfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (SEQ ID NO: 16) svActRIIB-Fc (E28Y, S44T) полінуклеотидна послідовність без сигнальної послідовності gagacacggtactgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagc aggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctagatgacttcaac tgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactc atttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgacagcccccaccggagggggaggatctgtcgagtgcccaccg tgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacg tgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag ccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacac cctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagt gggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcac cgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctc tccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 17) svActRIIB-Fc (E28Y, S44T) поліпептидна послідовність без сигнальної послідовності etryciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvkkgcwlddfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcnerfthl peaggpevtyeppptaptggggsvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkp reeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngq pennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (SEQ ID NO: 18) В іншому варіанті виконання цього винаходу, також надаються вектори експресії, що містять молекули нуклеїнової кислоти й полінуклеотиди цього винаходу, трансформовані клітини хазяїна з такими векторами й способами продукування svActRIIB поліпептидів. Термін "вектор експресії" відноситься до плазмід, фаг, вірусів або векторів для експресії поліпептидів з полінуклеотидною послідовністю. Вектори для експресії svActRIIB поліпептидів містять, як мінімум, необхідні послідовності для розмноження вектора й для експресії клонованої вставки. Вектор експресії містить у собі одиницю транскрипції, що містить складання (1) генетичних елементів або елементів, що мають регуляторну роль в експресії гена, наприклад, промотор або енхансер, (2) послідовність, що кодує svActRIIB поліпептиди й протеїни для транскрипції в мРНК і трансляції в протеїн, і (3) прийнятна ініціація транскрипції й термінація послідовності. Ці послідовності можуть далі включати селективний маркер. Прийнятні вектори для експресії в клітині хазяїна легко доступні й молекули нуклеїнової кислоти вбудовують у вектори з використанням стандартних ДНК рекомбінантних технологій. Такі вектори можуть включати промотори, які функціонують у специфічних тканинах і вірусні вектори для експресії svActRIIB поліпептидів у цільових людських й клітинах тварин. Зразковий вектор експресії, прийнятний для експресії svActRIIB-pDSRa, (описаний в WO 90/14363, включений у документ за допомогою посилання) і його похідні, що містять svActRIIB полінуклеотиди, так само як будь-які додаткові прийнятні вектори, відомі в цій галузі й описані нижче. Винахід далі надає способи створення svActRIIB поліпептидів. Може бути використана розмаїтість інших систем експресії /базових систем. Ці системи включають, але не обмежуються мікроорганізмами, такими як трансформована бактерія з рекомбінантним бактеріофагом, плазміда або косміда ДНК вектора експресії; трансформовані дріжджі з вектором експресії дріжджів; клітинні системи комах, інфікованих вірусним вектором експресії (наприклад, бакуловірус); рослинні клітинні системи трансфіковані вірусним вектором експресії (наприклад, вірус мозаїки кольорової капусти, вірус тютюнової мозаїки) або трансформовані бактеріальним вектором експресії (наприклад, плазмідою Ti або pBR322); або тваринні клітинні системи. Клітини ссавців корисні при продукуванні рекомбінантного протеїну включаючи, але не обмежуючись, VERO клітинами, HeLa клітинами, лініями клітин яєчника китайського хом'ячка (CHO) або їхніми похідними, такими як Veggie CHO і родинними клітинними лініями, які ростуть 11 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на безсировотному середовищі (див. Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31) або СНО штам DX-B11, що є невідповідним в DHFR (див. Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20) COS клітини, такі як COS-7 лінії клітин нирок мавпи (ATCC CRL 1651) (див. Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), W138, BHK, HepG2, 3T3 (ATCC CCL 163), RIN, MDCK, A549, PC12, K562, L клітини, C127 клітини, BHK (ATCC CRL 10) клітинні лінії, CV1/EBNA лінії клітин, похідна від клітинної лінії нирки африканської зеленої мавпи CV1 (ATCC CCL 70) (див. McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821), клітини нирки людського ембріона, такі як 293, 293 EBNA або MSR 293, людські епідермальні клітини A431, людські клітини Colo205, інші трансформовані клітинні лінії приматів, нормальні диплоїдні клітини, клітинні штами похідні від in vitro культури первинної тканини, первинні експлантати, HL-60, U937, HaK або Jurkat клітини. Експресія ссавців враховує продукування секретованих або розчинних поліпептидів, які можуть бути відновлені із середовища для вирощування. Використовуючи відповідну систему "хазяїн - векторна ДНК", svActRIIB поліпептиди продукуються рекомбінантно за допомогою культивування клітини хазяїна, трансформованої експресійним вектором, що містить молекули нуклеїнової кислоти цього винаходу при умовах, придатних для продукування. Трансформовані клітини можуть бути використані для тривалого, високопродуктивного продукування поліпептиду. Один раз такі клітини трансформуються векторами, які містять селектуючий маркер, також як і бажану касету експресії, дозволено, щоб клітини росли в збагаченому середовищі перед тим, як вони будуть переведені на селективне середовище. Планується, що селектуючий маркер стимулює зростання і відновлення клітин, які успішно експресують інтродуковані послідовності. Стійкі колонії міцно трансформованих клітин можуть бути проліферовані з використанням способів культивування, що підходять до використаної клітинної лінії. Огляд експресії рекомбінантний білків перебуває в Methods of Enzymology, v. 185, Goeddell, D.V., ed., Academic Press (1990). У деяких випадках, таких як в експресії з використання прокаріотичних систем, експресовані поліпептиди цього винаходу можуть мати потребу у рефолдінгу й окислені у відповідну третинну структуру й утворенні дисульфідних зв'язків для того, щоб бути біологічно активними. Згортання може бути завершеним з використанням безлічі процедур, відомих в даній галузі. Такі способи включають, наприклад, звільнення розчиненого поліпептиду при рН звичайно вище 7 у присутності роз'єднувального (хаотропного) агенту. Вибір хаотропу подібний до відборів, які використовують для розчинення включень, однак хаотроп звичайно використовується при нижчих концентраціях. Типові хаотропні агенти - гуанідин і сечовина. У більшості випадків, згортання/окисне розчинення також буде містити агент, що редукує, і його окислену форму в специфічному співвідношенні до генерування редокс потенціалу, що дозволяє переміщати дисульфіди для формування цистеїнових містків. Деякі, часто використовувані, редокс-пари включають цистеїн/цистамін, глутатіон/дитіобісглутатіон, хлорид міді, дитіотреітол ДТТ/дитіан ДТТ, і 2 -меркаптоетанол (bМЕ)/дитіо-bМЕ. У багатьох випадках, сорозчинник можуть використовувати для збільшення ефективності згортання. Часто використовувані сорозчинники включають гліцерол, поліетиленгліколь із різною молекулярною вагою й аргінін. На додаток, поліпептиди можуть бути синтезовані в розчині або у твердому носії відповідно до звичайних технологічних прийомів. Різні автоматичні синтезатори комерційно придатні й можуть бути використані відповідно до відомих протоколів. Що можна побачити на прикладі: Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d.Ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J Am Chem Soc, 105:6442, (1983); Merrifield, Science 232:341-347 (1986); Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284; Barany et al., Int J Pep Protein Res, 30:705-739 (1987). Поліпептиди й протеїни цього винаходу можуть очищати відповідно методикам очищення протеїну, які добре відома фахівцям. Ці методики включають, на одному рівні, грубе фракціонування білкових і небілкових фракцій. Розділені пептиди поліпептиди від інших протеїнів, що цікавлять пептиди або поліпептиди можуть бути далі очищені з використанням хроматографії й методик електрофорезу для досягнення часткового або повного очищення (або очищення до гомогенності). Термін "ізольовані поліпептиди" або "очищені поліпептиди" який використано у даному документі, означає, що він відноситься до суміші, здатної до відділення від інших компонентів, у якому поліпептиди очищені до будь-якого рівня щодо їх природного стану, який можна спостерігати. Очищений поліпептид також відноситься до поліпептиду, що є вільним від середовища в якому він може природно перебувати. Взагалі, "очищений" поліпептид відноситься до поліпептидної суміші, що була піддана фракціонуванню для видалення різних інших компонентів, і композиція якої добре зберігає його біологічну активність експресії. Використовується термін "значно очищений", це позначення буде ставитися до пептидної або поліпептидної суміші, у якій поліпептидні або пептидні форми - основні компоненти суміші, такі, 12 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що засновують приблизно 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % або більше протеїнів у композиції. Різні методики прийнятні для використання в очищенні будуть відомі фахівцям. Вони включають, наприклад, осадження з амонієм сульфату, ПЕГ, антитіла (іммуноосадження) й подібні або денатурація нагріванням, з наступним центрифугуванням; хроматографія, така як афінна хроматографія (стовпчик Протеїн-А), іонний обмін, гель фільтрація, звернена фаза, гідроксилапатит, хроматографія з гідрофобною взаємодією, ізоелектричне фокусування, гель електрофорез і комбінація цих методик. Як відомо в даній галузі, передбачається, що порядок проходження різних кроків очищення можуть змінювати, або певний крок можуть опускати, все ж таки результат у підходящій методиці для підготовки добре очищеного поліпептиду. Типові кроки очищення надані в Прикладах нижче. Різні способи квантифікації ступеня очищення поліпептиду будуть відомі фахівцям у світі цього винаходу. Вони включають, наприклад, визначення специфічної єднальної активності активної фракції, або оцінку кількості пептиду або поліпептиду у фракції аналізом SDS/PAGE. Спосіб оцінки чистоти поліпептидної фракції, якому надається перевага, розраховує єднальну активність фракції, для того, щоб зрівняти її з активністю зв'язування початкового екстракту, а в такий спосіб розрахувати ступінь очищення, яка встановлена в цьому документі як "кратний ступінь очищення". Фактичні одиниці, які використовувалися для подання кількості єднальної активності, звичайно, будуть залежати від специфіки обраного способу аналізу для наступного очищення й від того, чи виявить або ні поліпептид чи пептид єднальну активність, яку можна визначити. Стабілізовані поліпептиди активіну типу IIB зв'язуються з лігандами, які активують каскад м'язової деградації. Поліпептиди svActRIIB здатні до зв'язування й інгібуванню активності лігандів активіну А, міостатину, і/або РДФ-11, і мають здатність лікувати хвороби, що включають м'язову атрофію, так само, як і лікування певних ракових захворювань і інших хвороб. Приклади нижче показують поліпшені властивості поліпептидів і протеїнів svActRIIB, що мають амінокислотні заміщення, описані в цьому документі, і при цьому зберігають здатність зв'язувати й нейтралізувати міостатин, активін А, або РДФ–11 в аналізі in vitro, як і зберігати активність in vivo. Ці властивості приведуть до протеїнів і поліпептидів, що мають поліпшену технологічність у порівнянні з іншими розчинними рецепторами. Антитіла Даний винахід далі включає антитіла, які зв'язують стабілізовані поліпептиди ActRIIB, включаючи такі, які специфічно зв'язують поліпептиди svActRIIB цього винаходу. Як визначалось в даному документі, термін "специфічно зв'язує" відноситься до антитіл, що мають спорідненість до зв'язування (Ka) з поліпептидами svActRIIB 106 M-1 або іншими. Як визначалось в даному документі, термін "антитіло" відноситься до інтактних антитіл, включаючи поліклональні антитіла (див., наприклад Антитіла: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds), Cold Spring Harbor Press, (1988)), і моноклональні антитіла (див., наприклад, патент США №. RE 32011, 4902614, 4543439, і 4411993, і Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Kennett, McKearn and Bechtol (eds.) (1980)). Як визначалось в даному документі, термін "антитіло" також відноситься до фрагмента антитіла, такому як F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, Fc, і до одноланцюгових антитілам, які продукувались рекомбінантними ДНК технологіями або ферментним або хімічним розщепленням інтактних антитіл. Термін "антитіло" також відноситься до біспецифічних або до бифункціональних антитіл, штучні гібридні антитіла, що мають дві різні важкі/легкі ланцюгові пари й два різних сайти зв'язування. Біспецифічні антитіла можуть вироблятись по багатьом методикам, включаючи злиття гібридомів або зв'язування фрагментів Fab'. (Див. Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol.148:1547-1553 (1992)). Як визначалось в даному документі термін "антитіло" також відноситься до химерних антитіл, тобто антитілам, що мають людський постійний імуноглобульований домен антитіла з'єднаний з одним або більше нелюдським змінним імуноглобульованим доменом антитіла, або його фрагментом (див., наприклад, патент США № 5,595,898 і патент США № 5,693,493). Антитіла також відносяться до "гуманізованих" антитіл (див., наприклад, Патент США № 4,816,567 і WO 94/10332), мінітіл (WO 94/09817), макситіл і антитілам, які продукуванні трансгенними тваринами, причому трансгенні тварини, які містять частку людських антитіл, що продукують гени в недостатній кількості для продукування ендогенних антитіл, здатні до продукування людських антитіл (див., наприклад, Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), і Патент США №. 6,300,129). Термін "антитіла" також включає мультимірні антитіла, або комплекс протеїнів високого порядку, такі як гетеродимерні антитіла й анти-ідіотипові антитіла. "Антитіла" також включають анти-ідіотипові антитіла. Антитіла стосовно поліпептидів svActRIIB 13 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть бути використані, наприклад, для ідентифікації й кількісного аналізу svActRIIB in vitro і in vivo. Також сюди відносяться поліклональні антитіла з будь-якого ссавця, наприклад мишачі або щурячі антитіла, або антитіла кролика, які специфічно зв'язуються з поліпептидами svActRIIB, описаними в цьому документі. Такі антитіла знаходять застосування як інструмент дослідження й у кількісному аналізі для визначення або оцінки поліпептидів, розкритих у цьому документі. Такі антитіла зроблені з використанням способів, описаних вище й відомих в даній галузі. Фармацевтичні композиції Також надані фармацевтичні композиції, що містять протеїни й поліпептиди svActRIIB цього винаходу. Такі композиції містять терапевтично або профілактично ефективну кількість поліпептиду або протеїну в суміші з фармацевтично прийнятними матеріалами, і фізіологічно придатними матеріалами для складання композиціями. Фармацевтична композиція може містити тридцятимільйонні матеріали для зміни, супроводу або збереження наприклад, рН, осмолярності, в'язкості, прозорості, кольору, ізотонії, запаху, стерильності, стабільності, інтенсивності розчинення або вивільнення, абсорбції або проникнення композиції. Відповідні матеріали композиції включають, але не обмежені, амінокислоти (такі, як гліцин, глутамін, аспарагін, аргінін або лізин); антимікробні речовини; антиоксиданти (такі, як аскорбінова кислота, сульфіт натрію або гідросульфіт натрію); буфери (такі, як борат, бікарбонат, Трис–НСl, цитрати, фосфати та інші органічні кислоти); наповнювачі (такі, як манітол або гліцин), хелатуючі агенти (такі, як етилендіамін тетраоцтова кислота (ЕДТК)); комплексоутворювачи (такі, як кофеїн, полівінілпіролідон, бета-циклодекстрин або гідроксипропіл-бетациклодекстрин); наповнювачі; моносахариди; дисахариди або інші карбогідрати (такі, як глюкоза, маноза або декстрини); білки (такі, як альбумін сироватки, желатин або імуноглобуліни); барвники; ароматизатори й розріджувачі; емульгуючі речовини; гідрофільні полімери (такі, як полівінілпіролідон); низькомолекулярні поліпептиди; сільоіутворюючі протиіони (такі, як натрій); консерванти (такі, як бензалконій хлорид, бензойна кислота, саліцилова кислота, тімеросал, фенілетиловий спирт, метилпарабен, пропілпарабен, хлоргексидін, сорбинова кислота або перекис водню); розчинники (такі, як гліцерин, пропіленгліколь або поліетиленгліколь); цукрові спирти (такі, як манітол або сорбітол); суспендуючи агенти; поверхнево-активні речовини або змочувальні реагенти (такі, як плюронікси, ПЕГ, сорбітан естери, полісорбати, такі, як полісорбат 20, полісорбат 80, тритон, трометамін, ліцитін, холестерол, тілоксапал); підсилювачі стійкості (сахароза або сорбітол); підсилювачі тонусу (такі, як галогеніди лужних металів (переважно натрій або калій хлорид, манітол, сорбітол); носії; розчинники; допоміжні речовини та/або фармацевтичні ад'юванти (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990). Оптимальна фармацевтична композиція буде визначена фахівцем, у залежності, наприклад, від наміченого способу прийому, виду випуску й бажаної дози. Дивиться, наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Такі композиції можуть впливати на фізичний стан, стабільність, швидкість in vivo виведення, і швидкість in vivo кліренсу поліпептиду. Наприклад, прийнятні композиції можуть бути водою для ін'єкцій, фізіологічним сольовим розчином для парентерального застосування. Первинне середовище або носій у лікарському препараті можуть бути або водним або неводним у природному стані. Наприклад, прийнятне середовище або носій може бути водою для ін'єкцій, фізіологічним сольовим розчином або штучною спинномозковою рідиною, може бути доповнений іншими матеріалами, розповсюдженими в препаратах для парентерального застосування. Підтримуючі типові середовища - це нейтральний забуферований фізіологічний розчин або фізіологічний розчин, змішаний із сироватковим альбуміном. Інші характерні фармацевтичні композиції містять Tріс буфер або ацетатні буфери, які можуть додатково містити сорбітол або прийнятний замінник. У варіанті виконання цього винаходу, препарати можуть бути приготовлені для зберігання змішуванням обраного препарату, що має бажаний рівень чистоти з факультативним рецептурним агентом (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) у формі ліофілізуючої таблетки або водного розчину. Додатково, терапевтичний препарат може бути складений як ліофілізат з використанням підходящих наповнювачів, таких як сахароза. Композиції можуть бути введені безліччю способів, наприклад, інгаляційною терапією, орально або за допомогою ін'єкцій. При розгляді парентерального застосування, фармацевтичні композиції для використання в цьому винаході можуть бути в апірогенній формі, парентерально прийнятними водними розчинами, що містять бажаний поліпептид у фармацевтично 14 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 прийнятному середовищі. Зокрема, прийнятне середовище для парентеральних ін'єкцій стерильна дистильована вода в якій поліпептиди складені як стерильний, ізотонічний розчин, збережений належним чином. Крім того, фармацевтична композиція може включати складання бажаних молекул з агентом, таким як ін'єктуючі мікросфери, біо-ерозійні частки, полімерні з'єднання (полімолочна кислота, полігліколієва кислота), гранули або ліпосоми, які надаються для контрольованого або постійного виведення продукту, що може потім бути доставлений через ін'єкцію речовини вповільненого усмоктування. Може також використовуватися гіалуронова кислота й це впливає на стійку тривалість, що активує, у циркуляції. Інші прийнятні способи для введення бажаної молекули включають пристрій, що імплантується для доставки фармацевтичної композиції. В іншому варіанті виконання винаходу, фармацевтичну композицію, прийнятну для застосування у вигляді ін'єкцій, можуть приготувати у водних розчинах, переважно у фізіологічно сумісних буферах, таких як