Спосіб модифікації фрагмента днк, що кодує інсектицидний білок bacillus thuringiensis, фрагмент днк, що кодує інсектицидний білок bacillus thuringiensis (варіанти), фрагмент днк, що кодує повнорозмірний інсекти

Настоящее изобретение относится к генетической инженерии и, более подробно, к растительной трансформации, в которой растение трансформируют, чтобы экспрессировать гетерологичный ген. Хотя в последние годы сделан значительный прогресс в отношении трансгенных растений, который экспрессируют чужеродные белки, такие как ферменты устойчивости к гербицидам и белки оболочки вирусов, очень мало известно об основных факторах, воздействующих на экспрессию чужеродных генов в растениях. Несколько потенциальных факторов может быть чувствительно в различной степени на уровне белковой экспрессии с отдельно кодирующей последовательности. Уровень отдельной мРНК в клетке, несомненно, критический фактор. Потенциальных причин низких устойчивых установившихся уровней мРНК, обусловленных природой кодирующей последовательности, много. Во-первых, синтез полноразмерной РНК может не идти с высокой частотой. Это могло бы быть вызвано, например, преждевременной терминацией РНК во время транскрипции или обусловливаться неожиданным процессингом РНК во время транскрипции. Во-вторых, полноразмерная РНК могла бы продуцироваться, но затем процессироваться (сплайсинг присоединение поли/А/) в ядре в такой манере, что образует нефункциональную мРНК. Если РНК правильно синтезирована, терминирована и полиаденилирована, тогда она может идти в цитоплазму для трансляции. В цитоплазме мРНК имеют определенные времена жизни, которые детерминируются их последовательностями и клеточным типом, в котором они экспрессированы. Некоторые РНК очень короткоживущие и некоторые гораздо более долгоживущие. В дополнение, имеет ся эффект, важность которого неопределенна, трансляционной эффективности на полужизни мРНК. В дополнение, каждая молекула РНК складывается в определенную структуру, или, возможно, семейство структур, которые детерминируются ее последовательностью. Отдельная последовательность любой РНК может проводиться к большей или меньшей стабильности в цитоплазме. Структура, возможно, также определяется процессингом в ядре. К сожалению, невозможно предсказать и почти невозможно определить структуру любой РНК (за исключением тРНК) in vitro или in vivo. Однако, похоже, что драматическое изменение последовательности РНК будет оказывать большой эффект на принимаемую ей структуру. Похоже, что структура или отдельные структурные черты также имеют роль в определении стабильности РНК. В РНК идентифицировано несколько отдельных последовательностей или сигналов, которые могут оказывать специфический эффект на стабильность РНК. Этот раздел суммирует все, что известно об этих последовательностях и сигналах. Эти идентифицированные последовательности часто А + Т богатые, и, таким образом, более вероятно, что встречаются в А + Т кодирующей последовательности, такой как B.t. ген. Такой мотив последовательности АТТТА (или АУУУА в РНК) вовлечен как дестабилизирующая последовательность в мРНК клеток млекопитающих (Shaw и Kamen 1986). О функционировании такой последовательности в растениях работ не проводилось. Многие короткоживущие мРНК имеют А + Т богатые 3' нетранслируемые районы, и эти районы часто имеют АТТТА последовательность, иногда присутствующую во многих копиях или как мультимеры (т.е., АТТТАТТТА....). Shaw и Kamen показали, что перенос 3' конца нестабильной мРНК к стабильной РНК (глобина или VA1) уменьшает время полужизни стабильной РНК в очень сильной степени. Они в дальнейшем показали, что пентамер АТТТА оказывал глубокий дестабилизирующий эффект на стабильный предшественник, и что этот сигнал может оказывать свои эффекты, в зависимости от того его располагали на 3' конце или внутри кодирующей последовательности. Однако, положение последовательностей АТТТА и/или последовательности, по соседству с которыми она оказывается, также, кажется, важно для определения, функционируют ли они как дестабилизирующее последовательности. Шоу и Камен показали, что тример АТТТА имел гораздо меньший эффект, чем пентамер на стабильность мРНК и димер или мономер не оказывали эффекта на стабильность (Шоу, Камен, 1987). Заметьте, что мультимеры АТТТА, такие как пентомер автоматически образуют А + Т богатый район. Это, как показано было, оказывает цитоплазматический эффект, а не ядерный. У других нестабильных мРНК, последовательность АТТТА может присутствовать только в одной копии, но часто содержится в А + Т богатом районе. Из данных по клеткам животных, собранных к настоящему времени, оказывается, что АТТТА по меньшей мере в некоторых контекстах (окружениях) важна для стабильности, но ещ е невозможно предсказать, какие положения АТТТА делают их дестабилизирующими элементами или похоже ли, что любые из этих эффектов наблюдаются в растениях. Некоторые исследования по деградации мРНК в животных клетках также указывают, что деградация РНК может начинаться в некоторых случаях с нуклеолитической атаки в А + Т богатые районы. Не ясно, происходят ли эти разрезания в АТТТА последовательностях. Существуют также примеры мРНК, которые имеют различную стабильность, зависящую от типа клетки, в которых они экспрессируются или от стадии клеточного цикла, на которой они экспрессируются. Например, гистоновые мРНК стабильны во время синтеза ДНК, но нестабильны, если синтез ДНК прекращен. 3' конец некоторых гистоновых мРНК, кажется, ответственен за этот эффект (Pandey и Mazzluff, 1987). Не кажется, что это направляется АТТТА, не является также ясным, что контролирует резную стабильность этой мРНК. Другой пример дифференциальной стабильности мРНК – lgb в В лимфоцитах во время созревания Б клеток (Genovese и Milcarek, 1988). Последний пример – нестабильность мутантной бета-талласеминовой глобиновой мРНК. В клетках костного мозга, где этот ген нормально экспрессируется, мутантная сРНК нестабильна, в то время как мРНК дикого типа стабильна. Когда мутантный ген экспрессируют в Hela или L клетках in vitro, мутантная мРНК не показывает нестабильности (Lim и др., 1988). Эти примеры все снабжают доказательством, что стабильность мРНК может определяться типом клетки или фактором, специфичными для клеточного цикла. Более того, этот тип нестабильности еще не ассоциирован со специфическими последовательностями. Учитывая эти неопределенности, невозможно предсказать, какие РНК, похоже, нестабильны в данной клетке. В дополнение, даже АТТТА мотив может действовать различно в зависимости от природы клетки, в которой присутствует данная РНК. Шоу и Камен (1987) сообщили, что активация протеин киназы С может блокировать деградацию, опосредованную АТТТА. Добавление полиаденилированного ряда к 3' концу – общая черта большинства эукариотических мРНК, как растений, так и животных. Общеприняты взгляд на процесс добавления полиА, что появляющийся транскрипт имеет протяженности дальше зрелого 3' конца. Внутри этого транскрипта находятся сигналы полиаденилирования и образования правильного 3' конца. Этот процессинг на 3' конце включает расщепление мРНК и добавление полиА к зрелому 3' концу. При поиске последовательностей консенсуса около полиА тракта как в растительных, так и в животных мРНК возможно идентифицировать последовательности консенсуса, которые, по-видимому включены в добавление полиА и расщепление 3' конца. Те же последовательности консенсуса, кажется важны для обоих этих процессов. Эти сигналы обычно вариация последовательности ААТААА. В животных клетках несколько вариантов этой последовательности, которые являются функциональными, идентифицировано, в растительных клетках, кажется, существует увеличенное количество функциональных последовательностей (Wickens и Stephenson, 1984, Dean и др., 1986). Поскольку все эти последовательности консенсуса – вариации ААТААА, они все А + Т богатые. Эта последовательность обычно находится за 15–20 пн перед полиА блоком в зрелой мРНК. Эксперименты в животных клетках показывают, что эта последовательность участвует как в добавление полиА, так и в 3' созревании. Сайтнаправленными мутациями в этой последовательности можно нарушить эти функции (Comocey и Wickens, 1988; Wickens. и др. 1987). Однако, также наблюдали, что последовательности за 50–100 пн от 3' имеющегося полиА сигнала также требуются, например, ген, который имеет нормальный ААТААА, но был перемещен или прерван ниже, не получал правильного полиаденилирования (Gil и Prondfoot 1984, Sadofsky и Alwine, 1984; Medevitt и др., 1984). То есть сам по себе сигнал полиА не существенен для полного и правильного процессинга. Еще не известно, какие специфические лежащие по ходу транскрипции последовательности требуются в дополнение к сигналу полиА, или существует ли специфическая последовательность, которая имеет эту функцию. Следовательно анализа последовательности может только обнаружить потенциальные полиА сигналы. В природных мРНК, которые нормально полиаденилированы, наблюдали, что нарушение этого процесса, либо посpедством изменения сигнала полиА, либо других последовательностей, в этой мРНК: могут быть получены глубокие эффекты на уровне функциональной мРНК. Это наблюдали в случае нескольких природных мРНК, с результатами, которые пока были все геноспецифичными. Не существует общих правил, которые можно вывести из изучения мутантов этих природных генов, и нет правил, которые можно было бы приложить к гетерологичным генам. Ниже приводятся четыре примера: 1. В глобиновом гене отсутствие правильного сайта полиА ведет к неправильной терминации транскрипции. По-видимому, хотя и не доказано, что неправильно терминированная РНК нефункциональна и нестабильна (Prondfoot и др., 1987). 2. В глобиновом гене отсутствие функционального сигнала полиА может приводить к 100-кратному уменьшению уровня накопления мРНК (Prondfoot и др., 1987). 3. Сайт полиА глобинового гена перемещали в 3' концы двух различных гистоновых генов. Гистоновые гены имеют вторичную структуру (стебель-петля) около из 3' конца. Количество правильно полиаденилированной гистоновой мРНК, продуцируемой с этих химер, уменьшалось при увеличении дистанции между стеблем-петлей и сайтом полиА. Также два гистоновых гена продуцировали значительно различающиеся уровни правильно полиаденилированных мРНК. Это предполагает взаимодействие между сайтом полиА и другими последовательностями на мРНК, которые модулируют накопление мРНК (Pandy и Mazzluff, 1987). 4. Ген леггемоглобина сои клонировали в клетках Hela, и было показано, что этот растительный ген содержит "загадочный" сигнал полиаденилирования, который активен в животных клетках, но не утилизируется в растительных. Это приводит к продукции новой полиаденилированной мРНК, которая нефункциональна. Это опять показывает, что анализ гена в клетках одного типа не может предсказать его поведение в альтернативных клеточных типах (Wiebaurr и др., 1988). Из этих примеров ясно, что в природных мРНК правильно полиаденилирование важно для накопления мРНК, и что нарушение этого процесса может воздействовать в значительной мере на уровни мРНК. Однако, имеются еще неполные знания, чтобы предсказать эффект изменений в нормальном гене. В гетерологичном гене, у которого мы не знаем, функциональны или имеющиеся полиА сайты (последовательности консенсуса), даже труднее предсказать последствия. Однако, возможно, что имеющиеся сайты, которые идентифицированы, нефункциональны. То есть, эти сайты могут не действовать как правильные сайты полиА, но вместо этого функционировать как аберрантные сайты, которые дают увеличение нестабильных мРНК. В системах животных клеток ААТААА гораздо более общий сигнал, обнаруживаемый в мРНК выше полиА, но по меньшей мере четыре варианта найдено (Wickens и Stephenson, 1984). В растениях не было сделано такого обширного анализа, но ясно то, что могут использоваться множественные последовательности, подобные ААТААА. Сайты растений, названные внизу минорными или мажорными, относятся только к изучению Dean и др., (1986), которые анализировали только три типа растительного гена. Обозначение сайтов полиаденилирования как мажорного или минорного относится только к частоте их встречаемости как функциональных сайтов в природных генах, которые были анализированы. В случае растений, это очень ограниченные данные. Трудно с определенностью предсказать, какой сайт обозначенный мажорным или минорным, с большей или меньшей вероятностью функционирует частично или полностью, находясь в гетерологичном гене, таком как B.t. PA P1A P2A P3A P4A P5A P6A P7A P8A P9A PICA P11A P12A P13A P14A P15A AATAAA AATAAT AACCAA ATATAA AATCAA ATACTA ATAAAA ATGAAA AAGCAT ATTAAT ATACAT AAAATA ATTAAA AATTAA AATACA CATAAA главный согласованный участок главный вставленный участок главный вставленный участок –«– –«– –«– –«– –«– –«– –«– –« – –«– минорный животный участок –«– –«– –«– Другой тип процессинга РНК, который происходит в ядре, сплайсинг интронов. Почти вся работа по сплайсингу интронов сделана в животных клетках, но некоторые данные появились из растений. Процессинг интрона зависит от правильных 5' и 3' границ сплайсинга. Последовательности консенсуса для этих границ получены как для животных, так и для растительных мРНК, но только несколько нуклеотидов, как известно, инвариантны. Следовательно, трудно предсказать с какой-либо определенностью, является ли имеющаяся граница сплайсинга функциональной или частично функциональной, основываясь исключительно на анализе последовательности. В частности, инвариантными нуклеотидами являются только ГТ на 5' конце интрона и АГ на 3' конце интрона. У растений все четыре нуклеотида можно обнаружить в каждой соседней позиции либо внутри интрона, либо в экзоне, фланкирующем этот интрон, хотя некоторые позиции, показывают некоторое нуклеотидное преимущество (Brown, 1986; Hanley и Schuler, 1988). Растительный интрон перемещали из гена пататина в ген GUS. Чтобы проделать это, проводили сайт-направленный мутагенез, чтобы ввести новые рестрикционные сайты, и этот мутагенез изменял несколько нуклеотидов в интроне и последовательности экзона, фланкированных ГТ и АГ. Этот интрон еще функционировал правильно, указывая на важность ГТ и АГ и возможность замены в других нуклеотидных положениях. Имеется, конечно, много случаев ГТ и АГ во всех генах, которые не функционируют как границы сплайсингинтрона, поэтому должна существовать некоторая другая последовательность или структурные черты, которые отличают границы сплайсинга. У растений одна такая черта, кажется, – у клеотидный состав на клетку. Wiebauer и другие., (1968) и Goodall и др. (1988) анализировали растительные интроны и экзоны и обнаружили, что экзоны имеют ~ 50% А + Т, в то время как интрон имеют ~ 70% А + Т. Goodall и др. (1988) также создал искусственный растительный интрон, который имеет консенсус 5' и 3' границ сплайсинга и случайно А + Т богатую внутреннюю последовательность. Этот интрон сплайсировался в растениях правильно. Когда внутренний сегмент был заменен Г + Ц богатой последовательностью, эффективность сплайсинга очень сильно снизилась. Эти два примера демонстрируют, что узнавание интрона в растениях может зависеть от очень общих причин – границ сплайсинга, которые имеют большое количество разнообразных последовательностей и А + Т богатость самого интрона. Это, конечно, делает трудным предсказать из одной последовательности, функционирует ли любая отдельно взятая последовательность, вероятно, как активная, или отдельно взятый активный нитрон для процессинга РНК. Гены В.t., будучи А + Т богатыми, содержат многочисленные участки различной длины, которые имеют 70% или более A + Т. Количество таких участков, обнаруженных анализов последовательности, зависит от длины последовательности сканирования. Как для полиаденилирования, описанного выше, существует запутанность в предсказании, какие последовательности, возможно, используются как сайты сплайсинга в любом данном гене. Во-первых, многие являющиеся природными гены имеют альтернативные пути сплайсинга, которые образуют альтернативные комбинации экзонов в конечной мРНК (Gallega и Modal-Ginard, 1988; Helfman и Ricei, 1988, Tsurushita, Korn, 1989). То есть, некоторые границы сплайсинга, по-видимому, узнаются в одних обстоятельствах или в некоторых типах клеток, но не в других. Законы, руководящие этим, непонятны. В дополнение, может существовать взаимодействие между путями процессинга, так что использование определенного сайта полиаденилирования может мешать сплайсингу в близлежащем сайте сплайсинга и наоборот (Adcemi и Nevins, 1988; Brady и Wold, 1988; Mazzluff и Pandey, 1988). Опять нет правил для предсказания. Например, в гене гормона роста быка небольшие делеции в экзоне несколько сот нуклеотидов ниже интрона вызывают падение эффективности сплайсинга с более, чем на 95% до менее чем 2% (в значительной мере нефункциональный). Другие делеции, однако, не имеют существенного эффекта (Hampson и Rottmanu, 1988). В заключение, разнообразие экспериментов in vitro и in vivo показывает, что мутации которые нарушают нормальный сплайсинг, ведут к быстрой деградации РНК в ядре. Сплайсинг в многоступенчатом процессе в ядре и мутации при нормальном сплайсинге могут приводить к блокадам в процессе на множестве стадий. Любая из этих блокировок может затем вести к аномальной и