Модифіковані поліпептиди рецептора активіну і їх застосування
Номер патенту: 101609
Опубліковано: 25.04.2013
Автори: Там Лі-тінг Тоні, Квак Кейс Су-нюнг, Хан Хк'ю, Сан Йонгхун, Жоу Ксяолан
Формула / Реферат
1. Ізольований білок, що містить модифікований поліпептид рецептора IIВ активіну (vActRIIB), причому зазначений поліпептид вибраний з групи, що складається з:
(a) поліпептиду, що має послідовність амінокислот, представлену SEQ ID NO: 18, за винятком заміни однієї амінокислоти в положенні 28, причому зазначена заміна вибрана з заміни будь-якої з А, F, Q, V, І, L, М, K, Н, W та Y на Е;
(b) поліпептиду, що має послідовність амінокислот, представлену амінокислотами з 19 по 134 послідовності SEQ ID NO: 18, за винятком заміни однієї амінокислоти в положенні 28, причому зазначена заміна обрана з заміни будь-якої з A, F, Q, V, І, L, М, K, Н, W і Y на Е;
(c) поліпептиду, що має послідовність амінокислот, представлену амінокислотами з 23 по 134 послідовності SEQ ID NO: 18, за винятком заміни однієї амінокислоти в положенні 28, причому вказана заміна обрана з заміни будь-якої з A, F, Q, V, І, L, М, K, Н, W і Y на Е;
(d) поліпептиду, що має послідовність амінокислот, представлену амінокислотами з 25 по 134 послідовності SEQ ID NO: 18, за винятком заміни однієї амінокислоти в положенні 28, причому вказана заміна обрана з заміни будь-якої з A, F, Q, V, І, L, М, K, Н, W і Y на Е;
(e) поліпептиду, що має щонайменше 90 % ідентичність з будь-яким з (а), - (d), причому заміна в положенні 28 обрана із заміни будь-якої з A, F, Q, V, І, L, М, K, Н, W і Y на Е, і при цьому поліпептид має здатність до скріплення міостатину, активіну А або GDF-11.
2. Ізольований білок за п. 1, який відрізняється тим, що:
(і) заміна в положенні 28 вибрана з A, W чи Y на E; або
(іі) поліпептид додатково містить заміну A на R в положенні 64.
3. Ізольований білок за п. 1 або 2 (і), який відрізняється тим, що поліпептид має послідовність, що вибрана з групи, що складається з SEQ ID NO: 20, 24, 26, 28, 34, 38, 40, 42, 87 та 88.
4. Ізольований білок за п. 1 або 2 (іі), який відрізняється тим, що поліпептид має послідовність, що вибрана з групи, що складається з SEQ ID NO: 34, 38, 40 та 42.
5. Ізольований білок за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що:
(I) поліпептид з’єднаний з щонайменше одним гетерологічним поліпептидом;
(II) поліпептид являє собою область Fc людини;
(III) поліпептид з’єднаний з щонайменше одним гетерологічним поліпептидом, що відрізняється тим, що гетерологічний поліпептид являє собою область Fc людини та відрізняється тим, що білок додатково містить лінкер.
6. Ізольований білок за п. 5, який відрізняється тим, що послідовність вибрана з групи, що складається з SEQ ID NO: 60, 62, 64, 87, 91, 93, 95 та 97.
7. Фармацевтична композиція, що містить ефективну кількість білка за будь-яким з пп. 1-6 в суміші з фармацевтично прийнятним носієм.
8. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти, яка містить полінуклеотид, вибраний з групи, що складається з:
(а) полінуклеотиду, що має послідовність, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID NO: 19, 23, 25, 27, 33, 37, 39, 41, 59, 61, 63, 92, 94 та 96 або їх доповнення; і
(b) полінуклеотиду, що кодує поліпептид, що має послідовність, обрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID NO: 20, 24, 26, 28, 34, 38, 40, 42, 60, 62, 64, 87, 88, 91, 93, 95 і 97.
9. Рекомбінантний вектор експресії, що містить нуклеїнові кислоти за п. 8.
10. Вектор за п. 9 для застосування в лікуванні розладів, пов’язаних з атрофією м’язів, або порушення обміну речовин у суб’єкта, що потребує такого лікування, який відрізняється тим, що вектор має здатність забезпечувати експресію поліпептидів vActRIIB в організмі суб’єкта.
11. Рекомбінантна клітина-хазяїн, що містить вектор за п. 9.
12. Спосіб отримання білка, зазначеного в будь-якому з пп. 1-6, що включає культивування клітини-хазяїна за п. 11, що забезпечує експресію білка та відновлення білка.
13. Застосування білка за п. 1
(І) для інгібування активності міостатину або збільшення м’язової маси, або збільшення співвідношення м’язової маси до жирової маси у суб’єкта, що потребує такого лікування;
(ІІ) в лікуванні розладів, пов’язаних з атрофією м’язів або порушенням обміну речовин, у суб’єкта, що потребує такого лікування, або
(ІІІ) в лікуванні захворювання, при якому в організмі суб’єкта відбувається надлишкова експресія активіну, у суб’єкта, що потребує такого лікування.
14. Застосування білка за п. 2
(І) для інгібування активності міостатину або збільшення м’язової маси, або збільшення співвідношення м’язової маси до жирової маси у суб’єкта, що потребує такого лікування;
(ІІ) в лікуванні розладів, пов’язаних з атрофією м’язів або порушенням обміну речовин, у суб’єкта, що потребує такого лікування, або
(ІІІ) в лікуванні захворювання, при якому в організмі суб’єкта відбувається надлишкова експресія активіну, у суб’єкта, що потребує такого лікування.
15. Застосування білка за п. 3
(І) для інгібування активності міостатину або збільшення м’язової маси, або збільшення співвідношення м’язової маси до жирової маси у суб’єкта, що потребує такого лікування;
(ІІ) в лікуванні розладів, пов’язаних з атрофією м’язів або порушенням обміну речовин, у суб’єкта, що потребує такого лікування, або
(ІІІ) в лікуванні захворювання, при якому в організмі суб’єкта відбувається надлишкова експресія активіну, у суб’єкта, що потребує такого лікування.
16. Застосування білка за п. 4
(І) для інгібування активності міостатину або збільшення м’язової маси, або збільшення співвідношення м’язової маси до жирової маси у суб’єкта, що потребує такого лікування;
(ІІ) в лікуванні розладів, пов’язаних з атрофією м’язів або порушенням обміну речовин, у суб’єкта, що потребує такого лікування, або
(ІІІ) в лікуванні захворювання, при якому в організмі суб’єкта відбувається надлишкова експресія активіну, у суб’єкта, що потребує такого лікування.
17. Застосування білка за п. 5
(І) для інгібування активності міостатину або збільшення м’язової маси, або збільшення співвідношення м’язової маси до жирової маси у суб’єкта, що потребує такого лікування;
(ІІ) в лікуванні розладів, пов’язаних з атрофією м’язів або порушенням обміну речовин, у суб’єкта, що потребує такого лікування, або
(ІІІ) в лікуванні захворювання, при якому в організмі суб’єкта відбувається надлишкова експресія активіну, у суб’єкта, що потребує такого лікування.
18. Застосування білка за п. 6
(І) для інгібування активності міостатину або збільшення м’язової маси, або збільшення співвідношення м’язової маси до жирової маси у суб’єкта, що потребує такого лікування;
(ІІ) в лікуванні розладів, пов’язаних з атрофією м’язів або порушенням обміну речовин, у суб’єкта, що потребує такого лікування, або
(ІІІ) в лікуванні захворювання, при якому в організмі суб’єкта відбувається надлишкова експресія активіну, у суб’єкта, що потребує такого лікування.
19. Застосування білка за п. 7
(І) для інгібування активності міостатину або збільшення м’язової маси або збільшення співвідношення м’язової маси до жирової маси у суб’єкта, що потребує такого лікування;
(ІІ) в лікуванні розладів, пов’язаних з атрофією м’язів або порушенням обміну речовин, у суб’єкта, що потребує такого лікування, або
(ІІІ) в лікуванні захворювання, при якому в організмі суб’єкта відбувається надлишкова експресія активіну, у суб’єкта, що потребує такого лікування.
20. Застосування за будь-яким з пп. 13-19, в якому захворювання, пов'язане з атрофією м'язів або порушенням обміну речовин, вибрано з групи, що складається з м'язової дистрофії, аміотрофічного латерального склерозу, застійного обструктивного захворювання легенів, хронічної серцевої недостатності, ракової кахексії, СНІДУ, ниркової недостатності, уремії, ревматоїдного артриту, вікової саркопенії, атрофії органів, кистьового тунельного синдрому, андрогенної недостатності, опікового ушкодження, діабету і виснаження м'язів унаслідок тривалого постільного режиму, пошкодження спинного мозку, інсульту, перелому кісток, старіння або дії мікрогравітації, цукрового діабету, ожиріння, гіперглікемії, і втрати кісткової маси.
21. Застосування за будь-яким з пп. 13-19, яке відрізняється тим, що захворювання, при якому відбувається надлишкова експресія активіну є рак.