розчин Хенкса, розчин Рінгеру або забуферений фізіологічний розчин. Суспензії водних ін'єкцій можуть містити речовини, які збільшують в'язкість суспензії, такі як карбоксиметилцелюлоза натрію, сорбітол або декстран. Додатково, суспензії активних з'єднань можна приготувати як підходящі масляні суспензії для ін'єкцій. Прийнятні ліофільні розчинники або середовища, включають жирні кислоти, такі, як сезамова олія, або синтетичні естери жирних кислот, такі, як етил олеат, тригліцериди або ліпосоми. Неліпідні полікатіонні амінополімери можна також використовувати для доставки. Необов'язково, суспензія може також містити прийнятні стабілізатори або агенти для збільшення розчинності з'єднань і враховувати готування висококонцентрованих розчинів. В іншій модифікації, фармацевтична композиція може бути складена для інгаляцій. Інгаляційні розчини можуть також бути складеними із пропелентом для аерозольної доставки. У ще одній модифікації розчини можуть розпорошувати. Легеневе введення описане далі в Міжнародній заявці № PCT/US94/001875, що описує легеневу доставку хімічно модифікованих протеїнів. Також спостерігається, що певні композиції можуть бути застосовані орально. У варіанті виконання цього винаходу, молекули, введені таким чином, можуть бути складені з носіями або без таких носіїв, які звичайно використовуються в складанні композицій твердої форми, таких, як таблетки й капсули. Наприклад, капсула може призначатися для вивільнення активної частини препарату в точці шлунково-кишковий тракту, коли біоактивність максимальна й пресистемна деградація мінімальна. Додаткові агенти можуть включатися для полегшення абсорбції терапевтичних молекул. Також можна використовувати розріджувачі, ароматизатори, легкоплавкі воски, рослинні олії, лубриканти, суспендуючі речовини, таблетки речовин, що розпадаються, і єднальні речовини. Фармацевтичні композиції для орального застосування можуть також бути складені з використанням фармацевтично прийнятних носіїв, добре відомих в цій галузі в дозуванні, прийнятної для орального застосування. Такі носії уможливлюють складання лікарського препарату як таблетки, пігулки, драже, капсули, рідини, гелі, сиропи, суспензії, й подібні, для прийому усередину пацієнтом. Фармацевтичні композиції для перорального використання можна одержувати за допомогою комбінації активних компонентів із твердим наповнювачем і обробки результуючої суміші гранул (необов'язково, після здрібнювання) для одержання ядра пігулок або драже. Можна додати за бажанням прийнятні допоміжні речовини. Відповідні наповнювачі включають карбогідрати або білковий наповнювач, такі як цукор, включаючи лактозу, сахарозу, манітол або сорбітол; крохмаль із зерна, пшениці, рису, картоплі або інших рослин; целюлозу, таку як метил целюлоза, гідроксипропілметил-целюлоза або карбоксиметилцелюлоза натрію; смоли, включаючи акації й трагаканту; і протеїни, такі як желатин і колаген. За бажанням, можна додати агенти, що розпадаютья та розчиняютья, такі як перехресні полівінілпіролідон, агар, альгінова кислота або її сіль, така як альгінат натрію. Ядра драже можуть використовувати в з'єднанні з прийнятними оболонками, такими як розчини концентрованого цукру, що може також містити смолу акації, тальк, полівінілпірролідон, гель каброполу, поліетіленгліколь, та/або діоксид титана, лакові розчини й підходящі органічні розчинники або суміші розчинника. В оболонки пігулок або драже можна додавати барвники або пігменти для ідентифікації продукту або для того, щоб характеризувати кількість активної речовини, наприклад, його дозування. Фармацевтичні композиції, які можна використовувати перорально, також включають заповнені капсули з желатину, також, як і м'які, запаяні капсули з желатину й покриття, такі як гліцерол або сорбітол. Заповнені капсули можуть містити активні інгредієнти, змішані з наповнювачами або єднальними речовинами, такими як лактоза або крохмаль, що змазує речовину, такі як тальк або стеарат магнію, і, необов'язково, стабілізатори. У м'яких капсулах, 15 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активні компоненти можуть бути розчинені або суспендовані у відповідних рідинах, таких як олія, рідини або рідкий поліетіленгліколь з або без стабілізаторів. Допоміжні фармацевтичні композиції можуть бути очевидними для фахівців, включаючи препарати, що містять поліпептиди у формі постійної або регульованої доставки. Технології складання багатьох інших способів постійної або регульованої доставки, таких як ліпосомні носії, біо-ерозійні мікрочастки або пористі гранули й ін'єкції речовини вповільненого всмоктування, також відомі фахівцям у даній галузі. Можна подивитись, наприклад, заявку PCT/US93/00829, що описує контрольоване виведення пористих полімерних мікрочасток для доставки фармацевтичних композицій. Додаткові приклади препаратів з уповільненим вивільненням включають напівпроникну полімерну матрицю у формі профільованого виробу, тобто плівки або мікрокапсули. Матриці з уповільненим вивільненням можуть включати поліестери, гідрогелі, полілактиди (U.S. 3,773,919, EP 58,481), сополімери L-глутамінової кислоти й гама етил-L-глутамат (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983), полі (2гідроксиетил-метакрилат)(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277, (1981); Langer et al., Chem. Tech.,12:98-105(1982)), етиленвінілацетат (Langer et al., supra) або полі-D(-)-3гідроксимасляна кислота (EP 133,988). Фармацевтичні композиції з уповільненим вивільненням також включають ліпосоми, які можна приготувати будь-яким або декількома способами, відомими в цій галузі. Можна подивитись, наприклад, Eppstein et al., PNAS (USA), 82:3688 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949. Фармацевтична композиція, яка призначена, для застосування in vivo, як правило, повинна бути стерильна. Це може бути виконано фільтрацією через стерильні фільтраційні мембрани. Коли композиція ліофілізована, стерилізацію з використанням цього способу можуть перевірити перед або після ліофілізації й відновлення. Фармацевтична композиція для парентерального застосування може зберігатися в ліофілізованій формі або у формі розчину. На додаток, парентеральні суміші, як правило, розміщають у контейнер, що має стерильний вхідний отвір, наприклад, пакет внутрішньовенного розчину або ампулу, що має пробку, що піддається проколюванню гіподермічною голкою для ін'єкцій. Відразу після виготовлення фармацевтичної композиції, вона повинна зберігатися в стерильних ампулах як розчин, суспензія, гель, емульсія, тверда речовина, або зневоднений або ліофілізований порошок. Такі фармацевтичні композиції можуть зберігатися або в готовій до використання формі або у формі (тобто ліофілізованій), що вимагає відновлення перед застосуванням. В особливому варіанті виконання