нестабильной РНК. Изучение мутантов нормально прецессированных генов (полиаденилирование и сплайсинг) относится к изучению гетерологичных генов, таких как В.t. Гены В.t, возможно, содержат функциональные сигналы, которые приводят к образованию аберрантных нефункциональных мРНК, и эти мРНК, вероятно, нестабильны. Но гены В.t даже более вероятно, возможно, содержат сигналы, которые аналогичны мутантным сигналам в природном гене. Как показано выше, эти мутантные сигналы, очень вероятно, вызывают дефекты в путях процессинга, с последствием – образование нестабильных мРНК. Неизвестно с какой-либо определенностью, каковы сигналы терминации транскрипции РНК в растительных и животных клетках. Некоторые исследования в животных генах, которые указывают, что участки последовательности, богатой Т, вызывают терминацию РНК полимеразы II из тимуса теленка in vitro. Эти исследования показали, что 3' концы терминированных in vitro транскриптов часто лежат внутри блоков Т таких, как Т5, Т6 или Т7. Другие найденные сайты не состояли исключительно из Т, но имели один или более других нуклеотидов с таким же успехом. Терминация, как было найдено, происходит внутри последовательностей ТАТТТТТТ, АТТЦТЦ, ТТЦТТ. (Dedrick и др., 1987; Reines и др.,1987). В случае этих двух последних контекст, в который попадает последовательность, вдобавок является Ц + Т богатым. Не известно, существенно ли это. Другие исследования вовлекают районы А как потенциальные терминаторы транскрипции. Интересный пример из SV 40 иллюстрирует неопределенность в определении терминаторов основанных только на последовательности. Один потенциальный терминатор SV 40 был обнаружен как имеющий А богатость и район двойной симметрии (потенциальная петля-стебель) 5' к А богатому участку. Однако, второй терминатор, обнаруженный экспериментально ниже в том же гене не был А богатым и не включал никакой потенциальной вторичной структуры (Kessler и др., 1988). Конечно, обусловленные А + Т содержанием В.t генов, они являются обогащенными блоками А или Т, которые могли бы действовать как терминаторы. Примером с глобиновым геном, описанным выше, показана важность терминации для стабильности данной мРНК. Отсутствие нормального сайта полиА ведет к нарушению правильной терминации с последующим падением мРНК. Имеется также влияние на стабильность мРНК, обусловленный трансляцией мРНК. Преждевременная терминация трансляции в триозофосфатизомеразе человека приводит к нестабильности этой мРНК (Daar и др., 1988). Другой пример – глобиновая мРНК при бета–талассемии, описанная выше, которая специфически нестабильна в клетках костного мозга (Lim и др., 1988). Дефект в этом мутантном гене представляет делецию одной пары оснований в кодоне 44, что приводит к терминации трансляции (нонсенс кодон) в кодоне 60. По сравнению с правильно терминируемой нормальной глобиновой мРНК эта мутантная РНК очень нестабильна. Эти результаты показывают, что неправильно транслированная мРНК нестабильна. Другая работа на дрожжах показывает, что правильная, но слабая трансляция может оказывать влияние на уровни мРНК. Гетерологичный ген модифицировали для замены определенных кодонов на более предпочтительные в дрожжах кодоны. Суммарное 10-кратное увеличение в продукции белков было достигнуто, но имелось также и приблизительно 3-кратное снижение мРНК (Hoekema и др., 1987). Это указывает, на то, что более эффективная трансляция может приводить к большей стабильности мРНК, и что эффект использования кодонов может происходить на уровне РНК, также как и на трансляционном уровне. Из изучения использования кодонов, не ясно, какие кодоны приводят к ослаблению трансляции, или как это соотносится со стабильностью мРНК. Следовательно, цель настоящего изобретения – обеспечить метод для получения синтетических растительных генов, которые экспрессируют соответствующие им белки на относительно высоких уровнях по сравнению с генами дикого типа. Есть еще другая цель настоящего изобретения – обеспечить синтетическими растительными генами, которые экспрессируют кристаллический белковый токсин Bacillus thuringiensis на относительно высоких уровнях. Фиг. 1 иллюстрирует стадии, использованные в модификации генов дикого типа для увеличения эффективности экспрессии в растениях. Фиг. 2 иллюстрирует сравнение изменений в модификацированной В.t.k. HD–1 последовательности примера 1 (нижняя линия) против последовательности дикого типа В.t.k. HD–1, которая кодирует кристаллический белковый токсин (верхняя линия). Фиг. 3 иллюстрирует сравнение изменений в последовательности синтетического В.t.k. HD–1 в примере 2 (нижняя линия) против последовательности В.t.k. HD–1 дикого типа, которая кодирует кристаллический белковый токсин (верхняя линия). Фиг. 4 иллюстрирует сравнение изменений в последовательности синтетического В.t.k. HD–73 в примере 3 (нижняя линия) против последовательности В.t.k. HD–73 дикого типа (верхняя линия). Фиг. 5 представляет плазмидную карту интермедиата трансформации растений векторной кассеты pMON 893. Фиг. 6 представляет плазмидную карту интермедиата трансформации растений векторную кассету pMON 900. Фиг 7. представляет карту для лишенной концов Т–ДНК А, tumefaciens АСО. Фиг. 8 иллюстрирует сравнение изменений в синтетическом усеченном B.t.k. HD–73 гене (аминокислоты 29–615 с N – концевым Met-ala) в примере 3 (нижняя линия) против последовательности дикого типа B.t.k. HD–73 (верхняя строчка). Фиг. 9 иллюстрирует сравнение замен в последовательности полноразмерного синтетического (дикого типа B.t.k. HD–73) нижняя строчка (против) в примере 3 последовательности полноразмерногоо B.t.k. HD–73 дикого типа (верхняя строчка). Фиг. 10 иллюстрирует сравнение замен в полностью синтетической полноразмерной последовательности B.t.k. HD–73 в примере 3 (нижняя строчка) против полноразмерной последовательности дикого типа B.t.k. HD–73 (верхняя строчка). Фиг. 11 иллюстрирует сравнение замен в полностью синтетической полноразмерной последовательности B.t.k. HD–73 в примере 3 (нижняя строчка) против полноразмерной последовательности дикого типа B.t.k. HD–73 (верхняя строчка). Фиг. 12 иллюстрирует сравнение замен в синтетической В.t.t последовательности в примере 5 (нижняя строчка) против последовательности В.t.t. дикого типа, которая кодирует кристаллический белковый токсин (верхняя строчка). Фиг. 13 иллюстрирует сравнение замен в синтетической последовательности В.t. Р2 в примере 6 (нижняя линия) против последовательности дикого типа В.t.k. HD–1, которая кодирует белковый токсин (верхняя строчка). Фиг. 14 иллюстрирует сравнение замен в синтетической последовательности B.t. entomocidus в примере 7 (нижняя строчка) против последовательности дикого типа B.t. entomocidus, которая кодирует белковый токсин Бтента (верхняя линия). Фиг. 15 иллюстрирует плазмидную карту для растительного экспрессионного кассетного вектора pMON 744. Фиг. 16 иллюстрирует сравнение замен в последовательности белка оболочки (синтетической) roll – вируса листьев картофеля (PLRV) в примере 9 (нижняя строчка) против последовательности белка оболочки дикого типа PLRV (верхняя строчка). Настоящее изобретение обеспечивает метод получения синтетических растительных генов, которые экспрессируют свой белковый продукт на уровнях, значительно выше, чем гены дикого типа, которые обычно использовали в растительной трансформации до сих пор. В другом аспекте, настоящее изобретение также обеспечивает новыми синтетическими растительными генами, которые кодируют нерастительные белки. Для краткости и ясности изложения настоящее изобретение будет сначала описано, учитывая приготовление синтетических растительных генов, которые кодируют кристаллический белковый токсин Bacillus thiringiensis (B.t.). Подходящие подвиды B.t. включают, но не ограничиваются только В. B.t. kurstaki HD–I, B.t. kurstaki HD–73, B.t. sotto, B.t. berliner, B.t. thuringiensis, B.t. tolworthi, B.t. dendrolimus, B.t. alesti, B.t. galleriae, B.t. aizawai, B.t. subtoxicus, B.t. entomocidus, B.t. tenebrionis and B.t. san diego. Однако тем, кто квалифицирован в этой области, следует знать и понимать, что настоящий метод может использоваться для получения синтетических растительных генов, которые кодируют нерастительные белки, другие, чем кристаллический белковый токсин В.t, также как и растительные белки (см. для примера пример 9). Экспрессия генов В.t. в растениях проблематична. Хотя об экспрессии генов В.t. в растениях на инсектицидиальных уровнях сообщалось, это исполнение не было прямым. В частности, экспрессия полноразмерного специфического гена липидоптерана В.t. (включающего ДНК из выделения из В.t.k.), как сообщалось, неуспешна в достижении инсектицидиальных уровней экспрессии в некоторых видах растений (Vaeck и др., 1987 и Barton и др., 1987). Сообщалось, что экспрессию полноразмерного гена из В.t.r. HD–I детектировали в томатах, но что усеченные гены приводили к более высокой частоте инсектицидиальных растений с более высоким общим уровнем экспрессии. Усеченные гены В.t.berliner также приводили к повышенной частоте инсектицидиальных растений табака (Vaeck и др., 1987). С другой стороны, инсектицидиальные растения развивались из трансформантов салата, используя полноразмерный ген. Также сообщалось, что полноразмерный ген из В.t.k. HD–73 давал несколько инсектицидиальный эффект в табаке (Adang и др., 1987). Однако мРНК В.t., обнаруженная в этих растениях была только 1,7 тпн по сравнению с ожидаемой 3,7 тпн, указывая на неправильную экспрессию гена. Полагают, что эта усеченная мРНК слишком коротка, чтобы кодировать функциональный усеченный токсин, но должна была существовать на низком уровне более длинная мРНК в некоторых растениях или инсектицидиально активности не должно было наблюдаться. Другие сообщали в публикациях, что они наблюдали значительное количество мРНК короче ожидаемой из усеченного В.t.k. гена, но некоторые мРНК ожидаемой длины также наблюдались. Действительно, полагают, что экспрессия полноразмерного гена токсична для каллюса табака (Barton и др., 1987). Вышесказанное иллюстрирует, что гены типа липидоптерана В.t. слабо экспрессируются в растениях по сравнению с другими химерными генами, предварительно экспрессируемыми с тех же кассетных промоторов. Экспрессия В.t.t. в томатах и картофеле происходит на уровнях, подобных В.t.k. (т.е., бедных). В.t.t. и В.t.k. гены разделяют только ограниченную гомологию последовательности, но они разделяют много общих черт в отношении нуклеотидного состава и наличия специфических А + T богатых элементов, Все сообщения в этой области отмечали ниже ожидаемой экспрессию В.t. генов в растениях. В целом, инсектицидиальная эффективность измерялась, используя насекомых очень чувствительных к В.t. токсину, таких как табачная бабочка-бражник. Хотя представлялось возможным получить растения, полностью защищенные от табачной бабочки-бражника, важно заметить, что бабочка-бражник является до 500 раз более чувствительно к В.t. токсину, чем некоторые агрономически важные насекомые-вредители, такие как совка-карадрина. Следовательно, представляет интерес получить трансгенные растения, кото рые защищены от всех важных лепидоптеранных вредителей (или от колорадского жука в случае В.t. tenebrionis) и в дополнение получить уровень экспрессии В.t., который обеспечивает дополнительный безопасный излишек сверх эффективного защитного уровня. Также важно придумать растительные гены, которые функционируют воспроизводимо от вида к виду, так что чувствительные к насекомым растения можно получить с предсказанием. Для того, чтобы достигнуть эти цели, важно понимать природу более бедной экспрессии, чем ожидаемая, генов В.t в растениях. Уровень стабильной В.t. мРНК в растениях гораздо ниже ожидаемого. То есть, по сравнению с другими кодирующими последовательностями, направляемыми тем же промотором, уровень В.t. мРНК, измеренный норзерн-анализом или анализом с защитой от нуклеаз, гораздо ниже. Например, растение томата 337 (Fischhoff и др., 1987) было отобрано как растение, лучше всех экспрессирующее pMON 9711, который содержит В.t.k. HD–1KpnI фрагмент, читаемый с CaMV 35 S промотора и содержит селектируемый маркерный ген NOS–NPTII–NOS. В этом растении уровень В.t. мРНК находится между 100 и 1000 – раз ниже, чем уровень NPTII мРНК, хотя промотор даже приблизительно 50 раз сильнее, чем NOS промотор (Sanders и др., 1987). Уровень белкового токсина В.t., обнаруженный в растениях, согласуется с низким уровнем В.t. мРНК. Более того, инсектицидиальная эффективность трансгенных растений коррелирует с В.t. белковым уровнем, указывая что белок токсина, продуцируемый в растениях, биологически активен. Следовательно, низкий уровень В.t. токсинов экспрессии может быть, результат низких уровней В.t. мРНК. Уровни матричной РНК определяются скоростью синтеза и скоростью деградации. Имеется баланс между этими двумя величинами, который определяет устойчивый постоянный уровень мРНК. Скорость синтеза сведена на максимальную использованием GMV 35 S промотора второго конститутивного растительного промотора экспрессии. Использование других растительных промоторов, таких как промотора нопалин синтезы (NOS), маннопин синтазы (MAS) и рибулезобифосфаткарбоксилазы малой субъединицы (RUBISSO), не вели к драматическим изменениям в уровне экспрессии белкового токсина В.t., указывая, что эффекты, определяющие уровни белкового токсина В.t. не зависят от промотора. Эти данные подразумевают, что кодирующие последовательности ДНК генов, кодирующих белковые токсины В.t. каким-то образом ответственны за уровень слабой экспрессии, и что этот эффект проявляется в низком уровне аккумулируемой стабильной мРНК. Ниже ожидаемых уровни мРНК наблюдали в случае четырех различных специфических генов лепидоптерана (два из В.t.k. HD–1, B.t. berliner и B.t.k. HD–13), также, как и гена из колеоптеран специфической B.t. tenebrionis. По-видимому, в генах B.t. лепидоптеранного типа эти влияния проявляются более сильно в полиоразмерных кодирующих последовательностях, чем в усеченных кодирующих последовательностях. Эти эффекты наблюдаются у всех растительных видов, хотя их значение кажется большим в некоторых растительных видах, таких как табак. Природа кодирующих последовательностей генов B.t. отличается от растительных генов, также как и многие другие гены, экспрессируемые в растениях. В частности, гены B.t. очень богаты (~ 62%) аденином (А) и тимидом (Т), в то время как растительные гены в большинство бактериальных генов, которые экспрессированы в растениях, имеют порядка 45–55% А + Т. А + T содержание геномов (и таким образом генов) любого организма – черты этого организма и отражает его эволюционную историю. В то время как внутри любого одного организма гены имеют сходный А + Т состав, А + Т состав может варьировать потрясающе от организма к организму. Например, некоторые виды Bacillus имеются среди наиболее А + Т богатых генов, в то время как некоторые виды Streptomyces находятся среди наименее А + Т богатых геномов (от 30 до 35% А + Т). Обусловленные вырожденность генетического кода и ограниченным числом кодонов, выбранных для любой аминокислоты, большинство "избытка" А + Т структурных кодирующих последовательностей некоторых видов Bacillus находятся в третьей позиции кодонов. То есть, гены некоторых видов Bacillus имеют А или Т как третий нуклеотид во многих кодонах. Таким образом А + Т состав частично может определять предпочтительность использования кодонов. В дополнение, ясно, что гены эволюционируют до максимальной функции в организме, в котором они эволюционируют. Это означает, что отдельные нуклеотидные последовательности, находящиеся в каком-либо гене, из одного организма, где они могут не играть никакой роли, за исключением кодирования на определенном участке аминокислот, имеют возможность быть узнанные как генетические контролирующие элементы в другом организме (такими как транскрипционными промоторами или терминаторами, сайта добавления полиА, сайтами сплайсинга интронов, или сигналами деградации специфической мРНК). Возможно, удивительно, что такие неправильно читаемые сигналы не являются более общими чертами экспрессии гетерологичных генов, но это можно частично объяснить относительно гомогенным А + Т составом (~ 50%) многих организмов. Этот А + Т состав плюс природа генетического кода представляют ясной требование случайной вероятности любой отдельной олигонуклеотидной последовательности. Таким образом, ген из E.coli c 50% А + Т составом гораздо менее вероятно, что содержит любой отдельный А + Т богатый сегмент, чем ген из В. thuringiensis. Как описано выше, экспрессия белкового токсина В.t. в растениях проблематична. Хотя наблюдения, сделанные в других системах, описанных выше, предоставляют надежду на возможность поднять экспрессионный уровень белковых токсинов В.t. в растениях, успех, полученный настоящим методом, совершенно неожиданный. Действительно, о так много, как в последние годы, сообщаемых сведениях, что экспрессия полноразмерного белкового токсина В.t.k. в табаке делает каллюсную ткань отмирающей (Barton и др. 1987), разумно было бы ожидать, что высокий уровень экспрессии белкового токсина недостижим из-за известных токсических эффектов. В его наиболее строгих употреблениях, метод настоящего изобретения включает модификацию существующей структурной кодирующей последовательности ("структурного гена"), который кодирует отдельный белок удалением последовательности АТТТА и имеющихся сигналов полиаденилирования сайтнаправленным мутагенезом ДНК, включающей структурный ген. Наиболее предпочтительно, чтобы фактически все сигналы полиаденилирования и последовательности АТТТА были удалены, хотя усиленные уровни экспрессии наблюдаются только частичным удалением каждой из выше определенных последовательностей. Альтернативно, если получен синтетический ген, который кодирует для экспрессии подчиненный белок, кодоны выбираются, чтобы избежать АТТТА последовательности и имеющихся сигналов полиаденилирования. Для целей настоящего изобретения сигналы полиаденилирования включают, но не строго ограничиваются. ААТААА, ААТААТ, ААССАА, АТАТАА, ААТСАА, АТАСТА, АТАААА, АТGААА, ААGCAT, АТТААТ, АТАСАТ, ААААТА, АТТААА, ААТТАА, ААТАСА and САТААА. При замене последовательностей АТТТА и сигналов полиаденилирования используются предпочтительно те кодоны, которые не включают кодоны, которые редко встречаются в геномах растений. Другое воплощение настоящего изобретения, представленное в схеме на рис. 1, использует метод для модификации существующего структурного гена или альтернативно синтез de novo структурного гена, который несколько менее строгий, чем метод, описанный первым выше. Ссылаясь на рис. 1, выбранная последовательность ДНК сканируется, чтобы найти районы, с более, чем четырьмя последовательными, адениновыми (А) или тиминовыми (Т) нуклеотидами. А + Т районы сканируют на потенциальные сигналы полиаденилирования растений. Хотя отсутствие пяти или более последовательных А или Т нуклеотидов элиминирует большинство растительных сигналов полиаденилирования, если имеется более, чем один из минорных сигналов полиаденилирования, найденного внутри десяти нуклеотидов каждого другого, тогда нуклеотидную последовательность этого района предпочтительно изменяют, чтобы удалить эти сигналы, в то же время поддерживая оригинальную аминокислотную последовательность. Вторая стадия – принять во внимание 15–3Р нуклеотидные районы, окружающие А + Т богатые районы, определенные на первой стадии. Если А + Т состав окружающего района менее чем 80%, район должен быть проверен на наличие сигналов полиаденилирования. Изменение, района, основанное на сигналах полиаденилирования, зависит (1) от количества присутствующих сигналов полиаденилирования и (2)присутствия мажорного растительного сигнала полиаденилирования. Протяженный район исследуют на присутствие растительных сигналов полиаденилирования. Сигналы полиаденилирования удаляют сайт-направленным мутагенезом последовательности ДНК. Протяженный район также исследуют на мультикопийность последовательности АТТТА, которая также удаляется мутагенезом. Предпочтительно, чтобы районы, включающие много последовательных А + Т оснований или Г + Ц оснований нарушались, так как, предсказывают, что эти районы имеют более высокую вероятность формировать структуру шпилки, обусловленную полукомплементарностью. Следовательно, вставление гетерогенных нуклеотидов уменьшает вероятность формирования полукомплементарной вторичной структуры, которая, как известно, ингибирует транскрипцию и/или трансляцию в некоторых организмах. В некоторых случаях этот вредный эффект может быть сведен к минимуму использованием последовательностей, которые не содержат более, чем пять последовательных А + Т или Г + Ц. СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ ДЛЯ МУТАГЕНЕЗА Олигонуклеотиды, используемые в мутагенезе, предназначены для поддержания правильной аминокислотной последовательности и рамки считывания и особенно чтобы не вводить общие рестрикционные сайты, такие как Bgl II, Hind III, Sae I, Kpn I, Ecor I, Nco I, Pst I и Sae I в молифицированный ген. Эти рестрикционные сайты находятся среди инсерционных сайтов полилинкера клонирующих векторов, таких как плазмиды рис. 118 и pMON 7258. Конечно, введения новых сигналов полиаденилирования, АТТТА последовательности или последовательные районы по более чем пять А + Т или Г + Ц, следует также избегать. Предпочтительный размер для олигонуклеотидов около 40–50 оснований, но использовали фрагменты, имеющие размер от 18 до 100 оснований. В большинстве случаев сохраняют минимум от 5 до 8 пар оснований гомологии образца ДНК на обоих концах синтезированного фрагмента, чтобы обеспечить правильную гибридизацию данного праймера с образцом (матрицей). В олигонуклеотидах следует избегать последовательностей длиннее, чем пять пар оснований А + Т или Г + Ц. В кодонах, использованных в замене кодонов дикого типа, следует предпочтительно избегать ТА или ГЦ дуплета, где это возможно. Концы отбирают из таблицы предпочтительных растительных кодонов (такие как в таблице 1 ниже так? чтобы избежать кодонов, которые редко встречаются в растительных геномах, и должны быть сделаны попытки отобрать кодоны, предпочтительно установленные к Г + Ц составу около 5%. Таблица 1 Предпочтительные кодоны, используемые в растениях Аминокислота Кодон Процент встречаемости в растениях ARG CGA CGC CGG 7 11 5 CGU AGA AGG 25 29 23 Продолжение табл. 1 Аминокислота Кодон Процент встречаемости в растениях LEU CUA CUC CUG CUU UUA UUG 8 20 10 28 5 30 SER UCA UCC UCG UCU AGC AGU 14 26 3 21 21 15 THR ACA ACC ACG ACU 21 41 7 31 PRO CCA CCC CCG CCU GLY GGA GGC GGG GGU ILE AUA AUC AUU VAL GUA GUC GUG GUU LYS AAA AAG ASN AAC AAU 45 19 9 26 32 20 11 37 12 45 43 9 20 28 43 36 64 72 28 Продолжение табл. 1 Аминокислота Кодон Процент встречаемости в растениях GLN CAA CAG 64 36 HIS CAC CAU 65 35 GLU GAA GAG 48 52 ASP GAC GAU 48 52 TYR UAC UAU 68 32 CYS UGC UGU 78 22 PHE UUC UUU 56 44 MET TRP AUG UGG 100 100 Предсказывают, что районы с многочисленными последовательными А + Т или Г + Ц основаниями имеют большую вероятность формировать шпилечные структуры, обусловленные полукомплементарностью. Нарушение этих районов инсерцией гетерогенных пар оснований являются предпочтительным и должны уменьшить сродство в формировании полукомплементарных вторичных структур, таких как шпильки, которые, как известно, в некоторых организмах ингибируют транскрипцию (транскрипционные терминаторы) и трансляцию (аттенуаторы). Однако трудно предсказать биологический эффект района, формирующего потенциальную шпильку. Для тех, кто квалифицирован в данной области очевидно, что в то время как вышеуказанное описание направлено на модификацию последовательностей ДНК генов дикого типа, настоящий метод можно использовать для конструирования целого синтетического гена для данной аминокислотной последовательности. Районов с пятью или более последовательных А + Т или Г + Ц нуклеотидов следует избегать. Кодоны следует отбирать, избегая ТА и ГЦ дуплетов в кодонах где бы то ни было возможным. Использование кодонов может быть нормализовано против таблицы предпочтительного использования кодонов в растениях (такой как таблица 1) и Г + Ц составу, предпочтительно приспособленного к порядку 50%. Результирующую последовательность следует проверить, чтобы убедиться, что имеются минимальные растительные сигналы полиаденилирования и последовательности АТТТА. Обнаруженные рестрикционные сайты, обычно используемые в клонирующих векторах, также предпочтительно избегаются. Однако, замена нескольких уникальных рестрикционных сайтов на всем протяжении гена полезна для анализа экспрессии гена или конструирования вариантов гена. Растительные генные конструкции Экспрессия растительного гена, которая существует у формы двухцепочечной ДНК, включает транскрипцию матричной РНК /мРНК/ с одной цепи ДНК с помощью фермента РНК полимеразы, и последующий процессинг первичного мРНК транскрипта внутри ядра. Этот процессинг включает 3' нетранслируемый район, который добавляет полиаденилат нуклеотиды к 3' концу РНК. Транскрипция ДНК в мРНК регулируется районам ДНК, обычно называемым "промотор". Промоторный район содержит последовательность оснований, которые сигнализируют РНК полимеразе связаться с ДНК и инициировать транскрипцию мРНК, используя одну из цепей ДНК как матрицу, для создания соответствующей цепи РНК. Целый ряд промоторов, которые являются активными в растительных клетках, описаны в литературе. Они включают промоторы нопалинсинтазы (NOS) и октопинсинтазы (OCS) (которое несут опухолевоиндуцируемые плазмиды Agrobacterium tumefaciens), вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 19S и 35S, индуцируемый светом промотор из малой субъединицы рибулезобифосфаткарбоксилазы (ssRUBTSCO, очень многочисленный растительный полипептид) и промотор маннопин синтазы (MAS) (Velten и др. 1984 и Velten & Schell, 1985). Все эти промоторы использовали для создания различных типов конструкций ДНК, которое экспрессировали в растениях /см. например, публикацию РСТW 084/02913 (Rogers и др., Morsanto)/. Промоторы, которые как известно или обнаружено, вызывают транскрипцию РНК в растительных клетках, можно использовать в настоящем изобретении. Такие промоторы можно получить из растений или растительных вирусов и включают, но не ограничиваются, промотор CAMV 35S и промоторы, выделенные из растительных генов, таких как гены SS RUBISCO. Как описано ниже, предпочтительно, чтобы отдельно выбранный промотор был способен приводить к достаточной экспрессии, вызывая продукцию эффективного количества белка. Промоторы, использованные в конструкциях ДНК (т.е. химерные растительные гены) настоящего изобретения можно модифицировать, по желанию, чтобы повлиять на их контрольные характеристики. Например, промотор CAMV 35S можно лигировать с частью гена SS RUBISCO, который репрессирует экспрессию SS RUBISCO в отсутствие света, чтобы создать промотор, который активен в листьях, но не в корнях. Результирующий химерный промотор можно использовать как описано здесь. Для целей этого описания обозначение "CaMV 35S" промотор, таким образом, включает вариации промотора CaMV 35S, например, промоторы, образованные посредством лигирования с районами оператора, случайным или направленным мутагенезом и т.д. Более того, промоторы можно изменять для создания многочисленных "энхансерных последовательностей", чтобы облегчить повышенную экспрессию гена. РНК, продуцируемая с конструкции ДНК настоящего изобретения также содержит 5' нетранслируемую лидерную последовательность. Эта последовательность может происходить из промотора, отобранного для экспрессии данного гена, и может специально модифицироваться так, чтобы увеличить трансляцию мРНК. 5' Нетранслируемые районы могут также быть получены из вирусных РНК, из подходящих эукариотических генов, или из последовательности синтетического гена. Настоящее изобретение не ограничено конструкциями, как представлено в нижеследующих примерах. Скорее нетранслируемая лидерная последовательность может быть частью 5' конца нетранслируемого района кодирующей последовательности для белка оболочки вируса, или частью проморной последовательности, или может происходить из неродственного промотора или кодирующей последовательности. В любом случае предпочтительно, чтобы последовательность, фланкирующая сайт инициации, соответствовала правилам консенсуса трансляционной последовательности для усиления инициации трансляции, как сообщалось Kozak (1984). Конструкция ДНК настоящего изобретения также содержит модифицированную или полностью синтетическую структурную кодирующую последовательность, которую изменили для усиления действия этого гена в растениях. В отдельном воплощении настоящего изобретения использовали метод усиления, чтобы сконструировать модифицированные или полностью синтетические гены, кодирующие кристаллический белковый токсин Bacillus thuringiensis. Структурные гены настоящего изобретения могут дополнительно кодировать слитый белок, включающий амино-терминальный транспортный пептид хлоропластов или секреторную сигнальную последовательность (см. для примера, примеры 10 и 11). Конструкция ДНК также содержит 3' нетранслируемый район, 3' нетранслируемый район содержит сигнал полиаденилирования, который функционирует в растениях, чтобы вызвать присоединение полиаденилат нуклеотидов к 3' концу вирусной РНК. Примеры подходящих 3' районов являются (1) 3' транскрибируемыми, нетранслируемыми районами, содержащими сигнал полиаденилирования Agrobacterium опухолево-индуцируемые гены плазмиды (Тi), такие как ген нопалин синтазы (NOS) и (2) растительные гены, подобные генам запасных белков соевых бобов (7S) и ген малой субъединицы RuBP карбоксилазы (Е9). Пример предпочтительного 3' района – тот, который из гена 7S, описанный в больших деталях в примерах внизу. Растительная трансформация Растительный химерный ген, содержащий структурную кодирующую последовательность настоящего изобретения, можно ввести в геном растения любым подходящим методом. Подходящие растения для использования в практике настоящего изобретения включают, но не ограничиваются, соевые бобы, хлопчатник, люцерну, масличное семя лен, томаты, сахарную свеклу, подсолнечник, картофель, табак, кукурузу, рис и пшеницу. Подходящие для трансформации растительные векторы включают векторы, происходящие из Тi плазмиды Agrobacterium tumefaciens, также как и обнаруженные Verrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) и EPO публикация 120,51b (Schilpercot и др.). В дополнение к растительным векторам трансформации, происходящих от Тi, или индуцируемыми в корнях (Ri) плазмид Agrobacterium, могут использоваться альтернативные методы, для инсерции конструкций ДНК этого изобретения в растительные клетки. Такие методы могут включать, например, использование липосом, электропорации, веществ, которые увеличивают принятие свободной ДНК, доставку свободной ДНК посредством микропулевой бомбардировки, и трансформацию, используя, вирусы или пыльцу. Особенно полезный для трансформации двудольных растений – Тi плазмидный кассетный вектор – показан на рис. 5. Отсылаясь к рис. 5, экспрессионная кассета pMON 893 состоит из усиленного CaV 85 промотора (EN85S) и 3' конца, включающего сигналы полиаденилирования из гена соевых бобов, кодирующего альфаглавную субъединицу бета-конглицинина. Между этими двумя элементами находится полилинкер, содержащий множественные рестрикционные сайты для инсерции генов. Стимулированный CaMV35S промотор конструировали следующим образом. Фрагмент промотора CaMV35S, простирающегося между положениями -343 и +9 предварительно конструировали в рис. 13 Odell и др. (1985). Этот сегмент содержит один район, обнаруженный Odell и др. (1985) как необходимый для максимальной экспрессии CaMV35S промотора. Его вырезали как ClaI–HindIII фрагмент, делали тупые концы ДНК полимеразой I (фрагмент Кленова) и вставляли в Hinc и сайт рис. 18. Этот верхний район промотора 35S вырезали из этой плазмиды как HindIII–EcoRV фрагмент (протяженностью от -343 до -90) и вставляли в ту же плазмиду между HidIII и PstI сайтами. Усиленный CaMV35S промотор таким образом содержит дупликацию последовательностей между -343 и -90 (Kay и др., 1987). 3' конец гена 7S берет свое начало от гена 7S, содержащегося в клоне, обозначенном 17.1 (Schuler и др., 1982). Этот 3' концевой фрагмент, который включает сигналы полиаденилирования, тянется от AvaII сайта, локализованного около 30 пн выше терминаторного кодона для гена бета-конглицинина в клоне 17.1, до EcoRI сайта, локализованного около 450 пн ниже этого терминаторного кодона. Оставшийся pMON 393 содержит сегмент pBR 322, который обеспечивает начало репликации в E.coli и район для гомологичной рекомбинации "разоруженной" Т–ДНК штамма Agrobacterium ACO (описанного ниже), oriV район из плазмиды RKI с широким кругом хозяев, ген устойчивости к стрептомицину (спектиномицину из Tn7, и химерный NPTII ген, содержащий CaMV35S промотор и 3' конец нопалин синтазы (NOS), которая обеспечивает канамициновую устойчивость в трансформированных растительных клетках. Ссылаясь к рис. 6, трансформационный вектор pMON 900 является производным pMON 893. Усиленный CaMV35S промотор pMON893 заменен на промотор 1,5 тпн маннопин сиитазы (МAS) (Velten и др.). После введения конструкции ДНК в плазмидный вектор pMON893 1984 или pMON900 интермедиатный вектор вводят в A. tumefaciens штамм АСО, который включает "разоруженную" (т.е. неонкогенную) Тi плазмиду. Коинтегрировавшие Тi плазмидные векторы отобраны и использованы для трансформации двудольных растений. Ссылаясь на фиг. 7, А. tumefaciens – "разоруженный" штамм, подобный рТiВ6SE, описанному Fraley и др. (1985). Для конструирования АСО начальный штамм Agrobacterium был штамм А208, который содержит Тi плазмиду нопалинового типа. Тi плазмида была "разоружена" подобно тому, как описано у Fraley и др. (1985) так, чтобы существенно все нативные Т–ДНК были удалены за исключением левой границы и несколько сот пар оснований Т–ДНК внутри левой границы. Остаток Т–ДНК, распространяющийся до точки сразу за правой границей заменяли новым куском ДНК, включающим (слева направо) сегмент pBR 322, OriV район из плазмиды RK2, и ген устойчивости к канамицину из Tn 601. pBR 322 и oriV сегменты подобны сегментам в pMON 893 и обеспечивают район гомологии для образования коинтеграта. Следующие примеры приведены, чтобы лучше объяснить практику настоящего изобретения и не должны быть интерпретированы любым образом, ограничивающим масштаб настоящего изобретения. Те, кто квалифицирован в этой области, признают, что можно сделать различные модификации, ограничения и т.