Спосіб виявлення раннього апоптозу

Реферат: Винахід належить до галузі клінічної та експериментальної медицини. Спосіб виявлення раннього апоптозу полягає в тому, що відбирають пробу клітин, яку ділять на два зразки. Після цього клітини першого зразка фарбують барвником Хехста 33342, візуально визначають стан клітин і підраховують кількість клітин, які мають позитивне забарвлення. Другий зразок клітин опромінюють високоградієнтним когерентним випромінюванням при λ=650 нм, інкубують у вологій камері при температурі 37 °C протягом 60 хвилин, знову ділять на два зразки, один з яких фарбують барвником Хехста 33342 та мікроскопують з підрахунком апоптозних клітин, а UA 106268 C2 (12) UA 106268 C2 другий піддають конфокальній мікроскопії та методом голографічної мікроінтерферометрії візуально визначають стан клітин і підраховують клітини з елементами зморщування, конденсації, сегментування і фрагментації ядра. Якщо в другому зразку апоптозних клітин більше, ніж у першому зразку, на 20-50 %, констатують ранній апоптоз по різниці числа апоптозних клітин у першому і другому зразках. Заявлений спосіб робить можливим виявлення апоптозних клітин на ранніх стадіях програмованої смерті. UA 106268 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі клінічної та експериментальної медицини, а саме до способу виявлення раннього апоптозу. Апоптоз - програмована смерть клітин, що відбувається в здоровому і хворому організмі людини і тварин, яка характеризується первинними порушеннями в ядрі клітин, що призводить до його конденсації, сегментації, фрагментації (фрагменти - апоптозні тільця), зморщування тіла клітини та її подальшої ліквідації, головним чином, шляхом аутофагоцитоза і гетерофагоцитоза. При цьому розрізняють ранній апоптоз з деформацією, конденсацією, сегментуванням ядра (хроматину) і виражений апоптоз з фрагментацією ядра, утворенням апоптозних тілець, частковим або повним руйнуванням клітини. Визначення числа апоптозних клітин може мати діагностичне та прогностичне значення при різних захворюваннях і отруєннях у людини, а також на експериментальних моделях. Найбільш простим і легко доступним тест-об'єктом можуть бути лімфоцити крові, клітини гемопоетичного ряду, епітеліальні клітини бар'єрних комплексів і слизових оболонок, які одними з перших включаються в захисну відповідь організму при різних зовнішніх впливах, зокрема, при контакті з токсичними хімічними речовинами. Для виявлення апоптозу використовуються морфологічні способи - електронна, люмінесцентна та світлова мікроскопія після фіксування та фарбування клітин різними барвниками. Найбільш близьким за сукупністю операцій, за допомогою яких здійснюється спосіб, що заявляється, є спосіб виявлення апоптозу, викладений у статті Macho, A., Decaudin, D., Castedo, M., Hirsch, Т., Susin, S. A., Zamzami, N., and Kroemer, G. (1996) Chloromethyl-X-rosamine is an aldehyde-fixable potential-sensitive fluorochrome forthe detection of early apoptosis. Cytometry 25, 333-340. Відповідно до цього способу клітини обробляли різними реагентами при температурі 37 °C протягом 48 годин. Зміни в клітинах вивчали за допомогою фазово-контрастної мікроскопії. Життєздатність клітин визначали шляхом фарбування трипановим синім. Препарати відмивали буфером з рН 6,5 для блокування ушкоджуючої дії глутамату на нервові клітини. Апоптозні клітини виявляли за допомогою спеціального барвника Хехста Н33258. Клітини фіксували 10 %им розчином формаліну в нейтральному фосфатному буфері при рН 7,4 протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. Після відмивання клітин дистильованою водою їх обробляли барвником Хехста в концентрації 8 мг/мл протягом 5 хвилин. Морфологію ядер вивчали за допомогою люмінесцентного мікроскопа моделі Olympus IX70). Апоптоз розраховували кількісно по співвідношенню змінених і нормальних клітин (по конденсації і фрагментації ядер). Підраховували 200 клітин в препараті. Відомий і спосіб, що заявляється, мають наступні спільні ознаки (операції): - відбір проби клітин; - фарбування відібраних клітин барвником Хехста; - візуальне визначення стану клітин під