Текст
Реферат: Винахід належить до ізольованих білків розчинного рецептора активіну IIВ, які здатні сполучати рецептор активіну А, міостатин або GDF-11 та інгібувати їх активність. Винахід також належить до вектора і клітини-хазяїна, композиції, що містить ізольований білок і способу лікування UA 101609 C2 (12) UA 101609 C2 атрофії м'язів і інших захворювань і порушень, пов’язаних з рецептором активіну А, міостатину або GDF-11. UA 101609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ Пріоритетною для даної заявки є заявка США, серійний номер 61/065,474, подана 11 лютого 2008 року, і попередня заявка США, серійний номер 60/905,459, подана 6 березня 2007 року, опис яких покладений в основу і повністю включений в дану заявку посиланнями. ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ Даний винахід відноситься до білків сімейства трансформуючого фактору росту β (TGF-β) і до розчинних рецепторів TGF-β, а також до способів модуляції активності членів сімейства TGF-β для лікування різних захворювань. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Сімейство білків TGF-β включає TGF-β, активіни, білки морфогенезу кістки (BMP), фактор росту нервів (NGF), нейротрофічний чинник головного мозку (BDNF) і фактор росту/диференціювання (GDF). Вказані білки беруть участь в регуляції широкого спектру біологічних процесів, включаючи проліферацію, диференціювання і інші функції клітин. GDF-8, що також називається міостатином, є членом сімейства TGF-β, експресується головним чином клітинами зростаючої і дорослої скелетної м'язової тканини. Очевидно, міостатин грає істотну роль в негативній регуляції росту скелетної мускулатури. (McPherron et al., Nature (Лондон) 387, 83-90 (1997)). Було показано, що антагонізм міостатину приводить до збільшення сухої м'язової маси тварин. (McFerron et al., див. вище, Zimmers et al., Science 296:1486 (2002)). Інший представник сімейства TGF- β - це GDF 11. GDF 11 приблизно на 90 % ідентичний міостатину за послідовністю амінокислот. GDF 11 бере участь в розвитку осьової структури тварин. (Oh et al., Genes Dev 11:1812-26 (1997)), а також грає роль в розвитку і зростанні скелетної мускулатури. Активіни А, В, AB є гомо- і гетеродімери відповідно, двох поліпептидних ланцюгів, ВА і ВВ (Vale et al. Nature 321, 776-779 (1986), Ling et al., Nature 321, 779-782 (1986)). Активіни вперше були виявлені як пептиди гонад, що беруть участь в регуляції синтезу фолікулостимулюючого гормону (ФСГ). У даний час вважають, що вони беруть участь в регуляції ряду біологічних процесів. Актовін А є переважною формою активіну. Активін, міостатин, GDF 11, і інші члени надсімейства TGF сполучаються і з рецепторами активіну типу II і типу ІЕВ, кожен з яких є трансмембраним серином, треоніновою кіназою забезпечуючою передачу сигналу (Harrison et al., J. Biol. Chem. 279,28036-28044 (2004)). Дослідження поперечного скріплення показало, що міостатин здатний сполучати рецептори активіну типу II ActRIIA і ActRIIB in vitro (Lee et al., PNAS USA 98:9306-11 (2001)). Також існують свідоцтва того, що GDF 11 сполучає як ActRIIA, так і ActRIIB (Oh et al., Genes Dev 16:2749-54 (2002)). Відомо, що експресія білка TGF-β пов'язана з різноманітними захворюваннями і розладами. Відповідно, терапевтичні молекули, що мають активність агоністів декількох білків TGF-β одночасно можуть бути дуже ефективні при таких хворобах і розладах. Додатково, одержання лікарських засобів на основі білків може бути пов'язано з проблемами, що можливо виникають в ході експресії і очищення білка. Одна з таких проблем - агрегація білків під час експресії і очищення. Накопичення великої кількості білків в ході культивування клітин може приводити до агрегації. В процесі очищення можуть виникнути умови, додатково стимулюючі агрегацію білків. (Cromwell, M.E.M. et al., The AAPS Journal 8:E572-E579, 2006). Можна спробувати ослабити фактор, який викликає агрегацію, однак, існує потреба в білках із зниженою схильністю до утворення агрегатів. Даний винахід задовольняє потребу в терапевтичних молекулах, які сполучаються з численними лігандами, і мають знижену схильність до агрегації, і, таким чином, покращують технологічність, що забезпечує ефективне виробництво білків, корисних для лікування патологічних станів, пов'язаних з TGF-β. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Згідно даного винаходу запропонований ізольований (виділений) білок, що містить модифікований поліпептид рецептора ІЕВ активіну людини (що позначається vActRIIB). У цьому документі термін поліпептид vActRIIB відноситься до поліпептидів vActRIIB людини і поліпептидів vActRIIB5 людини. Згідно одного варіанту реалізації винаходу, білок містить поліпептид з послідовністю амінокислот SEQ ED NO:2 або 18, в якій амінокислоти в будь-якому положенні Е28 або R40, або в обох положеннях Е28 і R40 замінені на іншу ненативну (тобто, що не міститься в нативному білку в даному положенні) амінокислоту, при цьому вказаний поліпептид може скріплювати міостатин, активіну А або GDF-11. Згідно одного варіанту реалізації винаходу, білок містить поліпептид з послідовністю амінокислот SEQ ID NO:2 або 18, в якій амінокислоти в положеннях Е28 або R40, або в обох положеннях Е28 і R40 замінені на іншу ненативну амінокислоту, при цьому сигнальний пептид видалений, і вказаний поліпептид може скріплювати міостатин, активіну А або GDF-11. Згідно одного варіанту реалізації винаходу, білок містить поліпептид з послідовністю амінокислот SEQ ID NO:2 або 18, в якій амінокислоти в положеннях Е28 або R40, або в обох положеннях Е28 і R40 замінені на іншу ненативну амінокислоту, при цьому сигнальна послідовність видалена і N-кінець зрілого поліпептиду укорочений, причому вказаний поліпептид може скріплювати міостатин, активіну А або GDF-11. Згідно одного варіанту реалізації винаходу, в N-кінцевому зрілому укороченому поліпептиді vActRIIB відсутні чотири N-кінцеві амінокислоти або шість N-кінцевих амінокислот зрілої послідовності, при цьому вказаний поліпептид може скріплювати міостатин, активіну А або GDF-11. Згідно одного варіанту реалізації винаходу, замінник в положенні Е28 вибраний з групи, включаючої W, Y і А. Згідно додаткового варіанту реалізації, замінник в положенні Е28 вибраний з групи амінокислот, що включає A, F, Q, V, І, L, М, K, Н, W і Y. Згідно додаткового варіанту реалізації, замінник в положенні R40 вибраний з групи амінокислот, що включає G, Q, Μ, Η, Κ і N. Згідно додаткового варіанту реалізації, замінник в положенні Е28 вибраний з групи амінокислот, що включає A, F, Q, V, І, L, М, K, Н, W і Y, і замінник в положенні R40 вибраний з групи амінокислот, що включає A, G, Q, Μ, Η, Κ і N. Згідно 1 UA 101609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 додаткового варіанту реалізації, поліпептид також містить гетерологічний білок. Згідно одного варіанту реалізації винаходу, гетерологічним білком є Fc-домен. Згідно додаткового варіанту реалізації, Fc-домен є Fc-домен IGG людини. Згідно одного варіанту реалізації винаходу, білок містить поліпептиди з послідовністю амінокислот, що представлена SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 і 97. Згідно ще одного варіанту винаходу, білок містить поліпептид, що кодується полінуклеотидом, який має послідовність, що представлена SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, 96 або комплементарну їй послідовність. У іншому аспекті, даний винахід забезпечує ізольовану молекулу нуклеїнової кислоти, що містить полінуклеотид, що кодує поліпептид vActRIIB. Згідно одного варіанту реалізації винаходу, молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид з послідовністю нуклеїнової кислоти, що представлена в SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 69, 71, 92, 94, 96 або комплементарну їй послідовність. Згідно ще одного варіанту винаходу, молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що кодує поліпептид з послідовністю амінокислот, що представлена в групу, яка складається з SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95, і 97. Згідно додаткового варіанту реалізації, молекула нуклеїнової кислоти також містить послідовність регуляції транскрипції або трансляції. У іншому аспекті запропонований рекомбінантний вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти vActRIIB. У іншому аспекті запропоновані клітинигосподарі, що містять рекомбінантні вектори, а також запропоновані способи одержання поліпептидів vActRIIB. У даному винаході також запропонована композиція, що містить щонайменше один поліпептид або білок vActRIIB згідно даного винаходу. Згідно одного варіанту реалізації винаходу, композиція є фармацевтичною композицією, що містить поліпептид або білок vActRIIB в суміші з фармацевтично прийнятним носієм. У іншому аспекті даного винаходу запропонований спосіб лікування або запобігання захворюванню, пов'язаного з атрофією м'язів (м'язовою слабкістю), у суб'єкта, страждаючого від такого порушення, шляхом введення суб'єктові терапевтичної композиції, що містить поліпептид або білок vActRIIB. Атрофія включає або є слідством, окрім іншого, наступних станів: ракової кахексії, м'язової дистрофії, бічного аміотрофічного склерозу, застійного обструктивного захворювання легенів, хронічної серцевої недостатності, хімічної кахексії, кахексії в результаті ВІЧ/СНІД, ниркової недостатності, уремії, ревматоїдного артриту, вікової саркопенії, вікової крихкості, атрофії органів, кісткового тунельного синдрому, андрогенної недостатності і атрофії м'язів унаслідок знерухомленості через тривалий постільний режим, пошкодження спинного мозку, інсульту, перелому кісток і старості. Атрофія м'язів може також виникати в результаті невагомості, обумовленої космічним польотом, стійкості до інсуліну, атрофії м'язів унаслідок опіків, андрогенної недостатності і інших захворювань. У іншому аспекті даного винаходу запропонований спосіб лікування захворювання, пов'язаного з експресією активіну А. Згідно одного варіанту реалізації винаходу, таким захворюванням є рак. У ще одному аспекті даного винаходу запропонований спосіб лікування порушення обміну речовин, що включає введення терапевтичної композиції суб'єктові, що потребує такого лікування, при цьому порушення обміну речовин вибирають з остеопорозу, діабету, ожиріння, порушення механізму засвоєння глюкози, гіперглікемії, андрогенної недостатності і метаболічного синдрому. У іншому аспекті даного винаходу запропоновано застосування терапевтичної композиції у виготовленні лікарського препарату для лікування вказаних захворювань. У ще одному аспекті даного винаходу запропонований спосіб генної терапії, що включає введення вектора суб'єктові, що потребує цього, що кодує поліпептид або білок vActRIIB згідно даного винаходу, при цьому вектор має здатність до експресії поліпептиду або білка vActRIIB в організмі суб'єкта. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР Фіг. 1. На фіг. 1 показана послідовність амінокислот розчинний ActRIIB-IgGIFc людини дикого типу (SEQ ID NO:98). Послідовність сигнального пептиду виділена жирним шрифтом, за нею слідує позаклітинний домен зрілого ACTRIIB, і курсивом позначений Fc IgGl людини, зокрема, неповна шарнірна область. Амінокислоти Е28 і R40 підкреслені. Послідовність лінкерів GGGGS (SEQ ID NO:75) виділена курсивом і підкреслена. Фіг. 2. Ηа фіг. 2 показана послідовність амінокислот розчинний ActRIIB 5-IgGIFc людини (SEQ ID NO:99). Послідовність сигнального пептиду виділена жирним шрифтом, за нею слідує розчинний домен зрілого ActRIIB5 і Fc IgGl людини, що включає неповну шарнірну область, виділений курсивом. Е28 і R40 підкреслені. Послідовність лінкерів (GGGGS) (SEQ ID NO:75) виділена курсивом і підкреслена. Фіг. 3. На фіг. 3 показаний вплив обробки розчинним vActRIIB-Fc E28W на масу яєчок (Фіг. 3А) і яєчників (Фіг. 3В) у мишей з нокаутом за інгібіном-. Фіг. 4. На фіг. 4 показаний вплив обробки розчинним vActRIIB-Fc E28W на коефіцієнт виживання у самців (фіг. 4А) і самок (фіг. 4В) мишей з нокаутом за інгібіном-. Фіг. 5. На фіг. 5 показаний вплив обробки розчинним vActRIIB-Fc E28W на масу тіла у мишей з пухлиною 26 товстої кишки. Фіг. 6. На фіг. показаний вплив обробки розчинним vActRIIB-Fc E28W на виживання мишей з пухлиною 26 товстої кишки. