Спосіб руйнування уражених та хворих клітин, спосіб лікування раку, композиція та терапевтичний набір для руйнування уражених та хворих клітин

1 Способ разрушения пораженных, больных или тому подобных клеток, включающий обеспечение контакта клетки с протеином р53 или геном и поражающим ДНК агентом в объединенном количестве, достаточном для разрушения данной клетки 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с протеином р53 или геном в сочетании с рентгеновским облучением, ультрафиолетовым облучением, -облучением, микроволновым излучением, адриамицином, 5флуороурацилом, этопозидом, камптотецином, актиномицином D, митомицином С или цисплатином 3 Способ по п 1, отличающийся тем, что клетка является эпителиальной опухолевой клеткой 4 Способ по п 1, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с протеином р53 или геном в сочетании с цисплатином 5 Способ по п 1, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с рекомбинантным вектором, который возбуждает экспрессию протеина р53 в данной клетке, в сочетании с поражающим ДНК агентом 6 Способ по п 5, отличающийся тем, что рекомбинантный вектор, вызывающий экспрессию р53, является "оголенной" плазмидой ДНК, плазмидой в пределах липосомы, ретровирусным вектором, вектором аденоассоциированного вируса (AAV), вектором герпесвируса или вектором аденовируса-рекомбинанта 7 Способ по п 6, отличающийся тем, что реком бинантный вектор, вызывающий экспрессию р53, является вектором аденовируса-рекомбинанта 8 Способ по п 7, отличающийся тем, что количе5 ство аденовирусного вектора составляет от 1x10 12 до 1х10 бляшкообразующих единиц (pfu) 9 Способ по п 8, отличающийся тем, что количество аденовирусного вектора составляет 5x107 бляшкообразующих единиц 10 Способ по п 8, отличающийся тем, что количество аденовирусного вектора составляет 2x107 бляшкообразующих единиц 11 Способ по п 6, отличающийся тем, что вирусный вектор является герпесвирусным вектором 12 Способ по п 6, отличающийся тем, что вирусный вектор подается через эндоскоп, внутривенно, внутритрахеально, интралезионально, через кожу или подкожно 13 Способ по п 1, отличающийся тем, что опухоль находится в резецированной поддерживающей опухоль ткани 14 Способ по п 6, отличающийся тем, что вирусный вектор вводится в количестве примерно 0,1 мл 15 Способ по п 6, отличающийся тем, что вирусный вектор вводится в количестве примерно 10 мл 16 Способ по п 7, отличающийся тем, что рекомбинантный вектор, вызывающий экспрессию р53, является вектором аденовируса-рекомбинанта, включающим зону экспрессии р53, размещенную при контролирующем воздействии промотора цитомегаловируса IE 17 Способ по п 7, отличающийся тем, что используют вектор аденовируса-рекомбинанта, включающий зону экспрессии р53, промотор цитомегаловируса IE и ранний сигнал полиаденилации SV40 18 Способ по п 7, отличающийся тем, что, по крайней мере, один ген, ответственный за репликацию аденовируса, удаляют из структуры вектора указанного аденовируса, а зону экспрессии р53 внедряют на его место 19 Способ по п 18, отличающийся тем, что зону экспрессии р53 внедряют на место удаленных зон ЕІАи ЕІА аденовирусного вектора 20 Способ по п 7, отличающийся тем, что используют вектор аденовируса-рекомбинанта, ко О ГО 43917 торыи присутствует в пределах аденовирусарекомбинанта 21 Способ по п 1, отличающийся тем, что сначала обеспечивают контакт клетки с протеином р53 или геном, а затем обеспечивают ее контакт с повреждающим ДНК агентом 22 Способ по п 1, отличающийся тем, что сначала обеспечивают контакт клетки с повреждающим ДНК агентом, а затем обеспечивают ее контакт с протеином р53 или геном 23 Способ по п 1, отличающийся тем, что одновременно обеспечивают контакт клетки с протеином р53 или геном и с повреждающим ДНК агентом 24 Способ по п 1, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с первой композицией, содержащей протеин р53 или ген, и со второй композицией, содержащей повреждающий ДНК агент 25 Способ по п 24, отличающийся тем, что первую и вторую композицию диспергируют в фармакологически приемлемом виде 26 Способ по п 1, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с единственной композицией, содержащей протеин р53 или ген в сочетании с повреждающим ДНК агентом 27 Способ по п 26, отличающийся тем, что композицию диспергируют в фармакологически приемлемом виде 28 Способ по п 26, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с единственной композицией, содержащей рекомбинантный вектор, который возбуждает экспрессию р53 в клетке в сочетании с повреждающим ДНК агентом 29 Способ по п 28, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с единственной композицией, содержащей аденовирус-рекомбинант, включающий рекомбинантный вектор, который возбуждает экспрессию р53 в клетке в сочетании с повреждающим ДНК агентом 30 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанная клетка является человеческой клеткой 31 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанная клетка является гиперпролиферативной клеткой 32 Способ по п 31, отличающийся тем, что указанная клетка является клеткой рака легких 33 Способ по п 32, отличающийся тем, что клетка рака является клеткой немелкоклеточной карциномы легкого 34 Способ по п 33, отличающийся тем, что указанная клетка немелкоклеточной карциномы легкого является клеткой плоскоклеточного рака 35 Способ по п 33, отличающийся тем, что клетка немелкоклеточной карциномы легкого является клеткой аденокарциномы 36 Способ по п 33, отличающийся тем, что клетка немелкоклеточной карциномы легкого является клеткой крупноклеточной недифференцированной карциномы 37 Способ по п 32, отличающийся тем, что клетка рака легкого является клеткой мелкоклеточной карциномы легкого 38 Способ по п 31, отличающийся тем, что указанная клетка является клеткой рака груди 39 Способ по п 31, отличающийся тем, что ука занная клетка является клеткой, имеющей мутацию в гене р53 40 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанная клетка расположена в организме животного, а протеин р53 или ген и поражающий ДНК агент вводят в организм животного в фармакологически приемлемом виде 41 Способ по п 40, отличающийся тем, что включает впрыскивание в пораженное опухолью место терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей аденовирус-рекомбинант, содержащий рекомбинантный вектор, вызывающий экспрессию р53 в опухолевой клетке, и обеспечение контакта опухоли с поражающим ДНК агентом 42 Способ по п 41, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем радиоактивного облучения, ультрафиолетового облучения, -облучения или микроволнового облучения 43 Способ по п 42, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем радиоактивного облучения места расположения опухоли 44 Способ по п 42, отличающийся тем, что опухолевая клетка приводится в контакт с поражающим ДНК агентом путем облучения опухолевой клетки рентгеновским облучением 45 Способ по п 44, отличающийся тем, что доза рентгеновского излучения составляет 2000-6000 рентген 46 Способ по п 44, отличающийся тем, что доза рентгеновского излучения составляет 50-200 рентген 47 Способ по п 42, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем ультрафиолетового облучения места расположения опухоли 48 Способ по п 42, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем -облучения места расположения опухоли 49 Способ по п 42, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем микроволнового облучения места расположения опухоли 50 Способ по п 41, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем введения в организм животного терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей поражающее ДНК соединение 51 Способ по п 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является цисплатином 52 Способ по п 51, отличающийся тем, что указанный цисплатин вводят в дозе 20 мг/м2 53 Способ по п 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является доксорубицином 54 Способ по п 53, отличающийся тем, что указанный доксорубицин вводят в дозе 25-75 мг/м 55 Способ по п 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является этопозидом 56 Способ по п 