д. в отношении методов и генов, здесь описанных, в то же время не отклоняясь от духа и объема настоящего изобретения. Пример 1 – модифицированный В.t.k. HD–I ген. Отсылаясь к фиг. 2, ген В.t.k. HD–I дикого типа, как известно экспрессируется слабо в растениях как полноразмерный ген или как усеченный ген. Г + Ц состав гена В.t.k. ниже (370), содержащий много А + Т богатых районов, потенциальных сайтов полиаденилирования (18 сайтов, см. таблицу 2 в списке последовательностей) и многочисленные последовательности АТТТА. Таблица 2 Список последовательностей потенциальных сайтов полиаденилирования AATAAA* AATAAT* AACCAA ATATAA AATCAA ATACTA ATAAAA ATGAAA AAGCAT ATTAAT ATACAT AAAATA ATTAAA** AATTAA** AATACA** CATAAA** *указывает мажорный потенциальный сыйт полиаденилирования растений; **указывает минорный потенциальный сайт полиаденилирования животных. Все остальные – потенциальные минорные сайты полиаденилирования растений . Табл. 3 перечисляет синтетические олигонуклиотиды, предназначенные и синтезированные для сайт-направленного мутагенеза В.t.k. HD–I гена. Таблица 3 Праймеры для мутагенеза B.t.l. HD – I гена Праймер Длина (пн) BTK185 18 TCCCCAGATA ATATCAAC Последовательность BTK240 48 GGCTTGATTC CTAGCGAACT CTTCGATTCT CTGGTTGATG AGCTGTTC BTK462 54 CAAAACTGAG AGGTGGAGGT TGGCAGCTTG AACGTACACG GAGAGGAGAGGAAC BTK669 48 AGTTAGTGTA AGCTCTCTTC TGAACTGGTT GTACCTGATC CAATCTCT BTK930 39 AGCCATGATC TGGTGACCGG ACCAGTAGTA TTCTCCTCT BTK1110 32 AGTTGTTGGT TGTTGATCCC GATGTTAAAA GG BTK1380A 37 GTGATGAAGG GATGATGTTG TTGAACTCAG CACTACG BTK1380T 100 CAGAAGTTCC AGAGCCAAGA TTAGTAGACT TGGTGAGTGG GATTTGGGTG ATTTGTGATG AAGGGATGAT GTTGTTGAAC TCAGCACTAC GATGTATCCA BTK1600 27 TGATGTGTGG AACTGAAGGT TTGTGGT В.t.k. HD–I ген (Bgl II фрагмент из рМО 9921, кодирующий аминокислоты 29–607 с Met–Ala на N – конце) клонировали в рMON 7258 (рис. 118 производное, которое содержит Bgl II сайт в клонирующем районе полилинкера), сайт Bgl II, образуя pMON 5342. Ориентация В.t.k. гена выбиралась такая, что синтезировали цепь противоположной ориентации (негативную цепь) в нитевидных фаговых частиц для мутагенеза. Использовали процедуру Kunkle (1985) для мутагенеза, используя плазмиду pMON 5342 как стартовый материал. Районы мутагенеза отбирали следующим образом. Все районы последовательности ДНК В.t.k. гена, которые содержат пять или более последовательных А или Т пар оснований, были идентифицированы. Они были распределены по длине и в порядке большего процента А + Т в окружающих последовательностях в пределах района в 20–30 пар оснований. ДНК затем анализировали на районы, которые могут содержать сайты полиаденилирования (см. таблицу 2 выше) или последовательности АТТТА. Олигонуклиотиды предназначали, которые имели наивысшую элиминацию А + Т непрерывных районов, которые содержали один или более сайтов полиаденилирования или АТТТА последовательностей. Два потенциальных сайта полиаденилирования растений были оценены более критически (см. таблицу 2) основываясь на опубликованных сообщениях. Отбирали кодоны с увеличенным Г + Ц составом, они не образовывали рестрикционных сайтов для ферментов, полезных для клонирования и сборки модифицированного гена (Bam H I, Bgl II, Sae I, Noo I, EcoR V) и не содержали дуплетов ТА или ГЦ, о которых сообщалось, что они не часто встречаются в кодонах у растений. Олигонуклеотиды были по меньшей мере 18 пн длины, простирающиеся до 100 пар оснований и содержали по меньшей мере 5–8 пар оснований прямой гомологии с нативными последовательностями на концах фрагментов для эффективной гибридизации и праймирования в реакциях сайт-направленного мутагенеза. Рис. 2 сравнивает последовательность гена В.t.k. HD–I дикого типа с последовательностью, которая получила при модификации сайт-направленным мутагенезом. Конечный результат этих замен был увеличить Г + Ц содержание в гене В.t.k. с 37% до 41%, в то же время также уменьшить растительные потенциальные сайты полиаденилирования с 18 до 7 и уменьшить районы АТТТА с 13 до 7. Детально, мутагенные замены с аминоконцевого (5') по карбоксильный (3') концы следующие: ВТК 185 – 18-мер, использованный для элиминации растительного сайта полиаденилирования в середине девяти пар оснований А + Т района. ВТК 240 – 48-мер. Семь пар оснований были заменены этим олигонуклеотидом, чтобы элиминировать три потенциальных сайта полиаденилирования (2 ААЦЦАА, 1 ААТТА). Еще один район, близкий к району, измененному ВТК 240, начинаясь с 312 пн, имел высокий А + Т состав (13 из 15 пар нуклеотидов) и АТТТА район. Однако, он не содержал потенциального сайта полиаденилирования и его самый длинный непрерывающийся А + Т ряд был семь пар нуклеотидов. ВТК 462 – 54-мер, вводящий 13 пн замены. Первые шесть замен осуществлялись, чтобы уменьшить А + Т обогащенность данного гена заменой кодонов дикого типа на кодоны, содержащие Г или Ц, в то же время избегая дуплетов ЦГ. Следующие семь замен, сделанных ВТК 462, использовали, чтобы элиминировать А + Т богатый район (13 из 14 пар нуклеотидов были А или Т), содержащий два АТТТА района. ВТК 669 – 48-мер, делающий девять индивидуальных нуклеотидных замен, элиминирующих три возможных сайта полиаденилирования (АТАТАА, ААТЦАА; и ААТТАА) и одиночный АТТТА сайт. ВТК 930 – 39-мер, предназначенный для увеличения Г + Ц состава и элиминации потенциального сайта полиаденилирования (ААТААТ – мажорный сайт). Этот район не содержал район из девяти пар осно ваний непрерывной А + Т последовательности. Одна из нуклеотидных замен была с Г на А, потому что Г в этой позиции мог бы создать Г + Ц богатый район (ЦЦГГ/Г/Ц). Так как реакции сиквенса указывают, что могут быть трудности образования последовательности через Г + Ц непрерывные пары, думали, будет благоразумно избежать образования потенциально проблематичных районов даже, если они проблематичны только in vitro. ВТК 1110 – 32-мер, предназначенный для введения пяти замен в ген дикого типа. Один потенциальный сайт (ААТААТ – мажорный сайт) элиминировали в середине А + Т богатого района (19 из 22 пар оснований). ВТК 1380 А и ВТК 1380 Т ответственны за 14 индивидуальных нуклеотидных замен. Первый район (1380 А) имеет 17 непрерывных А + Т пар оснований. В этом районе АТТТА и потенциальный сайт полиаденилирования (ААТААТ). 100-мер (1380 Т) содержит все замены, предписываемые 1380 А. Большой размер праймера этого был частично эксперимент определить, возможно ли использовать большие олигонуклеотиды для мутагенеза (выше 60 нуклеотидов длиной). Второе обсуждение было, что 100-мер использовали для мутагенеза матрицы, которая предварительно подвергалась мутагенезу с 1380 А. Первоначальный праймер, предназначенный для мутагенеза район ниже и прилежащий к 1380 А не отжигался эффективно с желаемым местом, как указано неспособностью получить чистую последовательность, используя праймер. Большой район гомологии 1380 Т все же допускал правильный отжиг. Расширенный размер 1380 Т был более удобным, чем это необходимо. Второй район, прилежащий к 1380 А, покрывающийся 1380 Т, имеет высокий А + Т состав (22 из 29 нуклеотидов А или Т). ВТК 1600 – 27-мер, ответственный за пять индивидуальных замен пар оснований. АТТТА район и растительный сайт полиаденилирования были идентифицированы и сделаны соответствующие замены. Все 62 оснований были заменены сайт-направленным мутагенезом. Г + Ц состав, увеличенный на 55 пар оснований, потенциальные сайты полиаденилирования были сокращены от 18 до семи и АТТТА последовательности уменьшены с 13 до семи. Замены В последовательности ДНК привели к заменам в 55 из 579 кодонов в усеченном В.t.k. гене в pMON 5342 (приблизительно 9,5%). Ссылаясь к таблице 4, модифицированные В.t.k. HD–I гены конструировали так, что они содержали все вышеперечисленные модификации (рMON 5370) или различные наборы индивидуальных модификаций. Эти гены вставляли в рMON 893 для растительной трансформации и растения табака, содержащие эти гены, анализировали. Анализ растений табака на индивидуальные модификации предпринимали по нескольким причинам. Экспрессия усеченного гена дикого типа в табаке очень слабая, приводящая к редкой идентификации растений, токсичных для ТНW. Токсичность определяли анализами съеденных листьев как по меньшей мере 60% смертность гусениц 1-го дня бабочки-бражника со степенью повреждения от 1 или менее (шкала от 0 до 4,0 эквивалентен полной защите, 4 полной гибели). Модифицированный НD–I ген (рMON 5370) демонстрирует большое увеличение экспрессии (оцененной приблизительно 100-кратной, см. таблицу 8) в табаке. Следовательно, увеличение экспрессии гена дикого типа обусловленное индивидуальными модификациями, по-видимому, сильно увеличивают частоту токсичных растений табака и присутствиедетектируемого В.t.k. белка. Результаты показаны в следующей таблице: Таблица 4 Сравнительные эффекты региональных модификаций в B.t.k. гене Конструкция Модифицированные позиции растений Токсичных растений pMON5370 185, 240, 669, 930, 1110, 1380a+b, 1600 38 22 pMON10707 185, 240, 462, 669 48 19 pMON10706 930, 1110, 1380a+b, 1600 43 1 pMON10539 185 55 2 pMON10537 240 57 17 pMON10540 185, 240 88 23 pMON10705 462 47 1 Эффекты каждых индивидуальных олигонуклеотидных замен на экспрессию все же обнаруживали некоторые общие тенденции. Шесть различных конструкций создавали, предназначенных для идентификации ключевых районов. Девять различных олигонуклеотидов разделяли на половины по их позиции в данном гене. Замены в N-терминальной части объединяли в рMON 10707 (185, 240, 462, 668). Замены с – терминальной части объединяли в рMON 10706 (930, 1110, 1380 a + b, 1600). Результаты анализа растений в этих двух конструкциях указывают, что pNON 10707 продуцирует существенное ко личество токсичных растений (19 из 48). Белок из этих растений детектировали ELIZA анализом. рMON 10706 растения редко были идентифицированы как инсектицидиальные (1 из 43) и уровни В.t.k. скудно детектировались иммунологическим анализом. Исследование N-терминальных замен в больших деталях было проделано с 4 рMON конструкциями, 10539 (только 185), 10537 (только 240), 10540 (185 и 240), и 10705 (только 462). Результаты указывают, что присутствие замены в 240 требовалось для создания существенного количества токсичных растений (рMON 10540; 23 из 88, pMON 10537; 17 из 57). Отсутствие 240 замен, приводило к низкой частоте токсичных растений с низкими уровнями В.t.k. белка, одинаковых с результатами с геном дикого типа. Эти результаты указывают, что замены в 240 ответственны за существенное увеличение в экспрессионных уровнях В.t.k. выше аналогичной конструкции дикого типа в табаке. Замены в дополнительных районах (185, 462, 669) в соединении с 240 может приводить к увеличению В.t.k. экспрессии (> 2 раз). Однако, замены в районе 240 – терминальной части гена все же приводят к драматическому увеличению экспрессии. Несмотря на важность изменения района 240 экспрессии модифицированных генов, возросшая экспрессия может достигаться и изменением других районов. Гибридные гены, частично дикого типа, части но синтетические, были образованы, чтобы определить эффекты сегментов синтетического гена на уровни В.t.k. экспрессии. Гибридный ген создавали из N-терминальной трети (нуклеотиды с 1 по 590 на фиг. 2, до Xba I сайта) с С-терминальным концом В.t.k. HD–I (рMON 5378) дикого типа. Растения, трансформированные этим вектором, были также токсичны, как и растения, трансформированные модифицированным HD–I геном (рMON 5370). Это согласуется с изменением района 240. Однако, рMON 10538, гибрид с N-терминальной третью (ген дикого типа первые 600 пар нуклеотидов до второго XbaI сайта) и синтетическими Стерминальными последними двумя третями пары нуклеотидов с 590 до 1845 на фиг. 3 использовали для трансформации табака и получали драматическое увеличение экспрессии. Уровни экспрессии, не кажется, чтобы были также высоки, как наблюдаемые с синтетическим геном, но сравнимы с уровнями модифицированного гена. Эти результаты показывают, что модификация сегмента 240 не существенна для увеличенной экспрессии, так как рMON 10538 имеет интактный 240 район. Полностью синтетический ген является, в большинстве случаев, превосходящим экспрессионные уровни В.t.k. (см. пример 2). Пример 2. Полностью синтетический В.t.k. HD–I ген. Синтетический В.t.k. HD–I ген сконструирован, используя предпочтительные растительные кодоны, перечисленные в таблице 5 внизу. Таблица 5 перечисляет кодоны и частоту их встречаемости в растительных генах двудольных растений по сравнению с частотой их встречаемости в В.t.k. HD–I гене жидкого типа (аминокислоты 1–615) и синтетическом гене этого примера. Общее количество каждой аминокислоты в этом сегменте перечислено в скобках под обозначением аминокислоты. Таблица 5 Встречаемость различных кодонов в синтетическом B.t.k HD–I гене Амино Кодон кислота Процентная встречаемость в растениях (Дт B.t.k.) Син ARG (43) CGA CGC CGG CGU AGA AGG 7 11 5 25 29 23 11 5 2 14 55 14 2 5 0 27 41 25 LEU (49) CUA CUC CUG CUU UUA UUG 8 20 10 28 5 30 16 0 2 22 50 10 4 20 6 24 0 45 SER (64) UCA UCC UCG UCU AGC AGU 14 26 3 21 21 15 27 9 8 19 6 31 5 28 0 31 32 5 THR (42) ACA ACC 21 41 31 19 14 53 ACG ACU 7 31 14 36 0 33 PRO (34) CCA CCC CCG CCU 45 19 9 26 35 6 21 38 53 12 3 32 ALA (31) GCA GCC GCG GCU 23 32 3 41 38 9 3 50 26 29 0 45 GLY (46) GGA GGC GGG GGU 32 20 11 37 52 17 15 15 45 15 6 34 ILE (46) AUA AUC AUU 12 45 43 39 11 50 2 67 30 Продолжение табл. 5 Аминокислота Кодон Процентная встречаемость в растениях (Дт B.t.k.) Син VAL (38) GUC GUG GUU 20 28 43 5 11 39 16 37 45 LYS (3) AAA AAG 36 64 10 0 33 67 ASN (44) AAC AAU 72 28 27 73 80 20 GLN (31) CAA CAG 64 36 77 23 61 39 HIS (10) CAC CAU 65 35 0 100 80 20 GLU (30) GAA GAG 48 52 87 13 50 50 ASP (23) GAC GAU 48 52 17 83 65 35 TYR (25) UAC UAU 68 32 20 80 72 28 CYS (2) UGC UGU 78 22 50 50 1000 PHE (36) UUC UUU 56 44 17 83 83 17 MET (9) AUG 100 100 100 TRP (9) UGG 100 100 100 У результирующего синтетического гена отсутствуют последовательности АТТТА, содержит только один потенциальный сайт полиаденилирования и имеет Г + Ц состав 48,5%. Рис. 3 – сравнение последовательности HD–I дикого типа по сравнению с последовательностью синтетического гена для аминокислот 1– 615. Имеется приблизительно 77% гомологии ДНК между синтетическим геном и геном дикого типа и заменены 366 из 615 кодонов (приблизительно 60%). Пример 3. Синтетический В.t.k. HD–73 ген. Кристаллический белковый токсин из В.t.k. HD–73 демонстрирует более высокую единичную активность против некоторых сельскохозяйственноважных вредителей. Белковый токсин HD–I и HD–73 демонстрирует существенную гомологию (» 90%) в N-терминальных 450 аминокислотах, но отличается значительно в районе аминокислот 451–615. Слитые белки, включающие аминокислоты 1–450 HD–1 и 451–615 HD–73 демонстрируют инсектицидиальные свойства HD–73 дикого типа. Использованная стратегия была использовать 5' – концевые две трети синтетического HD–1 гена (первые 1850 нуклеотидов, до Sac1 сайта) и драматически модифицировать последние 590 оснований (через 645 аминокислоту) HD–73 в манере, согласующейся с алгорифмом, использованном для планирования синтетического HD–I гена. Таблица 6 внизу перечисляет олигонуклеотиды, использованные для модификации HD–73 гена в порядке, использованном в гене с 5' к 3' концу. Девять олигонуклеотидов использовали в 590 нуклеотидном районе, каждый нуклеотид протяженностью от 33 до 60 оснований. Только неизменные районы слева были областями, в которых не было длинных непрерывных участков А или Т нуклеотидов (длиннее шести). Все сайты полиаденилирования и сайты АТТТА были элиминированы. Таблица 6 Праймеры для мутагенеза B.t.k. HD – 73 Праймер Длина (пн) Последовательность 73K1363 51 AATACTATCG GATGCGATGA TGTTGTTGAA CTCAGCACTA CGGTGTATCC A 73K1437 33 TCCTGAAATG ACAGAACCGT TGAAGAGAAA GTT 73K1471 48 ATTTCCACTG CTGTTGAGTC TAACGAGGTC TCCACCAGTG AATCCTGG 73K1561 60 GTGAATAGGG GTCACAGAAG CATACCTCAC ACGAACTCTA TATCTGGTAG ATGTTGGATGG 73K1642 33 TGTAGCTGGA ACTGTATTGG AGAAGATGGA TGA 73K1675 48 TTCAAAGTAA CCGAAATCGC TGGATTGGAG ATTATCCAAG GAGGTAGC 73K1741 39 ACTAAAGTTT CTAACACCCA CGATGTTACC GAGTGAAGA 73K1797 36 AACTGGAATG AACTCGAATC TGTCGATAAT CACTCC 73KTERM 54 GGACACTAGA TCTTAGTGAT AATCGGTCAC ATTTGTCTTG AGTCCAAGCT GGTT Результирующий ген имеет два потенциальных сайта полиаденилирования (по сравнению с 18 в WТ) и не имеет АТТТА последовательности (12 в WT). Г + Ц состав увеличился с 37% до 48%. Все 59 индивидуальных замен пар оснований были сделаны, используя праймеры из таблицы 6. В целом, имеется 90% гомология ДНК между районом гена HD–73, модифицированного сайт-направленным мутагенезом, и последовательностью дикого типа аналогичного района HD–73. Синтетический HD–73 – гибрид первых 1360 нуклеотидов из синтетического HD–I и следующих 590 нуклеотидов или около того модифицированной HD–73 последовательности. Фиг. 4 – сравнение выше описанного синтетического B.t.k. HD–73 и B.t.k. HD–73 дикого типа, кодирующего аминокислоты 1–645. В модифицированном районе HD–73 гена 44170 кодонов (25%) было заменено как результат замен сайт-направленного мутагенеза, происходящих из олигонуклеотидов, находящихся в таблице 6. В целом, приблизительно 50% кодонов в синтетическом В.t.k. HD–73 отличаются от аналогичного сегмента дикого типа и гена HD–73. Делению одной пары нуклеотидов обнаружили в синтетическом HD–73 гене в процессе секвенирования 