Спосіб визначення забруднення води важкими металами

Реферат: Винахід належить до галузі екології, а саме до способу біоіндикації важких металів у природних та стічних водах. Спосіб визначення забруднення води важкими металами включає відбір проби, приготування на її основі та на основі дистильованої води твердого поживного середовища Сабуро, використання як біоіндикаторів пігментосинтезувальних дріжджів, засівання їх суцільним газоном, інкубування культури. Зразки фотографують при заданому освітленні, передають цифрове зображення на комп'ютер, визнають забруднення води важкими металами за зміною росту дріжджів та різницею інтенсивності кольору пігменту. Спосіб дозволяє підвищити достовірність результатів та створювати відповідну базу даних. UA 108287 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі екології, а саме до способу біоіндикації важких металів у природних об'єктах (природних та стічних водах), і може бути використаний для оцінки забруднення природних та стічних вод важкими металами. Існує багато способів визначення вмісту металів у природних об'єктах. Для цього, наприклад, використовують різноманітні організми-біоіндикатори. Відомий спосіб визначення адсорбції важких металів дріжджовими клітинами [Лозовая О.Г. Поиск биосорбентов тяжелых металлов среди дрожжей различных таксономических групп / О.Г. Лозовая, Т.П. Касаткина, В.С. Подгорский // Мікробіологічний журнал. - 2004. - Т. 66, № 2. - С. 92-101], який включає: вирощування біомаси дріжджів у чашках Петрі на напіврідкому поживному середовищі Рідер при рН 6,8, що містить (г/л): (NH 4)2SO4 - 3,0; K2НРО4 - 0,1; KН2РО4 1,0; MgSO4 - 0,7; NaCl - 0,5; глюкоза - 10,0; дріжджовий екстракт - 0,1 %; з додаванням певних концентрацій солей важких металів, після цього проводять їх посів на чашки крапельним методом, інкубують протягом 48 год. при температурі 28 °C, потім, коли розмір найбільшої колонії дріжджів досягне у діаметрі 4 мм, чашки переносять в ексикатор, де вони контактують з газоподібним H2S протягом 15 хв. Здатність накопичувати іони важких металів оцінюють за ступенем утворення світлих та темнозабарвлених зон навколо колонії. Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: - використання дріжджів як тест-об'єктів; - посів дріжджів на поживне середовище, що містить важкі метали; - інкубація дріжджових клітин; - визначення впливу важких металів на життєдіяльність дріжджів. Недоліком прототипу є необхідність у спеціальному обладнанні, трудомісткість способу і його значна вартість, крім цього, цей спосіб не передбачає використання пігментосинтезувальних дріжджів як біоіндикаторів забруднення води важкими металами та визначення зміни їх інтенсивності залежно від концентрації важких металів у середовищі з можливістю спостереження за цим процесом за допомогою комп'ютера. Відомий спосіб визначення забруднення оточуючого середовища металами [UA 75513 C2. Спосіб визначення забруднення оточуючого середовища металами / Рильський О.Ф., Гвоздяк П.І., Шевчук І.А., заявник та патентовласник Запорізький державний університет. - № 20040706208; заявл. 26.07.2004; опубл. 17.04.2006, Бюл. № 4, 2006], який включає: відбір проби, що містить певну кількість важких металів, приготування на її основі твердого поживного середовища м'ясо-пептонного агару (МПА) та приготування контрольного середовища, посів пігментосинтезувальних бактеріальних культур Pseudomonas fluorescens sp., Pseudomonas fluorescens var. pseudo-iodinum, Serratia marcescens, інкубацію бактерій та візуальне спостереження за втратою ними пігментів і визначення за цим показником забруднення оточуючого середовища металами. Ознаками, спільними з аналогом, є: - відбір проб; - використання як біоіндикаторів пігментосинтезувальних мікроорганізмів; - приготування контрольного та дослідного твердого поживного середовища; - засівання їх біоіндикаторними пігментосинтезувальними мікроорганізмами; - інкубування культури; - спостереження за її пігментоутворенням; - визначення за цим показником забруднення середовища важкими металами. Недоліком аналога є те, що як біоіндикатори використовують бактеріальні культури Pseudomonas fluorescens sp., Pseudomonas fluorescens var. pseudo-iodinum, Serratia marcescens, які є прокаріотами і мають хімічний склад та обмін речовин, відмінний від організму людини; крім того, швидкість росту і розмноження бактерій недостатня, що знижує експресність способу. Даний спосіб також не передбачає визначення зміни інтенсивності кольору пігменту мікроорганізмів та комп'ютерну обробку даних. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб визначення забруднення води важкими металами, який шляхом вирощування пігментосинтезувальних дріжджів на поживному середовищі, їх фотографування, визначення інтенсивності кольору пігменту, за допомогою комп'ютерних програм, дозволяє підвищити достовірність та чутливість способу, створювати відповідну базу даних. Суттєвими ознаками винаходу є відбір проби, з можливим вмістом важких металів, приготування на її основі та на основі дистильованої води поживного середовища Сабуро, використання як біоіндикаторів пігментосинтезувальних дріжджів, засів поживного середовища суцільним газоном дріжджів, інкубування, фотографування зразків культури при заданому освітленні, передачу цифрового зображення на комп'ютер, знаходження різниці інтенсивності 1 UA 108287 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кольору пігменту контрольного та дослідного зразків, визначення забруднення води за зміною росту дріжджів та інтенсивністю їх пігментоутворення. Відмінними від аналога ознаками є: використання Сабуро як поживного середовища, використання як біоіндикаторів пігментосинтезувальних дріжджів, фотографування зразків культури при заданому освітленні, передача цифрового зображення на комп'ютер, знаходження різниці інтенсивності кольору пігменту контрольного та дослідного зразків, визначення забруднення води за зміною росту дріжджів та інтенсивністю їх пігментоутворення. Визначення інтенсивності пігментоутворення здійснювали за допомогою відомого способу [UA 49812 U, МПК (2009), C12Q 1/00, С12М 1/00, С12М 1/34. Спосіб визначення інтенсивності пігментоутворення у бактерій / Рильський О.Ф., Домбровський К.О., Гороховський Є.Ю., Жиленко А.В.; заявник і патентовласник ЗНУ. - № u200912311; заявл. 30.11.2009; опубл. 11.05.2010, Бюл. № 9, 2010 p.], який включає: інкубування контрольних і дослідних зразків, фотографування зразків культур бактерій при заданому освітленні, передачу цифрового зображення на комп'ютер у програму Adobe Photoshop, визначення відтінків за допомогою пакета програм СІЕ Lab, порівняння кольору дослідних та контрольних зразків культур бактерій, визначення зміни інтенсивності пігментоутворення за різницею між кольорами dE. Пігментосинтезувальні дріжджі мають структуру клітин, подібну тваринним організмам, і відносяться до еукаріот, а також частіше за всіх контактують з людиною. Так, наприклад, культуру дріжджів Rhodotorula rubra доцільно використовувати як біоіндикатор, тому що вона має стійкі рожевозабарвлені пігменти-каротиноїди, мешкає поряд із людиною (може існувати у воді, добре рости на харчових продуктах), внаслідок чого її можна використовувати як об'єктивний біоіндикатор забруднення води. При цьому втрата пігменту при наявності небезпечної концентрації металів передує загибелі клітин. Запропонований спосіб простий у реалізації, економічний, тому що не потребує спеціального обладнання, дозволяє визначати концентрацію металів, при якій спостерігається зміна пігментоутворення задовго до летальної для дріжджів концентрації. Спосіб здійснюють таким чином: - відбирають проби води; - готують поживні середовища Сабуро на основі відібраної проби води та проб із певним вмістом важких металів і на дистильованій воді; засівають на них культуру дріжджів суцільним газоном; - інкубують посівний матеріал при температурі 27-30 °C протягом 3-9 діб; - фотографують зразки культури при заданому освітленні; - передають цифрове зображення на комп'ютер; - визначають різницю інтенсивності пігментоутворення дріжджів контрольного та дослідного зразків; - оцінюють забруднення води за зміною росту дріжджів та інтенсивністю їх пігментоутворення. Приклад конкретного виконання: Оцінці підлягали природні води та стічні води гальванічних виробництв машинобудівельних 6+ 2+ 2+ 2+ заводів, зокрема стічні води, що містили переважно Cr , Zn , Cd , Cu ; та модельні водні 2+ 6+ розчини, які містили такі іони важких металів: Сu (у концентраціях 150-900 мг/л), Сr (10-70 2+ 2+ мг/л), Zn (100-550 мг/л), Cd (20-1050 мг/л). Концентрація металу в стічних водах була визначена за допомогою хімічного аналізу і відповідала показникам модельних розчинів. Для приготування середовища Сабуро, на якому культивували пігментосинтезувальні дріжджі, використовували дистильовану воду (контроль), проби природних і стічних вод та модельні розчини з використанням дистильованої води, до якої додавали важкі метали в певних концентраціях. Засівали поживні середовища суцільним газоном дріжджів виду Rhodotorula rubra, щільність 7 клітин становила 10 кл/мл. Усі досліди робили у п'ятикратній повторності. Культивування дріжджів проводили при температурі 28 °C протягом 3-9 діб. У процесі росту порівнювали інтенсивність пігментоутворення у дослідах та контролі. За цим показником оцінювали забруднення води важкими металами. 2+ Приклад 1. Оцінці підлягали водні розчини, які містили іони Сu (у концентраціях 150-900 мг/л). 2 UA 108287 C2 Таблиця 1 Вплив іонів Сu Концентрація іонів 2+ Сu , мг/л Дистильована вода (контроль) 150 мг/л 250 мг/л 350 мг/л 500 мг/л 600 мг/л 700 мг/л 800 мг/л 900 мг/л 2+ на ріст та пігментоутворення у дріжджів Rhodotorula rubra Ріст 3 доба Пігмент 6 доба Пігмент Ріст Ріст 9 доба Пігмент ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ ++ + + ++++ ++++ +++ ++ ++++ +++ +++ +++ ++ + + ++++ ++++ +++ ++ ± ++++ ++++ +++ +++ ++ + + ++++ ++++ +++ +++ ± ± Примітка (тут та далі): ++++ - суцільний ріст або пігментоутворення; +++ - добрий ріст або пігментоутворення; ++ - помірний ріст або пігментоутворення; + - слабкий ріст або пігментоутворення; - - відсутність росту та/або пігментоутворення; ± - наявність пігментних та безпігментних колоній. 5 10 15 Вплив іонів міді на ріст та пігментоутворення дріжджів Rhodotorula rubra був відзначений на 3 добу культивування. Мідь у концентраціях до 150 мг/л є нетоксичним елементом для даного виду дріжджів. Колір пігменту також не відрізнявся від контрольного. Здатність культури до 2+ пігментоутворення втрачалася з концентрації 350 мг/л Сu . При концентрації міді 500 мг/л колонії були молочного кольору зі слабким рожевим забарвленням верхівки. Повністю синтез 2+ пігменту інгібувався при концентрації Cu 600 мг/л. Але на 6 добу культивування культура починала відновлювати здатність синтезувати пігмент разом із збільшенням кількості колоній. 2+ При концентрації 800 мг/л Сu на 9 добу синтезу пігменту так і не спостерігалося. Відзначено, 2+ що з концентрації Сu 200 мг/л починала зменшуватися кількість дріжджових колоній, а 2+ повністю ріст припинявся у присутності в середовищі 900 мг/л Сu . На фіг. 1 наведено графік зміни інтенсивності кольору пігменту дріжджів виду Rhodotorula rubra залежно від концентрації міді у середовищі Сабуро та доби культивування (X концентрація іонів міді, Y - зміна інтенсивності кольору пігменту). 6+ Приклад 2. Оцінці підлягали водні розчини, які містили іони Сr (у концентраціях 10-70 мг/л). Таблиця 2 Вплив іонів Сr Концентрація іонів 6+ Сr , мг/л Дистильована вода (контроль) 10 мг/л 15 мг/л 20 мг/л 30 мг/л 40 мг/л 50 мг/л 60 мг/л 70 мг/л 6+ на ріст та пігментоутворення у дріжджів Rhodotorula rubra Ріст 3 доба Пігмент Ріст 6 доба Пігмент Ріст 9 доба Пігмент ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ + + + + + + +++ ++ ± ± ± ++ + + + + + + ++++ +++ ± ± ± ± +++ ++ + + + + + ++++ +++ ± ± ± ± 3 UA 108287 C2 5 10 З даних таблиці 2 видно, що культура Rhodotorula rubra починала втрачати пігмент із 6+ 6+ концентрації 10 мг/л Сr , але на 6 добу відновлювала синтез пігменту. При концентраціях Сr 20-50 мг/л спостерігалися пігментні та безпігментні колонії. У присутності в середовищі 60 мг/л іонів хрому (VI) синтез пігменту повністю інгібувався. Пригнічення росту культури також 6+ 6+ починалося з 10 мг/л Сr , а при 70 мг/л Сr він повністю припинявся. На фіг. 2 наведено графік зміни інтенсивності кольору пігменту дріжджів виду Rhodotorula rubra залежно від концентрації хрому в середовищі Сабуро та доби культивування (X концентрація іонів хрому, Y - зміна інтенсивності кольору пігменту). Таким чином, за графіками можна визначити концентрацію важкого металу в водному середовищі. 