55, отличающийся тем, что указанный этопозид вводят в дозе 35-50 мг/м2 57 Способ по п 50, отличающийся тем, что пора 43917 жающии ДНК агент является верапамилом 58 Способ по п 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является подофиллотоксином 59 Способ по п 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является 5-флуороурацилом 60 Способ по п 59, отличающийся тем, что указанный 5-флуороурацил вводят в дозе 3-15 мг/кг 61 Способ по п 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является камптотецином 62 Способ по п 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является актиномицином D 63 Способ по п 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является митомицином С 64 Способ по п 40, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем введения в организм животного терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей поражающее ДНК соединение 65 Способ по п 40, отличающийся тем, что ген р53 или протеин вводят перед поражающим ДНК агентом 66 Способ по п 65, отличающийся тем, что период между вводом вирусного вектора и поражающего ДНК агента составляет 12-24 ч 67 Способ по п 65, отличающийся тем, что период между вводом вирусного вектора и поражающего ДНК агента составляет 6-12 ч 68 Способ по п 65, отличающийся тем, что период между вводом вирусного вектора и поражающего ДНК агента составляет примерно 12 ч 69 Способ по п 40, отличающийся тем, что ген р53 или протеин вводят после поражающего ДНК агента 70 Способ по п 69, отличающийся тем, что период между вводом поражающего ДНК агента и вирусного вектора составляет 12-24 ч 71 Способ по п 69, отличающийся тем, что период между вводом поражающего ДНК агента и вирусного вектора составляет 6-12 ч 72 Способ по п 69, отличающийся тем, что период между вводом поражающего ДНК агента и вирусного вектора составляет примерно 12 ч 73 Способ по п 40, отличающийся тем, что ген р53 или протеин вводят одновременно с поражающим ДНК агентом 74 Способ лечения рака, включающий введение в организм животного, больного раком, терапевтически эффективного сочетания протеина р53 или гена с повреждающим ДНК агентом 75 Способ по п 74, отличающийся тем, что впрыскивают в место, поврежденное опухолью, терапевтически эффективное количество фармацевтического соединения, содержащего аденовирусрекомбинант, включающий рекомбинантный вектор, который вызывает экспрессию р53 в пораженной опухолью клетке, и обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом 76 Способ по п 75, отличающийся тем, что вирусный вектор вводят в количестве примерно 0,1 мл 77 Способ по п 75, отличающийся тем, что вирусный вектор вводят в количестве примерно 10 мл 78 Способ по п 75, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем облучения поврежденного опухолью места рентгеновскими лучами, ультрафиолетовыми лучами, -лучами или путем микроволнового облучения 79 Способ по п 75, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем ввода в организм животного терапевтически эффективного количества фармацевтического соединения, содержащего поражающее ДНК соединение 80 Способ по п 75, отличающийся тем, что поражающим ДНК соединением является цисплатин 81 Способ по п 78, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем радиоактивного облучения места расположения опухоли 82 Способ по п 78, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем ультрафиолетового облучения места расположения опухоли 83 Способ по п 78, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем -облучения места расположения опухоли 84 Способ по п 78, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем микроволнового облучения места расположения опухоли 85 Способ по п 75, отличающийся тем, что поражающим ДНК агентом является доксорубицин 86 Способ по п 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является этопозидом 87 Способ по п 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является верапамилом 88 Способ по п 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является подофиллотоксином 89 Способ по п 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является 5-флуороуроцилом 90 Способ по п 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является камптотецином 91 Способ по п 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является актиномицином 92 Способ по п 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является митомицином С 93 Способ по п 74, отличающийся тем, что ген р53 или протеин вводят перед поражающим ДНК агентом 94 Способ по п 93, отличающийся тем, что период между вводом вирусного вектора и поражающего ДНК агента составляет от 12 до 24 часов 95 Способ по п 93, отличающийся тем, что период между вводом вирусного вектора и поражающего ДНК агента составляет 6-12 ч 96 Способ по п 93, отличающийся тем, что период между вводом вирусного вектора и поражающего ДНК агента составляет примерно 12 ч 97 Способ по п 74, отличающийся тем, что ген р53 или протеин вводят после поражающего ДНК агента 98 Способ по п 97, отличающийся тем, что период между вводом поражающего ДНК агента и вирусного вектора составляет 12-24 ч 99 Способ по п 97, отличающийся тем, что период между вводом поражающего ДНК агента и вирусного вектора составляет 6-12 ч 43917 8 100 Способ по п 97, отличающийся тем, что период между вводом поражающего ДНК агента и вирусного веісгора составляет примерно 12 ч 101 Способ по п 74, отличающийся тем, что ген р53 или протеин вводят одновременно с поражающим ДНК агентом 102 Композиция для разрушения пораженных, больныхи тому подобных клеток, содержащая протеин р53 или ген в сочетании с повреждающим ДНК агентом 103 Композиция по п 102, отличающаяся тем, что содержит протеин р53 или ген в сочетании с адриамицином, 5-флуороурацилом, этопозидом, комптотецином, актиномицином D, митомицином С или цисплатином 104 Композиция по п 103, отличающаяся тем, что содержит протеин р53 или ген в сочетании с цисплатином 105 Композиция по п 102, отличающаяся тем, что содержит рекомбинантный вектор, который обеспечивает экспрессию протеина р53 в клетке животного в сочетании с поражающим ДНК агентом 106 Композиция по п 105, отличающаяся тем, что рекомбинантный вектор является "оголенной" плазмидой ДНК, плазмидой в пределах липосомы, ретровирусным вектором, вектором аденоассоциированного вируса (AAV) или вектором аденовируса-рекомбинанта 107 Композиция по п 106, отличающаяся тем, что рекомбинантный вектор является вектором аденовируса-рекомбинанта 108 Композиция по п 107, отличающаяся тем, что рекомбинантный вектор является вектором аде новируса-рекомбинанта, локализованным в пределах аденовирусной рекомбинантной частицы 109 Композиция по п 102, отличающаяся тем, что содержит вектор аденовируса-рекомбинанта, локализованного в пределах аденовирусной рекомбинантной частицы, в сочетании с цисплатином 110 Композиция по п 102, отличающаяся тем, что диспергирована в фармакологически приемлемой форме 111 Композиция по п 110, отличающаяся тем, что пригодна для введения внутрь пораженного места 112 Терапевтический набор для разрушения пораженных, больных и тому подобных клеток, содержащий внутри соответствующей упаковки (оболочки) приготовленное фармакологическое средство рекомбинантного вектора, которое вызывает экспрессию протеина р53 в клетке животного, и приготовленное фармацевтическое средство поражающего ДНК агента 113 Терапевтический набор по п 112, отличающийся тем, что рекомбинантный вектор и поражающий ДНК агент находятся в одной упаковке 114 Терапевтический набор по п 112, отличающийся тем, что рекомбинантный вектор и поражающий ДНК агент находятся в различных отдельных упаковках 115 Терапевтический набор по п 112, отличающийся тем, что содержит фармацевтическое средство аденовируса-рекомбинанта, включающего рекомбинантный вектор, который вызывает экспрессию протеина р53 в клетке животного, и фармацевтическое средство - цисплатин Настоящее изобретение относится, в основном, к области новых направлений в усовершенствовании методов химиотерапевтического вмешательства Кроме того, настоящее изобретение предлагает новые способы и композиции, которые объединяют потенциальные