даний винахід орієнтований на створення наборів для продукування одиниці одноразової дози застосування. Кожний набір може містити перший контейнер, що має висушені білки й другий контейнер, що має водний склад. Також включені в галузь цього винаходу набори, що містять одне й мультикамерні попередньо набрані шприци (наприклад, рідинні шприци й ліошприци). Ефективна кількість фармацевтичної композиції, застосовувана терапевтично, буде залежати, наприклад, від терапевтичного контексту й цілей. Фахівцям зрозуміло, що прийнятний рівень дозування для лікування, таким чином, дуже залежить, частково, від доставки молекули, для індикації якої застосовується поліпептид, способу прийому, розміру (вага тіла, поверхня тіла або розмір органа) і стану (вік і загальний стан здоров'я) пацієнта. Отже, клініцисти можуть титрувати дозу й модифікувати спосіб прийому для одержання оптимального терапевтичного ефекту. Типове дозування може бути в діапазоні приблизно від 0,1 мг/кг до 100 мг/кг або вводиться внутрівенно. Фармацевтична композиція пролонгованої дії може вводитися кожні тричотири дні, щотижня, або два тижні, залежно від часу напіврозпаду й швидкості кліренсу специфічного складу. Частота дозування залежить від фармакокінетичних параметрів поліпептиду у використовуваній композиції. Звичайно, фармацевтична композиція застосовується доти, поки дозування не досягне одержання бажаного ефекту. Фармацевтична композиція може, таким чином, вводитися одноразово або багаторазово (з однаковою або різною концентрацією/дозуванням) із часом, або як безперервне уливання. Далі уточнення підходящого дозування роблять за стандартною методикою. Підходяще дозування може бути встановлено використанням прийнятних даних про залежність між дозою й ефектом. Шлях введення фармацевтичної композиції відповідно до відомих способів, наприклад, орально, через внутрішньовенні ін'єкції, внутрішньочеревинно, внутрішньоцеребрально (внутрішньопаренхимально), інтрацеребровентрикулярно, внутрішньом'язово, внутрішньоочно, внутрішньоартеріально, інтрапортально, уведенням усередину уражених тканин, інтрамедулярно, підоболонково, інтравентрикулярно, трансдермально, підшкірно або інтраперитонеально; так само, як і інтраназально, ентерально, місцево, під'язиково, уретрально, вагінально, або ректальним способом, системою з уповільненим вивільненням або 16 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імплантованим пристроєм. Фармацевтичні композиції по необхідності можуть вводитися ін'єкційно болюсом або постійним уливанням, або імплантованим пристроєм. Альтернативно або додатково, композицію можна вводити локально через імплантацію мембрани, губки або іншого підходящого матеріалу, у якому бажана молекула абсорбується або інкапсулюється. При використанні імплантованого пристрою воно може бути імплантоване в будь-яку прийнятну тканину або орган, і поставка бажаної молекули може бути через дифузію, болюс із тимчасовим вивільненням, постійне введення. У деяких випадках, поліпептиди svActRIIB цього винаходу можуть бути доставлені імплантуванням певних клітин, які створені способами генної інженерії, з використанням таких способів, як описано в цьому документі, для експресії й секреції поліпептиду. Такі клітини можуть бути тваринними або людськими, і можуть бути аутологічними, гетерологічними або ксеногенними. При необхідності клітини можуть бути безсмертні. Для того, щоб зменшити шанс імунологічної відповіді, клітини можуть бути інкапсульовані в запобіганні інфільтрації навколишніх тканин. Герметизуючим матеріалом є, в основному, біологічно сумісні, напівпроникні полімерні оболонки або мембрани, що дозволяють визволити поліпептидні продукт(и), але попереджуючу деструкцію клітин імунною системою пацієнта або інших негативних факторів навколишніх тканин. Крім того, представлена svActRIIB генна терапія in vivo, у якій молекула нуклеїнової кислоти, що кодує svActRIIB, або похідна svActRIIB вводиться безпосередньо в суб'єкт. Наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує svActRIIB вводили в цільові клітини через локальні ін'єкції конструкції нуклеїнової кислоти з або без підходящого вектору доставки, такого як аденоасоційований вірусний вектор. Альтернативний вірусний вектор включає, але не обмежується, ретровірусами, аденовірусами, простим герпесом, вірусними й папілома вірусними векторами. Фізичний перенос вірусного вектору можна досягти in vivo локальною ін'єкцією бажаної конструкції нуклеїнової кислоти або іншим прийнятним вектором доставки, що містить необхідну послідовність нуклеїнової кислоти, переносом за допомогою ліпосом, прямою ін'єкцією (неізольованої ДНК) або бомбардуванням мікрочастинками (генна гармата). Фармацевтичні композиції даного винаходу можна використовувати окремо або в комбінації з іншими терапевтичними агентами для посилення їхніх терапевтичних ефектів або зменшення потенційних побічних дій. Використання svActRIIB композицій Даний винахід представляє способи й фармацевтичні композиції для скорочення або нейтралізації кількості або активності міостатину, активіну А або РДФ–11 in vivo і in vitrо. Поліпептиди svActRIIB мають високу спорідненість до зв'язування міостатину, активіну А або РДФ-11 і здатні на скорочення й інгібування біологічної активності, щонайменше, одного міостатину, активіну А або РДФ-11. В іншому аспекті, цей винахід надає способи й реагенти для лікування порушень пов'язаних з міостатином і/або активіном А у суб'єкта, що потребує такого лікування, застосуванням ефективної дози препарату svActRIIB на суб'єкта. Як визначалось в даному документі термін "суб'єкт" відноситься до будь-яких тварин, таких як ссавці, включаючи й людину. Композиції по даному винаходу можна використовувати для збільшення безжирової м'язової маси у суб'єкта. Композиції можна також використовувати для збільшення безжирової м'язової маси в пропорції з жировою масою, і в такий спосіб зменшувати жирову масу як відсоток маси тіла суб'єкта. Приклад 3 демонструє, що поліпептиди й протеїни svActRIIB винаходу можуть збільшувати безжирову м'язову масу тварин. Порушення, які можуть лікуватися препаратом svActRIIB включають, але не обмежуються різними формами м'язової атрофії, як і метаболічні розлади, такі як діабет і зв'язані порушення, дегенеративні захворювання костей, такі як остеопороз. М'язова атрофія може включати дистрофію, таку як м'язову дистрофію Дюшенна, коли прогресує м'язова дистрофія, тип м'язової дистрофії Беккера, м'язова дистрофія ДежеринаЛандузи, м'язова дистрофія Ерба й дитяча нейроаксональна м'язова дистрофія. Додаткові порушення м'язової дистрофії виникають від хронічних захворювань або порушень, таких як бічний аміотрофічний склероз, застійні обструкційні легеневі захворювання, рак, СНІД, ниркова недостатність, атрофія органів, депривація