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ 2 UA 101609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Запропоновані білки, що включають різні поліпептиди рецептора активіну ІІВ людини (vActRIIB). Дані білки і поліпептиди відрізняються своєю здатністю сполучатися принаймні з одним з трьох TGF- білків: міостатином (GDF-8), активіном А і GDF-11, і інгібувати активність цих білків. Дані білки і поліпептиди також демонструють тенденцію до агрегації, понижену в порівнянні з поліпептидами без модифікацій згідно даного винаходу. Модифікації полягають в заміні амінокислот в положеннях 28, 40, або і 28 і 40 відносно ActRIIB дикого типу номер NP_001097 (SEQ ID NO:47) і позаклітинного домена ActRIIB (SEQ ID NO:18) або ActRIIB5 (SEQ ID NO:2). У даній заявці термін "члени сімейства TGF-" або "білки TGF-" відноситься до структурно схожих факторів росту сімейства трансформуючих факторів росту, включаючого активіни і білкові фактор росту і диференціювання (GDF) (Kingsley et al. Genes Dev. 8: 133-146 (1994), McPherron et al. Growth factors and cytokines in health and disease, Vol. IB, D. LeRoith and C.Bondy. ed., JAI Press Inc., Greenwich, Conn, USA: pp 357-393). GDF-8, що також називається міостатином, є негативним регулятором тканини скелетних м'язів (McPherron et al. PNAS USA 94:12457-12461 (1997)). Міостатин синтезується у формі неактивного білкового комплексу завдовжки приблизно 375 амінокислот, що має номер в Генбанку ААВ86694 (SEQ NO:49) для людини. Білок-попередник активується в результаті протеолітичного розщеплювання в чотирьохосновному сайті процесингу, з утворенням N-кінцевого неактивного продомену і С-кінцевого білка приблизно з 109 амінокислот, який дімеризуєтся з утворенням гомодімеру масою приблизно 25 Кда. Цей гомодімер є зрілим, біологічно активним білком (Zimmers et al., Science 296, 1486 (2002)). У даній заявці термін "продомен" або "пропептид" відноситься до неактивного N-кінцевого білка, який відщеплюється з вивільненням активного С-кінцевого білка. У даній заявці термін "міостатин" або "зрілий міостатин" відноситься до зрілого, біологічно активного С-кінцевого поліпептиду у виглядімономеру, димеру або іншій формі, а також до біологічно активних фрагментів або споріднених поліпептидів, включаючи алельні варіанти, варіанти сплайсингу, рекомбінантні білки і поліпептиди. Як повідомлялося, зрілий міостатин має 100 %-ву ідентичну послідовность у багатьох видів, включаючи людину, мишу, курку, свиню, індичку і щура (Lee et al., PNAS 98, 9306 (2001)). У даній заявці термін GDF-11 відноситься до BMP (морфогенетичний білок кістки), що має номер в базі Swissprot 095390 (SEQ ID NO:50), так само як варіантам і гомологам різновидів цього білка. GDF-11 приблизно на 90 % ідентичний міостатину на рівні амінокислотної послідовності. GDF-11 залучений в регуляцію формування передньо-задньої осьової будови скелета (McPherron et al., Nature Genet. 22 (93): 260-264 (1999); Gamer et al., Dev. Biol. 208 (1), 222232 (1999)), але постнатальні функції його невідомі. Активін А є гомодімером ланцюгів поліпептиду ВА. У даній заявці термін "активін" відноситься до білка активіну, що має номер в GenBank: NM 002192 (SEQ ID NO:48), а також до варіантів і гомологів даного білка у інших видів. Рецептори активіну У даній заявці термін рецептори активіну типу II В (ActRIIB) відноситься до рецепторів активіну людини, що мають номер NP_001097 (SEQ ID NO:47). Термін "розчинний ActRIIB" відноситься до позаклітинної області ActRIIB (SEQ ID NO:18), ActRIIB5 (SEQ ID NO:2), а також до цих послідовностей, в яких аргінін в положенні 64 замінений на аланін. Модифіковані розчинні поліпептиди ActRIIB. Даний винахід забезпечує ізольовані білки, що містять модифіковані поліпептиди рецептора ActRIIB людини (в даній заявці називаються поліпептидами vActRIIB, або модифікованими поліпептидами). У даній заявці термін "vActRIIB білок" відноситься до білка, що містить поліпептид vActRIIB. У даній заявці термін "ізольований" відноситься до молекули білка або поліпептиду, до деякої міри очищеня від ендогенного матеріалу. Ці поліпептиди і білки характеризуються здатністю сполучати і інгібувати активність активіну А, міостатину або GDF-Il. У деяких варіантах афінність сполучення різних поліпептидів з активіном А, міостатином або GDF-11 покращена в порівнянні з поліпептидами дикого типу. У одному з варіантів поліпептид vActRIIB має послідовність амінокислот SEQ ID NO:2 або 18, в якій амінокислоти в будь-якому з положень Е28 або R40, або в обох положеннях Е28 і R40 замінені на іншу ненативну амінокислоту, і при цьому поліпептид може скріплювати міостатин, активін А або GDF-11. У іншому варіанті поліпептидами vActRIIB є зрілі варіанти або укорочені зрілі варіанти цих послідовностей. У даній заявці термін, "зрілий поліпептид vActRIIB " відноситься до поліпептиду з видаленою сигнальною послідовністю. У одному варіанті зрілі послідовності є, наприклад, амінокислотами 19-160 з SEQ ID: 2, і амінокислоти 19-134 з SEQ ID: 18, причому одна або обидві амінокислоти в положеннях 28 і 40 замінені на іншу ненативну амінокислоту, і поліпептиди зберігають здатність сполучатися з активіном А, міостатином або GDF-11. У даній заявці термін укорочений зрілий поліпептид vActRIIB відноситься до поліпептиду з видаленою сигнальною послідовністю і, крім того, амінокислотами N-кінцевої частини зрілого поліпептиду. У одному варіанті видалені 4№кінцеві амінокислоти або 6 N-кінцевих амінокислот зрілого поліпептиду. У цьому варіанті укорочені зрілі послідовності є, наприклад, амінокислотами 23-160 з SEQ ID NO:2, або амінокислоти 25-160 з SEQ ID NO:2; і амінокислоти 23-134 з SEQ ID NO:18, або амінокислоти 25-134 з SEQ ID NO:23-134 з: 18, або SEQ ID амінокислоти 25-134 з SEQ ID:18 причому одна або обидві амінокислоти в положеннях 28 і 40 замінені амінокислотами нехарактерними для дикого типу, які зберігають здатність сполучатися з активіном А, міостатином або GDF-11. У даній заявці, термін "положення 28" і "положення 40" (тобто, Е28 і R40) відноситься до положення амінокислоти в послідовностях SEQ ID NO:2 і 18, які включають сигнальну послідовність з 18 амінокислот. Для одноманітності, якщо зрілі поліпептиди vActRIIB містять заміни в положенні 10 і/або положенні 22, або укорочені зрілі поліпептиди містять заміни в положенні 6 і/або положенні 18, або заміни в положеннях 4 і/або положенні 16 зрілих або укорочених зрілих послідовностей, ці варіанти будуть все ще вказані щодо повнорозмірних SEQ ID NO:2 і 18, або як 3 UA 101609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 показано на фігурах 1 або 2, тобто, як заміни амінокислоти в положенні Е28 і/або R40. Такі зрілі варіанти або укорочені N-кінцеві варіанти описані нижче. У одному варіанті, замінник в положенні Е28 вибраний з групи амінокислот, що складається з W, Υ і А. У одному варіанті замінник в положенні 28 є W. У іншому варіанті замінник в положенні 28 вибраний з групи амінокислот, що складається з A, F, Q, V, І, L, Μ, Κ, Η, W і Υ. У подальшому варіанті замінникв положенні 40 вибраний з групи амінокислот, що складаються з G, Q, Μ, Η, Κ і N. У подальшому варіанті замінник в положенні 28 вибраний з групи амінокислот, що складаються з A, F, Q, V, І, L, М, K, Н, W і Υ, і замінник в положенні 40 вибраний з групи амінокислот, що складається з A, G, Q, М, Η, Κ, і N. У одному варіанті білок включає поліпептиди, що мають послідовність амінокислот з групи, що складається з SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30,32, 34, 36, 38, 40,42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95, і 97. У іншому варіанті білок включає поліпептид, кодуючий полінуклеотид, що має послідовність, представлену в групі, що складається з SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, 96 або послідовність, комплементарна вказаній. У одному варіанті реалізації в поліпептиді vActRIIB видалені сигнальні послідовності, і в результаті виходить зрілий модифікований поліпептид. Для одержання поліпептидів, готових до застосування, можна використовувати різні сигнальні пептиди. Сигнальний пептид може мати послідовність, показану на фігурах 1 і 2 (SEQ ID NO:73) або альтернативні сигнальні послідовності, такі як SEQ ID NO:74, сигнальна послідовність SEQ ID NO:2 і 18. Можна використовувати будь-які інші сигнальні пептиди, корисні для експресії vActRIIB або vActRIIB5. У іншому варіанті реалізації vActRIIB поліпептидів, що мають послідовності, які по суті подібні SEQ ID NO:2 і 18. У даній заявці термін "по суті подібний" відноситься до поліпептидів, що мають щонайменше приблизно 80 %-у ідентичність, щонайменше приблизно 85 %-у ідентичність, щонайменше приблизно 90 %-у ідентичність, щонайменше приблизно 95 %-у ідентичність, по меншій мірі приблизно 98 %-у ідентичність, або щонайменше приблизно 99 %-у ідентичність щодо послідовності амінокислот, що представлена SEQ ID NO:2 і 18, в яких одну або обидві амінокислоти в положеннях 28 і/або 40 замінені на амінокислоти, не характерні для дикого типу, причому поліпептид зберігає активність поліпептиду SEQ ID NO:2 і 18, яка є здатністю сполучати і інгібірувати міостатин, активін А або GDF-11. Крім того, термін поліпептид vActRIIB включає фрагменти SEQ ID NO:2 або 18, такі як укорочені по N- і С-кінцеві варіанти, що містять заміни в положенні 28 і/або 40, описані тут, причому, поліпептид має здатність до скріплення і інгібування міостатину, активіну А або GDF-11. У даній заявці термін "похідна" поліпептидів vActRIIB і vActRIIB5 відноситься до приєднання щонайменше одного додаткового хімічного угрупування, або принаймні одного додаткового поліпептиду з утворенням ковалентного кон'югату або агрегату, такого як глікозильні групи, ліпіди, ацетилові групи, або поліпептиди, що приєднуються на С-кінці або N-кінці (поліпептиди злиття), кон'югати з молекулами ПЕГ, і інші модифікації, які описані більш повно нижче. Різні поліпептиди рецептора ACTRIIB (vActRIIB) можуть також включати додаткові модифікації і похідні, включаючи модифікації С- і N-кінців, які є результатом процесингу в ході експресії в різних типах клітин, таких як клітини ссавців, Е. соlі, дріжджі і інші рекомбінантні клітини-господарі. Далі, передбачені фрагменти поліпептиду vActRIIB і поліпептиди, що містять інактивовану ділянку(ки) N-глікозилювання, інактивовану ділянку(ки) протеази, або консервативну заміну(и) амінокислот, в послідовностях поліпептиду, представлених в SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95, і 97. У даній заявці, термін "активність поліпептиду vActRIIB або vActRIIB5 або "біологічна активність розчинного поліпептиду ActRIIB або ActRIIB5" відноситься до одного або більше виду активності поліпептидів vActRIIB і vActRIIB5 in vitro або in vivo, включаючи, але не обмежуючись приведеними в Прикладах нижче. Види активності поліпептидів vActRIIB включають, але не обмежені перерахованими: здатність сполучатися з міостатином, або активіном A, GDF-11, і здатність знижувати або нейтралізувати активність міостатину, активіну А або GDF-11. У даній заявці термін "здатний до сполучення" (що має здатність до сполучення) з міостатином, активіном, або GDF-11, відноситься до сполучення, що вимірюється відомими в даній області способами, такими як спосіб Віасоrе, описаний в Прикладі 2 нижче. Крім того, в Прикладі 2, тест-систему на основі клітин pMARE C2C12 використовують для вимірювання активності нейтралізації активіну, активності нейтралізації міостатину і активності нейтралізації GDF-11. Види активності in vivo включають, але не обмежені збільшенням маси тіла, збільшенням сухої (без жиру) маси м'язів, збільшенням маси скелетних м'язів, зменшенням загальної маси, продемонстровані в моделях з використанням тварин нижче, і відомі в даній області. Види біологічної активності далі включають скорочення або запобігання кахексії, викликаної певними типами пухлин, запобігання зростанню певних типів пухлин, і збільшення виживання в певних моделях на тваринах. Подальше обговорення vActRIIB дій поліпептиду приведене нижче. Поліпептиди згідно даного винаходу далі включають гетерологічні поліпептиди, приєднані до поліпептиду vActRIIB безпосередньо або через лінкерну послідовність з утворенням гібридного (рекомбінантного, злитого) білка. У даній заявці термін "рекомбінантний білок" відноситься до білка і гетерологічного поліпептиду, сполученими способами рекомбінантних ДНК. Гетерологічні поліпептиди включають, але не обмежені поліпептидами Fc, гістидіновими мітками, і лейциновими "блискавками", стимулюючими олігомеризацію і стабілізацію різних поліпептидів ActRIIB як описано, наприклад, в WO 00/29581, яка включена в дану заявку за допомогою посилання. У одному варіанті реалізації, гетерологічним поліпептидом є поліпептид Fc або Fc-домен. У одному варіанті Fc-домен вибраний з Fcдоменів IgGl, IgG2 і IgG4 людини. Вони приведені в SEQ ID NO:80, 82 і 84. vActRIIB може далі включати 4 UA 101609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 шарнірні послідовності IgGl, IgG2, і IgG4 (повністю або частиною), прилеглі до відповідного Fc-домену IGG. Повні шарнірні послідовності для IgGl, IgG2, і IgG4, представлені в SEQ ID NO:76, 77, і 78 