мікроскопом; - підрахунок апоптозних клітин. Але, як описаний спосіб, так і інші відомі способи, визначають виражений (завершений) апоптоз - спонтанне запрограмоване відмирання клітин на стадії втрати життєздатності, що вже відбулася. Вони не можуть виявити ранній апоптоз, тобто початкові ознаки зміни щільності ядерної речовини, що не фіксуються шляхом фарбування клітин. Тому відомі способи не можуть вирішити поставлену задачу, а тому, на погляд заявників, жоден з відомих способів виявлення апоптозу не може бути обраний як прототип і критика недоліків буде некоректною, тому що вони не вирішують поставлену задачу. В основу винаходу поставлено задачу створити спосіб, в якому шляхом додаткової активації зразка клітин високоградієнтним когерентним лазерним випромінюванням забезпечується стимулювання функціональної активності та метаболізму клітин. При цьому тенденція до розвитку апоптозу, що повільно реалізується в звичайних умовах під дією хвороботворних і ушкоджуючих біологічних, фізичних, хімічних агентів прискорюється, а первинні ранні ознаки зміни оптичних характеристик ядерної речовини виявляються при спекл-мікроскопії візуально і зберігаються на відповідних мікрофотографіях (додаткова візуалізація та верифікація). Це робить можливим виявлення апоптозних клітин на ранніх стадіях програмованої смерті. Поставлена задача вирішена в способі виявлення раннього апоптозу, який полягає в тому, що відбирають пробу клітин, яку ділять на два зразки, після чого клітини першого зразка фарбують барвником Хехста 33342, візуально визначають стан клітин і підраховують кількість клітин, які мають позитивне забарвлення, потім другий зразок клітин опромінюють високоградієнтним когерентним випромінюванням при λ = 650 нм, інкубують у вологій камері при температурі 37 °C протягом 60 хвилин, ділять знову на два зразки, з яких один фарбують 1 UA 106268 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 барвником Хехста 33342 та мікроскопують з підрахунком апоптозних клітин, а другий піддають конфокальній мікроскопії та методом голографічної мікроінтерферометрії візуально визначають стан клітин і підраховують клітини з елементами зморщування, конденсації, сегментування і фрагментації ядра, і якщо в другому зразку апоптозних клітин більше, ніж у першому зразку на 20-50 %, констатують ранній апоптоз з різниці числа апоптозних клітин у першому і другому зразку. З науково-технічної та патентної літератури невідома сукупність операцій, що заявляється, яка дозволяє вирішити поставлену задачу - виявити ранній апоптоз клітин. Актуальність вирішення поставленої задачі полягає в тому, що заявлений спосіб дає можливість визначити зростання числа відмираючих шляхом апоптозу клітин на його ранніх стадіях при різних негативних впливах на організм людини або тварини, наприклад, токсикантами або лікарськими препаратами. Це має прогностичне значення і дозволить управляти процесом апоптозу, наприклад, змінивши дозу або вид лікарського препарату. В профілактичній токсикології - це рішення задач безпечних рівнів впливу, тому що зростання числа апоптозних клітин є свідченням "діючого" рівня досліджуваного фактора. В принципі, про утилітарність можна говорити і по відношенню до "функціонального стану клітин", тому що кожна група клітин, що розрізняється за допомогою заявленого способу, несе своє фізіологічне або патологічне "навантаження". Адже кожна клітина - це самодостатня біологічна система ("організм"), яка проходить закономірні стадії диференціації, зростання і вмирання. Відкривається можливість, незначно впливаючи на хід цих процесів, спостерігати їх спрямованість і встановлювати кількісні показники за (це добре) або проти (це погано). Висновок про те, що приріст числа змінених клітин після їх активації малоінтенсивним лазерним опромінюванням на 20-50 % свідчить про ранній апоптоз, встановлений експериментально. Число виявлених заявниками апоптозних клітин (наприклад) в нормальних фізіологічних умовах узгоджується з даними літератури. Що стосується патології, то тут дані заявників узгоджуються з літературними тільки в спрямованості, оскільки