возможности DNAпоражающих агентов с комбинированной доставкой гена-суппрессора новообразований Объединение DNA-поражающих факторов с ксеногенной экспрессией гена-суппрессора новообразований ведет к ощутимой синергии, подавляющей активность отдельных индивидуальных компонентов Современные методы лечения рака, включающие радиационную терапию, хирургию и химическую терапию, характеризуются ограниченной эффективностью Только рак легких убивает в Соединенных Штатах более 140000 человек ежегодно Недавно для установленной возрастной группы смертность от рака легких превысила смертность от рака груди у женщин Хотя введение в жизнь программы борьбы с курением снизило уровень распространения заболеваний от курения, уровень смертности от рака легких останется высоким даже в 21-м веке Развитие новых терапевтических методов лечения рака легких будет зависеть от проникновения в механизм биологии рака легких на молекулярном уровне В настоящее время установлено, что разновидности рака вызываются, по крайней меречастично, генетическими отклонениями, которые проявляются или в повышенной экспрессии одного или более генов, или в экспрессии отклоненного от нормы или мутантногэ гена-или генов Например, во многих случаях, как известно, экспрессия онкогенов вызывает развитие рака "Онкогены" - это генетически измененные гены, чей мутированный продукт экспрессии каким-то образом нарушает нормальное функционирование клетки или управление этим процессом (Spendidos et al, 1989) Большинство из изученных на настоящий момент онкогенов получили определение "активированных" в результате мутации, часто точечной мутации, в кодирующей области нормального клеточного гена, то есть "протоонкогена", результатом чего является замещение аминокислоты в протеиновом продукте, экспрессия которого претерпела изменение Этот продукт с видоизмененной экспрессией проявляет отклоненные от нормы биологические функции, которые оказывают влияние на протекание процесса образования опухолей (Travail et al , 1990) Не проявляющие себя мутации могут развиваться при различных обстоятельствах, например в результате химического мутагенеза или ионизирующей радиации Целый ряд онкогенов или онкогенных семейств, включая ras, myc, neu, raf, erb, src, finis, jun, abl, в настоящее время уже идентифицированы и в различной степени описаны (Travail et al ,1990, Bishop,1987) Как установлено, при нормальном росте клетки, прото-онкогены, стимулирующие рост, сбалансированы генами - супрессорами, сдерживающими рост новообразований Некоторые факторы могут внести дисбаланс во взаимодействие этих двух сил, ведущий к состоянию, предполагающему образование опухолей Одним из таких факторов является мутация в генах -супрессорах новообразований (Wemberg ,1991) Одним из важных генов-супрессоров новообразований является ген, кодирующий клеточный протеин, р53, который представляет собой ядерный фосфопротеин kD 53 (замещенный в цикле фосфопротеин kD 53), который управляет клеточной пролифератией (процессом разрастания клеток) Мутации, происходящие с геном р53, и потеря аллельного гена на хромосоме 17р, где этот ген размещен, являются одними из наиболее распространенных видоизменений, идентифицированных в злокачественных новообразованиях человека Протеин р53 обладает высокой степенью сохранности в процессе эволюции и проявляется в наиболее нормальных тканях Было продемонстрировано, как природный р53 (в некоторых источниках р53 "дикого типа") должен быть вовлечен в управление клеточным циклом (Mercer, 1992), в процесс транскрипционного регулирования (Fields et al , Mietz et al ,1992), в репликации DNA (Wilcock and Lane,1991,and Bargonetti et al ,1991) и в возбуждение апоптоза (Yomsh - Rouach et al,1991, and, Shawetal ,1992) Известны различные мутантные аллельнве гены р53,в которых единственное базовое замещение ведет к синтезу протеинов, которые имеют совершенно другие характеристики, определяющие закономерности роста, что, в конечном счете, ведет к злокачественным новообразованиям (Hollstem et al ,1991) Действительно, было установлено, что ген р53 является наиболее часто мутированным геном при раке у человека (Hollstem et al ,1991) и, в частности, ассоциируется с теми разновидностями рака, возникновение которых связано с сигаретным дымом (Hollstem et al ,Zakut - Houn et al, 1985) Чрезмерная экспрессия p53 в опухолях груди также была документально подтверждена (Casey et al ,1991) Одним из аспектов, привлекающих наибольшее внимание генной терапии рака, является использование генов - супрессоров, таких как р53, для лечения опухолей Было установлено, что трансфекция (заражение клеток чужеродной нуклеиновой кислотой, например вирусной) природного гена р53 в определенного типа опухолевых клетках рака груди и легких может восстановить управление процессом подавления роста в клеточных линиях (Casey et al,,1991,Takahasi et al , 1992) Хотя трансфекция DNA не является жизнеспособным средством введения DNA в клетки пациентов, эти результаты служат демонстрацией того, что внедрение природного гена р53 в раковые клетки, содержащие мутированный р53, может стать эффективным методом лечения, если 43917 10 будут разработаны усовершенствованные способы внедрения гена р53 В настоящее время ведется изучение проблемы и создаются системы внедрения гена, которые могут быть применены в генной терапии для подавления роста опухоли Средства на основе вируса для трансфекции гена вызывают особый интерес, благодаря способности вирусов инфицировать действительно живые клетки Налицо способ, в котором перемещается сам вирусный генетический материал В этой связи уже были отмечены некоторые успешные решения, например воспроизведение ретровирусных векторов, разработанных для доставки целого многообразия генов Однако, существуют серьезные проблемы, связанные с использованием ретровирусных векторов в генной терапии Поскольку их эффективность зависит от наличия ретровирусных рецепторов на клетках-мишенях, их трудно сконцентрировать и обеззаразить, и кроме того, они могут эффективно внедряться только в размножающиеся клетки (репликационные клетки) Основную проблему клинической онкологии составляет устойчивость клетки злокачественного новообразования к воздействию химиотерапевтического лекарственного средства Почти 80% случаев рака легких составляет рак легких с вовлечением значительного количества клеток (NSCLC) Однако больные этой формой рака, в основном, невосприимчивы к химиотерапевтическим методам лечения (Doyle,1993) Одной из задач современных исследований в области лечения злокачественных новообразований является поиск путей улучшения действенности терапевтических методов лечения рака, основанных на перемещении гена, путем изучения механизма взаимодействия между продуктом гена и химиотерапевтическими лекарственными средствами Ген герпес-симплекс-тимидин-киназы (HS-tk), будучи внедренным в опухоль мозга с помощью ретровирусной векторной системы, успешно вызывал восприимчивость к gancilclovir антивирусного агента (Culver, et al ,1992) Продукт гена HS-tK представляет собой экзогенный вирусный энзим, и поскольку экспрессия протеина wt - р53 проявляется в нормальных тканях, возникает предположение, что модуляция устойчивости к воздействию химиотерапевтических средств, вызванная альтерацией в экспрессии wt - р53, возможно явится альтернативным подходом, использующим путь, который опосредствованно определен эндогенной генетической программой Аденовирусная система имеет потенциальные преимущества при перемещении гена in vivo, например легкость получения высокого значения титра вируса, высокая степень инфекционной активности и невосприимственность для многих типов клеток Однако стабильность и продолжительность существования экспрессии внедренного гена все еще остаются проблематичными Рост уровней р53 в клетках, которые отличаются чувствительностью к химиотерапевтическим лекарственным средствам, может наблюдаться в пределах 6 часов после воздействия DNA-поражающих стимуляторов (Fntche, et al ,1993, Zhan.et al ,1993),хотя повышенная активность, вызванная 12 11 43917 действием DNA, может быть возвращена в первофекция", которое описывает образование