відповідно. Поліпептид vActRIIB може можливо додатково включити лінкерну послідовність. Лінкери насамперед виконують функцію спейсерів між поліпептидом і другим гетерологічним поліпептидом, або іншим приєднаним елементом, або між двома або більш модифікованими поліпептидами ActRIIB. У одному варіанті реалізації лінкер складається з амінокислот, сполучених пептидними зв'язками, переважно з 1-20 амінокислот, причому амінокислоти вибрані з 20 природних амінокислот. Одна або більше з цих амінокислот може бути глікозильована в тому сенсі, як це розуміють фахівці в даній області. У одному варіанті реалізації, від 1 до 20 вибрані з гліцину, аланіну, проліну, аспаргіну, глутаміну і лізину. Переважно, лінкер складається з амінокислот, які не містять груп, що створюють просторові утруднення, таких як гліцин і аланін. Типові лінкери є полігліцинами, наприклад (GIy)5, (GIy)8, poly(Gly-Ala), і поліаланінами. Один особливо відповідний лінкер показаний в розділі Приклади нижче - (Gly)4Ser (номер послідовності - 75). У іншому варіанті реалізації vActRIIB може містити шарнірний лінкер, тобто лінкер сусідній з шарнірною областю (див. послідовність номер 79). Лінкери також можуть бути непептидними лінкерами. Наприклад, алкільні лінкери такі як -NH-(CH2)SC(O)-, де s=2-20. Ці алкільні лінкери можуть додатково містити як замінники групи, що не створюють просторових перешкод, такі як нижчий алкіл (наприклад, Q-Cδ), нижчий ацил, галоген (наприклад, СІ, Br), CN, NH2, феніл. У одному варіанті реалізації поліпептиди vActRIIB пов'язані з поліпептидом Fc прямо або через лінкер або через шарнірний лінкер. У іншому варіанті реалізації, Fc представляє собою Fc область імуноглобуліну людини. vActRIIB, приєднані до Fc, включають, наприклад, vActRIIB-IgGIFc, E28A (SEQ ID NO:60); vActRIIB-IgGIFc, E28W (SEQ ID NO:62), vActRIIB-IgGIFc, E28Y (SEQ ID NO:64), vActRIIB-IgG Fc, R40G (SEQ ID NO:66), vActRIIB5-IgGlFc, E28A (SEQ ID NO:70), and vActRIIB5-IgGlFc E28W (SEQ ID NO:72), як показано в Таблицях 1-2 і описано в приведених в даній заявці прикладах. Інші варіанти реалізації включають vActRIIB-IgG2 Fc, E28W (SEQ ID NO:91), vActRIIB-IgG2 Fc, E28Y (SEQ ID NO:93) і vActRIIB-IgG2 Fc (SEQ ID NO:95). Було показано, що ці варіанти (модифікації) демонструють знижену агрегацію в порівнянні з ActRIIB-IgG2 IgG2 дикого типу, як показано в прикладах нижче. Поліпептиди vActRIIB, розкриті в даній заявці, можуть також бути приєднані до непептидної молекули, що додає їм бажані властивості, таке знижене руйнування і/або збільшений період "напівжиття", понижена токсичність, знижена іммунногенність і/або підвищена біологічна активність поліпептиду ActRIIB. Приклади такі молекули включають, але не обмежені, лінійними полімерами, такими як поліетилен-гліколь (PEG), полілизін, декстран, ліпід, холестерольна група (як наприклад, стероїд), вуглевод або олігосахарид. У іншому аспекті, даний винахід забезпечує ізольовані нуклеїнові кислоти, включаючи полінуклеотиди, що кодує поліпептиди vActRIIB згідно даного винаходу. Термін "ізольовані" відноситься до молекул, певною мірою очищених від ендогенного матеріалу. У одному прикладі, нуклеїнова кислота даного винаходу містить полінуклеотид, що кодує поліпептид та має послідовність SEQ ID NO:4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95, і 97. Зважаючи на виродженість генетичних кодів, що полягає в тому, що в деяких випадках одну амінокислоту кодують більш,ніж один кодон, послідовність ДНК може відрізнятися від представленої в SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, і 96 або в комплементарній нитці ДНК SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, і 96, і проте кодувати поліпептид з послідовністю SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95, і 97. Ці варіантні послідовності можуть виникати в результаті мутацій, що "мовчать", в процесі реплікації або можуть бути продуктом направленого мутагенезу цих послідовностей. У іншому прикладі, молекула нуклеїнової кислоти даного винаходу включає полінуклеотид, що має послідовність, представлену в SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, і 96 і комплементарних послідовностях SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 і 96. У іншому варіанті реалізації, даний винахід забезпечує нуклеїнові кислоти, які гібридизуються в тяжких умовах або умовах середньої жорсткості з послідовністю, представленою в SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 або 96, або комплементарною послідовністю SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39,41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, і 96, і що кодують поліпептид, що має послідовність амінокислот SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 і 97, і де кодований поліпептид зберігає активність поліпептиду vActRIIB. Молекули нуклеїнової кислоти згідно даного винаходу ДНК в одноланцюговій і дволанцюжковій формі, а також РНК. ДНК включає, наприклад кДНК, ДНК геному, синтетичну ДНК, ДНК, ампліфікованну способом ПЦР, і їх комбінації. ДНК генома може бути виділена звичайними способами, наприклад з використанням ДНК послідовностей 1 і 17 або їх відповідний фрагмент як зонд. ДНК генома, що кодує поліпептиди ActRIIB, одержують з бібліотек геномів, які існують для більшості видів. Синтетична ДНК може бути одержана шляхом хімічного синтезу олігонуклеотидних фрагментів, що перекриваються, з подальшою збіркою, в результаті якої відбувається відновлення частини або всіх кодуючих областей і фланкуючих послідовностей. РНК може бути одержана з прокаріотичного вектора експресії, який забезпечує синтез мРНК у великій кількості, наприклад вектора, що містить промотор Т7 і полімеразу РНК. кДНК одержують з бібліотек, приготованих з мРНК з різних тканин, продукуючих ActRIIB. Молекула ДНК цього винаходу включає гени з повною послідовністю, а також 5 UA 101609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 полінуклеотиди і їх фрагменти. Повнорозмірний ген може також включати послідовності, що кодують Nкінцеву послідовність. У іншому аспекті даного винаходу додатково запропоновані вектори експресії, що містять послідовності нуклеїнових кислот, а також клітини, трансформовані такими векторами, і способи одержання поліпептидів vActRIIB. Термін вектор експресії відноситься до плазміди, фагу, вірусу або вектору, експресуючому поліпептид з послідовності полінуклеотиду. Вектор експресії містить одиницю транскрипції, що включає набір: 1). Генетичний елемент або елементи, що грають роль регулятора експресії гена, наприклад промотори або енхансери. 2). Послідовність, що кодує поліпептиди vActRIIB, яка транскрибується в мРНК і транслюється в білок. 3). Відповідні послідовності для ініціації і термінує транскрипції. Ці послідовності можуть також включати маркер селекції. Вектори для використання в клітинах легко доступні, і молекули нуклеїнових кислот вбудовують у вектори, використовуючи стандартні технології рекомбінантної ДНК. Такі вектори можуть включати промотори для функціонування в конкретних тканинах, а вірусні вектори призначені для експресії vActRIIB до певних клітин тварин або людини. Прикладом вектора, відповідного для експресії vActRIIB, є pDSRa (описаний в WO 90/14363, див. див. список літератури) і його похідні, що містять полінуклеотиди vActRIIB, а також інші відомі відповідні вектори, описані нижче. Далі в даній заявці запропоновані способи одержання поліпептидів vActRIIB. Можна використовувати різноманітні системи експресії/господарі можуть бути використані. Такі системи включають мікроорганізми, такі як бактерії, трансформовані рекомбінантним бактеріофагом, плазмідні або космідні ДНК-вектор експресії, клітини комах, інфіковані вірусною системою експресії, наприклад, бакуловірусом, клітини рослин, трансфіковані вірусними векторами (наприклад, вірусами мозаїки кольорової капусти, тютюну, TMV) або трансформовані бактерійними векторами (наприклад, плазмідами Ті або pBR322), або системи на основі клітин тварин. Клітини тварин, використовувані для рекомбінантної продукції білків, включають, наприклад, клітини VERO, HeLa, CHO і їх похідні, такі як Veggie CHO і споріднені лінії клітин, що вирощуються в безсироватковому середовищі (Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31) або лінія CHO - DX-Bl 1, яка не має DHFR (Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20), клітини COS такі як COS-7 (ATCC CRL 1651) (see Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), W138, BHK, HepG2, 3T3 (ATCC CCL 163), RIN, MDCK, A549, PC12, K562, клітини L, клітини C127, клітини BHK (ATCC CRL 10), клітини Vl/EBNA отримані з клітинної лінії CVl (ATCC CCL 70) (McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821), клітини нирки ембріонів людини 293, 293 EBNA або MSR 293, клітини епідермісу людини А431, клітини Соlо205, інші трансформовані клітини приматів, звичайні диплоїдні клітини, клітини in vitro культури первинних тканин, первинні експланти, HL-60, U937, клітини HAK або Jurkat. Експресія в клітинах ссавців дозволяє одержувати поліпептиди, що секретуються або розчиняються, які можна збирати з середовища, в якому вирощували клітини. Використовуючи відповідну комбінацію вектора і системи-реципієнта, поліпептиди vActRIIB одержували рекомбінантним способом: шляхом культивування у відповідних умовах клітин, трансформованих вектором експресії, що містить послідовності нуклеїнових кислот згідно даного винаходу. Трансформовані клітини можна використовувати для продукування поліпептидів протягом тривалого часу і з великим виходом. Після того, як клітини трансформують векторами, що містять маркери селекції і потрібну касету експресії, клітини можна вирощувати 1-2 дні в збагаченому середовищі, після чого можна перенести на звичайне середовище. Маркер селекції забезпечує ріст і виділення клітин, які експресують вбудовані послідовності. Стійкі групи стабільно трансформованих клітин можуть бути розмножені з використанням способів культивування тканин, відповідних для використовуваної клітинної лінії. Огляд експресії рекомбінантних білків можна знайти в Methods of Enzymology, ν. 185, Goeddell, D. V., ed., Academic Press (1990). В деяких випадках, таких як експресія в прокаріотних системах, для забезпечення біологічної активності може бути необхідний "рефолдінг" окислення експресуючих поліпептидів згідно даного винаходу до утворення правильної третинної структури і дисульфідних зв'язків. Рефолдінг можна здійснити з використанням різних відомих способів. Такі методи включають, наприклад, приміщення солюбілізованого поліпептиду в умови з pH > 7 у присутності хаотропного агента. Вибір такого агента аналогічний вибору агента для нерозчинних гранул, але хаотропний агент зазвичай використовують в нижчій концентрації. Приклади таких речовин включають гуанідин і сечовину. В більшості випадків, розчини для рефолдінгу/окислення включають поновлюючий агент і його окислену форму в певному співвідношенні, що забезпечує редокс-потенціал, що допускає дисульфідні переходи, які необхідні для утворення цистеїнових містків. Найбільш часто використовувані редокс-парі включають цистеїн - цистамін, глутатіон - дитіобіо-GSH, хлорид міді, ДТТ - дитіан-ДТТ, 2-меркаптоетанол - дитіо2-меркаптоетанол. У багатьох випадках, можна використовувати ко-розчинник для збільшення активності згортання. Часто використовувані ко-розчинники включають гліцерин, ПЕГ різної молекулярної ваги і аргінін. Крім того, поліпептиди можуть бути синтезовані в розчині або на твердій поверхні з використанням відповідних способів. Різні автоматичні синтезатори доступні комерційно і можуть бути використані відповідно до протоколів, що ухвалили. Див. також Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d.Ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tarn et al., J Am Chem Soc, 105:6442 (1983); Merrifield, Science 232:341-347 (1986); Barany and Merrifield, The Peptides. Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284; Barany et al., Int J Pep Protein Res, 30:705-739(1987). 