заявники визначають не тільки клітини з "розвиненим" (той, що вже відбувся) і "вираженим" апоптозом, а й такі, що проходять перші (початкові, ранні) етапи входження клітин в стадію програмованої смерті. Тому кількісні показники дещо підвищені в порівнянні з даними літератури (а це і добре, тому що заявники виявляють патологічні зміни раніше і в більш повному обсязі). Добре відоме використання лазерного випромінювання в біології та медицині. Наприклад, це підсумовано в огляді літератури, виконаному К. Schutze зі співавт. (див. SchtiUe К, Posl H, Lahr G. Laser micromanipulation systems as universal tools in cellular and molecular biology and in medicine // Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 1998 Jul; 44 (5):735-46.) Показано, що УФ-лазерний мікропромінь є цінним інструментом у широкій галузі молекулярної біології, так само як в медичних дослідженнях. Ця система дозволяє виділяти і досліджувати маленькі об'єкти. Важливе застосування вузькоспрямованого лазера - створення системи, яка дозволяє виділяти і працювати з окремими клітинами, їх компартментами з наступним молекулярним аналізом в "повністю безконтактній" манері. Лазерна система дозволяє швидше виділяти гомогенний примірник розмірами від менше ніж одного до декількох сотень мікрометрів в діаметрі без вторгнення в суміжні області. При цьому матрична або інформаційна рибонуклеїнова кислота (мРНК) відібраного примірника, так само як і примірника, що залишається після дослідження, добре збережена, як було продемонстровано на прикладі тканини диференційованої аденокарциноми товстої і прямої кишки. Зворотної транскрипції певної мРНК, що кодує цитоплазматичний α-актин, не спостерігали, що показано за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР-реакції). Будь-який вид тканини, так само як окремі клітини з різних джерел і навіть субклітинних структур, можуть бути досліджені, використовуючи цей лазерний спосіб. Скрізь, де треба аналізувати гомогенні зразки (клітини або навіть хромосомні генетичні зміни), цей унікальний і швидкий лазерний спосіб мікропідготовки стане ключовою технологією великої цінності. Агруч О.В. (IV Васильевские чтения. Материалы XXIII Международной научно-практической конференции "Применение лазеров в медицине и биологии", 25-28 мая 2005 года, г. Николаев. Харьков: Лазер и Здоровье, 2005. - С. 10) проводив лазерне опромінення біологічно активних точок у дітей у віці 11-14 років протягом 20 с з апаратом для низько інтенсивної лазеротерапії АФЛ-2, що працює в безперервному режимі випромінювання з довжиною хвилі 0,63 мкм, 2 щільністю потужності на кінці світловода 8-10 мВт/см . Тривалість курсу 7-9 днів. Отримали ефект біостимуляції, який виявлявся в стимуляції гемопоезу (збільшення кількості клітин червоної та білої крові при їх вихідній зниженій кількості), збільшенні числа Т- і В-клітин та 2 UA 106268 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кількості імуноглобулінів у крові, підвищення активності антиоксидантної системи, співвідношення ферментів аеробного та анаеробного обміну. Скирда І.І. та ін. (IV Васильевские чтения. Материалы XXIII Международной научнопрактической конференции "Внутривенное лазерное облучение крови в профилактике и лечении нарушений вентиляционно-перфузионных отношений с угрозой развития гипоксии и гипоксемии в ранний послеоперационный период в абдоминальной хирургии" 25-28 мая 2005 года, г. Николаев. - Харьков: Лазер и Здоровье, 2005. - С. 54-55) проводили внутрішньовенне лазерне опромінення. Експозиція 30 хвилин, довжина хвилі - 0,633 нм. Відновлення кисневої ємності крові (відновлення червоної крові). Брілль Г.Е., Бугаєва І.О. (IV Васильевские чтения. Материалы ХХIII Международной научнопрактической конференции "Изменение распределения лимфоцитов по фазам клеточного цикла при воздействии низкоинтенсивного лазерного излучения", 25-28 мая 2005 года, г. Николаев. - Харьков: Лазер и Здоровье, 2005. - С. 68-69) в дослідах на білих щурах-самцях проводили перкутанний інфрачервоний лазерний вплив при довжині хвилі 890 нм, потужності 4 мВт, частота імпульсів - 1500 Гц. Визначали сумарний вміст ДНК в клітинах при забарвленні акридиновим помаранчевим. У неопромінених тварин у фазі синтезу ДНК знаходилося 4,5 % клітин. Після впливу до 21 доби підвищення числа лімфоцитів з активацією біосинтезу ДНК в 2 рази, стимулюється мітотична активність клітин як передумова посилення імунної відповіді. Попов А.