и проначальное состояние в течение четырех часов, лифератию клеток, которые потеряли способность если стимулятор удаляют (Tishler, et контролировать процесс клеточного деления, т е al ,1993) Отсюда, высокий уровень экспрессии р53 превратились в раковые клетки Совершенно очеможет поддерживаться даже после прекращения видно, что целый ряд различных типов трансфорвоздействия на организм лекарственного средстмированных клеток можно считать потенциальныва Обеспечение экспрессии протеина wt - р53 с ми объектами использования способов и помощью Ad-p53 достигает кульминации на трекомпозиций по данному изобретению, например, тий день после инфицирования (14 - складкой саркомы, меланомы, лимфомы, широкий спектр больше, чем эндогенный "дикого типа") и снижаеттвердых опухолей и т п Хотя любая ткань, в котося до низкого уровня к девятому дню (Zhang, et рой наблюдается рост злокачественной клетки, al ,1993) Это наводит на мысль, что переменно может служить объектом использования изобревысокого уровня экспрессии wt-p53 достаточно, тения, предпочтительную область использования чтобы инициировать цитотоксическую программу составляют ткани легких и груди Изобретатели в раковой клетке обнаружили, что вектор, осуществляющий перенос рекомбинанта, вызывающего экспрессию р53 играет важную роль в определении чувстр53,оказался в состоянии значительно снизить вительности клеток рака легких человека к химиостепень роста клеток в том случае, если он истерапевтическим лекарственным средствам Мнопользуется в сочетании с поражающим DNA агенгообразие протоколов лечения(историй том болезни),включающих хирургическое вмешательство, химиотерапию и радиотерапию, было изучено, в связи с лечением разновидности рака легких человека NSCLS, однако коэффициент выживаемости в течение продолжительного срока остается неудовлетворительным В чем возникает потребность, так это в комбинированном терапевтическом методе, которым мог бы использоваться самостоятельно или в качестве вспомогательного лечения для предотвращения местного рецидива, следующего за предварительной резекцией, или который заключается в методе лечения, состоящем во введении инъекций в поврежденное место, которое первоначально было невосприимчивым к воздействию лекарственного средства, и в котором имеются метастазы, или при местном рецидиве рака легких Композиции и способы требуют дальнейших исследований, разработки и совершенствования способов клинической применимости новых средств для лечения рака Кроме того, эти способы и композиции должны подтвердить свое право на использование in vivo Настоящее изобретение направлено на решение задачи улучшения терапевтических средств и способов использования их в процессе уничтожения клеток путем объединения воздействий генасупрессора злокачественных новообразований или протеина и DNA-поражающего агента или фактора Настоящее изобретение также предлагает композиции и способы, включающие такие, которые используют вирусное перемещение генапосредника, с целью обеспечения экспрессии природного гена-супрессора злокачественного новообразования, например р53, в клеткахмишенях и направить агент или фактор, который вызывает повреждение DNA Изобретатели неожиданно обнаружили, что используя композиции, раскрытые в данном изобретении, они получили возможность вызвать запрограммированное уничтожение клетки, явление, известное под названием "апоптоз", в значительном количестве клеток мишеней Используя настоящее изобретение, авторы продемонстрировали замечательный эффект, заключающийся в контроле роста клетки ракового новообразования Формирование и рост опухолевой клетки также известны под названием "транс Изобретение предлагает в определенных примерах осуществления способы и композиции для уничтожения клетки или клеток, например раковых клеток или клетки, путем обеспечения контакта или облучения клетки или популяции клеток протеином р53 или геном и одним или более поражающими DNA агентами, общее количество которых оказывается достаточно эффективным, чтобы убить данную клетку (клетки) Перечень клеток, которые могут быть уничтожены в результате использования настоящего изобретения, включает например, нежелательные, но доброкачественные опухолевые клетки, такие как клетки гиперплазии, доброкачественной опухоли простаты, клетки щитовидной железы, отличающиеся повышенной активностью, клетки, относящиеся к аутоиммунным заболеваниям, например клетки В которые производят антитела, присутствующие в артритах, волчанке, миастения гравис, плоскоклеточной метаплазии, дисплазии и т п Хотя изобретение применимо при уничтожении, в основном, все нежелательных клеток, специфическая задача, которую оно решает - это уничтожение злокачественных клеток Термин "злокачественные клетки "относится к клеткам, которые потеряли способность к управлению циклом деления клетки, что ведет к появлению "трансформированного" или "ракового" фенотипа Для того, чтобы убить клетки, такие как злокачественные или метастазные, используя способы и композиции по настоящему изобретению, следует обеспечить контакт клетки-мишени с протеином р53 или геном и, по крайней мере, одним поражающим DNA агентом, общее количество которых достаточно эффективно, чтобы уничтожить данную клетку-мишень Этот процесс может включать обеспечение контакта с протеином р53 или геном и поражающим (и) DNA агентом (ами) или фактором(ами) одновременно Это может быть достигнуто путем обеспечения контакта клетки с одной единственной композицией или фармакологической единицей, которая включает оба компонента, или путем обеспечения контакта клетки с двумя отдельными композициями или фармакологическими единицами в одно и то же 14 13 43917 время, при условии, что одна композиция включафлуороурацил (5FU), этопозид (VP-16), камптотеет протеин р53 или ген, а другая включает порацин, актиномицин-D, митомицин С, цисплатин жающий DNA агент (CDDP) и даже пероксид водорода Настоящее изобретение также очерчивает круг использоваСовершенно очевидно, что клетка-мишень ния комбинаций из одного или нескольких пораможет быть первоначально облучена поражаюжающих DNA агентов, которые основаны на принщим (и) DNA агентом(ами), а затем приведена в ципе излучения, или представляют собой контакт с протеином р53 или геном, или наоборот активные соединения, например использование Однако, для вариантов осуществления изобретерадиоактивного излучения совместно с цисплатиния, где поражающий DNA фактор и р53 испольном или использование цисплатина с этопозидом зуют для воздействия на клетку раздельно, слеВ отдельных случаях использование цисплатина в дует четко уяснить, что между каждым из вводов сочетании с протеином р53 или геном значительуказанных компонентов не должно быть значино предпочтительнее, по сравнению с упомянутым тельного промежутка времени, чтобы поражаюсоединением щий DNA агент и р53 оставались бы в состоянии в полной мере объединенными усилиями оказать Может быть использован любой способ обесположительное воздействие на клетку Установпечения контакта клетки с протеином р53 в течелено, что в таких случаях контакт с обоими компонии периода времени, пока этот способ обеспечинентами следует осуществлять с промежутками в вает высокие уровни инфицирования протеина пределах 12-24 часов, а более предпочтительно, р53 внутри клетки Он включает как прямую досс промежутками в пределах 6 - 1 2 часов, при этом тавку протеина р53, так и доставку гена или DNAнаиболее предпочтительным временем задержки сегмента, который кодирует р53,при этом данный (опаздывания) следует считать около 12 часов ген должен будет возбудить экспрессию и образование р53 внутри клетки При таком способе досТермины "приведенные в контакт "или "подтавки протеина наблюдается недостаток, который верженные воздействию", в применении к клетке, заключается в деградации протеина и низкой поиспользуются в настоящем описании для того, глотительной способности клетки Сделано зачтобы охарактеризовать процесс, с помощью коключение, что способ использования рекомбиторого ген-супрессор злокачественной опухоли нантного вектора, вызывающего экспрессию или протеин, например р53, и поражающий DNA протеина