андрогенів і ревматоїдний артрит. Зайва експресія міостатину й/або активіну може сприяти виснаженню й декільком синдромам м'язової атрофії. Виснаження виникає в результаті ракового захворювання, а також в результаті ревматоїдного артриту, дрифтер нефропатії, ниркової недостатності, ушкоджень через опіки й інші причини. В інших прикладах, сироваткова й внутрішньом’язова концентрація міостатинового імунореактивного протеїну виявляється збільшеною в людини, що хворіє на СНІД, в якої у зв'язку із цим є м'язова атрофія, і яка пропорційно пов'язана зі знежиреною масою 17 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS USA 95: 14938-14943 (1998)). Рівень міостатину також збільшується при опіках, в результаті катаболічного м'язового ефекту (Lang et al., FASEB J 15, 1807-1809 (2001)). Додаткові умови, що призводять до м'язової атрофії, можуть виникати в результаті пасивності через недієздатність, а саме, знаходження в інвалідній колясці, тривалого постільного режиму через параліч, хвороби, пов'язані з ушкодження спинного мозку, перелому кості або травми, і м'язової атрофії в умовах малої гравітації (космічні польоти). Наприклад, виявлено, що міостатиновий імунореактивний протеїн плазми збільшується після тривалого постільного режиму (Zachwieja et al. J Gravit Physiol. 6(2):11(1999). Також було виявлено, що м'язи пацюків, що піддавалися впливу мікрогравітації протягом космічних польотів у шатлах, виділяють збільшену кількість міостатину, у порівнянні з м'язами пацюків, які не піддавалися такому впливу (Lalani et al., J.Endocrin 167 (3):417-28 (2000)). На додаток, пов'язане з віком збільшення відношення жиру до м'язів, і пов'язана з віком м'язова атрофія, здається, пов'язана з міостатином. Наприклад, середнє число сироваткового міостатин-імунореактивного протеїну збільшується з віком у групах молодих (19-35 років), середнього віку (36-75 років) і літніх (76-92 років) чоловіків і жінок, коли середнє значення м'язової маси й безжирової маси зменшувалася з віком у цих групах (Yarasheski et al. J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002)). На додаток, виявлено, що міостатин експресується в нижчій кількості в м'язі серця й експресія активується в кардіоміоцитах після інфаркту (Sharma et al., J Cell Physiol. 180 (1):1-9 (1999)). Таким чином, скорочення рівня міостатину в м'язі серця може поліпшувати відновлення серцевого м'яза після інфаркту. Як виявилося, міостатин також впливає на метаболічні порушення, включаючи діабет 2 типу, неінсулінзалежний цукровий діабет, гіперглікемію й ожиріння. Наприклад, показано, що відсутність міостатину поліпшує фенотипи страждаючим ожирінням і діабетом у двох моделях мишей (Yen et al. FASEB J. 8:479 (1994). Поліпептиди svActRIIB цього винаходу прийнятні для лікування таких метаболічних порушень. Таким чином, застосування композицій по даному винаходу поліпшить стан суб'єктів, що страждають діабетом, ожирінням і на гіперглікемічний стан. На додаток, композиції, що містять поліпептиди svActRIIB можуть зменшувати усмоктування їжі в осіб з ожирінням. Застосування стабілізованого поліпептиду ActRIIB цього винаходу може поліпшити міцність костей і послабити остеопороз й інші дегенеративні хвороби костей. Було виявлено, що, наприклад, міостатин-дефіцитні миші показали збільшення змісту мінеральних солей, і щільність плечової кістки миші й збільшення змісту мінеральних солей у трабекулярній і трубчастій кістках в областях, де м'язи прикріплені, як і збільшення м'язової маси (Hamrick et al. Calcif Tissue Int 71(1):63-8 (2002)). На додаток, препарат svActRIIB цього винаходу можна використовувати для лікування впливу депривації андрогенів у таких випадках, як використана терапія депривації андрогену, наприклад, для лікування раку простати. Даний винахід також представляє способи й композиції для збільшення м'язової маси м'ясомолочної худоби із застосуванням ефективної дози протеїнів svActRIIB тварин. Після того, як тестували зрілий С-кінцевий поліпептид міостатину подібний або ідентичний у всіх видах, очікували, що поліпептиди svActRIIB ефективні для збільшення безжирової м'язової маси й скорочення жиру в будь-яких важливих сільськогосподарських видах, включаючи велику рогату худобу, кур, індиків й свиней. Поліпептиди svActRIIB і композиції цього винаходу також протидіють активності активіну А, як показано в аналізах in vitro нижче. Відомо, що активін А експресує в певних типах раку, зокрема гонадних пухлинах, таких, як карцинома яєчника, і приводити до важких виснажень. (Ciprano et al. Endocrinol 141 (7):2319-27 (2000), Shou et al., Endocrinol 138 (11):5000-5 (1997); Coerver et al., Mol Endocrinol 10(5):534-43 (1996); Ito et al. British J Cancer 82(8):1415-20 (2000), Lambert-Messerlian, et al., Gynecologic Oncology 74:93-7 (1999). Таким чином, композиції по даному винаходу можуть використовуватися для лікування станів, зв'язаних зі гіперекспресією активіну А, як і експресією міостатину, таких, як виснаження від певного раку й лікування певних типів гонадних пухлин. Крім того, поліпептиди svActRIIB цього винаходи придатні для виявлення й проведення кількісного аналізу міостатину, активіну А або РДФ–11 у будь-якій кількості аналізів. В основному, стабілізовані поліпептиди ActRIIB цього винаходу корисні як агенти захоплення для зв'язування й іммобілізації міостатину, активіну А або РДФ–11 у багатьох аналізах, подібних до описаних, наприклад, в Asai, ed., Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993). Поліпептиди можуть маркірувати деякими способами або реагувати із третьою молекулою, такою як антитіло, що маркіроване для можливості детектування й певною кількостю міостатину. Наприклад, поліпептид або третя молекула може модифікувати з контрастною речовиною, такою як біотин, яку можна потім зв'язати з четвертою молекулою, 18 UA 107921 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 такою як фермент-маркірований стрептавідін, або інші протеїни. (Akerstrom, J Immunol 135:2589 (1985); Chaubert, Mod Pathol 10:585 (1997)). У даному винаході були описані в супроводі наступні приклади запропоновані для ілюстрації та не для обмеження. Приклад 1 Експресія й очищення svActRIIB поліпептидів Наступні способи використовували для експресування й очищення стабілізованих ActRIIB поліпептидів. кДНК рецептора активіну типу IIB людини ізолювали із кДНК бібліотеки людського сім'яника (Clontech, Inc.) і клонували, як описано в заявці США з реєстраційним номером 11/590,962, заявці США з реєстраційним номером: 2007/0117130, які в даному документі включені як посилання. Наступні способи використовували для продукування svActRIIB-Fc (E28W, S44T) поліпептиду (SEQ ID NO: 10), і ActRIIB-Fc (E28W) (SEQ ID NO: 21). Полінуклеотиди, що кодують svActRIIB, (E28W, S44T) (SEQ ID NO: 5), або полінуклеотиди, що кодують