3' конца в нуклеотидной паре 1890. Это приводит к мутации сдвига рамки начиная с аминокислоты 625 с преждевременным стоп кодоном в аминокислоте 640 (pMON5379). Таблица 7 внизу сравнивает встречаемость кодонов гена B.t.k. HD–73 дикого типа против синтетического гена этого примера по аминокислотам 451–645 и использование кодонов природных генов двудольных растений. Общее количество каждой аминокислоты, кодируемой в этом сегменте данного гена находится в скобках под обозначением аминокислоты. Таблица 7 Встречаемость различных кодонов в синтетическом B.t.k HD–73 гене Процент использования в растениях (Дт НД-73) Син Аминокислота Кодон ARG (10) CGA CGC CGG CGU AGA AGG 7 11 5 25 29 23 10 0 10 20 60 0 0 8 0 23 62 8 LEU (12) CUA CUC CUG CUU UUA UUG 8 20 10 28 5 30 25 17 17 8 33 0 8 58 8 0 8 17 SER (21) UCA UCC UCG UCU AGC AGU 14 26 3 21 21 15 24 10 10 24 0 33 18 27 0 18 14 23 Аминокислота Кодон THR (15) ACA ACC ACG ACU 21 41 7 31 47 13 13 27 38 31 0 31 PRO (7) CCA CCC CCG CCU 45 19 9 26 71 0 14 14 71 0 0 29 Продолжение табл. 7 Процент использования в растениях (Дт НД-73) Син ALA (14) GCA GCC GCG GCU 23 32 3 41 29 7 21 43 31 8 15 46 GLY (15) GGA GGC GGG GGU 32 20 11 37 33 0 27 40 43 0 14 43 ILE (15) AUA AUC AUU 12 45 43 33 7 60 7 40 53 VAL (15) GUA GUC GUG GUU 9 20 28 43 40 0 20 40 7 7 36 50 LYS (3) AAA AAG 36 64 67 33 100 0 ASN (20) AAC AAU 72 28 20 80 53 47 GLN (5) CAA CAG 64 36 60 40 67 33 HIS (3) CAC CAU 65 35 67 33 100 0 GLU (7) GAA GAG 48 52 86 14 57 43 ASP (5) GAC GAU 48 52 40 60 50 50 Продолжение табл. 7 Аминокислота Кодон TYR (5) UAC UAU 68 32 0 100 20 80 CYS (0) UGC UGU 78 22 0 0 0 0 PHE (13) UUC UUU 56 44 8 92 67 33 MET (2) AUG 100 100 100 TRP (2) UGG 100 100 100 Процент использования в растениях (Дт НД-73) Син Конструировали еще один усеченный синтетический HD–73 ген. Последовательность этого синтетического HD–73 гена идентична последовательности вышеописанного синтетического HD–73 гена в районе, в котором они перекрываются (аминокислоты 29–615), и она также кодирует Met–Ala на N-конце. Фиг. 8 демонстрирует сравнение этого усеченного синтетического HD–73 гена с N-терминальными Met–Ala против HD–73 гена дикого типа. В то время, как предыдущие примеры были направлены на получение синтетических и модифицированных генов, кодирующих усеченные B.t.k. белки, синтетический и модифицированный гены могут также быть получены, кодирующими полноразмерные токсичные белки. Один полноразмерный В.t.k. ген состоит из последовательности синтетического HD–73 на фиг. 4, нуклеотиды 1–1845, плюс HD–73 последовательность дикого типа, кодирующая аминокислоты 616 к С-концу нативного белка. Фиг. 9 показывает сравнение этого синтетического (дикого типа полноразмерного HD– 73 гена против полноразмерного HD–73 гена дикого типа). Еще один полноразмерный B.t.k. ген состоит из синтетической HD–73 последовательности фиг. 4, нуклеотиды 1–1845, плюс модифицированная HD–73 последовательность, кодирующая аминокислоты 616 по направлению к С-концу нативного белка. С-концевой район был модифицирован сайт-направленным мутагенезом, чтобы удалить имеющиеся сигналы полиаденилирования и последовательности АТТТА в соответствии с алгоритмом фиг. 1. Фиг. 10 демонстрирует сравнение этого синтетического (модифицированного полноразмерного HD–73 гена против полноразмерного HD–73 гена дикого типа). Еще один полноразмерный В.t.k. ген состоит из полной синтетической последовательности HD–73, которая объединяет синтетическую HD–73 последовательность фиг. 4, нуклеотиды 1–1845, плюс синтетическая последовательность, кодирующая аминокислоты 616 по направлению к С-концу нативного белка. Сконцевая синтетическая часть предназначена для элиминации имеющихся сигналов полиаденилирования и последовательностей АТТТА и для включения предпочтительных растительных кодонов. Фиг. 11 представляет сравнение этого полностью синтетического полноразмерного HD–73 гена против полноразмерного HD–73 гена дикого типа. Альтернативно, еще один полноразмерный B.t.k. ген состоит из полностью синтетической последовательности, включающей 1–1830 пар нуклеотидов B.t.k. HD–I (фиг. 3) и 1834–3534 B.t.k. HD–73 (фиг. 11). Пример 4. Экспрессия модифицированного и синтетического B.t.k. HD–I и синтетического HD–73. Сконструирован целый ряд векторов для трансформации растений для экспрессии B.t.k. генов путем объединения структурных кодирующих последовательностей ранее описанных генов в кассетном векторе для трансформации растений pMON 893. Соответствующий интермидматный вектор для трансформации вставляли в подходящий "разоруженный" вектор Agrobacterium, такой как f.tumefaciens АСО, супра. Растительные эксплантаты культивировались вместе с "разоруженным" вектором Agrobacterium, и растения регенерировали при селекции на канамициновую устойчивость, используя известные протоколы: табака (Rorsch и др., 1985), томатов (MoCormict и др., 1986), и хлопка (Trolinder и др., 1987). а) Табак. Уровень B.t.k. HD–I белка в трансгенных растениях табака, содержащих pMON 9921 (усеченный, дикого типа), pMON 5370 (модифицированный HD–I, пример 1, фиг. 2) и pMON 5377 (синтетический HD–I, пример 2, фиг. 3), анализировали Вестерн анализом. Ткань листьев замораживали в жидком азоте, растирали до тонкого порошка и затем растирали в 12 (вес/объем) ДДС–ПЭГ буфера для образца. Образцы замораживали в сухом льде, затем инкубировали 10 минут в кипящей водяной бане и микроцентрифугировали в течение 10 минут. Белковую концентрацию супернатанта определяли методом Брэнфорда (Anal. Biochem. 72: 248–254). Пятьдесят мкг белка наносили на дорожку 9% ДДС–ПЭГ геля, белок переносили на нитроцеллюлозу и B.t.k. HD–I белок визуализировали, используя антитела, продуцируемые против B.t.k. HD–I белка, как первичные антитела, и вторичные антитела против конъюгированной щелочной фосфатазы как описано изготовителем (Promega, Madison, WI). Очищенный трипсиновый HD–I фрагмент использовали как контроль. Принимая во внимание, что B.t.k. белок из растений табака, содержащих pMON 9921 был ниже уровня детекции, B.t.k. белок из растений, содержащих модифицированный (pMON 5370) и синтетический (pMON 5377) гены, легко детектировался. B.t.k. белок, из растений, содержащих pMON 9921 оставались недетектируемыми, даже с 10кратным временем инкубации. Соответствующие уровни B.t.k. HD–I белка в этих растениях оцениваются в таблице 8. Так как белок из растений, содержащих pMON 9921, не наблюдали, уровень белка в этих растениях оценивали из соответствующих уровней мРНК (см. ниже). Растения, содержащие модифицированный ген (pMON 5370), экспрессировали приблизительно в 100 раз больше B.t.k. белка, чем растения, содержащие ген дикого типа (pMON 9921). Растения, содержащие полностью синтетический B.t.k. HD–I ген (pMON 5377), экспрессировали приблизительно в пять раз больше белка, чем растения, содержащие модифицированный ген. Модифицированный ген способствует большей части наблюдаемого увеличения экспрессии B.t.k. Растения, использованные для образования вышеперечисленных данных, являются лучшими представителями из каждой конструкции, основанной либо на анализе табачной бабочки-бражнике, либо на данных, полученных из предыдущего Вестерн анализа. Таблица 8 Экспрессия B.t.k НD-I белка в трансгенном табаке Описание гена Дикого типа Вектор Концентрация B.t.k. белка* Во сколько раз увеличилась экспрессия В pMON 9921 10 1 Модифицированный Синтетический pMON 5370 pMON 5377 1000 5000 100 500 *B.t.k белковые концентрации экспрессируются в нг/мг всего растворимого белка. Уровень B.t.k. белка для растений, содержащих ген дикого типа, оценивали по уровням мРНК. Растения, содержащие эти гены, тестировались на биоактивность, чтобы определить, приводят ли повышенные количества белка, наблюдаемого в Вестерн-анализе, к соответствующему увеличению биоактивности. Листья тех же растений, использованных для Вестерн–данных в таблице 1, тестировали на биоактивность против двух насекомых. Детальный анализ листьев был сначала проделан, используя табачную бабочку-бражника, исключительно чувствительного липидоптерального насекомого. Листья из всех трех трансгенных растений табака полностью были защищены и наблюдали 100% смертность табачной бабочки-бражника (см. таблицу 9 внизу). Гораздо менее чувствительное насекомое, червь листовой хлопковый, использовали затем в другом детальном биоанализе листьев. Совка-карадрина приблизительно в 500 раз менее чувствительна к B.t.k. HD–I белку, чем табачная бабочка-бражник. Разница в чувствительности этих двух насекомых была определена, используя очищенный HD–I белок в анализе пищевого режима (см. внизу). Растения, содержащие ген дикого типа (pMON 9921) демонстрировали только минимальную защиту от совки-карадрина, тогда как растения, содержащие модифицированный ген показывали почти полную защиту и растения, содержащие полностью синтетический ген были целиком защищены от повреждения совкой-карадрина. Результаты этих биоанализов подтверждают уровни экспрессии B.t.k. HD–I, наблюдаемой Вестерн анализом и демонстрируют, что повышенные уровни B.t.k. HD–I белка коррелируют с повышенной инсектицидиальной активностью. Таблица 9 Протекции растений табака от табачной бабочки-бражника и совки-карадрина Описание гена Нет Дикого типа Модифицированный Синтетический Вектор Вред табачной бабочке-бражнику* Вред совкекарадрину* Нет pMON 9921 pMON 5370 pMON 5377 NL 0 0 0 NL3 1 0 * – степень вреда насекомым оценивалась: 0, нет повреждений; 1, легкие; 2, средние; 3, серьезные; или NL, не имеется отсутствующих листьев. Биоактивность B.t.k. HD–I белка, продуцируемого этими трансгенными растениями, далее исследовали, до более точного количества относительных активностей. Листовую ткань из растений табака, содержащих гены дикого типа, модифицированные и синтетические, растирали в 100 мМ буфере карбоната натрия, рН 10 в соотношении 1:2 (вес/объем). Отделяющийся материал удаляли центрифугированием. Супернатант объединяли в синтетическую диету подобно тому, как описано Marrone и др. (1985). Диетический субстрат готовили в день данного теста с растворами растительного экстракта, включенных вместо 20% водяного компонента. Один мл диетической среды разаликвочивали в 96-гнездные микротитрационные планшеты. После высушивания "диеты" добавляли по одной личинке 1-го дня табачного почкового червя в каждую лунку. 16 насекомых тестировались для каждого растительного образца. Растения инкубировали при 27оС. Через семь дней личинки из каждой обработки объединяли и взвешивали на аналитических весах. Средний вес на насекомого подсчитывали и сравнивали со стандартным графиком относящегося к концентрациям B.t.k. белка к среднему весу личинки. Вес насекомых был обратно пропорционален (в логарифмической манере) относительному увеличению концентрации B.t.k. белка. Количество B.t.k. HD–I белка, основанное на растущем ингибировании роста личинок, определяли для двух разных растений, содержащих каждый по три гена. Специфическую активность (нг B.t.k. HD–I на мг растительного белка) определяли для каждого растения. Растения, содержащие модифицированный HD–I ген (pMON 5370) составляли в среднем приблизительно 1400 нг (1200 и 1600 нг) B.t.k. HD–I на мг растительного экстрагированного белка. Эта величина сравнима близко с 1000 нг B.t.k. HD–I белка на мг растительного экстрагированного белка как определено Вестерн анализом (таблица 1), концентрации B.t.k. HD–I для растений, содержащих синтетический HD–I ген, составляли в среднем приблизительно 8200 нг (7200 и 9200 нг) B.t.k. HD–I белка на мг растительного экстрагированного белка. Это число хорошо сравнимо с 5000 нг HD–I белка на мг растительного экстрагированного белка, оцененного Вестерн анализом. Подобно этому, растения, содержащие синтетический ген показывали приблизительно в шесть раз выше специфическую активность, чем соответствующие растения, содержащие модифицированный ген для этих биоанализов. В Вестерн анализе соотношение приблизительно 10 раз, снова оба находятся в хорошем соответствии. Уровень B.t.k. белка в растениях, содержащих ген HD–I дикого типа (pMON 9921), был слишком низким, чтобы дать значительное уменьшение веса личинок и отсюда был ниже уровня, который мог бы быть подсчитан в этом анализе. В заключение, уровни B.t.k. HD–I белка, определенные как биоанализами, так и Вестерн анализом, для этих растений, содержащих модифицированные и синтетические гены, согласуются, что демонстрирует, что B.t.k. HD–I белок, продуцируемый этими растениями, является биологически активным. Уровни мРНК определяли в растениях, содержащих B.t.k. HD–I ген (pMON 9921) дикого типа и модифицированный ген (pMON 5370) для выяснения, происходят ли повышенные уровни белковой продукции от увеличения транскрипции или трансляции. мРНК из растений, содержащих синтетический ген, не может анализироваться непосредственно с той же пробы ДНК как использования для генов дикого типа с модифицированных из-за многочисленных замен, сделанных в кодирующей последовательности. мРНК выделяли и гибридизовали с одно-цепочечной пробой ДНК, гомологичной приблизительно 5' 90 пн кодирующей последовательности гена дикого типа или модифицированного. Гибриды переваривали SI нуклеазой и защищенные пробой фрагменты анализировали электрофорезом в геле. Так как процедура использовала большой избыток пробы и долгое время гибридизации, количество защищенной пробы пропорционально количеству B.t.k. мРНК, присутствующей в этом образце. Два растения, экспрессирующие модифицированный ген (pMON 5370), как было обнаружено, продуцируют в 10 раз больше РНК, чем растение, экспрессирующее ген дикого типа (pMON 9921). Повышенный уровень мРНК с модифицированного гена согласуется с результатом, ожидаемым от модификаций, введенных в этот ген. Однако, это 10-кратное увеличение мРНК, с модифицированного гена по сравнению с геном дикого типа контрастирует с 100-кратным увеличением B.t.k. белка с этих генов в растениях табака. Если две мРНК одинаково хорошо транслировались, тогда 10-кратное увеличение стабильной мРНК, можно было бы ожидать, дает 10-кратное увеличение белка. Более высокое увеличение уровня белка указывает на то, что мРНК модифицированного гена транслируется около 10 раз высшей эффективностью, чем дикого типа. Таким образом, около половины общего эффекта на экспрессии гена может быть объяснено изменениями в уровнях мРНК и около половины – изменениями трансляционной эффективности. Это увеличение трансляционной эффективности поражает тем, что только около 9,5% кодонов было заменено в модифицированном гене, то есть, понятно, что этот эффект не обусловлен полной сменой предпочтительности использования кодонов. Повышенная трансляционная эффективность может быть обусловлена изменением во вторичной структуре мРНК, которое действует на трансляцию, или удалением специфических трансляционных блоков, обусловленных специфическими кодонами, которые были заменены. Увеличенная экспрессия, показанная с синтетическим HD–I геном, была также показана с синтетическим HD–73 геном в табаке. B.t.k. HD–73 детектировали в экстрактах растений табака, содержащих усеченный ген HD–73 дикого типа (pMON 5367), в то время как B.t.k. HD–73 белок легко обнаруживали в экстрактах из растений табака, содержащих синтетический HD–73 ген рис. 4 (pMON 5383). Приблизительно 1000 кг B.t.k. HD–73 белка обнаружили на мг общего растворимого растительного белка. Как описано выше в примере 3, B.t.k. HD–73 белок, кодируемый pMON 5383, содержит небольшой С-концевой избыток аминокислот, не кодируемых HD–73 белком дикого типа. Эти экстра аминокислоты не оказывали влияния на токсичность насекомых или на повышение растительную экспрессию. Второй синтетический HD–73 ген конструировали как описано в примере 3 (рис. 8) и использовали, для трансформации табака (pMON 5390). Анализ растений, содержащих pMON 5390, показал, что этот ген экспрессировался на уровнях, сравнимых с уровнями pMON 5383 и что эти растения имели сходную инсектицидиальную эффективность. В растениях табака синтетический HD–I ген экспрессировался на приблизительно 5-кратном уровне по сравнению с синтетическим HD–73 геном. Однако, этот синтетический HD–73 ген еще экспрессировался по меньшей мере в 100 раз лучше, чем HD–73 ген дикого типа. HD–73 белок приблизительно в 5 раз более токсичен для многих насекомых-вредителей, чем HD–I белок, таким образом как HD–I, так и HD–73 ген обеспечивают приблизительно сравнимую инсектицидиальную эффективность в табаке. Полноразмерные B.t.k. HD–73 гены, описанные в примере 3, были также вставлены в вектор для трансформации растений pMON 893 так, чтобы они экспрессировались с En 35s промотора. Синтетический дикого типа полноразмерный HD–73 ген, фиг. 9, вставляли pMON 893 для создания pMON 10505. Синтетический /модифицированный полноразмерный HD–73 ген, рис. 10, вставляли в pMON 893 для создания pMON 10526. Полностью синтетический HD–73 ген, рис. 11, объединяли с pMON 893 для создания pMON 10518. Эти вектора использовали для получения трансформированных растений табака, и эти растения анализировали на инсектицидиальную эффективность и на уровни B.t.k. HD–73 белка Вестерн блотами или иммуноанализом ELISA. Растения табака, содержащие все три эти полноразмерных B.t.k гена продуцировали детектируемый B.t.k. белок, и показывали 100% смертность табачной бабочки-бражника. Этот результат является неожиданным в свете предыдущих сообщенных