6 UA 101609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Поліпептиди і білки даного винаходу можуть бути очищені відповідно до прийнятих способів очищення білків, відомих в даній області. Приклади таких методик включають, наприклад, фракціонування неочищеного матеріалу на білкові і небілкові фактори. Після відділення поліпептидів від інших білків, цільові пептиди або поліпептиди можна далі очищати з використанням хроматографічних і електрофоретичних методів до досягнення часткового або повного очищення. Термін "ізольовані (виділені) поліпептиди" або "очищені поліпептиди" відноситься до компоненту, відокремленого від інших компонентів, в тих випадках, коли поліпептид очищений до ступеня, в порівнянні з його природним станом. Відповідно, "Очищений поліпептид" також відноситися до поліпептиду, вільного від природного оточення. Зазвичай термін "очищений" відноситься до поліпептидного компоненту, який був фракціонований, з видаленням інших компонентів, який зберігає свою біологічну активність. У даній заявці термін "по суті очищений" відноситься до пептиду або поліпептиду, що становить основний компонент композиції, наприклад, приблизно 50 %, приблизно 60 %, приблизно 70 %, приблизно 80 %, приблизно 85 % або приблизно 90 % і більш за білки даної композиції. Фахівцям в даній області відомі численні методики, відповідні для використання в очищенні. Наприклад, осадження за допомогою сульфату амонію, ПЕГ, антитіл (імунопреципітація) і.т.п. або теплова денатурація з подальшим центрифугуванням, хроматографія (така як, аффінна хроматографія (колонки з білком А), іонообмінна хроматографія, гель-фільтрація, обернено-фазова, хроматографія на гідроксилапатиті, хроматографія гідрофобних взаємодій), ізоелектричне фокусування, електрофорез і комбінація цих способів. Як відомо, порядок проведення різних етапів очищення може бути змінений, певні етапи можуть бути опущені, з тим же результатом значно очищеного білка. Приклади етапів очищення приведені нижче в розділі Приклади. Фахівцям в даній області відомі різні методи оцінки ступеня очищення поліпептиду, які можна використовувати в контексті даного винаходу. Вони включають, наприклад, визначення активності специфічного сполучення активної фракції, або визначення кількості пептиду або поліпептиду у фракції способом електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (SDS-PAGE). Переважним способом оцінки чистоти фракції поліпептиду є розрахунок активності сполучення фракції і порівняння цієї активності з активністю початкового екстракту, що дозволяє розрахувати ступінь очищення, яку в даній заявці визначають як" - кратну очищення". Одиниці, використовувані для виразу кількості активності сполучення (зв'язуючій активності) на практиці, будуть, звичайно, залежати від конкретного способу, вибраного для оцінки ступеня очищення і від того чи показують поліпептид(и) визначувану активність сполучення чи ні. Модифіковані поліпептиди активіну типу ІІВ зв'язуються з лігандами, які активують каскади деградації м'язів. Поліпептиди vActRIIB, здатні до сполучення і інгібування лігандів активіну А, міостатину і/або GDF11, мають терапевтичний потенціал для лікування захворювань, що включають атрофію м'язів, а також певні види раку і.т.д., як показано нижче в розділі Приклади. Проте, агрегація може відбуватися в процесі експресії або очищення поліпептидів ActRIIB або ActRIIB5 дикого типу. Ця агрегація включає утворення структур з олігомерів в процесі експресії і неструктурованих агрегатів в процесі експресії і очищення поліпептидів. Разом методи структурного аналізу, молекулярного моделювання і мас-сперометрії показали, що мультимерізація поліпептидів ActRIIB може відбуватися по механізму утворення дисульфідних зв'язків між молекулами, чому сприяють електростатичні і водневі взаємодії між неглікозильованими поліпептидами ActRIIB. Сильні водневі зв'язки існують, наприклад, між двома молекулами ActRIIB, між бічним ланцюгом Е28 одного ActRIIB і бічним ланцюгом R40 іншого поліпептиду ActRIIB. Крім того, значні електростатичні зв'язки існують між Е28 одного ActRIIB і R40 іншого ActRIIB. Ці електростатичні взаємодії можуть вносити значний внесок до збільшення популяції нестабільних димерів ActRIIB, що приводить до стимулювання утворення нековалентних або ковалентних зв'язків між молекулами ActRIIB. Взаємодія між амінокислотами 28 і 40 - найбільш важливе з цих взаємодій, оскільки ці 2 залишки беруть участь в утворенні подвійних водневих зв'язків і сильних електростатичних зв'язків. Амінокислоти 28 і 40 беруть участь у взаємодіях ActRIIB:ActRIIB, але не беруть участь у взаємодії ActRIIB і його лігандів. Таким чином, 28 і 40 можуть бути замінені на ненативні амінокислоти відповідно до даного винаходу, і це забезпечить поліпшення розчинності і зменшення агрегації поліпептидів рецепторів. Таким чином, Е28 і R40 замінюють, відповідно, іншими можливими природними амінокислотами, здійснюють експресію і тестування способом Віосоrе, як показано нижче. Сполучення, визначене в тесті Віосоrе, показане в таблицях ІА і IB, і в прикладі 2 (див. нижче). Крім того, нижче показаний відсоток агрегації поліпептидів vActRIIB. Результати в розділі Приклади демонструють агрегацію поліпептидів vActRIIB і білків із замінами амінокислот, описаними в даній заявці, і при цьому зберігають здібність до сполучення і нейтралізації міостатину, активіну А і GDF-11. Антитіла Даний винахід далі включає антитіла, які сполучають модифіковані поліпептиди ActRIIB, включаючи ті, які специфічно сполучаються з поліпептидами vActRIIB згідно даного винаходу. У даній заявці термін "специфічно сполучає" відноситься до антитіл з аффінністю сполучення (Но) для поліпептидів vActRIIB від 106 М-1 і більше. У даній заявці термін "антитіло" відноситься до цілих антитіл, включаючи поліклональні антитіла (Див., наприклад, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds), Cold Spring Harbor Press (1988)) і моноклональні антитіла (Див., наприклад патенти США №№ RE 32,011, 4,902,614, 4,543,439 і 4,411,993, а також Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Kennett, McKearn and Bechtol (eds.) (1980)). У даній заявці термін "антитіло" також відноситься до фрагмента 7 UA 101609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 антитіла, такому як F(ab), F(ab'), F(ab') 2, Fv, Fc і одноланцюговим антитілам, що одержуються за допомогою технології рекомбінатної ДНК або за допомогою ферментативного або хімічного розщеплювання початкових антитіл. Термін "антитіло" також відноситься до біспецифічних або біфункціональних антитіл, які є штучними гібридними антитілами, що містять дві різні пари важких/легких ланцюгів і два різні сайти сполучення. Біспецифічні антитіла можуть бути одержані різноманітними способами, включаючи злиття гібридом або сполучення Fab'-фрагментів (див. Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol.148: 1547-1553 (1992)). У даній заявці термін "антитіло" також відноситься до гібридних антитіл, в часності, до антитіл, що містять константну область імуноглобуліну людини, пов'язану з однією або більше модифікованих областей імуноглобуліну, людини, що не є імуноглобуліном, або фрагментів таких антитіл (див., наприклад, патент США № 5,595,898 і патент США № 5,693,493). До антитіл також відносяться "гуманізовані" антитіла (див. патент США № 4,816,567 і WO 94/10332), мінітіла (WO 94/09817), максітіла, і антитіла, що продукуються трансгенними тваринами, що мають певну частку генів для продукування антитіл людини, але не продукуючих ендогенних антитіл, що дозволяє одержувати антитіла людини (див. Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) і патент США № 6,300,129). Термін "антитіла" також включає мультимерні антитіла, комплекс білків вищого порядку, таких як гетеродимерні і антиідіотипові антитіла. "Антитіла" також включають анти-діотипові антитіла. Антитіла до vActRIIB можна застосовувати, наприклад, для ідентифікації і кількісного аналізу vActRIIB in vitro і in vivo. Також включені поліклональні антитіла всіх ссавців, наприклад антитіла мишей і щурів, і антитіла кроликів, які специфічно сполучають описані в даній заявці поліпептиди vActRIIB, включаючи SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 і 97. Такі антитіла знаходять застосування як засоби дослідження і в кількісних аналізах для визначення і аналізу поліпептидів, що виявляються тут. Такі антитіла одержують, використовуючи описані вище методи і існуючу техніку. Фармацевтичні композиції Також запропоновані фармацевтичні композиції, що містять білки і поліпептиди vActRIIB згідно даного винаходу. Такі композиції містять терапевтично або профілактично ефективну кількість поліпептидів або білків в суміші з фізіологічно прийнятними матеріалами. Фармацевтична композиція може містити матеріали для зміни, підтримки і збереження, наприклад, pH, осмоляльності, в'язкості, прозорості, кольору, ізотонічності, запаху, стерильності, стабільності, ступеня розчинення або вивільнення, адсорбції або проникаючої здатності. Відповідні матеріали включають (але не обмежені) амінокислоти (такі як гліцин, глютамін, аспарагін, аргінін або лізин); антимікробні засоби; антиоксиданти (такі як аскорбінова кислота, сульфіт або гідросульфат натрію); буфери (такі як борат, бікарбонат, Tris-HCl, цитрати, фосфати, інші органічні кислоти); наповнювачі (такі як манітол або гліцин), хелатні агенти (такі як етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТА)); комплексоутворювачі (такі як кофеїн, полівінілпіролідон, бетациклодекстрин або гідроксипропіл-бета-циклодекстрин); наповнювачі; моносахариди; дисахариди і інші карбогідрати (такі як глюкоза, маноза, або декстрин); протеїни (такі як серумальбумін, желатин або імуноглобуліни); фарбники; ароматизатори і розфактор; емульгатори; гідрофільні полімери (такі як полівінілпіролідон); низькомолекулярні поліпептиди; солетворні протиіони (такі як натрій); консерванти (такі як хлорид бензалконію, бензойна кислота, саліцилова кислота, тімеросал, фенетиловий спирт, метилпарабен, пропілпарабен, хлоргексидин, сорбінова кислота або пероксид водню); розфактор (такі як гліцерин, пропіленгліколь або поліетиленгліколь); цукрові спирти (такі як манітол або сорбітол); суспендуючі агенти; поверхнево-активні речовини або зволожувачі (такі як ПАВ для емульсій, ПЕГ, ефір сорбітану, полісорбати, такі як полісорбат 20, полісорбат 80, тринітротолуол, трометамін, лецитин, холестерол, тилоксапал); стабілізатори (сахароза або сорбітол); агенти, що збільшують тонус (такі як галогеніди лужних металів (переважно хлориди натрію і калію), манітол, сорбітол); носії; розфактор інертні носії і/або фармацевтичні адьюванти (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990). Оптимальна фармацевтична композиція може бути визначена фахівцем в даній області залежно від, наприклад, передбачуваного способу введення, способу доставки і бажаного дозування. Див., наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences (вище). Такі композиції можуть впливати на фізичний стан, стабільність, рівень вивільнення in vivo і кліренс (виведення) поліпептидів in vivo. Наприклад, відповідними композиціями можуть бути вода для ін'єкцій, фізіологічний розчин для парентерального введення. Основний носій або середовище (основа) фармацевтичної композиції може бути як водної так і неводної природи. Наприклад, відповідним носієм або середовищем може бути вода для ін'єкцій, фізіологічний розчин або штучна спинно-мозкова рідина, можливо доповнена іншими матеріалами, зазвичай вживаними в композиціях для парентерального введення. Нейтральна буферна сіль або сіль в суміші з альбуміном сироватки є найбільш поширеними носіями. Інші типові фармацевтичні композиції включають буфер Tris з pH 7,0-8,5, або ацетатний буфер з pH 4,0-5,5, які можуть додатково містити сорбітол або відповідний замінник сорбітолу. У одному з варіантів здійснення даного винаходу, композиції можуть бути одержані змішуванням вибраної композиції, що має бажаний рівень чистоти, з додатковими агентами (Remington's Pharmaceutical Sciences, вище) у формі ліофілізованої пігулки або водного розчину. Крім того, терапевтична композиція може бути у вигляді ліофілізату, що містить відповідний наповнювач, такий як сахароза. Доставку композиції можна здійснювати різними способами, наприклад, інгаляційною терапією, перорально, або шляхом ін'єкцій. У випадках, коли передбачено парентеральне введення, терапевтичні 8 UA 101609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 композиції згідно даного винаходу можуть мати форму апірогенного водного розчину для парентерального введення, що містить поліпептиди у фармацевтично прийнятному середовищі. Особливо відповідним носієм для парентеральних ін'єкцій є стерильна дистильована вода, в якій поліпептиди готують у вигляді стерильного, стабільного ізотонічного розчину. Ще один варіант виготовлення може включати змішування цільової молекули з агентом, таким як мікросфери, частинки, що біоруйнуються, полімерні сполуки (полімолочна кислота, полігліколева кислота), гранули, або ліпосоми, які забезпечують контрольоване або сповільнене вивільнення продукту, який може бути потім доставлений шляхом ін'єкції форми із сповільненим вивільненням. Також можна використовувати гіалуронову кислоту, що може забезпечувати ефект безперервної циркуляції. Інші відповідні засоби для введення бажаної молекули включають