ActRIIB (E28W) (SEQ ID NO: 19) злили до полінуклеотидів, що кодує людський IgG2 Fc (SEQ ID NO: 22), за допомогою полінуклеотидів, що кодують шарнірну лінкерну послідовність (SEQ ID NO: 26), використовуючи ПЦР із подовженням, що перекривається, з використанням праймерів, які утримують мутації, що результують в амінокислотних замінах у позиції 28 з E на W, і в позиції 44 з S на T. Повною полінуклеотидною послідовністю є SEQ ID NO: 9 для svActRIIB-IgG Fc (E28W, S44T), і SEQ ID NO: 20 для ActRIIB-ActRIIB-IgG Fc (E28W). Фрагменти двохспіральної ДНК субклонували у вектори pTT5 (Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada (NRCC), 6100 Avenue Royalmount, Montreal (Quebec) Canada H4P 2R2)), pDSRα описані в WO/9014363) і/або похідні pDSRα. Тимчасову експресію стабілізованого ActRIIB–Fc поліпептиду проводили як викладено нижче. svActRIIB–IgG Fc (E28W, S44T) (SEQ ID NO: 10), і ActRIIB–IgG Fc (E28W) (SEQ ID NO: 21) поліпептиди експресували тимчасово в безсироватковій суспензії адаптованих 293–6E клітин (National Research Council of Canada, Ottawa, Canada), які утримуються в FreeStyle™ середовищі (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), доповнених 250 мкг/мл генетисину (Invitrogen) і 0,1 % плюроніком F68 (Invitrogen). Трансфекцію виконували як 1л культивування. Коротко, 6 клітинний інокуляр вирощували до 1,110 клітин/мл в 4л колбі Фернбаху (Corning, Inc.), яку струшували. Культура, що струшується, у колбі підтримувалася на шейкерній платформі Innova 2150 (News Brunswick Scientific, Edison, NJ) при 65 об/хв., що була поставлена у зволожений інкубатор, що підтримує 37 °C і 5 % CO2. Під час трансфекції, 293–6Е клітин були розведені до 6 1,0  10 клітин/мл. Трансфекційні комплекси сформували в 100 мл FreeStyle™ 293 Media (Invitrogen). Спочатку додали 1 мг плазмідної ДНК у середовище, з послідовним додаванням 3 мл FuGene HD трансфекційного реагенту (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Трансфекційний комплекс інкубували при кімнатній температурі приблизно 15 хвилин і потім додавали до клітин у колбу, що струшувалась. Через дванадцять годин після трансфекції, додали 20 % (вага/обсяг) пептону TN1 (OrganoTechnie S.A., TeknieScience, QC, Canada) для досягнення кінцевої концентрації 0,5 % (вага/обсяг). Трансфекцію/експресію проводили 4–7 днів, після чого кондиційоване середовище збирали центрифугуванням при 4000 об/хв. 60 хвилин при 4 °C. Стабільна трансфекція й експресія проводилася в такий спосіб. Клітинну лінію svActRIIBIgG-Fc створили трансфекцією стабільних клітин-хазяїв яєчників китайського хом'ячка з експресійними плазмідами, що містять полінуклеотиди, що кодують svActRIIB-IgG Fc (E28W, S44T) (SEQ ID NO: 9) або ActRIIB-IgG Fc (E28W) (SEQ ID NO: 20) з використанням стандартних процедур електропорації. Після трансфекції клітинна лінія з експресійними плазмідами клітини росли в безсироватковому селекційному середовищі без GHT 2-3 тижня, що дозволяло відібрати плазміду й відновити клітини. Клітини відбирали поки вони не досягли 85 % життєздатності. Цей пул трансфікованих клітин культивували потім у середовищі, що містить 150 нМ метотрексату. Через 6 днів аналізу експресії, пул svActRIIB-Fc (E28W, S44T) експресійних клітин показав високий клітинний титр, продуктивність росту, і поліпшену специфічну продуктивність (пікограмм/клітина/день) протеїну, продукованого в порівнянні з пулами ActRIIB-Fc (E28W) експресійних клітин. Селекціоновані пули, наприклад, продукували приблизно 1,2 г/л для svActRIIB-Fc (E28W, S44T) порівняно з 0,9 г/л для ActRIIB-Fc (E28W). Кожну з svActRIIB–Fc (E28W, S44T) і ActRIIB–Fc (E28W) експресуючих клітинних ліній збільшили з використанням стандартного процесу культури з підживленням. Клітини інокулювали у Хвильовому біореакторі (Wave Biotech LLC). Культури живили 3 рази болюсом з 19 UA 107921 C2 5 10 15 живильним речовинами. Зібрали 10 л на 10 день, залишок був зібраний на 11 день; обидва збори піддали глибокій фільтрації з наступною стерильною фільтрацією. Кондиційоване середовище фільтрували через 10 дюймовий 0,45/0,2 мікрон фільтр попереднього очищення, з наступною фільтрацією через 6 дюймовий 0,2 мікронний фільтр. Очищення протеїну Приблизно 5 л кондиційованого середовища безпосередньо перенесли на 220 мл MabSelect™ колону Protein A column (GE Healthcare). Колону попередньо зрівноважили у ФСБ (фосфатно сольовий буфер: 2,67 мМ хлориду калію, 138 мМ хлориду натрію, 1,47 мМ дигідрофосфату калію, 8,1 мМ фосфату натрію двохосновного, рН 7,4). Колону промивали рівноважним буфером, поки зчитування OD280 було приблизно нулю, і потім протеїн елюірували з 0,1 М оцтовою кислотою. Застосовували Mabselect™ Pool до 300 мл SP–HP колоні (GE Healthcare) (5 × 15 див). Колону попередньо врівноважували 10 мМ NaOAC, pH 5. Колону потім промивали рівноважним буфером, поки зчитування OD280 було приблизно нулю. Колону елюірували 20 об'ємами колони градієнтного буферу їх 0-150 мМ NaCl в 10 мМ NaOAC, pH 5. SP-HP пул концентрували й фільтрували 0,5 мкМ фільтром з ацетату целюлози (Corning). Використані послідовності протеїнів викладені в таблиці нижче. ActRIIB–Fc svActRIIB–IgG2Fc (E28W, S44T) (SEQ ID NO: 10) ActRIIB послідовність Лінкер-Шарнір etrwciyynanwelertnqtgle GGGGSVECPPCP rcegeqdkrlhcyaswrnssgt (SEQ ID NO: 27) ielvkkgcwlddfncydrqecv ateenpqvyfcccegnfcnerft hlpeaggpevtyeppptapt (SEQ ID NO: 6) ActRIIB–IgG2Fc etrwciyynanwelertnqsgl GGGGSVECPPCP (E28W) ercegeqdkrlhcyaswrnss (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 21) gtielvkkgcwlddfncydrqec vateenpqvyfcccegnfcner fthlpeaggpevtyeppptapt (SEQ ID NO: 19) 20 25 30 35 IgG2 Fc APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO:22) APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 22) Приклад 2 Характеристика поліпептидів Зразки svActRIIB–Fc (E28W, S44T) (SEQ ID NO: 10), очищені через MabSelect™ крок і поліпептиди ActRIIB–Fc (E28W) (SEQ ID NO: 21), очищені через SP–HP колонкові, як описано вище розбавили із ФСБ, рН 7,4 до 0,2 мг/мл. Глікозильований профіль поліпептидів потім установлювали з використанням SEC як описано нижче. Ексклюзійна хроматографія розмірів (ЕХР). Експерименти проводили на системі Agilent 1100 ВЕЖХ із двома колонами (TOSOHAAS G3000swxl, 7.8 × 300 мм) у тандемі. 