Спосіб ідентифікації dipylidium caninum у популяції собак за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Спосіб ідентифікації Dipylidium caninum у популяції собак за допомогою полімеразної ланцюгової реакції включає проведення ПЛР, пробопідготовку, ампліфікацію, детекцію ампліфікаційної ДНК. Використовують ДНК ген 12S рРНК, який складається з таких послідовностей пар праймерів: 5’ - CAGCAAGTGAATCCGTTCAG-3’ 5’ – GCATCAAAACTCTAATAAGCAGCA-3’. UA 103721 U (12) UA 103721 U UA 103721 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини та ветеринарної мікробіології, паразитології, імунології та біотехнології, а саме до способу ідентифікації Dipylidium caninum за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Спосіб полімеразної ланцюгової реакції застосовується для діагностики інфекційних та паразитичних захворювань тварин та людини. В його основі лежить виявлення специфічного фрагмента геному збудника заразної хвороби у біологічних зразках і являє собою багаторазово повторювані цикли синтезу специфічної ділянки ДНК до гена-мішені. Існують паразитологічні та серологічні способи діагностики наявності збудника Dipylidium caninum. Відомим аналогом - паразитологічними способом досліджують фекалії для виявлення члеників дипілідій (Методичні рекомендації. Епідеміологія, лікуваня та профілактика дипілідіозу.) Недоліком аналога є те, що яйця дипілідій виявляють не у всіх пробах фекалій. Відомий аналог є спосіб визначення Toxocara canis у біологічних зразках за методом Фюлеборна (Робочий Зошит для практичних занять з дисципліни "Паразитологія та інвазійні хвороби тварин". Харківська державна зооветеринарна академія, кафедра паразитології). Недоліком аналога є те, що яйця дипілідій мають високу щільність та в насиченому розчині солі не спливають на поверхні, а осідають на дні. Найближчим аналогом до корисної моделі є спосіб визначення Toxocara canis у собак за допомогою полімеразної ланцюгової реакції [Применение ПЦР в контроле паразитарних ситуаций Toxocara canis, T.cati. //Труды Всероссийского научно-исследовательского института гельминтологии им. К.И. Скрябина]. Недоліком найближчого аналога є специфічність праймерів не тільки для Toxocara canis, але і для деяких інших збудників, що потребує проведення додаткових уточнюючих тестів. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб ідентифікації Dipylidium caninum у популяції собак за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб включає проведення ПЛР, пробопідготовку, ампліфікацію, детекцію ампліфікаційної ДНК, згідно з корисною моделлю, використовують ДНК ген 12S рРНК (L49460.1), який складається з наступних послідовностей пар праймерів: 5" - CAGCAAGTGAATCCGTTCAG-3’ 5" - GCATCAAAACTCTAATAAGCAGCA-3", щоб забезпечити ефективність способу ідентифікації Dipylidium caninum. Корисну модель виконують наступним чином. Спочатку проводять пробопідготовку. Для цього відбирають свіжі проби фекалій і ретельно перемішують у ступці з додаванням дистильованої води. Одержану суспензію фекалій фільтрують через металеве ситечко або марлеву салфетку в чисту склянку, після чого придонний осад розподіляють у лабораторні пробірки типу "Еппіндорф" та заморожують при t20 °C. Для проведення ПЛР використовують праймери до послідовності ДНК гена 12S рРНК D. cananum: 5" - CAGCAAGTGAATCCGTTCAG-3’ 5" - GCATCAAAACTCTAATAAGCAGCA-3". Виділення ДНК із зразків проводять за допомогою набору для виділення ДНК фірми "Мініпреп" (Сілекс М, Росія). Буфер для ампліфікації містив 10 мМ Тріс-НСl (рH 8,3); 50 мМ KСl; 0,01 % альбуміну; 2,5 мМ MgCl2 і по 200 мкМ дезоксинуклеозид три фосфатів (dATP, dTTP, dCTP, dGTP). На 50 мкл реакційнної суміші було додано 50 пмоль кожного праймера і 1 од. Tag - полімерази. Виділена з проб ДНК додавалась у кількості 5 мкл. Для попередження випару реакційної суміші зверху нашаровувалося 50 мкл мінеральної олії. Ампліфікацію проводять по наступній програмі: 94 °C-3 хв (1 цикл) 94 °C-30 сек. 59 °C-30 сек. 72 °C-30 сек. (35 циклів) Розмір продукта ампліфікації - 179 п. н. Детекцію ампліфікованої ДНК здійснюють з використанням електрофореза у 1,5 % агарозному гелі з ТБЕ-буфером. Для цього 10 мкл ампліфікованого зразка наносять в лунку агарозного гелю та експонують при 20 мВт/см протягом 15 хв. Забарвлення гелю проводять 0,1 % розчином етидію броміду протягом 5 хв. Приклад Порівняльна оцінка чутливості розробленого способу для ідентифікації ДНК Dipylidium caninum. (Таблиця 1, 2). 1 UA 103721 U 5 10 Аналіз чутливості розробленого способу, при дослідженні ДНК виділеної з фекалій хворих тварин, проводили в порівнянні з методами копроскопії. При одночасному обстеженні собак та кішок за допомогою копроскопії та ПЛР встановлено, що за даними дослідження фекалій екстенсивність інвазії складала 0 %, за даними ПЛР - 8 %. Результати дослідження фекалій за допомогою ПЛР на наявність антигенів Dipylidium caninum вказують на поширення цих гельмінтів серед обстежених тварин. Серед 135 обстежених собак встановлено 11 (8,14 %) позитивних проб на Dipylidium caninum. Серед 52 обстежених кішок встановлено 5 (9,6 %) позитивних проб на Dipylidium caninum. Таким чином ПЛР є сучасним та більш достовірним способом діагностики дипілідіозу тварин та може використовуватись в лабораторіях ветеренарії і медицини. Спосіб ідентифікації Dipylidium caninum у популяції собак за допомогою полімеразної ланцюгової реакції Таблиця 1 № проби 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 Дані копроскопічних досліджень (кількість члеників у полі зору) 2 Дані ПЛР Dipylidium caninum + + + UA 103721 U Продовження таблиці 1 № проби 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 51 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 Дані копроскопічних досліджень (кількість члеників у полі зору) 3 Дані ПЛР Dipylidium caninum + + + UA 103721 U Продовження таблиці 1 № проби 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 Дані копроскопічних досліджень (кількість члеників у полі зору) Дані ПЛР Dipylidium caninum + + + Спосіб ідентифікації Dipylidium caninum у популяції кішок за допомогою полімеразної ланцюгової реакції 5 Таблиця 2 № проби 1 2 3 4 Дані копроскопічних досліджень (кількість члеників у полі зору) 4 Дані ПЛP Dipylidium caninum UA 103721 U Продовження таблиці 2 № проби 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Дані копроскопічних досліджень (кількість члеників у полі зору) Дані ПЛP Dipylidium caninum + + + + ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб ідентифікації Dipylidium caninum у популяції собак за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає проведення ПЛР, пробопідготовку, ампліфікацію, детекцію 5 UA 103721 U ампліфікаційної ДНК, який відрізняється тим, що використовують ДНК ген 12S рРНК, який складається з таких послідовностей пар праймерів: 5’ - CAGCAAGTGAATCCGTTCAG-3’ 5’ – GCATCAAAACTCTAATAAGCAGCA-3’. 5 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6