імплантуючі засоби для доставки лікарського засобу. У іншому аспекті фармацевтичні препарати, відповідні для введення шляхом ін'єкції можуть включати водні розчини, переважно фізіологічно сумісні буфери такі як розчин Хенкса, розчин Рінгера, або фізіологічний розчин. Водні·ін'єкційні суспензії можуть містити речовини, які збільшують в'язкість суспензії, такі як Na-КМЦ (Na-карбоксиметилцелюлоза), сорбітол або декстран. Додатково, суспензії активних сполук можуть бути приготовані у формі відповідних масляних суспензій для ін'єкцій. Відповідний ліпофільний розфактор або носії включають жирні масла, такі як кунжутне масло, або складні ефіри синтетичних жирних кислот, такі як етилолеат, тригліцериди або ліпосоми. Для доставки можна також використовувати неліпідні полікатіонні амінополімери. Додатково, суспензії можуть містити відповідні стабілізатори або агенти для збільшення розчинності сполук, що дозволяють одержувати розчини з високою концентрацією. У іншому варіанті здійснення даного винаходу, фармацевтична композиція може бути використана для інгаляції. Також можуть бути виготовлені інгаляційні розчини з пропелентом для доставки у формі аерозоля. Ще в одному з варіантів здійснення даного винаходу, передбачена доставка розчинів зрошуванням. Введення через легені додатково описане в заявці PCT/US94/001875, яка описує доставку хімічно модифікованих білків через легені. Також передбачена можливість перорального введення композицій. У одному з варіантів здійснення даного винаходу, молекули, введені таким чином, можуть бути доповнені речовинами, які використовуються при приготуванні твердих дозованих форм, таких як пігулки і капсули. Наприклад, капсула може бути призначена для вивільнення активної порції композиції в тій ділянці шлунково-кишкового тракту, в якому біодоступність максимальна, а пресистемна деградація мінімальна. Можуть бути включені додаткові агенти для полегшення всмоктування терапевтичної сполуки. Також можуть бути включені розфактор, ароматизатори, воску з низькою точкою плавлення, рослинні масла, лубриканти, агенти, суспендуючі, дезінтегратори, і зв'язуючі агенти. Фармацевтичні композиції для орального введення також можуть бути доповнені фармацевтично прийнятними носіями, відомими в даній області техніки. Такі носії забезпечують можливість приготування фармацевтичних композицій у вигляді пігулок, гранул, драже, капсул, рідин, гелів, сиропів, суспензій, суспензій і подібних форм для вживання пацієнтом. Фармацевтичні препарати для орального використання можуть бути одержані шляхом об'єднання активних речовин з твердим носієм і обробки одержаної в результаті суміші гранул (зазвичай після подрібнення) з одержанням ядер пігулок або драже. Відповідні допоміжні речовини можуть бути додані за бажанням. Відповідні носії включають вуглеводні або білкові наповнювачі, такі як сахариди, включаючи лактозу, сахарозу, манітол, і сорбіт; крохмаль з кукурудзи, пшениці, рису, картоплі, або інших рослин; целюлоза, такі як метилцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза або Na-КМЦ; смолу, включаючи гуміарабік і трагакант; і білки, такі як желатин і колаген. Якщо необхідно, можуть бути додані дезінтегратори або солюбілізатори, такі як поперечно-зшитий полівінілпіролідон, агар, альгінова кислота і її сіль, наприклад альгінат натрію. Ядра драже можуть бути використані у поєднанні з відповідними оболонками, такими як насичені розчини цукру, які можуть також містити гуміарабік, тальк, ПВП, гель карбопол, поліетиленгліколь і/або діоксид титану, летючий розчин, і відповідні органічні розфактор або суміші розчинників. Фарбники або пігменти можуть бути додані в оболонки пігулок або драже для ідентифікації продукту або для характеристики кількісного вмісту активної сполуки, наприклад, дозування. Фармацевтичні препарати для перорального введення також включають жорсткі желатинові капсули, разом з м'якими, герметичними капсулами, виконаними з желатину і покриття, такого як гліцерол або сорбітол. Жорсткі капсули можуть містити активні інгредієнти, змішані з наповнювачами або зв'язуючими агентами, такими як лактоза або крохмаль, лубрикантами, такими як тальк або стеарат магнію, і, додатково, стабілізаторами. У м'яких капсулах, активні сполуки можуть бути розчинені або суспендовані у відповідних рідинах, таких як жирні масла, рідини, або рідкий ПЕГ із стабілізаторами, або без них. Інші фармацевтичні композиції будуть очевидними для фахівця в даній області. Такі композиції включають композиції, що містять поліпептиди у формах сповільненого або контрольованого вивільнення. Способи виготовлення інших засобів тривалого або контрольованого вивільнення, такі як ліпосоминосії, мікрочастки, що біоеродують, або пористі гранули і ін'єкція речовин сповільненого всмоктування, також відомі в даній області. Див., наприклад, PCT/US93/00829, в якій описано контрольоване виділення пористих полімерних мікрочасток для доставки фармацевтичної композиції. Додаткові приклади препаратів сповільненого вивільнення включають напівпроникні полімерні матриці у формі профільованих виробів, наприклад плівки, мікрокапсули. Матриці сповільненого вивільнення можуть включати поліефіри, гідрогелі, полілактиди (U.S. 3,773,919, ЕР 58,481), сополімери L-глутамінової кислоти і гамма етил-Lглутамат (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983), полі-(2-гідроксіетилметакрилат) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981); Langer et al., Chem. Tech.,12:98-105(1982)), етиленвініл ацетат (вище, Langer et al.) або полі-D(-) - 3-гідроксимасляну кислоту (ЕР 133,988). Композиції сповільненого 9 UA 101609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 вивільнення також включають ліпосоми, які можуть бути одержані одним з відомих способів. Див., наприклад Eppstein et al., PNAS (USA), 82:3688 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949. Фармацевтична композиція, використовувана для введення in vivo, зазвичай має бути стерильною. Це може бути досягнуто фільтрацією через стерильні фільтраційні мембрани. Коли композиція ліофілізована, стерилізація може бути здійснена як до, так і після ліофілізації і розчинення. Композиція для парентерального введення зазвичай поміщена в контейнер, що має стерильний отвір, наприклад, пакет для внутрішньо венозного розчину або посудини, що має проникну пробку для голки. Після приготування композиції, її можна зберігати в стерильних посудинах у формі розчину, суспензії, гелю, емульсії, твердої речовини, дегідрованого або ліофілізованого порошку. Такі формули можуть зберігатися як у вигляді готової до застосування форми, так і у вигляді форми (наприклад ліофілізованою), що вимагає розчинення перед введенням. У одному з варіантів здійснення даний винахід відноситься до одержання наборів для одноразового введення дози. Набори можуть містити обидва контейнери: один, що містить - сухий білок і другий, такий, що містить водний розчин. Також в рамках даного винаходу передбачені набори, що містять однокамерний і багатокамерний заздалегідь наповнений шприц (наприклад, шприц для рідини і ліофілізовані шприци). Ефективна кількість фармацевтичної композиції для терапевтичного застосування залежатиме, наприклад, від терапевтичної ситуації і цілей. Кожен, що знається на даній області скаже, що зразкове дозування для лікування варіюватиме в залежності, від молекули, що доставляється, мети, для якої використовується поліпептид, шляхи введення, розміру (вага тіла, поверхня тіла, розмір органу) і стану пацієнта (вік і загальне здоров'я). Отже, лікар може змінити дозу і шлях введення, щоб досягти оптимального терапевтичного ефекту. Типова доза може мінятися від 0,1 мг/кг до 100 мг/кг і більш, залежно від згаданих вище факторів. Композиції, що містять поліпептиди, вводять переважно внутрішньовенно. Фармацевтичні композиції тривалої дії можна вводити кожні три або чотири дні, кожного тижня, раз в два тижні, залежно від періоду напіввиведення і рівня чистоти конкретної речовини. Частота дозування залежатиме від фармакокінетичних параметрів поліпептидів, використовуваних в препараті. Зазвичай, композицію вводять до досягнення дозування, що забезпечує бажаний ефект. Отже, композицію можна розводити одноразово, або за кілька разів (в такій же або різних концентраціях/дозуваннях) з інтервалами, або ж у формі тривалої інфузії. Подальший підбір відповідного дозування здійснюється рутинними способами. Необхідні дози можуть бути визначені шляхом оцінки даних про залежність між дозою і ефектом. Шляхи введення фармацевтичної композиції відповідають відомим способам, наприклад: оральний, внутрішньовенний, внутрішньочеревний, внутрішньоцеребральний (інтро-паренхіматозний), інтроцеребровентрикулярний, внутрішньом'язовий, внутрішньоочний, внутрішньоартеріальний, введення в комірну вену, всередину уражених тканин, інтромедулярний, інтротекальний, внутрішньошлуночковий, трансдермальний, підшкірний або внутрішньоочеревинний; а також інтроназальний, ентеральний, місцевий, сублінгвальний, уретральний, вагінальний або ректальний шляхи, за допомогою систем сповільненого вивільнення або засобів імплантацій. При необхідності, композиції можуть бути введені способом болісної ін'єкції, тривалої інфузії або за допомогою засобів, що імплантуються. Як альтернатива або додатково, композиції можна вводити місцевим шляхом імплантації мембран, губчастих матеріалів або інших відповідних матеріалів, на які може бути адсорбована або інкапсульована бажана молекула. Засіб може бути імплантований в будь-яку відповідну тканину або орган, доставка необхідної молекули може бути здійснена по механізму дифузії, болісної ін'єкції, сповільненої дії або безперервного введення. В деяких випадках доставку поліпептидів vActRIIB згідно даного винаходу можна здійснювати шляхом імплантації певних клітин, генетично модифікованих згідно описаних в даній заявці способів для експресії і секреції поліпептидів. Такі клітини можуть бути одержані з організму тварини або людини, і можуть бути аутологічними, гетерологічними або ксеногенними. Додатково, клітини можуть бути іморталізованими. З метою зменшення вірогідності імунної реакції, клітини можуть бути інкапсульовані, що виключає інфільтрацію навколишніх тканин. Матеріали інкапсуляції зазвичай є біосумісними, напівпроникними полімерними оболонками або мембранами, які забезпечують вивільнення поліпептидного(их) продукту(ів), і в той же час запобігають розширенню клітин імунною системою пацієнта або іншими негативними факторами навколишніх тканин. vActRIIB генна терапія in vivo передбачає також кодування vActRIIB молекули нуклеїнової кислоти або безпосередніх похідних vActRIIB, представлених в об'єкті. Наприклад, послідовності нуклеїнових кислот, кодуючих vActRIIB, вводять в клітини-мішені шляхом місцевої ін'єкції конструкта нуклеїнової кислоти з використанням вектора доставки або без нього, такого як аденовірусний вектор. Альтернативні вірусні вектори включають (але не обмежені) ретровіруси, аденовіруси, герпетичну лихоманку, вектори вірусу папіломи. Фізичне перенесення вірусного вектора може бути здійснене in vivo шляхом місцевої ін'єкції необхідного конструкта нуклеїнової кислоти або іншим відповідним вектором, що містить необхідну послідовність нуклеїнової кислот, перенесення за допомогою ліпосомів, безпосередня ін'єкція (депротеінізована ДНК) або бомбардування мікрочастками (генна гармата). Застосування композицій, що містять vActRIIB Даний винахід забезпечує способи і фармацевтичні композиції для зменшення або нейтралізації активності міостатину, активіну А або GDF-11 in vivo і in vitro шляхом здійснення контакту даних поліпептидів з поліпептидом vActRIIB. Поліпептиди vActRIIB мають високу афінність до міостатину, активіну А і GDF-11, і здатні знижувати або пригнічувати біологічну активність принаймні одного з: міостатину, активіну А і GDF-11. У деяких варіантах здійснення даного винаходу поліпептиди vActRIIB проявляють вищу активність, ніж дикий тип поліпептидів vActRIIB. Це показано нижче в розділі Приклади. 