попыток экспрессировать полноразмерные B.t.k. гены в трансгенных растениях. Vaeck и др. (1987) сообщили, что полноразмерный B.t.k. berlin ген, подобный нашему HD–I гену, не экспрессировался на детектируемом уровне в табаке. Barton и др. (1987) описали подобный результат для еще одного полноразмерного гена из B.t.k. HD–I (так называемый 4,5 тпн ген), и в дальнейшем указывали, что каллюс табака, содержащий этот ген становится некротическим; указывая что продукт полноразмерного гена токсичен для растительных клеток. Fischhoff и др. (1987) описали, что полноразмерный B.t.k. HD–I ген в томатах слабо экспрессировался по сравнению с усеченным геном, и не было растений, которые были полностью токсичными для табачной бабочки-бражника. Все три вышеперечисленные сообщения указывают, гораздо более высокие экспрессионные уровни и появление токсичных растений, если соответствующие B.t.k. гены были усеченными. Adang и др. сообщил, что полноразмерный HD–73 ген давал несколько растений табака с некоторой биологической активностью (ни одно не было высоко токсичным против бабочки-бражника и плохо детектируемый B.t.k. белок. Ими было также замечено, что основная B.t.k. мРНК в этих растениях была усеченная 1,7 тпн, которая не могла бы кодировать функциональный токсин. Это указывало на неправильную экспрессию гена в табаке. В противоположность всем этим сообщениям три полноразмерных B.t.k. HD–73 гена, описанных выше, все приводят к относительно высоким уровням белка и высоким уровням токсичности для насекомых. B.t.k. белок и уровни мРНК в растениях табака показаны в таблице 10 для этих трех векторов. Как можно видеть из этой таблицы, синтетический /дикого типа ген (pMON 10506) продуцирует B.t.k. белок приблизительно 0,01% от общего растворимого белка, синтетический/ модифицированный ген продуцирует B.t.k. около 0,02% общего растворимого белка, и полный синтетический ген продуцирует около 0,2% общего растворимого белка. мРНК B.t.k. анализировали в этих растениях Норзерн-блот анализом, используя общую 5 синтетическую половину этих генов в качестве пробы. Как показано в таблице 10, повышенные белковые уровни могут значительной степени объясняться повышенными уровнями мРНК. По сравнению с усеченным модифицированным и синтетическим генами это может указывать, что главный вклад в повышенную трансляционную эффективность вносит 5' половина гена, в то время как 3' половина гена содержит главным образом детерминанты стабильности мРНК. Повышенные белковые уровни также указывают, на то, что увеличенное количество полноразмерного гена, который является синтетическим или модифицированным, увеличивает B.t.k. уровни белка. По сравнению с усеченными синтетическими B.t.k. HD– 73 генами (pMON 5383 или pMON 5390) полностью синтетический ген (pMON 10518) продуцирует гораздо или слегка больше B.t.k. белка, демонстрируя, что полноразмерные гены способны экспрессироваться на высоких уровнях в растениях. Эти растения табака с высокими уровнями полноразмерного HD–73 белка не представляют доказательства аномальности и являются полностью воспроизводимыми. Уровни B.t.k. белка в этих растениях также дают ожидаемые уровни токсичности для насекомых, основанной на пищевом исследовании с червем листовым хлопковым или анализах пищевого режима растительных экстрактов с табачным почковым червем B.t.k. белок, обнаруженный Вестерн-блот анализом в этих растениях табака часто содержит различное количество белка около 80 кДа, который, по-видимому, протеолитический фрагмент полноразмерного белка. С-терминальная половина полноразмерного белка, как известно, протеолитически чувствительна, и подобные протеолитические фрагменты видны в случае полноразмерного гена E.coli и самого B.t.k. Эти фрагменты полностью инсектицидиальные Норзерн-блот анализ показал, что все существенные мРНК с этих полноразмерных генов были ожидаемого размера полной длины. Нет доказательства существования усеченных мРНК, которые давали бы начало 80 кДа белковому фрагменту. В дополнение, возможно, что этот фрагмент не присутствует в интактных растительных клетках и просто обусловлен протеолизом, во время экстракции для иммуноанализа. Таблица 10 Полноразмерный B.t.k НD-73 белок и уровни мРНК в трансгенных растениях табака Описание гена Синтетический/дикого типа Синтетический/модифицированный Полностью синтетический Вектор Концентрация белка* B.t.k. Относительный уровень мРHК B.t.k. pMON 10506 pMON 10526 pMON 10518 100 400 2000 0,5 1 40 Таким образом, не существует серьезного препятствия для продукции высоких уровней B.t.k. HD–73 белка в растениях с синтетических генов, и, ожидают, что это справедливо для других полноразмерных липидоптеранных активных генов, таких как B.t.k. HD–I или B.t.entemocidus. Полностью синтетический B.t.k. HD–I ген из примера 3 монтировался в векторы растительной трансформации такие как pMON 893. Полностью синтетический ген в pMON 10518 также был использован в еще одном растительном векторе и анализирован в растениях табака. Хотя CaM V35 промотор является в основном конструктивным промотором с высоким уровнем в большинстве растительных тканей экспрессионный уровень генов, направляемых CaM V35 промотором, низкий в цветочной ткане по отношению к уровням, наблюдаемым в тканях листьев. Так как экономически важные мишени, повреждаемые некоторыми насекомыми, являются цветочными частями или происходящими из цветочных частей (например, хлопковые коробочки и шелуха бутоны табака, бутоны и плоды томатов), это может быть преимуществом для увеличения экспрессии B.t.k. белка в этих тканях над тем, что получен с CaM V35S промотором. 35S промотор вируса мозаики остроконечной кондиломы (FMV аналогичен CAM V35S промотору. Этот промотор был выделен и встроен в вектор для растительной трансформации, аналогичный pMON 893. Относительно CaM V промотора FM V35S промотор высоко экспрессируется в флоральной ткани, в то же время обеспечивая подобные высокие уровни генной экспрессии в других тканях, таких как листовая. Вектор растительной трансформации pMON 10517 был сконструирован, в котором полноразмерный синтетический B.t.k. HD–73 ген с рис. 11 направляется FM V35S промотором. Этот вектор идентичен pMON 10518 примера 3 за исключением того, что FM V промотор заменен на CaM V промотор. Растения табака, трансформированные pMON 10517 и pMON 10518 получены и сравнивались на экспрессию B.t.k. белка Вестерн-блот или ELISA иммуноанализом в листьях и флоральной ткане. Этот анализ показал, что pMON 10517, содержащий FM V промотор, экспрессирующий на более высоких уровнях полноразмерный HD–73 белок в флоральной ткане, чем pMON 10518, содержащий CaM V промотор. Экспрессия полноразмерного B.t.k. HD–73 белка из pMON 10517 в листовой ткане сравнима с экспрессией, наблюдаемой в большинстве высоко экспрессирующих растений, содержащих pMON 10518. Однако, когда проанализировали флоральную ткань, табачные растения, содержащие pMON 10518, которые имели высокие уровни B.t.k. белка в листовой ткани, не имели детектируемого B.t.k. белка в цветках. С другой стороны, цветки, растений табака, содержащих pMON 10517 имели уровни B.t.k. белка почти такие же высокие, как и уровни в листьях приблизительно 0,05% общего растворимого белка. Этот анализ показал, что FM V промотор может ис пользоваться для продукции относительно высоких уровней B.t.k. белка в флоральной ткани по сравнению с CaM V промотором. б) Томаты. B.t.k. HD–I гены дикого типа, модифицированный и синтетический, тестированные в табаке, вводили в другие растения, чтоб демонстрировать широкие возможности этого изобретения. Трансгенные томаты получали, содержащие эти три гена. Данные показывают, что повышенная экспрессия, наблюдаемая с модифицированным и синтетическим генами, также распространяются и на томаты. Принимая во внимание, что B.t.k. HD–I белок только слабо детектируется в растениях, содержащих HD–I ген дикого типа (pMON 9921), B.t.k. HD–I легко детектировали и определяли уровни для растений, содержащих модифицированный (pMON 5370) или синтетический (pMON 5377) гены. Экспрессионные уровни для растений, содержащих HD–I гены дикого типа, модифицированный или синтетический, были приблизительно 10, 100 и 500 нг на мг тотального растительного экстракта растений (см. таблицу 11 внизу). Увеличение B.t.k. HD–I белка для модифицированного гена отвечало за большую часть наблюдаемого увеличения, в 10 раз выше, чем растения, содержащие ген дикого типа, по сравнению с только дополнительным 5-кратным увеличением для растений, содержащих синтетический ген. Вновь сделанные сайт-направленным мутагенезом замены в модифицированном гене являются главными поставщиками в повышенную экспрессию B.t.k. HD–I. Таблица 11 B.t.k НD-I экспрессия в трансгенных растениях томатов Вектор Концентрация B.t.k. белка* Во сколько раз увеличена B.t.k. экспрессия pMON 9921 pMON 5370 pMON 5377 10 100 500 1 10 50 Описание гена Дикого типа Модифицированный Синтетический * – B.t.k. HD-I белковые концентрации экспрессировались в нг/мг общего растворимого растительного белка. Данные для растений, содержащих ген дикого типа оцениваются из уровней мРНК и белковых уровней, определяемых ELISA. Эти отличия в B.t.k. HD–I экспрессии были подтверждены биоанализом против табачной бабочкибражника и совки-карадрина. Листья из растений томатов, содержащих каждый из этих генов, контролирующих гибель табачной бабочки-бражника и дающих 100% смертность. В случае совки-карадpины листья из растений, содержащих HD–I ген дикого типа (pMON 9921), показывали значительный причиняемый вред, листья из растений, содержащих модифицированный ген (pMON 5370), демонстрировал меньший вред и листья из растений, содержащих синтетический ген (pMON 5377), были полностью защищены (см. таблицу 12 ниже). Таблица 12 Протекция растений томатов от табачной бабочки-бражника и совки карадрина Вектор Вред*, наносимый табачной бабочкебражнику Вред*, наносимый совке-карадрине Нет pMON 9921 pMON 5370 pMON 5377 4 0 0 0 4 3 1 0 Описание гена Нет Дикого типа Модифицированный Синтетический * Вред определяется как указано в табл. 9. Большая часть подхода с синтетическим геном распространялась на томаты с синтетическим B.t.k. HD–73 геном. В томатах экстракты из растений, содержащих усеченный HD–73 ген дикого типа (pMON 5367), не показывали детектируемого HD–73 белка. Экстракты из растений, содержащих синтетический HD–73 ген (pMON 5383), показывали высокие уровни B.t.k. НD–73 белка, приблизительно 2000 нг на мг экстракта растительных белков. Эти данные ясно демонстрируют, что замены, сделанные в синтетическом HD–73 гене, ведут к драматическому увеличению экспрессии HD–73 белка в томатах, также как и в табаке. В контрасте с табачными, синтетический HD–73 ген в томатах, экспрессируется приблизительно на 4–5 раз более высоких уровнях, чем синтетический HD–I ген. Так как HD–73 белок приблизительно в 5 раз более активный, чем HD–I белок против многих насекомых-вредителей, включая виды Heliothis, увеличенная экспрессия синтетического HD–73 по сравнению с HD–I соответствует около 25-кратной увеличенной инсектицидиальной эффективности в томатах. Для того, чтобы определить механизмы, вовлеченные в повышенную экспрессию модифицированного и синтетического B.t.k. HD–I генов в томатах, выполняли SI нуклеазный анализ уровней мРНК из трансформированных растений томатов. Как указано выше, подобный анализ был выполнен с растениями табака, и этот анализ показал, что модифицированный ген продуцирует до 10 раз больше мРНК, чем ген дикого типа. Анализ в томатах использовал другую пробу ДНК, которые позволяли анализировать HD–I гены дикого типа (pMON 9921), модифицированный (pMON 5370) и синтетический (pMON 5377) с той же пробой. Эта проба происходила из 5' нетранслируемого промотора CaM V35 в pMON 893, который был общим у всех этих трех векторов (pMON 9921, pMON 5370 и pMON 5377). Этот SI анализ указывал, что уровни мРНК B.t.k. из модифицированного гена были от 3 до 5 раз выше, чем для гена дикого типа, и что уровни мРНК для синтетического гена были в 2–3 раза выше, чем для модифицированного гена. Три независимых трансформанта анализировались для каждого гена. По сравнению с увеличением B.t.k. HD–I белка из этих генов в томатах, показанному в таблице 11, эти возрастания мРНК могут объяснить приблизительно половину увеличения общего белка как было показано для табака для генов дикого типа и модифицированного. Для томатовобщее увеличение мРНК от дикого типа к синтетической приблизительно от 6 к 15 по сравнению с увеличением белка около 50 раз. Этот результат подобен наблюдаемому для табака в сравнении генов дикого типа и модифицированного, и это также распространяется и на синтетический ген. То есть, около половины общего увеличения B.t.k. белка из генов дикого типа и модифицированного можно объяснить увеличением мРНК и около половины – увеличенной трансляционной эффективностью. То же верно также в сравнении модифицированного гена с синтетическим. Хотя имеется дополнительное увеличение уровней РНК, это увеличение мРНК может объяснить только около половины увеличения общего белка. Полноразмерные B.t.k. гены, описанные выше, также использовали для трансформации растений табака и эти растения анализировали на B.t.k. белок и инсектицидиальную эффективность. Результаты этого анализа показаны в таблице 13. Растения, содержащие ген синтетический/дикого типа (pMON 10506) продуцируют B.t.k. HD–73 белок на уровнях около 0,01% уровня их общего растворимого белка. Растения, содержащие ген синтетический/модифицированный (pMON 10526) давали около 0,04% B.t.k. белка, и растения, содержащие полностью синтетический ген (pMON 10518) продуцировали около 0,2% B.t.k. белка. Эти результаты очень похожи на результаты на растениях табака для тех же генов. Уровни мРНК, оцененные Норзерн-блот анализом в томатах, также увеличиваются в параллели с увеличением белкового уровня. Как для табака с этими тремя генами, большая часть увеличения белка может объясняться увеличением мРНК с небольшой долей увеличения трансляционной эффективности, указанной для полностью синтетического гена. Наивысшие уровни полноразмерного B.t.k. белка (из pMON 10518) сравнимы или только слегка ниже, чем наивысшие уровни, наблюдаемые для усеченных HD–73 генов (pMON 5383 и pMON 5390). Растения томатов, экспрессирующих эти полноразмерные гены, имеют инсектицидиальную активность, ожидаемую для наблюдаемых уровней белка, как определялось пищевым анализом в случае червя листового хлопкового или анализах пищевого режима растительных экстрактов в случае табачной бабочкибражника. Таблица 13 Полноразмерный B.t.k НD-73 белок и уровни мРНК в трансгенных растениях табака Описание гена Синтетический/дикого типа Синтетический/модифицированный Полностью синтетический Вектор Концентрация B.t.k. белка* Во сколько раз увеличена B.t.k. экспрессия pMON 10506 pMON 10526 pMON 10518 100 400 2000 1 2-4 10 в) Хлопок Большая часть повышенной экспрессии B.t.k. HD–I и B.t.k. HD–73 при использовании модифицированного и синтетического генов распространяется на хлопок. Получили трансгенный каллюс, который содержал HD–I гены дикого типа (pMON 9921) и синтетический (pMON 5377). Здесь снова B.t.k. HD–I белок, продуцируемый каллюсом, содержащим ген дикого типа, не обнаружила тогда как каллюс, содержащий синтетический HD–I ген, экспрессирующий HD–I белок, на легко детектируемых уровнях. HD–I белок продуцируется приблизительно 1000 нг/мг растительного белка в экстракте из каллюса. Опять, чтобы убедиться, что белок, продуцируемый каллюсом трансгенного хлопка, биологически активен, и что повышенная экспрессия наблюдалась с транслированного гена для увеличения биологической активности, экстракты каллюса хлопка готовили тем же способом, что и описанный для растений табака, за исключением того, что каллюс сначала высушивали между листами Ватман для удаления столько воды, сколько возможно. Высушенный каллюс затем растирали в жидком азоте и растирали в 100 мМ буфере карбоната натрия, рН 10. Приблизительно 0,5 мл аликвоты этого материала помещали на листья томатов красильной кистью. После высушивания листьев пять личинок бабочки-бражника сажались на каждый из двух образцов листьев. Листья, "покрашенные" экстрактом из контрольного каллюса, были полностью разрушены. Листья, "окрашенные" экстрактом из каллюса, содержащего HD–I ген дикого типа (pMON 9921), показывали сильные повреждения. Листья, "окрашенные" экстрактом из каллюса, содержащего HD–I синтетический ген (pMON 5377), не показывали повреждений (см. таблицу 14 ниже). Таблица 14 Протекция табачной бабочки-бражника против листьев табака, “окрашенных” экстрактами, приготовленными из каллюса хлопка, содержащего контрооль, ген B.t.k НD-I дикого типа, синтетический ген или синтетический ген Описание гена Контроль Дикий тип HD-I Синтетический HD-I Синтетический HD-73 Вектор Вред*, наносимый табачной бабочке-бражнику Контроль pMON 9921 pMON 5377 pMON 5383 N4 3 0 0 *вред оценивали как показано в табл. 8. Каллюс хлопка также получали содержащим еще один синтетический ген, ген кодирующий B.t.k. HD–73. Приготовление этого гена описано в примере 3. Каллюс, содержащий синтетический HD–73 ген продуцировал соответствующий HD–73 белок на даже более высоких уровнях, чем каллюс, который содержал синтетический HD–I ген. Экстракты, сделанные из каллюса, содержащего HD–73 синтетический ген (pMON 