р53, обладает значительными преимуагент или фактор доставляется к клетке-мишени ществами или приводится в непосредственное соприкосновение с данной клеткой-мишенью Чтобы обеспеМожет быть разработано широкое многообрачить умерщвление клетки, оба компонента досзие рекомбинантных плазмидов и векторов, спотавляются в клетку в общем количестве, собных вызвать экспрессию протеина р53 и, будудостаточном для обеспечения процесса уничточи таким образом использованными, доставить жения этой клетки, т е запрограммированной гир53 в клетку Например известно использование бели клетки или апоптоза Термины "умерщвле"голой" DNA и плазмидов р53 для непосредственние", "запрограммированная гибель клетки" и ной доставки генетического материала в клетку "апоптоз" в настоящем контексте взаимозаменяе(Wolfe et al , 1990), соединения р53 - кодирующей мы и используются для описания серии внутриDNA, находящиеся в ловушке у липосом (Ledley et клеточных превращений, которые ведут к уничтоal ,1987) или у протолипосом, которые содержат жению клетки-мишени Процесс уничтожения протеины рецептора в вирусной оболочке (Nicolau клетки-мишени приводит в активное состояние et al ,1983), и р53-кодирующие DNA, присоединенвнутриклеточные протеазы и нуклеазы, что обесные к комплексу-переносчику полилизингликопропечивает ядерную инволюцию клетки и фрагментеина тацию ядерной DNA Понимание точных механизИзучалось также использование вирусовмов внутриклеточного молекулярного рекомбинантов, разработанных для обеспечения взаимодействия, направленных на осуществление проявления экспрессии р53 умерщвления клетки, не обязательно при испольЦелый набор вирусных векторов, например зовании настоящего изобретения ретровирусные векторы, вирус простого пузырькового герпеса (герпес-симплекс-в и рус) (патент США Поражающие DNA факторы или агенты в на№5 288 641, включенный в перечень ссылок), вистоящем контексте определяются как любые хирусы цитомегалии и т п могут быть использованы, мические соединения или методы лечения, котокак описано Миллером (Miller, 1992), могут быть рые вызывают повреждение DNA в применении к использованы рекомбинантные аденоассоциироклетке Такие агенты и факторы включают излучеванные вирусы (векторы AAV), описанные в пание или волны, которые стимулируют повреждетенте США №5 139 941 и включенные в перечень ние DNA, например ' - излучение, Х- излучение, ссылок, а также, в частности, векторы аденовируультрафиолетовое (UV) излучение, микроволны, сов-рекомбинантов Технологии приготовления электронные эмиссии и т п Многообразие химирешшкационно-дефектных инфицирующих вируческих соединений, присутствующее в описании в сов хорошо известны из уровня техники, а их привиде термина "химиотерапевтические" агенты, меры описаны в работах авторами Ghosдействуют как средства, вызывающие поражение Choudhury & Graham (1987), McGrory et al, (1988), DNA, при этом все они могут быть использованы в и Gluzman et al (1982), каждая из которых привекомбинированных методах лечения, раскрытых в дена в перечне ссылок настоящем изобретении Перечень предназначенных к использованию химиотерапевтических агенДля того, чтобы умертвить клетку в соответсттов включает например адриамицин,5вии с настоящим изобретением, следует обеспе 16 15 43917 чить контакт клетки с протеином р53 или геном и с дельности, и, предпочтительно, такие поражающим DNA агентом при их объединенном объединенные количества, которые обеспечивают количестве, достаточно эффективном для того синергическое снижение генетического груза в .чтобы умертвить данную клетку Термин "при опухолевом новообразовании объединенном их количестве, достаточно эффекИзучение in vivo и ex vivo определенных паративном для того, чтобы умертвить данную клетку" метров умерщвления клетки являются также эфозначает, что количества р53 и поражающих DNA фективными средствами, с помощью которых доагентов должны быть достаточными настолько, казывается эффективность композиций ичто, в том случае, если они будут объединены способов по настоящему изобретению Например, внутри клетки, это вызовет апоптоз данной клетки наблюдения воздействуют на подавление онкоХотя данного замечания и не требуется для кажгенности, измеренной с помощью экспрессии TdT дого из примеров осуществления изобретения, в замороженных высечек тканей или путем исполькачестве объединенного эффективного количестзования методов окрашивания и антигенов клеткива р53 и поражающего DNA агента, предпочтимишени, что не является новостью для паталотельно может быть принято такое количество, гоанатомов Естественно, другие способы опредекоторое инициирует умерщвление значительно ления массы опухоли, ее роста и жизнеспособнобольшого количества клеток, чем использование сти также могут быть использованы для каждого элемента в отдельности Наиболее предустановления факта умерщвления клеток почтительным может считаться такое эффективмишеней В частности, можно определить такое ное объединенное количество, которое будет соповедение в живом организме различных моделей ставлять величину, инициирующую синергическое раковых систем, включая те, в которых раковые умерщвление клетки в сравнении с результатами, клетки человека локализованы в пределах оргакоторые наблюдаются при использовании каждого низма животного Известно, что модели рака жииз элементов в отдельности вотного, в отличие от модели AIDS, имеют большое сходство(прогнозируемы) с режимами Определенное количество параметров in vitro лечения, разрабатываемыми для человеческого может быть использовано для определения реорганизма (Roth et al , редакторы, 1989) Сущестзультата, который достигается в результате привует один экземпляр образца прогнозируемой моменения композиций и способов, предлагаемых дели животного, в которой подкожно выращивали настоящим изобретением Эти параметры вклюклетки рака легких человека, разновидность коточают, например, подсчет результирующего колирого отличается малым размером клетки (клетки чества клеток до и после воздействия композиН358) Используя данную систему, изобретатели циями, описанными в настоящем изобретении, а показали, что аденовирус, несущий р53, введентакже измерением размеров многоклеточных опуный в виде капель внутрь пораженной опухолью холевых сфероидов, сформированных таким же области совместно с введением химиотерапевтиобразом, каким формируются их колонии в кульческого агента приводит к совершенно неожидантуре ткани In vitro процесс умерщвления клетки, в ному эффективному уменьшению клеток опухоли частности, показан в примере 1 осуществления способа настоящего описания Дополнительно Одним из предпочтительных способов доставможно измерить параметры, которые характерны ки протеина р53 в клетку является обеспечение для клетки, подвергающейся запрограммированконтакта клетки с вирионом аденовирусаному умерщвлению, например фрагментации клерекомбинанта или с частицей, которая включает точной геномной DNA на фрагменты с размерами вектор аденовируса-рекомбинанта, состоящий из нуклеосомы, которые, в основном, идентифицирообласти экспресии р53, расположенной под конвались путем выделения фрагментов при электролем промотора, способного направлять экстрофорезе геля агарозы, окраски DNA и сравнепресию р53 в данном типе клетки ния DNA с размерной цепочкой DNA Фрагменты с Область экспрессии р53 в векторе может соразмером нуклеосомы идентифицируются как держать последовательность геномов, но для упвозрастающие ступеньки (по типу спущенной петрощения можно предположить, что более предли) или цепочки мономеров или полимеров, почтительно использование последовательности имеющих основной блок приблизительно из 200 cDNA p53, так как это легко доступно для анализа пар уровня техники в данной области и проще в управлении процессом В дополнение к экспресПо аналогии, термин "терапевтически эффексии р53 и зоне промотора вектор должен также тивное количество" означает объединенное коливключать сигнал полиаденилации (polyadenilation), чество протеина р53 или гена поражающего DNA например ранний ген SV40 или ген протамина, агента, которое при введении в организм животноили что-либо подобное го в состоянии умертвить клетки внутри