10 UA 101609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 У одному з аспектів даного винаходу запропоновані способи і реагенти для лікування порушень, пов'язаних з міостатином і/або активіном А в у суб'єкта, що потребує такого лікування, що включають введення суб'єктові ефективної дози композиції, що містить vActRIIB. У даній заявці термін "суб'єкт" відноситься до будь-якого ссавця, включаючи людину. Композиції згідно даного винаходу використовують для збільшення долі (%) сухої м'язової маси по відношенню до ваги тіла і зниження процентної частки жирової маси в масі тіла. Порушення, які можна лікувати з використанням композицій vActRIIB, що включають, але не обмежені, різні форми атрофії м'язів, такі як метаболічні порушення: діабет і пов'язані з ним порушення, дегенеративні захворювання кісток, такі як остеопороз. Була підтверджена ефективність композицій, що містять vActRIIB, в лікуванні порушень, пов'язаних з атрофією м'язів, в різних моделях хвороб, представлених нижче в прикладі 3. Це було продемонстровано в експериментах лікування мишей з нокаутом по інгібіном-А, лікування атрофії м'язів в моделях ракової кахексії соlon-26, запобіганні атрофії м'язів в моделі хірургічного втручання на задній кінцівці, лікуванні ефектів оваріектомії у самок, в яких було показано збільшення сухої м'язової маси, зменшення жирової маси і збільшення вмісту мінералів. Порушення, пов'язані з дистрофією м'язів, включають такі види дистрофії, як м'язова дистрофія Дюшенна, прогресуюча м'язова дистрофія, м'язова дистрофія Беккера, м'язова дистрофія Дежерін-ландуза, м'язова дистрофія Ерба і дитяча нейроаксональна м'язова дистрофія. Причиною інших захворювань м'язів є хронічні захворювання або такі порушення, як бічний аміотрофічний склероз, хронічне обструкційне захворювання легенів, рак, СНІД, ниркова недостатність, атрофія органів, андрогенна недостатність і ревматоїдний артрит. Надекспресія міостатину і/або активіну може вносити внесок до розвитку кахексії, важких м'язових синдромів і синдрому атрофії жирової тканини. Ефективність поліпептидів vActRIIB в лікуванні кахексії в моделях тварин показана в прикладі 3. Кахексія також розвивається унаслідок ревматоїдного артриту, діабетичної нефропатії, ниркової недостатності, хіміотерапії, опікових пошкоджень, а також інших причин. У іншому прикладі, сироваткові і внутрішньом'язові концентрації міостатин-імунореактивного протеїну були збільшені у людей страждаючих м'язовими слабкостями, пов'язаними зі СНІДОМ і були оберненопропорційні жировій масі (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS USA 95: 14938-14943 (1998)). Також було показано, що рівень міостатину також підвищується у відповідь на опіки, що приводить до катаболічного ефекту в м'язах (Lang et al., FASEB J 15, 1807-1809 (2001)). Додаткові стани, що приводять до атрофії м'язів, можуть з'являтися унаслідок відсутності активності, внаслідок інвалідності: наприклад, знаходження в інвалідному кріслі, тривалий постільний режим унаслідок паралічу, хвороби, пошкодження спинного мозку, перелому кістки або травми і м'язової атрофії в умовах мікрогравітації (космічний політ). Наприклад, було виявлено збільшення рівня міостатин-імунореактивного білка в плазмі після тривалого постільного режиму (Zachwieja et al. J Gravit Physiol. 6(2): 11 (1999). Також було виявлено, що в м'язах щурів, поміщених в умови мікрогравітації в ході польоту космічного шатлу, кількість міостатину була підвищена в порівнянні з щурами, що не піддавалися дії мікрогравітації (Lalani et al., J.Endocrin 167 (3):417-28 (2000)). До того ж, вікове збільшення в співвідношенні жир/м'язи, і вікова м'язова атрофія, пов'язана з міостатином. Наприклад, середній вміст міостатин-імунореактивного білка збільшується з віком в групах молодих (19-35 років), середнього віку (36-75 років) і старих (76-92 років) чоловіків і жінок, тоді як середня м'язова маса і маса без жиру в тих же групах з віком знижується (Yarasheski et al. J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002)). Крім того, виявлено, що міостатин експресується в серцевому м'язі в невеликих кількостях, і після інфаркту відбувається підвищення експресії в кардіомоцитах (Sharma et al., J Cell Physiol. 180 (1):1-9 (1999)). Отже, пониження рівня міостатину в серцевому м'язі може поліпшити відновлення серця після інфаркту. Міостатин також, впливає на порушення обміну речовин, включаючи діабет другого типу, інсулінонезалежний цукровий діабет, гіперглікемію і ожиріння. Наприклад, було показано, що недолік міостатину приводить до поліпшення стану при ожирінні і діабетичного фенотипу в двох моделях на мишах (Yen et al. FASEB J. 8:479 (1994)). Це було показано в заявці на патент США № 11/590,962, на патент США № 2007/0117130, вектори AAV-ActRIIB5 забезпечують збільшення співвідношення м'язів до жиру в моделях на тваринах. vActRIIB поліпептиди згідно даного винаходу, такі як SEQ ID NO:4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 підходять для такого застосування. Відповідно, зниження відкладень жиру шляхом введення композицій згідно даного винаходу поліпшить стан при діабеті, ожирінні і гіперглікомічних станах у тварин. Крім того, композиції, що містять поліпептиди vActRIIB, можуть понизити споживання їжі у індивідуумів, страждаючих ожирінням, як показано в заявці на патент США №11/590,962 і заявці на патент США №2007/0117130 для поліпептиду ActRIIB5. Введення поліпептидів ActRIIB даного винаходу може поліпшити міцність кісток і понизити вираженість остеопорозу і інших дегенеративних захворювань кісток. Це було показано на прикладі моделі оваріектомії у мишей, описаної нижче. Також було виявлено, що, наприклад, у мишей, дефіцитних по міостатину, спостерігали підвищений вміст мінералів і щільність плечової кістки, підвищений вміст мінералів в трабекулярній і кортикальній кістках в місцях прикріплення м'язів, а також підвищену м'язову масу (Hamrick et al. Calcif Tissue Int 71(1):63-8 (2002)). Крім того, композиції, що містять vActRIIB даного винаходу, можна застосовувати для лікування ефектів андрогенної недостатності, наприклад при терапії, направленій на зниження рівня андрогенів, використовуваної для лікування раку простати. Даний винахід також забезпечує способи і композиції для збільшення м'язової маси тварин шляхом введення тварині ефективної дози білків vActRIIB. Оскільки С-кінцевий поліпептид міостатину ідентичний у всіх протестованих типів, можна чекати, що поліпептиди vActRIIB будуть ефективні для збільшення м'язової і 11 UA 101609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 зниження жирової маси важливих для сільського господарства видів, включаючи велику рогату худобу, курей, індичок і свиней. Поліпептиди vActRIIB і композиції згідно даного винаходу також знижують активність активіну А. Активін А експресується при певних типах раку, зазвичай пухлинах статевих залоз, таких як рак яєчників, і викликає важку кахексію (Ciprano et al. Endocrinol 141 (7) :2319-27 ( 2000), Shou et al., Endocrinol 138 (11) :5000-5 (1997); Coerver et al, MoI Endocrinol 10 (5) :534-43 (1996); Ito et al. British J Cancer 82 (8 ): 1415-20 (2000), Lambert-Messerlian, et al, Gynecologic Oncology 74:93-7 (1999)). У прикладі 3, показана ефективність поліпептидів vActRIIB згідно даного винаходу в лікуванні важкої кахексії, зменшення розміру пухлини, і тривала дія в експериментах з мишами з нокаутом за інгібіном- і в моделях з раковою кахексією при пухлині соlon-26. Відповідно, композиції даного відкриття можна застосовувати для лікування станів, пов'язаних з надекспресією (підвищеною експресією) активіну А, а також в станах з надекспресією міостатину, такі як ракова кахексія і лікування пухлин певних типів раку статевих залоз. Композиції згідно даного винаходу можна застосовувати як окремо, так і в комбінації з іншими терапевтичними агентами, що забезпечують посилення терапевтичної дії і зниження можливих побічних ефектів. Ці властивості включають підвищену активність, підвищену розчинність, понижену руйнованість, збільшений період напіввиведення, знижену токсичність і знижену імуногенність. Таким чином, композиції згідно даного винаходу можна застосовувати в схемах тривалого лікування. Крім того, гідрофільні і гідрофобні властивості сполук згідно даного винаходу добре збалансовані, що їх корисність при використанні як in vivo, так, і in vitro. Зокрема, сполуки згідно даного винаходу мають відповідний рівень розчинності у водних середовищах, забезпечує їх всмоктування і біодоступність в організмі, і в той же час мають достатній ступінь розчинності в жирах, щоб проникати через клітинні мембрани в передбачуване місце дії, таке як маса м'язів. Крім того, поліпептиди vActRIIB згідно даного винаходу можна застосовувати для виявлення (детектування) і кількісного аналізу міостатину, активіну А або GDF-11 в будь-яких тестах. В цілому, поліпептиди ActRIIB даного винаходу можна застосовувати як агентів захоплення для скріплення і іммобілізації міостатину. Активіну А або GDF-11 в різних аналізах, схожих на описані, наприклад в Asai, ed., Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993). Поліпептиди можна забезпечувати певними мітками або можна здійснювати реакцію з третьою молекулою, такий як антитіло, що забезпечує виявлення міостатину і визначення його кількості. Наприклад, поліпептид або третя молекула можуть бути модифіковані шляхом приєднання угрупування, що детектується, такий як біотин, який може бути пов'язаний з четвертою молекулою, такий як помічений ферментом стрептавідин, або інші білки (Akerstrom, J Immunol 135:2589 (1985); Chaubert, Mod Pathol 10:585 (1997)). Після опису даного винаходу приведені ілюструючі, але не обмежуючі винахід приклади. Приклад 1 Експресія і очищення поліпептидів vActRIIB Для експресії і очищення модифікованих поліпептидів vActRIIB використовували наступні способи. кДНК рецептора активіну людини типу ІІВ виділяли з бібліотеки кДНК, що одержали з яєчка людини (Clontech, Inc.) і клонована як описано в заявці США номер 11 /590,962, опублікованою під номером 2007/0117130. Визначення замін амінокислот Наступні підходи: структурний аналіз, молекулярне моделювання і мас-спектрометрія показали що агрегація (олігомеризація) ActRIIB може відбуватися в результаті утворення міжмолекулярних дисульфідних зв'язків, обумовлених електростатичними і водневими взаємодіями між неглікозильованими молекулами ActRIIB. Було показано, що амінокислоти 28 і 40 беруть участь у взаємодії ActRIIB:ActRIIB але не беруть участь у взаємодії ActRIIB з його лігандами. Спочатку, амінокислоти ActRIIB-Fc - Е28 і R40 замінювали на А в кожному положенні. Аналіз способами світлорозсіюванням і мас-спектрометрії підтвердили, що фракція повністю глікозильованого vActRIIB-IgGlFc, E28A і vActRIIB-IgGlFc R40A була значно збільшена в порівнянні з білком дикого типу. Е28А і R40A vActRIIB-IgGlFc інкубували при 37 °C протягом 6 днів, і при цьому спостерігали відсутність агрегації або агрегацію, незначну в порівнянні з диким типом. Були зроблені заміни амінокислот в положеннях 28 і 40 (по відношенню до послідовностей номер 2 і 18 з сигнальною послідовністю), що проводило до зменшення або запобігти агрегація, яка може виникати в ході експресії або очищення ActRIIB (номер послідовності 2 і 18). Агрегацію визначають як утворення структурованих олігомерів в ході експресії і утворення неструктурованих олігомерів в ході експресії генів і очищення білків. Агрегацію на різних стадіях процесу одержання і очищення визначали за допомогою ексклюзивної хроматографії відповідно до способу, описаного нижче. Наприклад, наступний спосіб використовували для одержання модифікованих поліпептидів ActRIIB (vActRIIB і vActRIIB5). Кодуючі полінуклеотиди vActRIIB, E28W (SEQ ID NO:23), були сполучені з кодуючими полінуклеотидами домен Fc IgGl людини (SEQ ID NO:82), через послідовність шарнірного лінкера (SEQ ID NO:79) шляхом ПЦР послідовностей, що перекриваються з використанням праймерів, що містять мутацію, що дає E28W. Повна послідовність полінуклеотиду представлена в SEQ ID NO:61. Дволанцюгове ДНК клонували в рТТ5 (Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada (NRCC), 6100 Avenue Royalmount, Montreal (Quebec) Canada H4P 2R2), pDSRβ (описана в WO/9014363) і/або похідні pDSRβ. У інших варіантах здійснення полінуклеотиди, що кодують поліпептиди vActRIIB, сполучали з полінуклеотидами, що кодують лінкер GGGGS (SEQ ID NO:75) і мультимерами таких лінкерів або шарнірні лінкери (наприклад, SEQ ID NO:79). Тимчасову експресію модифікованих vActRIIB-Fc і vActRIIB5-Fc здійснювали таким чином. 