5383), представляли повышенный контроль для табачной бабочкибражника, когда их наносили на листья томатов как описано для экстрактов, содержащих HD–I белок (см. таблицу 14). Трансгенные растения хлопка, содержащие синтетический B.t.k. HD–I ген (pMON 5377), или синтетический B.t.k. HD–73 ген (pMON 5383), также были исследованы. Эти растения продуцируют HD–I или HD– 73 белки на уровнях, сравнимых с уровнями, наблюдаемыми в каллюсе хлопка с теми же генами, и сравнимых с уровнями наблюдаемых в каллюсе хлопка с теми же генами и сравнимых с томатами и растениями табака с этими генами. Были обнаружены с высокой частотой растения хлопка, экспрессирующие B.t.k. белок от 1000 до 2000 нг/мг общего белка (от 0,1% до 0,2%), для либо усеченного синтетического HD–I, либо HD–73 генов. С листьями, из растений табака, экспрессирующих синтетический HD–I или HD–73 гены, были выполнены пищевые анализы для насекомых. Эти листья не наносили вреда (оценка 0), когда на них претендовали личинки капустного лупера (Trichoplusia ni) и только легкие повреждения, когда на них претендовали личинки совки-карадрина (Spodoptera exiqua). Оценку вреда проводили как определено в таблице 8 выше. Это демонстрирует, что растения хлопка, также как каллюс, экспрессировали синтетические HD–I или HD–73 гены на высоких уровнях и что те растения защищены от повреждения личинками насекомых Lepidopterm. Трансгенные растения хлопка, содержащие либо усеченный синтетический HD–I ген (pMON 5377), либо усеченный синтетический HD–73 ген (pMON 5383), также были выделены для протекции против червя семенного хлопкового на всех уровнях растений в теплице. Этот более реалистичный тест способности этих растений продуцировать сельскохозяйственно приемлемый уровень контроль. Червь семенной хлопковый (Heliothis zea) – основной вредитель хлопка, который наносит экономический вред разрушением верхушки, коробочки и семена, и защита этих плодовых тел также как листовой ткани, важна для эффективного контроля над насекомыми и адекватной защиты урожая. Для определения степени защиты, даваемой этим растениям, RI род растений хлопка, экспрессирующих на высоких уровнях либо B.t.k. HD–I (pMON 5377), либо B.t.k. HD–73 (pMON 5383), анализировали, используя 10–15 яиц червя семенного хлопкового на коробочку и до 20 самых верхних коробочек на каждом растении. По меньшей мере 12 растений анализировали на одну обработку. Процент вывевшихся яиц был приблизительно 70%. Это соответствует очень высокому давлению насекомых по сравнению с количеством личинок на растение, найденное при типичных условиях урожая. При этих условиях 100% коробочек на контрольных растениях хлопка нарушались в результате повреждения насекомыми. Для трансгенов наблюдали значительную защиту коробочек. Растения содержащие pMON 5377, 5383 (HD–I) имели 70–75% "выживших" коробочек в ответ на интенсивное давление в ходе этого анализа. Это похоже, является следствием высокой активности HD–73 белка против червя семенного хлопкового по сравнению с HD–I белком. В случаях, где трансгенные растения повреждались насекомыми, выжившие личинки задерживались в своем развитии по меньшей мере на одно поколение. Следовательно, повышенная экспрессия, полученная с модифицированным и синтетическим генами, не лимитируется любой одной культурой, табак, томаты и каллюс хлопка, и растения хлопка, и растения хлопка все показывают драматические увеличения экспрессии B.t.k., когда получают растений/каллюс, содержащие модифицированный или синтетический гены. Подобно этому, использование изменений, сделанных для получения модифицированного или синтетического B.t.k. HD–I генов, не ограничивается HD–I геном. Синтетический HD–73 ген во всех трех видах также показывал драматическое увеличение экспрессии. Суммарно продемонстрировано, что: (1) генетические замены, сделанные в HD–I модифицированном гене приводят к очень значительным увеличениям B.t.k. HD–I экспрессии, (2) продукция полностью синтетического гена ведет к дальнейшему пятикратному увеличению B.t.k. HD–I экспресии, (3) изменения, объединенные в модифицированном HD–I гене объясняют большую часть увеличения B.t.k. экспрессии, наблюдаемой с синтетическим геном, (4) повышенная экспрессия демонстрировала в трех ранних растениях – растениях табака, растениях томатов, и каллюсе хлопка, и растениях хлопка, (5) повышенная экспрессия как наблюдаемая Вестерн анализом, также соответствовала подобному увеличению в биоактивности, показывая, что B.t.k. HD–I белки, продуцируемые, были сравнительно активными, (6) когда метод настоящего изобретения, использованный для создания синтетического HD–I гена, использовали для конструирования синтетического HD–73 гена, он также экспрессировался на гораздо более высоких уровнях в табаке, томатах и хлопке, чем эквивалентный ген дикого типа с последующим возрастанием биоактивности, (7) полностью синтетический полноразмерный B.t.k. ген экспрессировался на уровнях, сравнимых с усеченными синтетическими генами. Пример 5. Синтетический B.t. tenebrionis ген в табаке, томатах и картофеле. Ссылаясь к рис. 12, синтетический ген, кодирующий активный токсин Coleopteran получали введением указанных замен в ген B.t. tenebrionis дикого типа или синтезом de nooo синтетического структурного гена. Синтетический ген вставляли в интермедиатный вектор для растительной трансформации, такой как pMON 893: плазмиду pMON 893, содержащую синтетический B.t.t. ген, затем вставляли в подходящий "разоруженный" штамм Agrobacterium такой как A. tumefaciens ACO. Трансформация и регенерация картофеля. Стерильную культуру побегов Russet Burbank поддерживали в пробирках, содержащих 10 мл среды РМ (Murashige и Skoog MS) неорганические соли, 30 г/л сахароза, 0,17 г/л NaH2PO x x H2O, 0,4 мг/л тиамин-HCl, и 100 мг/л мио-инозитол, 1 г/л Гелрита, рН 6,0. Когда ростки достигали приблизительно 5 см длины, стеблевые сегменты по 7–10 мм вырезали и заражали по срезанным концам "разоруженным" вектором Agrobacterium tumefaciens, содержащим синтетический B.t.t. ген с четырехдневной чашки с культурой. Стеблевые трансплантаты сокультивировали в течение трех дней при 23оС в стерильно фильтровальной бумаге, помещенной на 1,5 мл питательного слоя для клеток табака, покрывающего 1/10 Р среды (1/10 крепости MS неорганических солей и органических дополнений без казеина как у Jarret и др., (1980), 30 г/л сахароза и 8,0 г/д агар). Вслед за совместным культивированием эксплантаты переносили в Р–1 среду полной концентрации для индукции каллюса, составленной из неорганических солей, органических добавок как у Jarret и др., (1980) с исключением казеина, 3,0 мг/л бензиладенина (ВА), и 0,01 мг/л нафталинуксусной кислотой (NAA) (Jarret и др., 1980). Карбенициллин (500 мг/л) включали для ингибирования роста бактерий, и 100 мг/л канамицин добавляли для отбора трансформированных клеток. Через четыре недели эксплантаты переносили в раствор того же состава, но с 0,3 мг/л гиббереллиновой кислотой (GA3), вместо BA и NAA (Jarret и др., 1981) для начала образования побегов. Ростки начинали развиваться приблизительно две недели спустя переноса в индуцирующий побеги раствор, их отрезали и переносили в пробирки с РМ средой для укоренения. Побеги исследовали на устойчивость к канамицину, присваемой ферментом неомицин фосфотрансферазой II, помещением секции стебля на среду, индуцирующую рост каллюса, содержащую органические и неорганические соли, 30 г/л сахарозы, 2,25 мг/л ВА, 0,186 мг/л NAA, 10 мг/л GA3 (Webl и др., 1983) и 200 мг/л канамицина для отбора трансформированных клеток. Синтетический B.t.t. ген, описанный на рис. 12, помещали в растительный экспрессионный вектор как описано в примере 5. Эта плазмида имеет следующие характеристики: синтетический Bgl II фрагмент, имеющий приблизительно 1800 пн, вставляли в pMON 893 таким образом, чтобы усиленный 35S промотор экспрессировал бы B.t.t. ген. Эта конструкция, pMON 1982, использовалась для трансформации как табака, так и томатов. Растения табака, отобранные как канамицин устойчивые растения, скринировались с кроличьими анти- B.t.t. антителами. Перекрестно реагирующий материал детектировали на уровнях, предсказанных быть подходящими, чтобы быть причиной летального исхода для СРВ. Эти насекомые-мишени не кормятся на табаке, но трансгенные растения табака все же показывают, что синтетический ген улучшает экспрессию этого белка до детектируемых уровней. Растений томатов с конструкцией pMON 1982 были предназначены, чтобы продуцировать B.t.t. белок на уровнях, инсектицидиальных для СРВ. В начальных исследованиях листья четырех растений (5190, 5225, 5328 и 5133) показывали мало или не показывали вреда, наносимого при экспрессии СРВ личинкам (вред, оцененный по шкале от 0 до 4 с 4 как нет сохраненных листьев). При этих условиях контрольные листья были полностью съедены. Иммунологический анализ этих растений подтвердил присутствие материала, перекрестно реагирующего с анти- B.t.t. антителами. Уровни белковой экспрессии в этих растениях оценивали приблизительно от 1 до 5 нг B.t.t. белка в 50 мкг общего экстрагированного белка. Все 17 растений томатов (17 из 65 тестированных) были идентифицированы, которые показывают протекцию листовой ткани от СВР (оценка 0 или 1) и показывают хорошую смертность насекомых. Результаты, подобные тем, что наблюдались для табака и томатов с pMON 1982, были показаны с pMON 1984 в тех же видах растений. pMON 1984 идентичен pMON 1982 за исключением того, что синтетический ингибитор протеаз (CMTI) слит с ним выше нативного сайта протеолитического расщепления. Уровни экспрессии табака, как было оценено, подобны pMON 1982, между 10–15 нг на 50 мкг общего растворимого белка. Растения томатов, экспрессирующие pMON 1984, были идентифицированы защитой листьев от проглатывания СВВ. Оценка вреда была 0 с 100% смертностью насекомых. Картофель трансформировали как описано в примере 5 вектором, подобным pMON 1982, содержащим усиленный CaMV35 (синтетический B.t.t. ген). Листья растений картофеля, трансформированных этим вектором, скринировали биоанализом СРВ насекомых. Из 35 растений протестированных, листья 4 растений, 16a, 13c, 13d и 23a были полностью защищены, когда были подвержены. Биоанализ насекомых с листьев трех других растений, 13e, 1a и 13b, зарегистрировал уровни повреждений около 1 на шкале от 0 до 4, с 4 – полное разрушение растительного материала. Иммунологический анализ подтвердил присутствие B.t.t. перекрестно реагирующего материала в листовой ткани. Уровень B.t.t. белка в листовой ткани растения 16a (величина вреда 0) оценивали в 20–50 нг B.t.t. белка/50 мкг общего растворимого белка. Уровни B.t.t. белка, показанные в ткани 16a соответствуют их биологической активности. Иммунологический анализ 13e и 13b (ткань, которая насчитывала 1 в измерении вреда) обнаруживает меньше белка 5–10 нг/50 мкг общего растворимого белка), чем в растении 16а. На разрезанное растение 16а претендовали яйца СРВ с 50 до 200 в анализе целого растения. При этих условиях 16а не демонстрировал повреждений растения и 100% смертность насекомых, в то время, как растения картофеля были сильно поражены. Пример 6. Синтетический B.t.k. (ген Р2 белка). Р2 белок – яркий инсектицидиальный белок, продуцируемый некоторыми штаммами B.t., включая B.t.k. Он характеризуется его активностью против как Lepidoptera, так и Dipteran насекомых (Jamamoto и Jizuka, 1983). Гены, кодирующие Р2 белок, выделены и охарактеризованы (Donova и др. 1988). P2 белок, кодируемый этими генами, имеет длину приблизительно 600 аминокислот. Эти белки разделяют только органиченную гомология со специфическими Р1 – типа белками лепиндонтерия, такие как B.t.k. HD–I и HD–73 белки, описанные в предыдущих примерах. Р2 белки имеют существенную активность против большого разнообразия личинок лепидонтерия, включая капустный лупер, табачную бабочку-бражника и табачного червя почкового, так как они активны против агрономически важных насекомых-вредителей, Р2 белки являются желаемыми кандидатами для получения устойчивых к насекомым трансгенных растений, либо одних, либо в комбинации с другими B.t. токсинами, описанными в нижеперечисленных примерах. В некоторых растениях экспрессия одного Р2 белка может быть достаточна, чтобы обеспечить защиту против вредных насекомых. В дополнение, Р2 белок может обеспечить защиту против агрономически важных диптеран вредителей. В других случаях экспрессия Р2 вместе с B.t.k. HD–I или HD–73 белком может быть предпочтительной. Р2 белки должны обеспечить по меньшей мере дополнительный уровень инсектицидиальной активности по сравнению с кристаллическим белковым токсином B.t.k. HD–I или HD–73, и комбинация может даже обеспечить синергистическую активность. Хотя способ действия Р2 белка неизвестен, его отчетливая аминокислотная последовательность предполагает, что он функционирует отлично от белков B.t.k. HD–I и HD–73 типа. Продукция двух белков устойчивости насекомых с различными типами в том же растении сводит к минимуму возможности развития устойчивости насекомых к B.t.k. белкам в растениях. Отсутствие существенной гомологии ДНК между Р2 генами и HD–I и HD–73 генами сводит к минимуму возможности для рекомбинации между множественными генами устойчивости к насекомым в растительной хромосоме. Гены, кодирующие Р2 белок, хотя отличны по последовательности от генов B.t.k. HD–I и HD–73, разделяют много общих черт с этими генами. В частности, гены Р2 белка имеют высокий А + Г состав (65%), множественные последовательности потенциальных сигналов полиаденилирования (26) и многочисленные АТТТА последовательности (10). Из-за их суммарной целостности слабо экспрессируемым генам B.t.k. HD–I и HD–73 дикого типа, те же проблемы ожидают по экспрессии гена Р2 дикого типа, с чем встречались в предыдущих примерах. Основываясь на вышеописанном методе конструирования синтетических B.t.k. генов, синтетический Р2 ген спланирован, чтобы экспрессироваться на адекватных уровнях для защиты растений. Сравнение Р2 генов дикого типа и синтетического показано в примере 13. Пример 7. Синтетический B.t. Entomocidus ген. B.t. entomocidus ("Btent") белок – отдельный инсектицидальный белок, продуцируемый некоторыми штаммами B.t. бактерий. Он охарактеризован по его высокому уровню активности против некоторых лепитонтеран, которые относительно нечувствительны к B.t.k. HD–I и HD–73, такие как виды Spodoptera, включая совку-карадрина (Visser и др. 1988). Гены, кодирующие белок выделены и охарактеризованы (Honee и др., 1988). Btent белки, кодируемые этими генами, имеют приблизительно ту же длину, что и B.t.k. HD–I и HD–73. Эти белки разделяют только 68% аминокислотной гомологии с B.t.k. HD–I и HD–73 белками. Похоже, что только N-терминальная часть – половина этого белка Btent требуется для инсектицидальной активности как в случае HD–I и HD–73. За первыми 625 аминокислотами Btent разделяет только 35% гомологии аминокислот с HD–I и HD–73. Из-за их более высокой активности против видов Spodoptera, которые относительно нечувствительны к HD–I и HD–73, белки являются желательными кандидатами для продукции толерантных к насекомыми трансгенных растений, либо одних, либо в комбинации с другими B.t. токсинами, описанными в вышеперечисленных примерах. В некоторых растениях продукция Btent может быть достаточна для контроля агрономически важных вредителей. В других растениях, продукция двух отдельных толерантных для насекомых белков обеспечивает защиту против широкого набора насекомых. Против тех насекомых, где оба белка активны, комбинация B.t.k. HD–I или HD–73 типа белков плюс белок Btent могли бы обеспечить по меньшей мере дополнительную инсектицидальную эффективность, и могут даже обеспечить синергическую активность. В дополнение, из-за его отличной аминокислотной последовательности Btent белок может иметь другой способ действия, чем HD–I или HD–73. Продукция двух инсектицидальных белков в том же растении с различными типами действия могла бы сводить к минимуму возможности для развития устойчивости насекомых к белкам в растениях. Относительный недостаток гомологии последовательности ДНК с генами B.t.k. типа сводит к минимуму возможности для рекомбинации между множественными генами толерантности для насекомых в растительных хромосомах. Гены, кодирующие Btent белок, хотя отличны по последовательности от генов B.t.k. HD–I и HD–73, разделяют много общих черт с этими генами, в частности, гены белка Btent имеют высокий А + Т состав (62%), множественные потенциальные последовательности для сигналов полиаденилирования (39 в полноразмерной кодирующей последовательности и 27 в первых 1875 нуклеотидах, что по-видимому, кодирует активный фрагмент токсина) и многочисленные последовательности АТТТА 18 в полномерной кодирующей последова тельности и 12 в первых 1875 нуклеотидах). Из-за его общей сходности со слабо экспрессирующимися B.t.k. HD–I и HD–73 генами дикого типа, Btent гены дикого типа, как ожидается, демонстрируют подобные проблемы в экспрессии какие встречались с HD–I и HD–73 генами дикого типа. Основываясь на вышеописанном методе, использованном для конструирования других синтетических генов B.t., синтетический Btent ген предназначен, чтобы экспрессироваться на адекватных уровнях для защиты растений. Сравнение Btent генов дикого типа и синтетического показано на рис. 14. Пример 8. Синтетический B.t.k. гены для экспрессии в кукурузе. Высокий уровень экспрессии гетерологичных генов в кукурузных клетках был показан, чтобы усилить ее присутствием интрона гена кукурузы (Callis и др.). Типично эти интроны локализованы в 5' нетранслируемом районе химерного гена. Показано, что CaMV35 промотор и NOS 3' конец функционируют эффективно при экспрессии гетерологичных генов в клетках кукурузы (Fromm и др., 1986). Ссылаясь к рис. 15, растительный экспрессионный кассетный вектор (pMON 744) был сконструирован, так что содержит эти последовательности. Особенно экспрессионная кассета содержит усиленный CaMV35 промотор, за которым следует интрон 1 Adh гена кукурузы (Callis и др., 1987). За ним следует полилинкерный сайт клонирования для инсерции кодирующих последовательностей, этот полилинкер содержит среди других сайт Bg II. За полилинкером находится 3' конец. pMOV744 также содержит селектирующий маркерный ген 35 (NPT11)NOC 3' для канамициновой селекции трансгенных клеток кукурузы. В дополнение, pMON 744 имеет начало репликации E.