организма животного Это, в частности, подтверждается В предпочтительных вариантах изобретения умерщвлением раковых клеток, например, клеток предполагается, что может возникнуть необходирака легких, груди или клеток рака толстой кишки мость в расположении зоны экспрессии р53 под в организме животного или человека, пораженного контролем сильного, существенного (структурного) злокачественной опухолью Термин "терапевтичепромотора, например промотора цитомегаловируски эффективные соединения " означает, в основса (CMV), вирусного промотора LTR.RSV или ном, таким образом объединенные количества SV40 или промотора, ассоциированного с генами, р53 и поражающих DNA агентов, действие котокоторые проявляют экспрессию на высоких уроврых направлено на умерщвление большего колинях в клетках млекопитающих (молочной железы), чества клеток, чем каждый из элементов в отнапример промоторы фактора-1 элонгации или 18 17 43917 актина Все эти варианты имеют право на сущестиспользован любой аденовирус из 42 известных вование в связи с использованием изобретения В различных серотипов или подгрупп A-F Аденовинастоящее время наиболее предпочтительным рус типа 5 подгруппы С является предпочтительпромотором считается промотор IE вируса цитоным стартовым материалом для получения цельмегалии (CMV) ного репликационно-дефектного вектора аденовируса для использования в методике, Ген р53 или cDNA может быть введен в адепредлагаемой настоящим изобретением Аденоновирус-рекомбинант.в соответствии с настоящим вирус типа 5 выбран потому, что, в связи с этим изобретением, простым включением или добаваденовирусом человека, накоплен значительный лением кодирующей последовательности р53 в объем биохимической и генетической информавирусный геном Однако, в качестве предпочтиции, и, кроме того, он традиционно применяется тельных аденовирусов следует рассматривать для большинства структур, использующих аденодефектные вирусы репликаций, в которых вирусвирус в качестве вектора ный ген, существенный для репликации и / или "упаковки" был удален из аденовирусной векторСпособы и композиции, в связи с настоящим ной структуры, давая возможность зоне экспресизобретением, одинаково пригодны для умерщвсии р53 переместиться на свое место Любой ген, ления клетки или клеток как in vivo, так и in vitro В то ли существенный, например EIA, Е2, Е4, то ли том случае, когда клетки, предназначенные для несущественный, например ЕЗ, для репликации, умерщвления, сосредотачиваются внутри оргаможет быть удален и замещен рЗЗ В частности, низма животного, например раковые клетки рака предпочтительными являются те векторы и вилегкого, груди или прямой кишки, или другие клетрионы, в которых области Е1А и Е1В векторов ки, несущие мутированный р53, в данном случае аденовируса удалены, а зона экспрессии р53 внепротеин р53 или ген, а также поражающий DNA дрена на их место, что показано в качестве приагент должны вводиться в организм животного в мера на структуре генома на фиг 1 фармакологически приемлемом виде Термин "фармакологически приемлемый вид" в настояТехнологические процессы приготовления рещем контексте относится как к форме любой из пликационных дефектных аденовирусов хорошо композиций, которая может быть введена в оргаизвестны из уровня техники, что подтверждается низм животного, так и к методу обеспечения конприведенными в данном описании аналогами такта живого организма с радиационным излучеGhoss-Choudhury и Graham (1987), Me Grory et al , нием, т е к способу, с помощью которого (1988), и Gluzman et al , (1982), перечисленными в облучается какая-либо зо ча тела животного, нассылках на использованную литературу Кроме пример путем ' - излучения, Х- лучей, ультратого, хорошо известно, что могут быть использофиолетового (UV) излучения, микроволн, элекваны различные клеточные линии, с целью востронных эмиссий и тп Использование произведения аденовирусов-рекомбинантов, при поражающей DNA радиации и волн известно всем, этом, их воспроизведение может продолжаться до кто имеет опыт работы в области лучевой тератех пор, пока существует возможность дополнепии ния дефекта репликации, если таковой присутствует Предпочтительной клеточной линией являНастоящее изобретение также предлагает ется клеточная линия 293 человека, но способы лечения рака, которые, в основном, существуют также и другие клеточные линии, привключают введение в организм животного или емлемые для репликации, например, могут быть человека, больного раком, терапевтически эфиспользованы в предпочтительном случае эксфективной комбинации протеина р53 или гена и прессии Е1А и Е1В Причем клетки могут воспропоражающего DNA агента Это может быть досизводиться как на пластмассовых чашках, так и в тигнуто, благодаря использованию рекомбинанткультуре суспензии, чтобы получить запасы кульного вируса, в частности аденовируса, который туры вирусов несет вектор, способный вызвать экспрессию р53 Изобретение не ограничивается вирусами с в клетках опухолевых новообразований Композинедостающим звеном Е1 и клетками с экспрессией ция, несущая ген р53, в основном, должна быть Е1 Действительно, в связи с настоящим изобревведена в организм животного часто при обеспетением, могут быть использованы другие дополчении тесного контакта с опухолью, в виде фарняемые комбинации вирусов и клеток - хозяев мацевтически приемлемой композиции ПредпочМогут быть использованы клетки с экспрессией Е2 тительным способом является непосредственное и вирус, теряющий функциональное звено Е2 точвпрыскивание терапевтически эффективного коно так же, как и клетки с экспрессией Е4 и вирус, личества гена р53, такого, который размещается в теряющий функциональное звено Е4 и т д В том пределах границ рекомбинантного вируса, в то случае, если несущественный для репликации ген место в организме, которое поражено опухолью удаляется или замещается, каковым, например, Однако имеют право на существование и другие является ген ЕЗ, такой дефект нет надобности парентеральные способы введения, например отдельно укомплектовывать с помощью клеткивнутривенно, через кожу, эндоскопически или с хозяина помощью подкожного впрыскивания Для успешного использования изобретения При лечении рака, в соответствии с настояединственным требованием является создание щим изобретением, можно обеспечить контакт векторов аденовирусов, которые способны возбуклеток опухоли с поражающим DNA агентом, в ждать экспрессию р53 Природа же исходного адедополнение к воздействию протеина р53 или гена новируса решающего значения для использоваЭтот способ может осуществляться путем облучения изобретения не имеет Может быть ния места сосредоточения опухолевых тканей 19 43917 поражающей DNA радиацией, например рентгеновскими лучами, ультрафиолетовым световым излучением 'У - лучами или даже микроволнами Кроме того, опухолевые клетки могут быть приведены в контакт с поражающим DNA агентом путем введения в организм животного фармацевтически эффективного количества фармацевтического средства, содержащего поражающее DNA соединение, например адриамицин,5-флуороурацил, этопозид, камптотецин, актиномицин-D, митомицин С, а еще лучше - цисплатин Поражающий DNA агент может быть приготовлен и использован в виде сложной терапевтической композиции или фармакологического набора, полученного объединения поражающего DNA агента с протеином р53, геном или генной системой доставки, как было описано выше Поразительный положительный эффект, возникающий при использовании настоящего изобретения раскрывается в том, что использование вируса Ad5CMV-p53 в сочетании с тшсплатином показало замечательные результаты в исследованиях, использующих модель безволосой мыши Комбинированный режим вирус-поражающей DNA терапии значительно-снизил онкогенность клеток Н358, клеток, которые нормально производят значительные опухолевые массы Онкогенность раковых клеток рака легких была подавлена, благодаря лечению с помощью Ad5CMV-p53, но не благодаря лечению контрольным вирусом, вызывающим экспрессию люциферазы Это указывает на то, ччо протеин р53 в сочетании с поражающим DNA агентом имеет большую терапевтическую эффективность Специалистам, компетентным в данной области