2x ФСБ використовували як мобільну фазу при 0,5 мл/хв. На фігурі 1 показано порівняння між ActRIIB-Fc (E28W) і svActRIIB-Fc (E28W, S44T) на колонах ексклюзійної хроматографії з використанням протоколу, описаного вище. svActRIIB-Fc (E28W, S44T) показує одиничний пік у порівнянні з ActRIIB-Fc (E28W), що показує три піки. Це відповідає ступеню споріднення N-зв'язаного глікозилювання в позиції N42 Fc димеров обох протеїнів. Одиничний пік svActRIIB-Fc (E28W, S44T) поліпептиду відповідає повністю глікозильованого N-зв'язаного аспарагіну в позиції N42 димера. Три піки ActRIIB-Fc (E28W) відповідають (з ліва на право) повністю глікозильованого аспарагіну в N42, частково глікозильованого аспарагіну в N42, і не глікозильованого аспарагіну в N42. Таким чином, це демонструє, що svActRIIB-Fc (E28W, S44T) молекула - повністю глікозильована в порівнянні з ActRIIB-Fc (E28W), яка гетерогенна стосовно цього сайту гліколізації, і тому більше складна в очищенні. На додаток, попередні дослідження вказують, що svActRIIB-Fc (E28W, S44T) 20 UA 107921 C2 5 10 15 20 молекула, яка має додаткові поліпшені технологічні властивості як викладено нижче. Додаткові дослідження також демонструють, що найменший глікозильований пік ActRIIB-Fc (E28W) має більше низьку фізичну й термічну стабільність, чим частково або повністю глікозильовані молекули. Визначення значень KD і IC50 рецепторних поліпептидів для активіну А, міостатину й РДФ–11 було отримано як описано нижче. KinEx A™ Рівноважний Аналіз Заснований на розчині аналіз рівноважного зв'язування з використанням технології KinExA™ (Sapidyne Instruments, Inc.) використовували для визначення рівноваги дисоціації (KD) ліганд єднальних ActRIIB-Fc поліпептидів. Кожну гранулу UltraLink Biosupport (Pierce) попередньо покрили приблизно 100 мкг/мл міостатином, РДФ-11, або активіном А на ніч, і потім блокували бичачим сироватковим альбуміном. 1пМ і 3 пМ ActRIIB-Fc (E28W) (SEQ ID NO: 21) і svActRIIB-Fc (E28W, S44T) (SEQ ID NO: 10) зразки інкубували з різними концентраціями (від 0,7 фемтомоль до 160 пМ) міостатину, активіну А і РДФ-11 відповідно в зразку буфера при кімнатній температурі 8 годин перед пропущенням через ліганд-покриті гранули. Кількість зв'язаного гранулами розчинного рецептора визначали флуоресцентно (Cy5) міченим антилюдським-Fc антитілом кози в 1 мг/мл у суперблоці. Єднальний сигнал пропорційний концентрації вільного розчинного рецептора в рівновазі з даною концентрацією міостатину, активіну А або РДФ-11. KД одержували з нелінійної регресії кривих конкурування з використанням дуальної кривої однобічної гомогенно єднальної моделі передбаченої в програмному забезпеченні KinEx A™ (Sapidyne Instruments, Inc.). Значення KD одержували для кожного даного в таблиці нижче. ActRIIB–Fc (E28W) svActRIIB–Fc (E28W, S44T) 25 30 35 40 45 РДФ–11 0,1 пМ 0,1 пМ Активін A 0,2 пМ 0,1 пМ C2C12 Аналіз активності на клітинній основі Здатність ActRIIB-Fc (E28W) (SEQ ID NO: 21) і svActRIIB-Fc (E28W, S44T) (SEQ ID NO: 10) інгібувати зв'язування активіну А, РДФ-11 або міостатину з диким типом рецептору-Fc активіну IIB тестували з використанням аналізу активності на клітинній основі як описано нижче. Міостатин/активін/РДФ-11 - чутливу репортерну клітинну лінію згенерували трансфекцією C2C12 міобластних клітин (ATCC No: CRL-1772) з pMARE-luc конструкцією. pMARE-luc конструкцію зробили клонуванням дванадцяти повторень CAGA послідовності, що представляє міостатин/активін чутливі елементи (Dennler et al. EMBO 17: 3091-3100 (1998)) в pLuc-MCS репортерному векторі (Stratagene cat # 219087) вищерозташованого ТАТА-боксу. Клітини C2C12 по природі експресують рецептор IIB активіну на своїй клітинній поверхні. Коли міостатин/активін А/РДФ-11 зв'язують клітинні рецептори, активується Smad шлях метаболізму й фосфорильований Smad зв'язує чутливий елемент (Macias-Silva et al. Cell 87:1215 (1996)), у результаті чого експресує в ген люциферази. Люциферазна активність потім виміряється з використанням промислового набору аналізу люциферазного репортеру (cat # E4550, Promega, Madison, WI) відповідно із протоколом виробника. Стабільну лінію клітин C2C12, що трансфікували з pMARE-luc (C2C12/pMARE), використовували для виміру активності відповідно з наступною процедурою. Репортерні клітини висіяли в 96 лунок культури. Тестування з використанням розведення ActRIIB-IgG2 Fc коструйованого злиття як описано вище проводили з фіксованою концентрацією 4 нМ активіну А, міостатину й РДФ-11. Кожний із цих лігандів преінкубували з рецепторами в декількох концентраціях. Активність вимірювали за допомогою визначення активності люциферази в оброблених культурах. Значення IC50 визначали для кожного поліпептиду. Вони представлені в таблиці нижче. Ці значення подані в таблиці нижче. ActRIIB–Fc (E28W) svActRIIB–Fc (E28W, S44T) 50 Міостатин 0,1 пМ 0,1 пМ Міостатин 0,95 нM 1,07 нM РДФ–11 2,4 нM 2,4 нM Активін A 3,2 нM 3,6 нM Таким чином активність на клітинній основі приблизно однакова для ActRIIB-Fc (E28W) і svActRIIB-Fc (E28W, S44T). Стабільність при низькому рН Стабільність протеїну при низькому рН є корисним параметром при розгляданні технологічності протеїну, тому що етап вірусної інактивації промислового процесу продукування типово відбувається при низькому рН, такому як від рН приблизно 3,0 до 4,0. 21 UA 107921 C2 5 Для прогнозування ефектів короткострокової стабільності протеїну при низькому рН, використаному в ході експерименту, протягом етапу вірусної інактивації промислового очищення білку виконували наступний тест. Кожний протеїн розчиняли в 10 мг/мл 100 мМ ацетату натрію, рН 3,5. Його зберігали при 250С и аналізували через 0 годин, через 2 години й через 25 години й з використанням аналізів ексклюзійної хроматографії. Ексклюзійну хроматографію проводили, як описано вище й визначали відсоток високомолекулярних агрегатів. % високомолекулярна вага агрегату ActRIIB–Fc (E28W) svActRIIB–Fc (E28W, S44T) T=0 1,53 1,66 T=2 години 1,36 2,17 T=4 години 13,74 8,93 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Таким чином, відсоток високомолекулярних агрегатів, продукованих при рН 3,5 є значно менше для svActRIIB-Fc (E28W, S44T), чим для ActRIIB-Fc (E28W) через 4 години. Додаткові дослідження показали, що svActRIIB-Fc (E28W, S44T) показала кращу реверсивність, чим ActRIIB-Fc (E28W) при експозиції при рН 3,0 і 5,0 і що svActRIIB-Fc (E28, S44T) був більше гомогенним, чим ActRIIB-Fc (E28W) при всіх значеннях рН. Таким чином, продемонстровано, що svActRIIB-Fc (E28W, S44T) поліпептиди мають поліпшені технологічні характеристики, зокрема, поліпшену стабільність при низькому рН, більшу гомогенність при всіх значеннях рН у порівнянні з ActRIIB-Fc (E28W) при збереженні здатності інгібірувати активність активіну А, міостатину й РДФ-11. Приклад 3 Визначення in vivo ефективності 11 -тижневу C57Bl/6 миші-самки придбали в Charles River Laboratories. Мишам (десять мишей на групу) вводили одиничну дозу (10 мг/кг) svActRIIB-Fc (E28W, S44T) (SEQ ID NO: 10) або середовище (фізіологічний розчин з фосфатним буфером). Безжирову масу тіла визначали за допомогою ЯМР (PIXImus, GE LUNAR Corporation) на 3, 7, 10 і 14 день після введення дози десяти тваринам кожної групи. Результати для кожної серії мишей представлені на фігурі 2. Можна побачити, що одинична доза svActRIIB-Fc (E28W, S44T) значно збільшила безжирову масу тіла у тварин (P