сoli и ген устойчивости в ампициллину для селекции плазмиды E.coli. Пять B.t.k. кодирующих последовательностей, описанных в предыдущих примерах, вставляли в сайт BgI II pMОN 744 для экспрессии в клетках кукурузы B.t.k. Кодирующие последовательности вставленного и полученного векторов были: 1. B.t.k. HD–I дикого типа из pMON 9921, чтобы сделать pMON 8652. 2. Модифицированный B.t.k. HD–I из pMON 5370, чтобы сделать pMON 8642. 3. Синтетический B.t.k. HD–I из pMON 5377, чтобы сделать pMON 8643. 4. Синтетический B.t.k. HD–73 из pMON 5390, чтобы сделать pMON 8644. 5. Синтетический полноразмерный B.t.k. HD–73 из pMON 1050, чтобы сделать pMON 10902. pMON 8652 (дикого типа B.t.k. HD–I) использовали для трансформации протопластов клеток кукурузы и выделяли стабильно трансформированный канамицин устойчивый каллюс. мРНК B.t.k. из клеток кукурузы анализировали защитой нуклеазой SI и обнаружили, что она присутствует на уровнях, сравнимых с наблюдаемыми для кодирующей последовательности дикого типа (pMON 9921) в трансгенных растениях томатов. pMON 5652 и pMON 5642 (модифицированный HD–I) использовали для трансформации протопластов клеток кукурузы в транзитной системе экспрессии. Уровень мРНК B.t.k. анализировали защитой SI нуклеазой. Модифицированный HD – давал в несколько раз увеличение в мPHК. B.t.k. по сравнению с кодирующей последовательностью дикого типа в транзитно трансформированных клетках кукурузы. Это указывает на то, что модификации, введенные в B.t.k. HD–I ген, способны к усилению B.t.k. экспрессии в клетках одного хозяина как показано для растений-двойных хозяев и клеток. pMON 8642 (модифицированный HD–I) и pMON 8643 (синтетический HD–I) использовали для трансформации черной мексиканской сладкой кукурузы кретоалистов клеток ПЭГ-зависимым способом принятия ДНК, и стабильно трансформированный кукурузный каллюс селектировали на рост в содержащей канамицин растительной среде роста. Индивидуальные колонии каллюса, которые происходили из одиночных трансформированных клеток, выделяли и выращивали отдельно на содержащей канамицин среде. Чтобы определить экспрессию B.t.k. генов в этих клетках, образцы каллюса тестировались на токсичность насекомых биоанализом против личинок табачной бабочки-бражника. Для каждого вектора тестировали 96 каллюсных линий биоанализом. Порции каждого каллюса переносили на стерильные водяные агарные чашки, и добавляли пять личинок 1 для табачной бабочки-бражника и позволяли им питаться в течение 4 дней. pMON 8643 100% личинок погибало после выкармливания на 15 из 96 каллюсов и эти каллюсы показывали очень небольшой вред в результате поедания. Для pMON 8642 только 1 из 96 каллюсов был токсичен для личинок. Это показывает, что B.t.k. ген экспрессировался в этих образцах на инсектицидальных уровнях. Наблюдение, что значительно больше каллюса, содержащего pMON 8643, было токсично, чем pMON 8642, показывало, что значительно более высокие уровни экспрессии получены, когда кодирующая последовательность синтетического HD–I содержалась в клетках кукурузы, чем когда использовалась кодирующая последовательность модифицированного HD–I, подобно предыдущим примерам с растениями-двойными хозяевами. Полуколичественный иммуноанализ показал, что pMON 8643 токсичные образцы имели значительно больше B.t.k. белковые уровни, чем pMON 8642 токсичный образец. Образцы 16 каллюса, которые были токсичны для табачной бабочки-бражника, также тестировались на активность против европейского точильщика кукурузы. Европейский точильщик кукурузы приблизительно в 40 раз менее чувствителен к продукту HD–I гена, чем табачная бабочка-бражник. Личинок европейского кукурузного точильщика добавляли к образцам каллюса и позволяли кормиться в течение 4 дней. Два из 16 тестированных каллюсов, оба из которых содержали pMON 8643 (синтетический HD–I), были токсичны для личинок европейского кукурузного точильщика. Чтобы определить экспрессию генов B.t.k. в дифференцированных тканях кукурузы, использовали другой метод введения ДНК. Молодые листья срезали с растений кукурузы, и образцы ДНК вводили в листовую ткань микропулевой бомбардировкой. В этой системе ДНК на микропулях транзитно экспрессируется в клетках листьев после бомбардировки. Использовали три образца ДНК, и каждую ДНК исследовали три раза. 1. pMON 744, вектор экспрессии в кукурузе, нет B.t.k. гена. 2. pMON 8643 (синтетический HD–I). 3. pMON 752, кукурузный вектор для GUS гена, нет B.t.k. гена. Листья инкубировали при комнатной температуре 24 часа. pMON 752 образцы окрашивали на субстрате, который позволяет визуально детектировать продукт GUS гена. Этот анализ показал, что свыше одной сотни пятен в каждом образце были экспрессирующими GUS продукт и повторенные трижды образцы показывали очень сходные уровни GUS экспрессии. Для pMON 744 и pMON 8643 образцы 5 личинок табачной бабочки-бражника добавляли на каждый лист и позволяли им кормиться 48 часов. Все три образца, бомбардируемые pMON 8643, показывали интересные повреждения в результате поедания и отсутствие смертности личинок. Все три образца, бомбардируемые pMON 8643 не показывали доказательства первых повреждений и имели 100% смертность личинок. Образцы также анализировали на присутствие B.t.k. белка качественным иммуноанализом. Все pMON 8643 образцы имели детектируемый B.t.k. белок. Эти результаты демонстрируют, что синтетический B.t.k. ген экспрессировался в дифференцированных растительных тканях кукурузы на инсектицидальных уровнях. Пример 9. Синтетический ген белка оболочки рольного вируса листьев картофеля. Экспрессия в растениях генов белков оболочки из огромного разнообразия растительных вирусов, как утверждение, является эффективным методом сконструированной устойчивости к этим вирусам. Для того, чтобы достичь устойчивости к вирусу, важно экспрессировать вирусный белок оболочки на эффективном уровне. Для многих генов белков оболочки растительных вирусов не утверждали, что это проблема. Однако для гена белка оболочки из вируса (рольного) листьев картофеля (PLRV), экспрессия белка оболочки, как наблюдали, происходит на низком уровне по сравнению с другими генами белка оболочки, и этот низкий уровень белка не приводил к оптимальной устойчивости к PLRV. Ген для белка оболочки PLRV показан на фиг. 16. Ссылаясь на фиг. 16, верхняя строчка последовательности представляет ген как он был сначала сконструирован для растительной экспрессии в векторе pMON 893. Этот ген содержит 749 нуклеотидный BgIII-EcoRI фрагмент с кодирующей последовательностью, содержащейся между нуклеотидами 20 и 643. Этот фрагмент также содержит 19 нуклеотидов 5' некодирующей последовательности. Этот PLRV ген белка оболочки относительно слабо экспрессировался в растениях по сравнению с другими генами вирусных белков оболочки. Синтетический ген был предназначен для улучшения растительной экспрессии PLRV белка оболочки. Отсылая снова к рис. 16, изменения, сделанные в синтетическом PLRV гене, показаны в нижней строчке. Этот ген предназначен, чтобы кодировать точно такой же белок, как натуральный ген. Заметьте, что начало синтетического гена – в 14 нуклеотиде и конец последовательности – в 654 нуклеотиде. Кодирующая последовательность для синтетического гена – с 20 нуклеотида по 643 на рисунке. Замены, указанные сразу выше и ниже этих концов, служат только для введения подходящих рестрикционных сайтов сразу за кодирующей последовательностью. Таким образом размер синтетического гена – 641 нуклеотид, который меньше чем у натурального гена. Синтетический ген меньше, потому что вся существенно, некодирующая последовательность как на 5', так и на 3' конце, за исключением сегментов, кодирующих BgII и EcoRI рестрикционный сайты, удалена. Синтетический ген отличается от естественного гена в двух основных отношениях. Во-первых, 41 индивидуальных кодона внутри кодирующей последовательности заменены для удаления почти всех кодонов для данной аминокислоты, которые составляют менее, чем около 15% кодонов для аминокислоты из обзора всех растительных генов растений – двойных хозяев. Во-вторых, 5' и 3' некодирующие последовательности оригинального гена удалены. Хотя и не строго подтвержденные алгоритмом, описанным на фиг. 1, несколько замен кодонов и особенно удаления длинного 3 некодирующего района согласуются с этим алгоритмом. Оригинальная PLRV последовательность содержит два потенциальных растительных сигнала полиаценилирования (АЦЦАА и ААГГАА – и оба они встречаются в 3' некодирующем районе, который удален в синтетическом гене. Оригинальный PLRV ген также содержит АТТТА последовательность. Он также содержит 3' некодирующую последовательность, и находятся в средине самого длинного района непрерывных А + Т в этом гене (район 7 А + Т нуклеотидов). Эта последовательность удалялась в синтетическом гене. Таким образом, последовательности были заменены в соответствии с алгоритмом на рис. 1 мишеней для замен, в синтетическом гене PLRV белка оболочки путем удаления 3 некодирующего сегмента. Внутри кодирующей последовательности были также сделаны замены кодонов что бы удалить три других района последовательности, описанные выше. В частности, два района из 5 последовательных А + Т и один район из 5 непрерывных Г + Ц внутри кодирующей последовательности были удалены в синтетическом гене. Синтетический PLRV белка оболочки клонировали в вектор растительной трансформации, такой как pMON 893 и использовали для трансформации растений картофеля как описано выше. Эти растения экспрессируют белок оболочки PLRV на более высоких уровнях, чем достигнутые из натурального происхождения генов, и эти растения демонстрируют повышенную резистентность к инфекции PLRV. Пример 10. Экспрессия синтетических B.t. генов с промоторами малой субъединицы RUBISCO и транспортным и пептидами хлоропластов. Гены растений, кодирующие малую субъединицу RUBISCO (SSU) часто высоко экспрессируются, легко регулируются и иногда показывают тканевую специфичность. Эти экспрессионные свойства главным образом обусловлены последовательностями промотора в этих генах. Было возможным использовать SSU промоторы для экспрессии гетерологичных генов в трансформированных растениях. Типичные растения будут содержать множественные SSU гены, и экспрессионные уровни и тканевая специфичность различных SSU генов будет различна. SSU белки кодируются в ядре и синтезируются в цитоплазме, как пред шественники, которые содержат N-терминальную избыточность, известную как хлоропластный транспортный пептид (CТР). СТР направляет предшественник в хлоропласты и облегчает поступление SSU белка в хлоропласт. В этом процессе СТР отрезается от SSU белка. Это СТР последовательности использовались, чтобы направить гетерологичные белки в хлоропласты трансформированных растений. SSU промоторы могут иметь несколько преимуществ для экспрессии B.t.k. генов в растениях. Некоторые SSU промоторы очень высоко экспрессировались и могли дать увеличение экспрессионных уровней до или выше уровней, наблюдаемых с CaMV35S промоторо-тканевое распределение экспрессии с SSU промоторов отличается от распределения экспрессии с CaMV35S промотора, так как контроля некоторых насекомых-вредителей может быть предпочтительным направлять экспрессию B.t.k. в те клетки, в которых SSU больше экспрессируется. Например, хотя относительно конститутивный, в листьях CaMV35S промотор более высоко экспрессируется в сосудистой ткани, чем в некоторых других частях листа, в то время как большинство SSU промоторов наиболее высоко экспрессируются в мезофильных клетках листа. Некоторые SSU промоторы также более тканеспецифичны, так что может быть возможной утилизация специфического SSU промотора, чтобы экспрессировать B.t.k. только в одном наборе растительных тканей, если, например, B.t.k. экспрессия в определенных клетках, как было обнаружено, вреден для тех клеток. Например, для контроля колорадского жука в картофеле, может оказаться предпочтительным использовать SSU промоторы, чтобы направить B.t.t. экспрессию в листья, но не в съедобные клубни. Использование SSU СТР последовательности для локализации белков в хлоропластах может также быть выгодным. Локализация B.t.k. в хлоропластах могла бы защитить белки от протез, находящихся в цитоплазме. Это могло бы стабилизировать B.t. белок и привести к более высоким уровням аккумуляцию активного белка B.t. Гены, содержащие СТР, не могли бы быть использованы с SSU промотором или с другими промоторами, такими как CaMV35S. Огромное разнообразие векторов растительной трансформации сконструировано для экспрессии B.t.k. генов, утилизирующих SSU промоторы и SSUСТР. Промоторы и СТР использованные происходили из гена петуньи SSU II2, описанного Tumer и др., (1986) и из Arabidopsis atsla гена (SSU ген), описанного Krelbers и др., (1988) и Elinor и др., (1989). Промотор SSU II петуньи содержался в фрагменте ДНК, простирающегося приблизительно на 800 пн выше SSU кодирующей последовательности. Промотор Arabidopsis Ats IA заключался в фрагменте ДНК, который простирался приблизительно на 1,8 тпн выше SSU кодирующей последовательности. Верхние концевые удобные сайты из полилинкера рис. 18 использовались, чтобы передвинуть эти промоторы в векторы растительной трансформации, такие как pMON 893. Эти промоторные фрагменты тянулись до старта SSU кодирующей последовательности, точке, в которой Ncol рестрикционный сайт делали, чтобы разрешить инсерпию B.t. кодирующей последовательности, заменяя SSU кодирующую последовательность. Когда SSU промоторы использовали в комбинации с их СТР, фрагменты ДНК, пролегающие через кодирующую последовательность СТР, и маленькую часть зрелой SSU кодирующей последовательности в точке, в которой Ncol рестрикционный сайт был введен стандартными процедурами, чтобы позволить слить в рамке B.t. кодирующие последовательности с СТР. В частности, для СТРSSU IIa петуньи B.t. кодирующие последовательности были соединены с SSU последовательностью после аминокислоты 8 зрелой SSU последовательности в точке, в которую был помещен Ncol сайт. 8 аминокислот зрелой SSU последовательности включали, потому что предварительные эксперименты по введению ДНК в хлоропласты in vitro показывали, что введение B.t.k. наблюдалось только если этот сегмент зрелой SSU вводился. Для Arabidopsis ats IA СТР включали полный СТР плюс 24 аминокислот зрелой SSU последовательности плюс последовательность: Gly–Gly–Arg–Val–Asn–Cys–Met–Gln–Ala–Met терминирующая в Ncol сайте для B.t. слияния. Эта короткая последовательность повторяет сайт расщепления активного SSU CТР (между Сys и Met) плюс короткий сегмент, окружающий сайт расщепления. Эта последовательность была включена для того, чтобы увериться в правильном введении ДНК в хлоропласты. B.t. кодирующий последовательности были слиты с этим ats IA СТР после Met кодона. In vitro эксперименты с этой СТР конструкцией и другими (не B.t.) кодирующими последовательностями показали, что этот СТР несет белки-мишени в хлоропласты. Когда СТР использовали в комбинации с промотором CaMV35S использовали те же СТР сегменты. Их вырезали сразу выше АТГ старт сайтов СТР вводя BgIII сайты, и помещали ниже CaМV35S промотор pMON 835, как BgIII-Ncol фрагменты. B.t. кодирующие последовательности были слиты как описано выше. B.t.k. HD–I кодирующая последовательность дикого тика pMON 9921 (см. рис. 1) была слита с ats IA промотором, чтобы сделать pMIN 1981. Эти вектора использовали для трансформации растений табака, и эти растения скринировали на активность против табачной бабочки-бражника. Не было обнаружено ни одного токсичного растения. Это удивительно в свете того факта, что токсичные растения могут быть обнаружены, пусть с низкой частотой после трансформации pMON 9921, в котором B.t.k. кодирующая последовательность экспрессирована с усиленного CaMV35S промотора с pMON 893, и в свете факта, что Elionor и др. (1989) сообщают, что ats IA промотор сам сравним по силе CaMV35S промотора и приблизительно в 10 раз сильнее, чем если включена СТР последовательность. По меньшей мере для B.t.k. HD–I кодирующей последовательности дикого типа, не кажется, что бы это было случаем. Множество векторов растительной трансформации было конструировано, используя либо усеченную синтетическую HD–73 кодирующую последовательность рис. 4, либо полноразмерную B.t.k. HD–73 кодирующую последовательность рис. 11. Они перечислены в таблице внизу. Таблица 15