Ю. та інші використовували низькоінтенсивне (низькоефективне) лазерне випромінювання для вивчення змін показників зростання мікробних клітин на твердих поживних середовищах (див. Попов А.Ю., Попова Н.А., Тюрин А.В. Физическая модель воздействия низкоэффективного лазерного излучения на биологические объекты // Оптика и спектроскопия, 2007. - Т. 103. - № 3. - С. 502-508). Цей принцип враховано і заявниками. Дж. Хонг зі співавт. (див. Hong J, Zhu W, Zhuang H, Xu J, Sun X, Le Q, Li G, Wang Y. In vivo confocal microscopy of conjunctival goblet cells in patients with Sjogren syndrome dry eye / / Br J Ophthalmol. 2009 Dec 2. [Epub ahead of print]) застосували конфокальну мікроскопію для дослідження функціонального стану келихоподібних клітин кон'юнктиви ока у хворих з синдромом Серенсена (порушення секреції слізної рідини). Показано, що кількість клітин цього типу підвищеної яскравості істотно зростала, тоді як клітини інших видів не змінювалися. Це відображає участь келихоподібних клітин у підтримці вологості кон'юнктиви, а спосіб може бути, на думку авторів, використаний для оцінки функціонального стану клітин і в прогностичних цілях. Відомий патент України № 93113 на винахід "Спосіб отримання топограм поверхонь об'єктів", опубл. 10.01.2011 р., бюл. 1/2011. Винахід належить до вимірювальної техніки, голографічної і спекл-інтерферометрії і може використовуватися для отримання топограми поверхні об'єктів складної форми (біологічних систем - клітин, наприклад). Топограми отримують методом двоекспозиційної голографічної інтерферометрії. При голографічному зображенні об'єкта виникає система інтерференційних площ, перпендикулярних напрямку освітлення. Вони і представляють топограми об'єкта (див. Оптическая голография: Практические применения. Под ред. В.М. Гинзбург, Б.М. Степанова. Москва: Советское радио, 1978. - 240 с; патент України № 80706 на винахід "Спосіб фазомодульованої спеклінтерферометрії для вимірювання зміни фази об'єктної хвилі", опубл. 25.10.2007 р., бюл. 17/2007, власник - Одеський національний університет імені І.І. Мечникова). З існуючого рівня техніки невідомо, на який етап життєдіяльності клітини впливає лазерне випромінювання (відомо лише, що, залежно від сили впливу, спостерігається або біологічна активація клітини, або пригнічення життєво важливих процесів та її відмирання). Спосіб, що заявляється, показує, що низькоінтенсивне (низькоефективне) лазерне випромінювання активує всі спонтанно протікаючі процеси (біологічні етапи) розподілу, росту, розвитку, диференціювання і відмирання клітини. Це можна порівняти зі способом прискореного старіння за умови, що в клітині незалежно від лазерної активації відповідні стадії або етапи вже проходять на латентних, початкових стадіях. Новий спосіб відрізняється також наявністю інструменту прогнозування стану та спрямованості змін відповідної клітинної спільноти. У життєздатних клітин лазерна активація не призводить до більш швидкого відмирання, а робить їх більш толерантними до шкідливих впливів, підвищуючи їх реактивність і адаптаційні здібності. Можливість кількісної оцінки рівня раннього апоптозу відкриває нові можливості для його використання в токсикометрії та доклінічних випробуваннях нових лікарських засобів, зокрема встановлення граничних доз на культурі клітин та їх суспензіях в розчині. Спосіб, що заявляється, підтверджується наступними прикладами. Приклад 1. Кількісне визначення показника апоптозу клітин в суспензії лейкоцитів. 