12 UA 101609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Транзійну (тимчасову) експресію модифікованих варіантів двох вказаних молекул В здійснювали в безсироватковій суспензії клітин 293-6Е (National Research Council of Canada, Ottawa, Канада), підтримуваних в середовищі FreeStyle™ (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Канада) з додаванням 250 мкг/мл генетицину ((Invitrogen) і 0,1 % реагенту Pluronic F68 (Invitrogen). Трансфекцію здійснювали в культурі об'ємом 1 л. Клітинний посів вирощували до щільності 1.1 106 клітин на мл в 4-х літровій колбі Фернбаха (Corning, Inc.). Культуру у В колбі для струшування на платформі Innova 2150 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ), що коливається, при 65 оборотах в хвилину, яка була поміщена в інкубатор з вологим б середовищем при 37 °C і 5 % СO2. У момент трансфекції клітини розбавляли до 1.0 10 клітин/мл. Трансфекційні комплекси формували в 100 мл середовища FreeStyle. В середовище додавали 1 мг плазмідної ДНК, а потім 3 мл трансфекційного реактиву FuGene HD (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Трансфекційний комплекс інкубували при кімнатній температурі приблизно 15 хвилин, а потім додавали до клітин в колбі. Через 24 години після трансфекції додавали 20 % (мас/об.) пептону TNI OrganoTechnie S. Α., TeknieScience, QC, Канада) у кінцевій концентрації 0,5 % (мас/об.). Трансфекцію / експресію здійснювали протягом 4-7 днів, після чого збирали кондиційоване середовище шляхом центрифугування при 4000 обертах в хвилину протягом 60 хвилин при 4 °C. Стабільну трансфекцію і експресію здійснювали наступним способом. Створювали лінію клітин vActRIIB-(hu) IgG2-Fc шляхом трансфекції клітин СНО плазмідами експресії pDC323-vActRIIB (E28W)huIgG2 Fc і pDC324-vActRIIB (E28W)-huIgG2 Fc (як описано в Bianchi et al., Biotech and Bioengineering, 84(4):439-444 (2003)) з використанням стандартної процедури електропорації. Після трансфекції плазмідою експресії приймаючої лінії клітин, клітини вирощували в безсироватковому середовищі без GHT протягом 2-3 тижнів, що забезпечувало відбір за плазмідою і виділенням клітин. Клітини піддавали відбору до досягнення життєздатності як мінімум 85 %. Даний пул трансфеційованих клітин далі в середовищі, що містить 150 наномоль метотрексату. Клонування лінії клітин Створювали банк клітин з відібраних клонів відповідно до наступної процедури. Розмножений пул стабільно трансфеційованих клітин пула, висівали в планшети з 96 лунками, і клони-кандидати оцінювали їх здатність до росту і продуктивність в дослідженнях невеликого масштабу. З вибраного клону готували попередні банки клітин (РМСВ) приблизно по 60 пробірок. Всі РМСВ були протестовані на стерильність, мікоплазми і віруси. Лінію клітин, експресуючу vActRIIB-Fc, розмножували з використанням стандартного способу періодичної культури (fed batch). Клітинами інокулювали біореактор Wave (Wave Biotech LLC). Культуру підпитували 3 рази болюсними партіями. На 10 день збирали 10 літрів, а залишки збирали на 11 день; обидві партії зібраного матеріалу піддавали глибокій фільтрації з подальшою стерильною фільтрацією. Кондиційоване середовище фільтрували спочатку через 10-дюймовий фільтр з розміром пор 0,45/0,2 мікронів, а потім через 6-дюймовий фільтр з розміром пор 0,2 мікронів. Очищення білка Приблизно 5 літрів кондиційованого середовища, ActRIIB-Fc (IgGl і IgG2), що містить, ActRIIB5-Fc (IgGl і IgG2) і їх варіанти, концентрували за допомогою потокового мембранного фільтру на 10К площею 5 футів 2 (Pall). Концентрований матеріал завантажували на 5 мл колонку з білком A Protein A High Performance Column (GE Healthcare), яку врівноважували буфером ФБР (Дюльбекко, але без хлориду магнію або хлориду кальцію). Після того, як колонку промивали зрівноважуючим буфером до значення поглинання на довжині хвилі 280 нм (OD280) менше 0,1 нм, зв'язаний білок елюювали за допомогою буфера гліцин-НСІ 0,1 Μ (pH 2,7) і негайно нейтралізували буфером Tris-HCl 1 Μ (pH 8,5). Нейтралізований зібраний продукт концентрували до 1 мл і завантажували на 320 мл колонку Sephacryl 200 (GE Healthcare), яку врівноважували ФБР (за формулою Дюльбекко, але без хлориду магнію або хлориду кальцію). Проводили електрофорез в 4-20 % ДСН-ПААГ гелях (Invitrogen) для визначення того, які фракції слід об'єднувати. Ці поліпептиди тестували на активність і ступінь агрегації як показано нижче Приблизно 5 літрів кондиційованого середовища, ActRIIB-Fc (IgGl і IgG2), що містить, ActRIIB5-Fc (IgGl і IgG2) і їх варіанти, концентрували за допомогою потокового мембранного фільтру на 10К площею 5 футів 2 (Pall). Концентрований матеріал завантажували на 5 мл колонку з білком A Protein A High Performance Column (GE Healthcare), яку врівноважували буфером ФБР (Дюльбекко, але без хлориду магнію або хлориду кальцію). Після того, як колонку промивали зрівноважуючим буфером до значення поглинання по довжині хвилі 280нм (OD280) менше 0,1 нм, зв'язаний білок елюювали за допомогою буфера гліцин-НСІ 0,1 Μ (pH 2,7) і негайно нейтралізували буфером Tris-HCl 1 Μ (pH 8,5). Нейтралізований зібраний продукт концентрували до 1 мл і завантажували на 320 мл колонку Sephacryl 200 (GE Healthcare), яку врівноважували ФБР (за формулою Дюльбекко, але без хлориду магнію або хлориду кальцію). Проводили електрофорез в 4-20 % ДСН-ПААГ гелях (Invitrogen) для визначення того, які фракції слід об'єднувати. Ці поліпептиди тестували на активність і ступінь агрегації як показано нижче. Поліпептиди можна піддавати подальшому очищенню з використанням, наприклад, колонки з ShpСефарозою. Концентрацію визначали по OD280. Приклад 2 Тести на активність In vitro Зразки поліпептидів vActRIIB, очищені як описано вище, розбавляли фосфатним буферним розчином (2,67 мМ хлориду калію, 1,47 мМ хлориду натрію, 1,47 мМ монофосфату калію, 8,1 мМ дифосфату натрію, pH 7.4) до концентрації 0,2 мг/мл, а потім тестували способами MALDI-MS (матричноопосередкована лазерна десорбція/іонізація), ексклюзивної хроматографії (SEC) і/або ексклюзивної хроматографіїсвітлорозсіювання (SEC-LS). Агрегацію поліпептидів дикого і модифікованого типів після очищення за 13 UA 101609 C2 5 10 15 20 25 допомогою білка А визначали способами SEC або SEC-LS, а молекулярну вагу молекул підтверджували, використовуючи процедуру MALDI-MS, описану нижче. Ексклюзивна хроматографія (SEC): експерименти проводили на системі Agilent 1100 HPLC з двома колонками (TOSOHAAS G3000swxl, 7.8 300 мм) в тандемі. Як рухома фаза використовували 2х ФБР при швидкості 0,5 мл за хвилину. Ексклюзивна хроматографія -світлорозсіювання (SEC-LS): експерименти проводили на системі Agilent 1100 HPLC з гель-фільтраційною колонкою Superdex-200 (Amersham Pharmacia, Waukesha, WI, США). Потім зразки проганяли через лазерний детектор світлорозсіювання Wyatt miniDawn LS і рефрактометр Wyatt Optilab DSP Wyatt Technology Co., Santa Barbara, CA), щоб визначити молекулярну вагу. Як рухому фазу використовували ФБР при швидкості 0,4 мл за хвилину. Mac-спектроскопія - матричноопосередкована лазерна десорбція/іонізація (MALDI-MS): зразки змішували з синопіновою кислотою і піддавали MALDI-MS (Applied Biosystems Voyager System 2009). Цю процедуру використовували для перевірки молекулярної ваги молекул. Визначення аффінності скріплення і значення ICs0 для активіну і міостатину здійснювали, як описано нижче. Тест ВІАсоrе®: У гібридних конструктах IgGl Fc амінокислоти Е28 і R40 замінювали, відповідно, на інші амінокислоти, як описано вище. Конструкти одержували з лінкерами або без лінкерів, як показано нижче в таблицях. Кожен зразок vActRIIB-IgGlFc з кондиційованого середовища іммобілізували на поверхні СМ5, покритої антитілами кози до IgGl Fc людини (Jackson Immuno Research, номер каталогу 109-005-098, номер партії 63550). 20 нМ активіну А наносили на поверхні із зв'язаними зразками, з використанням BIACore2000 (BIACore Life Sciences, Piscataway, New Jersey). Одержані сенсограми нормували по RL (500 RU) іммобілізованих модифікованих vActRIIB-IgGlFc. Нормовані відповіді скріплення для деяких варіантів показані в Таблиці 2 і описані детально нижче. Так же визначали відносну аффіність скріплення шляхом вимірювання способом Віасоrе, з використанням кондиційованого середовища, одержану в процесі експресії в клітинах ссавців. Для іммобілізації поліпептиду в кондиційованому середовищі розчинного рецептора використовували активін А, зміряні сигнали SPR нормували. Нормовані SPR: +++++: > 60 ++++: 40-60 +++: 20-40++: 10-20+: 5-10,-:
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюModified polypeptides of activin receptor and using thereof
Автори англійськоюSun, Jeonghoon, Tam, Lei-ting Tony, Han, Hq, Kwak, Keith Soo-nyung, Zhou, Xiaolan
Назва патенту російськоюМодифицированные полипептиды рецептора активина и их применение
Автори російськоюСан Йонгхун, Там Ли-тинг Тони, Хан Хкью, Квак Кэйс Су-нюнг, Жоу Ксяолан
МПК / Мітки
МПК: C07K 14/71, C12N 5/10, A61K 38/17, C12N 15/861, C12N 15/12
Мітки: застосування, поліпептиди, рецептора, модифіковані, активіну
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/101-101609-modifikovani-polipeptidi-receptora-aktivinu-i-kh-zastosuvannya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Модифіковані поліпептиди рецептора активіну і їх застосування</a>
Модифіковані антагоністи (мутеїни) рецептора il-4
Номер патенту: 94021
Опубліковано: 11.04.2011
Автори: Вонг Тереза Мо-фан, Лонгфре Малінда, Грев Джері Майкл, Пен Кларк, Рожняк Стів, Юнг Стефані Л., Томкінсон Адріан
МПК: A61P 11/00, C12N 15/24, A61K 38/20
Мітки: мутеїни, модифіковані, рецептора, антагоністи
Формула / Реферат:
1. Очищений полінуклеотид, який включає: (a) нуклеотидну послідовність, наведену в SEQ ID NO: 6; або(b) нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, що має амінокислотну послідовність, наведену в SEQ ID NO: 14.2. Експресуючий вектор, який включає полінуклеотид за п. 1.3. Клітина-хазяїн, яка включає експресуючий вектор за п. 2.4. Спосіб одержання модифікованого антагоніста (мутеїна) рецептора IL-4, який...
Антагоністи активіну-actrii та їх застосування для підвищення рівня еритроцитів
Номер патенту: 101309
Опубліковано: 25.03.2013
Автор: Шерман Метью Л.
МПК: C12N 15/62, A61P 7/06, A61K 38/17
Мітки: застосування, рівня, антагоністи, підвищення, активіну-actrii, еритроцитів
Формула / Реферат:
1. Спосіб лікування або попередження анемії у пацієнта людини, у якому пацієнту, який цього потребує, вводять ефективну кількість поліпептиду ActRII, вибраного з групи, до якої належать: a) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною SEQ ID NO:2; b) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною SEQ ID NO:3; c) поліпептид, який включає...
Антагоністи активіну-actriia та їх застосування для сприяння ростові кісток
Номер патенту: 98447
Опубліковано: 25.05.2012
Автори: Сіхра Джасбір, Кнопф Джон
МПК: C07K 14/435
Мітки: активіну-actriia, сприяння, застосування, антагоністи, ростові, кісток
Формула / Реферат:
1. Активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa, який включає амінокислотну послідовність, яка складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 7. 2. Активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид має очищення принаймні 95 % відносно білкових забруднювачів, як визначають шляхом хроматографії з виключенням за розміром. 3. Активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa за п. 1 або 2, який...
Конденсовані гетероциклічні сполуки, спосіб їх одержання, фармачевтична композиція, антагоніст crf рецептора, спосіб лікування та застосування антагоніста crf рецептора
Номер патенту: 92169
Опубліковано: 11.10.2010
Автори: Чо Сук Янг, Пратт Скотт Алан, Сідем Крістофер Стівен, Асо Казуйоші, Коррітт Крістофер Пітер, Гіоркос Альберт Чарльз, Мочізукі Мічійо
МПК: C07D 235/24, C07D 235/12, C07D 235/18, C07D 403/02, C07D 235/04
Мітки: конденсовані, антагоніста, гетероциклічні, спосіб, рецептора, композиція, одержання, застосування, фармачевтична, лікування, антагоніст, сполуки
Формула / Реферат:
1. Сполука, представлена формулою (І):, (I) в якій R1 означає необов'язково заміщений гідрокарбіл, необов'язково заміщену С-зв'язану гетероциклічну групу, необов'язково заміщену N-зв'язану гетероарильну групу або ацил, за умови, що метил та трифторметил виключаються; R2 означає необов'язково заміщений циклічний...
Виділена молекула днк, яка кодує протопорфіриногеноксидазу, її модифіковані варіанти та їх застосування
Номер патенту: 71536
Опубліковано: 15.12.2004
Автори: Волрат Сандра, Уорд Ерік Рассел
МПК: C12N 5/10, G01N 33/566, C12N 1/21, A61K 38/44, C12N 1/15, C12N 15/09, C12N 15/82, C12N 15/53, A61K 48/00, C12Q 1/26, C12Q 1/68, C12N 9/02, A01H 5/00, C12N 5/04, A61P 43/00, C12N 1/19
Мітки: виділена, варіанти, кодує, днк, модифіковані, яка, застосування, молекула, протопорфіриногеноксидазу
Формула / Реферат:
1. Выделенная молекула ДНК, которая кодирует протопорфириногеноксидазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 10.2. Выделенная молекула ДНК, которая кодирует протопорфириногеноксидазу, аминокислотная последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, где:а) аланин в положении 220 заменен на аминокислоту, выбранную из группы, включающей валин, треонин, лейцин и...
Попередній патент: Спосіб активації хелперних t-клітин
Наступний патент: Наночастинка, що містить рапаміцин і альбумін, у ролі протиракового агента
Випадковий патент: Установка для електрошлакового наплавлення