2+ Приклад 3. Оцінці підлягали водні розчини, які містили іони Cd (у концентраціях 20-1050 мг/л). Таблиця 3 Вплив іонів Cd Концентрація іонів 2+ Cd , мг/л Дистильована вода (контроль) 20 100 200 300 500 700 800 900 1050 15 20 25 2+ на ріст та пігментоутворення у дріжджів Rhodotorula rubra 3 доба Пігмент Ріст Ріст 6 доба Пігмент Ріст 9 доба Пігмент ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ + + +++ ++ ++ + + + +++ +++ +++ ++ ++ ++ + + +++ +++ ++ + + + ± +++ +++ +++ +++ ++ ++ + + +++ +++ +++ ++ ++ + ± Іони кадмію (II) починали інгібувати ріст та пігментоутворення у дріжджів Rhodotorula rubra з 2+ концентрації 20 мг/л. При концентрації Cd 100 та 200 мг/л на 3 добу культивування колонії були слабкорожевого кольору, але синтез пігменту відновлювався до 9 доби. Концентрації 300, 500, 700 мг/л іонів кадмію виявилися на порядок шкідливіше як для росту, так і для пігментоутворення в даній культурі, розмір слабкозабарвлених колоній був дуже дрібний. Кадмій у кількості 800 мг/л дуже пригнічував ріст дріжджів, дрібні колонії на 3 добу були молочного кольору, а на 6 добу з'явилися декілька пігментованих колоній. При концентрації 900 2+ мг/л Cd протягом 9 діб синтез пігменту не спостерігався, зустрічалися дрібні молочні колонії. Повністю ріст дріжджів Rhodotorula rubra припинявся при концентрації 1050 мг/л іонів кадмію. 2+ Приклад 4. Оцінці підлягали водні розчини, які містили іони Zn (у концентраціях 100-550 мг/л). Таблиця 4 Вплив іонів Zn 2+ на ріст та пігментоутворення у дріжджів Rhodotorula rubra 2+ Концентрація іонів Zn , мг/л Дистильована вода (контроль) 100 мг/л 150 мг/л 200 мг/л 250 мг/л 300 мг/л 400 мг/л 500 мг/л 550 мг/л Ріст 3 доба Пігмент Ріст 6 доба Пігмент Ріст 9 доба Пігмент ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ + + ++ + +++ ++ ++ + + +++ ++ + + ± ++++ +++ ++ ++ + + + ++++ +++ ++ ++ ± ± 4 UA 108287 C2 2+ 5 10 15 З даних таблиці 4 видно, що при концентрації 100 та 150 мг/л іонів Zn пігментосинтезувальна здатність дріжджів Rhodotorula rubra значно пригнічувалася, але на 9 добу колір пігменту майже повністю відновився і не відрізнявся від контрольного. При концентрації 200 і 250 мг/л на 3 добу колонії були безпігментні, але з 6 доби синтез пігменту дещо відновлювався разом із збільшенням дріжджових колоній. 300 мг/л іонів цинку викликали повне пригнічення росту до 3 доби, а на 6 добу з'являлися пігментні та безпігментні колонії. При 2+ концентрації 400 мг/л Zn на 9 добу починався ріст слабкорожевозабарвлених та молочних колоній. Концентрація 500 мг/л на 9 добу викликала появу тільки безпігментних колоній. Повністю ріст припинявся при концентрації 550 мг/л іонів цинку (II). При дослідженні природних вод втрата пігментів у дріжджів не спостерігалася, тому що в цих водах концентраційні рівні металів були дуже низькими. Результати дослідження стічних вод, які містили комплекс важких металів, показали, що дріжджі реагували на присутність у середовищі металів втратою пігменту та затримкою росту. Це свідчить про те, що їх можна використовувати в комплексній оцінці стану забруднення води. Таким чином, насиченість кольору та стійкість пігментів-каротиноїдів даної культури дозволяє використовувати її для біоіндикації забруднення води важкими металами. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 25 Спосіб визначення забруднення води важкими металами, який включає відбір проби, приготування контрольного та дослідного, на основі проби, твердих поживних середовищ, засівання їх біоіндикаторними пігментосинтезувальними мікроорганізмами, інкубування культури, оцінювання її пігментоутворення та визначення за цим показником присутності металів, який відрізняється тим, що як біоіндикаторні мікроорганізми використовують пігментосинтезувальні дріжджі, як поживне середовище використовують Сабуро; фотографують зразки культури при заданому освітленні, передають цифрове зображення на комп'ютер, визначають забруднення води важкими металами за різницею інтенсивності кольору пігменту та росту дріжджів у контрольному та дослідному зразках. 5 UA 108287 C2 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6