знаний, известны методы доставки химиотерапевтических средств, включая структуры экспрессии DNA, в эвкариотические клетки В свете настоящего изобретения опытный специалист будет в состоянии доставить как поражающие DNA агенты, так и протеины р53 или гены к клеткам, используя для этого многообразие эффективных средств Для доставки DNA in vivo изобретатели предполагают использование различных генных систем доставки, например вирусную и с промежуточным звеном липосомы трансфекцию В контексте описания настоящего изобретения термин "трансфекция" используется для описания адресной доставки DNA в эвкариотические клетки путем использования таких систем доставки, как например, аденовирусные, AAV, ретровирусные или системы доставки гена с помощью плазмидов Специфичность вирусной доставки может быть выбрана для предпочтительного непосредственного переноса гена в отдельную специфичную клетку-мишень При этом используются вирусы, которые способны инфицировать эти отдельные специфичные виды клеток Естественно, различные особенности разновидностей вирусов определяют специфику выбора подходящего вируса для переноса гена по принципу того, как и генсупрессор злокачественного новообразования должен проявить свою способность к умерщвлению злокачественной клетки указанного типа 20 Было обнаружено, что применить поражающий DNA химиотерапевтический агент можно, используя целое многообразие средств, например, с помощью использования парентеральных способов доставки, таких как внутривенные и подкожные инъекции и т п Такие способы известны специалистам в области введения в организм лекарственных средств и будут описаны в разделе, относящемуся к фармацевтическим препаратам и способам лечения Для доставки гена in vitro могут быть использованы различные способы, например применение фосфата кальция или трансфекция с промежуточным звеном из декстрин-сульфата, электрофорез, позиционирование (целеуказание) с помощью стеклянного микроснаряда и т п Эти методы хорошо известны из уровня техники, а точный состав средств и методика их использования дается в описании к данному изобретению Другие варианты осуществления изобретения относятся к композициям, включающим фармацевтические средства, состоящие из протеина р53 или гена в сочетании с поражающим DNA агентом, например цисплатином В таких композициях р53 может быть представлен в виде сегмента DNA рекомбинантного вектора или рекомбинантного вируса, который способен вызывать экспрессию протеина р53 в клетке животного Данные композиции, включая и такие, которые содержат систему-вируса-рекомбинанта, предназначенную для доставки гена, например аденовирусную частицу, могут быть приготовлены для введения in vitro путем диспергирования в фармакологически приемлемом растворе или буферной смеси Предпочтительные, фармакологически допустимые растворы включают нейтральные физиологические растворы, защищенные фосфатом, лактатом, тризом (Tns) и т п Безусловно, у всех, кто использует вирусную систему доставки, существует стремление очистить вирион до такой степени, чтобы существенно освободить его от нежелательных загрязнений, таких например, как дефектные, создающие помехи аденовирусные частицы или эндотоксины и другие пирогены, чтобы этот вирион, не вызывал побочных реакций в организме животного или человека, получающего векторную структуру Предпочтительными средствами очистки вектора является создание условий для использования градиентов плавучей плотности, например, центрифугирование хлорида цезия в градиенте плотности Предпочтительными фармацевтическими средствами по изобретению являются такие, которые включают, в пределах фармакологически приемлемого раствора или буферной смеси, протеин р53, или предпочтительнее ген р53, в сочетании с химиотерапевтическим поражающим DNA агентом Примерами химиотерапевтических агентов могут служить адриамицин.флуороурацил5, комптоцин,актиномицин-D, пероксид водорода, митомицин С, цисплатин (CDDP) и этопозид (VP16), при этом особенно предпочтительным является использование цисплатина Последующие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к наборам, пред 22 21 43917 назначенным для умерщвления клеток, а именно жения промотора главного гена IE цитомегаловираковых клеток, которые могут быть определены руса (CMV) человека Первичный элемент 2 сокак терапевтические наборы для лечения рака средоточен в зоне раннего сигнала Такие наборы, по настоящему изобретению, полиаденилации SV40 Оба эти элемента расподолжны, в основном, содержать размещенную в ложенные в 15-20Ьр от ввода CDNA р53 на двух соответствующей контейнерной оболочконцах, определяют продукт 1,40kb цепной реакке(капсуле) фармацевтическое средство рекомбиции полимеризации (PCR) Первичные элементы 3 нантного вектора, которое способно вызвать экси 4 сосредоточены в 11 ячейке карты ( т и,) и 13,4 прессию протеина р53 в клетке животного, и ячейке карты (m u) генома Ad5,соответственно, и фармацевтическое средство поражающего DNA определяют специфический продукт 0,86kb цепагента Рекомбинантные векторы и поражающие ной реакции полимеризации (PCR) генома-вируса, DNA агенты могут присутствовать в одной и той На фиг2В показаны пробы геля агарозы проже капсуле или эти компоненты могут вводиться в дукта цепной реакции полимеризации (PCR) Две отдельных различных капсулах В предпочтительпары первичных элементов (параметров),которые ном варианте в качестве рекомбинантного вектора определяют фрагменты DNA 1,4kb (p53) и 0,86kb используется вектор аденовируса-рекомбинанта, (Ad5), были использованы в каждой реакции В вызывающий экспрессию р53, при этом данный каждой реакции были использованы матрицы вектор присутствует в пределах аденовирусной DNA плазмид рЕС53 (1-я полоса), DNA частицы, а в качестве поражающего DNA агента Ad5/RCV/GL2 01-я полоса, никаких DNA (3-я полоиспользуют цисплатин са) и DNA Ad5CMV -p53 (4-я полоса) Полоса с обозначением (М) соответствует генам-маркерам Компоненты набора, предпочтительно, ввомолекулярного веса дятся в виде жидких растворов или сухого порошка Втом случае, когда компоненты вводят в виде На фиг2С показано картирование ограничежидкого раствора, в качестве жидкого раствора ния DNA Ad5CMV-p53 Образцы DNA, очищенной используют водный раствор, причем особенно от CsCI - градиента AdSCMV - р53, были классипредпочтительным является стерильный водный фицированы по признаку отсутствия энзима (U), раствор В том случае, когда реагенты или компоHind III (Н) (задний, задняя нога туши), Ват НІ (В), ненты вводятся в виде сухого порошка, порошок Eco Rl (E) и СІа І (С), соответственно, и проаналиможет менять свое состояние путем добавления зированы на 1% геле агарозы Дорожка с обознаподходящего растворителя Вполне очевидно, что чением (М) соответствует генам-маркерам молерастворитель может присутствовать в другом конкулярного веса тейнерном средстве На фигЗА.ЗВ.ЗС и 3D показаны результаты наблюдения цитопатогенных эффектов на клетках Краткое описание рисунков 293, полученных с помощью аденовирусаЧастью настоящего описания являются рисунрекомбинанта ки, которые включены для дополнительного раскрытия определенных аспектов изобретения ИзоНа фигЗА.ЗВ.ЗС и 3D даны серии фазовых бретение может быть лучше понято при контрастных изображений (х 400) клеток 293 обращении к одному или целому ряду приведенНа фигЗ А.ЗВ.