3 UA 106268 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для отримання суспензії лейкоцитів в центрифужні пробірки з 0,5 мл 5 %-го розчину цитрату натрію додають кров з вушної вени кролика (5 мл), куди додають 2 мл 0,83 %-го розчину хлористого амонію. Через 3-5 хвилин настає гемоліз. Гемолізат центрифугують протягом 20 хвилин при 200 об/хв. Надосадову рідину видаляють, лейкоцити переносять в чисту центрифужну пробірку і, при необхідності, ще раз проводять гемоліз для видалення залишків еритроцитів, потім промивають фізіологічним розчином. З отриманої суспензії лейкоцитів відбирають дозатором 0,1 мл суспензії і переносять в пробірку Відаля з попередньо налитим розчином Рінгера-Локка (натрію хлориду - 9 г, натрію гідрокарбонату - 0,2 г, кальцію хлориду - 0,2 г, калію хлориду - 0,2 г, глюкози - 1 г. дистильованої води - 1 л) - 1,0 мл. Із цього робочого розчину суспензії лейкоцитів готують дві серії мазків на очищених предметних скельцях. Першу серію фіксують фарбуванням розчином барвника Хехста 33342 з вмістом 5 мкг/мл протягом 15 хвилин при кімнатній температурі, надлишок фарби змивають дистильованою водою, мазки сушать і піддають дослідженню. Продивляються не менше 200 лімфоцитів і відзначають число позитивно забарвлених клітин (у %). У нормі число апоптозних клітин становить не більше 2-5 %. Другу серію мазків накривають покривними скельцями з оптично чистого скла і піддають дії високо градієнтним когерентним випромінюванням з довжиною хвилі 650 нм для активації процесів життєдіяльності клітин. Час експозиції 3 хвилин (можливо емпірично підібрати експозицію, виходячи з виду тканини і задачі дослідження). Після цього мазки поміщають у вологу камеру на інкубацію при температурі 37 °C на 1 годину. Відразу після закінчення періоду інкубації мазки другої серії, в свою чергу, ділять на дві частини: одну частину (2а) - фарбують розчином барвника Хехста 33342 та підраховують в ній число апоптозних клітин за вже описаною схемою, а другу (2b) по черзі поміщають на предметний столик спеклового мікроскопа і методом голографічної мікроінтерферометрії також підраховують число апоптозних клітин з 200 переглянутих лімфоцитів. Після цього порівнюють показник числа апоптозних клітин при забарвленні барвником Хехста 33342 (виражений апоптоз) з кількістю апоптозних клітин після опромінення високоградієнтним когерентним випромінюванням. Різниця їх кількості відповідає ранньому апоптозу. Спосіб дозволяє фіксувати в пам'яті комп'ютера зображення кожної з переглянутих клітин, що забезпечує об'єктивність підрахунку з наступною можливістю повторної перевірки. У нормі після активації число апоптозних клітин не змінюється і залишається рівним 2-5 %, зростаючи зазвичай не більше ніж на 1-2 % за рахунок клітин, що знаходяться на ранніх етапах апоптозу. Якщо число апоптозних клітин досягає 10 % при традиційних методах забарвлення і 20±3 та більше, то це свідчить про наявність функціональних порушень в процесах життєдіяльності клітинної популяції. Для перевірки цього положення 8 білим щурам-самцям масою 220±17 г вводили внутрішньочеревно ацетат свинцю в дозі 1/20 DL50 в 1,0 мл водного розчину. Контрольним тваринам (4 особи) внутрішньочеревно вводили по 1,0 мл фізіологічного розчину. Через 3 доби щурів виводили з експерименту з дотриманням вимог біоетики. Отримували суспензію лейкоцитів з 5 мл відібраної крові. У приготованих мазках методом голографічної мікроінтерферометрії підраховували число апоптозних лімфоцитів, в тому числі з ознаками раннього апоптозу після активації і без неї. Дані представлені в таблиці 1. З наведених в таблиці 1 даних видно, що за допомогою запропонованого способу картина розвитку клітинної смерті стає більш повною і адекватно відображає патогенетичні особливості не тільки гемотоксисногії, але й (певною мірою) імунотоксичної дії свинцю, тому що процес зачіпає імунокомпетентні клітини крові. Приклад 2. Кількісне визначення апоптозу гемопоетичних клітин селезінки. Для дослідження використовували селезінку білих щурів. У тварини виділяли селезінку і поміщали в скляний стакан з 50 мл розчину Рінгера-Локка (натрію хлориду - 9 г, натрію гідрокарбонату - 0,2 г, кальцію хлориду - 0,2 г, калію хлориду - 0,2 г, глюкози - 1 г, дистильованої води - 1 л). Селезінку відмивали від слідів крові легким погойдуванням протягом 3-5 хвилин. При необхідності забруднений розчин в склянці змінювали. Потім поверхню селезінки підсушували