ЗС и 3D даны четыре фотограных рисунков в сочетании с подробным описанием фии одной фигуры, показанной на странице Фиотдельных вариантов осуществления изобретегура 2А - перед трансфекцией, фигура ЗВ - отриния цательный контрольный результат на 12-й день после трансфекции, фигура ЗС -появление цитоФиг 1 Дана схема образования аденовирусапатогенного эффекта (СРЕ) на 12-й день после рекомбинанта р53 Кассета экспрессии р53 была трансфекции, фигура 3D - полное проявление цивведена между ХЬа - и Cla участками pXCJL 1 топатогенного эффекта (СРЕ) на 14-й день после Вектор экспрессии р53 (рЕС53) и рекомбинантныи трансфекции плазмид (pJM17) были подвергнуты котрансфекции в клетках 293 Зараженные клетки выдержиНа фиг4А,4В,4С и 4D дана иммунология клевались в среде до тех пор, пока не проявлялся ток, инфицированных аденовирусамицитопатогенный эффект Идентификация вновь рекомбинантами образованных аденовирусов-рекомбинантов р53 На фиг4А,4В,4С и 4D показаны серии имму(AdSCMV - р53) производилась на пробах цепной нологических изображений клеток Н358 На реакции полимеризации (PCR) DNA с использовафиг4А,4В,4С и 4D даны 4 фотографии фигуры, нием матриц DNA, приготовленных из надосадочпредставленной на одной странице Проявление ной жидкости, обработанной протеиназой К и эксспособности к инфицированию в клетках трактом фенола Н358 Клетки Н358 были инфицированы Ad5CMVр53 или Ad5/RCV/GL2 в 50 PFU/клетка в течение На фиг2А показана карта, применяемая для 24 часов Питательная среда была использована структурных исследований DNA Ad5CMVединственно, в качестве смоделированной инр53 Карта DNA генома AdCMV-p53 с местами расфекции Инфицированные клетки были проаналиположения кассет экспрессии р53,первичных мазированы с помощью иммуноокрашивания На фиг териалов цепной реакции полимеризации (PCR) и 4А представлены результаты испытаний смодеограничивающих участков Размер генома около лированной инфекции с помощью антитела anti35,4kb, разделенные на 100 ячеек карты (1 п и р53 На фиг4В показаны клетки, инфицированные (ячейка карты = 0,35kb) Кассета экспрессии заняконтрольным Ad5/RSV/GL2 и испытанные с помола место зоны Е1 (1,3 - 9,2 m u) генома щью антитела anti-p53 На фиг 4С даны инфицироAd5 Первичный элемент 1 сосредоточен в первом ванные клетки Ad5CMV-p53, испытанные с помоинтроне, расположенном вниз по траектории дви 23 43917 щью несвязанного антитела (МОРС21) На cpnr4D показана клеточная инфекция АЬ5СМУ,испытанная антителом anti-p53 В качестве антитела anti-p53 был использован Pab 1801,а для окрашивания применяли авидинобиотиновый метод На фиг5А показано сравнение относительного уровня экспрессии экзогенного р53 в клетках Н358 с помощью геля SDS-PAGE, окрашенного в голубой цвет (Coomassie - blue) Образцы клеток Н358,которые были инфицированы Ad5CMV-p53 или Ad5/RSV/GL2 в 30 PFU/клетка, препарировались в течение 24 и 72 часов после инфицирования Испытывались образцы пробы SDS-PAGE, окрашенной в голубой цвет (Coomassie blue), с целью определения относительного содержания протеина Полосы 1 и 4 содержат образцы клеток, инфицированных Ad5/RSV/GL2 Полосы 2 и 3 содержат образцы клеток, инфицированных двумя индивидуальными группами AdSCMV - р53 через 24 часа после инфицирования Полосы 5 и б - это образцы Ad5CMV-p53 - инфицированной клетки, собранные через 72 часа после инфицирования Полоса 7 - это образец Н358 с моделированным инфицированием через 72 часа после инфицирования Полоса М - это предварительно окрашенные гены-маркеры молекулярного веса в kDu (CIBCO - BRL) На фиг 5В дан блотированный Western анализ геля, размещенного на полосе, идентичной той, которая принадлежит SDS-PAGE на фиг 5 А Относительные уровни экспрессии р53 были исследованы Western блотированием с использованием anti - р53 Первичные антитела были моноклинальными антителами против протеина р53 (Pab 1801 .Oncogene Science Inc) и Р-актина (Amersham Inc) HRP-коньюгированное вторичное антитело и ECL- проявитель были получены из вирус-инфицированных клеток Н358, прошедших Western блотирование (Amersham Inc) Отпечаток, полученный Western блотированием, на фиг5В, имеет эквивалентную методику восстановления и лечения, что и у тех, которые представлены на фиг 5 А На фиг 6 показано время протекания экспрессии р53, определенное Western блотированием Множественные чашки клеток Н358 были инфицированы AdSCMV при 10 PFU/клетка Клеточные лизаты были приготовлены в установленные моменты времени после инфицирования Western блотирование было испытано с помощью антител анти-р53 и антиактина одновременно Полосы с отметкой 'С представляют отрицательные результаты Гистограмма показывает относительные количества р53, определенные с помощью денситометра На фиг 7А показана кривая роста вирусинфицированных клеток рака легких у человека в клеточных линиях Н 358 Клетки были засеяны в количестве 105 клеток на чашку (60мм), при этом в процессе участвовали 6 чашек на одну клеточную линию Через 24 часа клетки были инфицированы Ad5CMV-p53 или Ad5/RSV/GL2 при 10 т о і (множественность инфицирования, те PFU/клетка) После инфицирования клетки подсчитывались ежедневно в течение 6 дней Кривые 24 роста представляют данные, полученные при наблюдении четырех отдельных исследований На фиг 7В показана кривая роста вирусинфицированных клеток рака легких у человека в клеточных линиях Н 322 Клетки были засеяны в количестве 105 клеток на чашку (60мм), при этом в процессе участвовали 6 чашек на одну клеточную линию Через 24 часа клетки были инфицированы Ad5CMV-p53 или Ad5/RSV/GL2 при 10 m о і (множественность инфицирования, т е PFU/клетка) После инфицирования клетки подсчитывал ись ежедневно в течение 6 дней Кривые роста представляют данные, полученные при наблюдении четырех отдельных исследований На фиг 7С показана кривая роста вирусинфицированных клеток рака легких у человека в клеточных линиях Н 460 Клетки были засеяны в количестве 105 клеток на чашку (60мм), при этом в процессе участвовали 6 чашек на одну клеточную линию Через 24 часа клетки были инфицированы Ad5CMV-p53 или Ad5/RSV/GL2 при 10 т о і (множественность инфицирования, те PFU/клетка) После инфицирования клетки подсчитывались ежедневно в течение 6 дней Кривые роста представляют данные, полученные при наблюдении четырех отдельных исследований На фиг 8 показана схема последовательности операций при исследовании AdSCMV - р53 в ортотопической модели рака легких Дозировка и методика лечения безволосых мышей, зараженных клетками Н226Вг и вирусами, представлены в указанной схеме На фиг9А,9В,9С и 9D показаны образцы средостений, легких мышей, прошедших лечение, и контрольных мышей Фиг 9А,9В,9С и 9D - это фотографии одной фигуры Особь была принесена в жертву в конце 6-недельного периода, наступившего после прекращения лечения Ткани легкого и средостения были иссечены для изучения опухолевого формообразования На фигЭА показан образец медиастинального блока от нормальной безволосой мыши На фиг 9В дан образец медиастинального блока из мыши, которая была подвергнута лечению с помощью переносчика фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) На фигЭС показан образец медиастинального блока от мыши, прошедшей курс лечения AdSCMV -р53 На фиг 9D представлен образец медиастинального блока, взятого от мыши, прошедшей курс лечения Ad5/RSV/GL2 Стрелки указывают на опухолевые массы На фигЮА показано непрерывное воздействие CDDP на степень роста родительских Ad-Lucинфицированных и Ad-p53-инфициpoвaнныx клеток Н358 Клетки Н358(1,5 х 105 клеток/лунка) были высеяны в двух экземплярах на чашке с 24 лунками Через 24 часа в 1 0 0 ^ 1 среды был добавлен Ad-Luc-вирусный штамм (запас биомассы) (108 PFU/мл) или Ad-p53-BHpycHbm штамм (10 PFU/мл) Через дополнительные 24 часа инкубационного периода среда, содержащая вирус, была заменена свежей средой, которая содержала 1 ^ г/мл CDDP 25 26 полученное в результате испытания "Students ttest" (студенческого t-испытания), чем у контрольной группы (Ctl) На фиг 12B,12C,12D,12E показано маркирование по месту dUTP с TdT- определением апоптоза Сфероиды Н358 были зафиксированы на третий день и окрашены по методике, описанной в материалах и способах примера 7 Контрольный необработанный сфероид (В), сфероид (С), обработанный CDDP, сфероид(О), инфицированный Adр53 и сфероид (Е),инфицированный Ad-p53 и обработанный CDDP Bar = 1 0 0 ^ м 43917 На фиг 10В показано воздействие CDDP в течение 24 часов на рост родительских Ad-Lucинфицированных и Ad-p53 - инфицированных клеток Н358 Клетки были подвержены воздействию CDDP непрерывно (фигЮА) или в течение 24 часов (фиг 10В), после чего следовало восстановление в свободной от лекарственного средства среде Клетки, которые оставались в виде приложенного монослоя, были испытаны на жизнеспособность в течение более пяти дней путем определения степени поглощения голубизны трипана Показано значение +/-8Е На пятый день клеточное число для Ас1-р53 CDDP-группы значительно отличалось от всех остальных групп как для А, так и для В (р