фільтрувальним папером. Зі свіжих послідовних поперечних розрізів селезінки готували відбитки на оптично чистих предметних скельцях, наносили по одній краплі вище зазначеного розчину і покривали оптично чистим покривним склом. Всі відбитки (8-10) ділили на дві групи. Мазки першої групи піддавали забарвленню барвником Хехста 33342 (див. приклад 1). Мазки другої групи піддавали впливу високо градієнтного когерентного лазерного випромінювання з довжиною хвилі 650 нм для активації процесів життєдіяльності клітин. Час 4 UA 106268 C2 5 10 15 20 експозиції 3 хвилини (можливо емпірично підібрати експозицію, виходячи з виду тканини і задачі дослідження). Після цього скельця з відбитками тканини поміщали у вологу камеру на інкубацію при температурі 37 °C на 1 годину. Потім відразу після закінчення періоду інкубації мазки другої серії ділили на дві частини: одну частину (2а) - фарбували розчином барвника Хехста 33342 та підраховували в ній число апоптозних клітин за вже описаною схемою, а другу (2b) по черзі поміщали на предметний столик спеклового мікроскопа і в ній методом голографічної мікроінтерферометрії також підраховували число апоптозних клітин з 200 переглянутих гемопоетичних клітин. Після цього порівнювали показник числа апоптозних клітин при забарвленні барвником Хехста 33342 (виражений апоптоз) з кількістю апоптозних клітин після опромінення високоградієнтним когерентним випромінюванням. Різниця їх кількості відповідає ранньому апоптозу. В нормі вміст апоптозних клітин в селезінці становить 5-7 (іноді до 10 %). Підвищення вмісту клітин з ознаками апоптозу (у тому числі раннього) понад 20 % свідчить про наявність патологічного процесу різної природи. З наведених у таблиці 2 даних видно, що мають місце суттєві відмінності в числі апоптозних клітин не тільки між контролем та дослідом, а й між їхнім числом, що визначали, у традиційно забарвлених мазках і після активації. Таким чином, наведені приклади переконливо показують переваги запропонованого способу перед існуючими, особливо в плані оцінки токсикодинаміки процесу відмирання клітин під дією токсичних агентів. Таблиця 1 Результати визначення числа апоптозних лімфоцитів в периферійній крові білих щурів Група тварин, варіант обробки мазків Контрольна, 1 Контрольна, 2а Контрольна, 2b Дослід із в/ч введенням Рb, 1 Дослід із в/ч введенням Рb, 2а Дослід із в/ч введенням Рb, 2b Вид апоптозу, число апоптозних клітин, % Виражений Ранній Загальний 2,5±1,1 2,5±1,1 2,8±1,5 2,8±1,5 2,1-1,5 1,8±0,9 3,9±1,4 9,6±2,3 9,6±2,3 10,9±2,1 10,9±2,1 10,5±2,1 7,5±1,4 18,0±1,8 Таблиця 2 Результати визначення числа апоптозних гемопоетичних клітин селезінки Група тварин, варіант обробки мазків Контрольна, 1 Контрольна, 2а Контрольна, 2b Дослід із в/ч введенням Рb, 1 Дослід із в/ч введенням Рb, 2а Дослід із в/ч введенням Рb, 2b Вид апоптозу, число апоптозних клітин, % Виражений Ранній Загальний 5,5±1,2 5,5±1,2 4,8±1,5 4,8±1,5 5,1±1,5 1,5±1,1 6,8±1,7 11,9±2,7 11,9±2,7 12,5±2,5 12,5±2,5 11,7±2,4 9,7±1,6 21,4±3,8 5 UA 106268 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 Спосіб виявлення раннього апоптозу, який полягає в тому, що відбирають пробу клітин, яку ділять на два зразки, після чого клітини першого зразка фарбують барвником Хехста 33342, візуально визначають стан клітин і підраховують кількість клітин, які мають позитивне забарвлення, потім в другому зразку клітини опромінюють високоградієнтним когерентним випромінюванням при λ=650 нм, інкубують у вологій камері при температурі 37 °C протягом 60 хвилин, ділять знову на два зразки, з яких один фарбують барвником Хехста 33342 та мікроскопують з підрахунком апоптозних клітин, а другий піддають конфокальній мікроскопії та методом голографічної мікроінтерферометрії візуально визначають стан клітин і підраховують клітини з елементами зморщування, конденсації, сегментування і фрагментації ядра, і, якщо в другому зразку апоптозних клітин більше, ніж у першому зразку, на 20-50 %, констатують ранній апоптоз з різниці числа апоптозних клітин у першому і другому зразках. 15 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6