Спосіб одержання лектину ікри коропа (cyprinus carpio l.)

Реферат: Спосіб одержання лектину ікри коропа (Cyprinus carpio L.) включає гомогенізацію ікри у блендері, центрифугування і фільтрування супернатанту та очистку лектину афінною хроматографією. Здійснюють гомогенізацію ікри у блендері з 1 %-ним розчином хлориду натрію, видаляють баластні білки після підкислення до рН 4,5 центрифугуванням і проводять очистку афінною хроматографією на поперечнозшитому овомукоїді та на співполімері полівінілового спирту і групоспецифічних речовин крові людини, а елюцію адсорбованого лектину здійснюють за допомогою 2 % розчину лактози в діапазоні температур +20 - +55 °С. UA 108685 U (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ЛЕКТИНУ ІКРИ КОРОПА (CYPRINUS CARPIO L.) UA 108685 U UA 108685 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до одержання природних речовин, що знаходять застосування в біохімії та гістохімії, а саме до одержання лектину ікри коропа. Відомий спосіб одержання лектину ікри коропа (Cyprinus carpio L.), який включає гомогенізацію ікри, очистку лектину з освітленого гомогенізату гель-хроматографією та іонообмінною хроматографією на ДЕАЕ-целюлозі [1]. Найближчим до заявленої корисної моделі за технічною суттю є спосіб одержання лектину ікри коропа за допомогою афінної хроматографії на сефарозі 4 В [2]. Відповідно до цього способу лектин одержують шляхом гомогенізації ікри у блендері 20 мМ тріс-НСl буферним розчином з 5 мМ СаСl2 (рН 7,4), центрифугуванням при 10000 g протягом години, фільтруванням супернатанту та очисткою лектину афінною хроматографією на сефарозі 4 В при елюції адсорбованого на гелі лектину 0,4 М розчином N-ацетил-D-глюкозаміну, концентруванням одержаного продукту та остаточною очисткою лектину гель-хроматографією. До недоліків найближчого аналога належить малий вихід з сировини через низьку спорідненість до вказаного афінного сорбенту та недостатня чистота одержаного продукту. В основу корисної моделі поставлена задача усунення вищезгаданих недоліків шляхом використання афінних сорбентів, що мають значно вищу афінність до вказаного лектину. Поставлена задача вирішується тим, що у способі одержання лектину ікри коропа (Cyprinus carpio L.), який включає гомогенізацію ікри у блендері, центрифугування і фільтрування супернатанту та очистку лектину афінною хроматографією, згідно з корисною моделлю, здійснюють гомогенізацію ікри у блендері з 1 %-ним розчином хлориду натрію, видаляють баластні білки після підкислення до рН 4,5 центрифугуванням і проводять очистку афінною хроматографією на поперечнозшитому овомукоїді та на співполімері полівінілового спирту і групоспецифічних речовин крові людини, а елюцію адсорбованого лектину здійснюють за допомогою 2 % розчину лактози в діапазоні температур +20 - +55 °C. Перевагою запропонованого способу одержання лектину ікри коропа (Cyprinus carpio L.) є те, що запропоновані афінні сорбенти мають значно вищу спорідненість до очищуваного лектину, що підвищує вихід цільового продукту із сировини. Окрім цього, проведення афінної хроматографії на сорбентах, які мають вищу афінність до цільового продукту, приводить до підвищення його чистоти. Запропонована корисна модель пояснюється ілюстраціями. На Фіг. 1 відображено проведення афінної хроматографії лектину ікри коропа за найближчим аналогом, на Фіг. 2 очистку лектину ікри коропа гель-хроматографією за найближчим аналогом, на Фіг. 3 - очистку лектину ікри коропа афінною хроматографією на поперечнозшитому овомукоїді за пропонованою корисною моделлю, на фіг. 4 - очистку лектину ікри коропа афінною хроматографією на співполімері полівінілового спирту і групоспецифічної речовини крові людини за пропонованою корисною моделлю. На Фіг. 5 відображено дослідження електрофоретичної чистоти лектину ікри коропа, проведеного в 15 % поліакриламідному гелі з 0,1 % додецилсульфату натрію в лужній буферній системі (рН 8,6), де 1 - положення білківмаркерів, 2 - лектин ікри коропа, очищений за пропонованою корисною моделлю; 3 - лектин ікри коропа, очищений за пропонованою корисною моделлю у присутності 1 % Р-меркаптоетанолу; 4 - лектин ікри коропа, очищений за найближчим аналогом. Спосіб одержання лектину ікри коропа (Cyprinus carpio L.) за найближчим аналогом здійснюють таким чином. Свіжезібрану ікру (приблизно 500 г) поміщають в міксер і гомогенізують з 1,5 л 1 % розчину хлориду натрію протягом 5 хв. Одержаний гомогенат центрифугують при 6000 g протягом 10 хв. і рН освітленого супернатанту доводять до рН 4,5. Після видалення осаду центрифугуванням при 6000 g протягом 10 хв., рН надосадової рідини доводять до 7,0. Після цього знову центрифугують 20 хв при 6000 g. Надосадову рідину, одержану після цієї стадії, наносять на колонку афінного сорбенту (частково гідролізована сефароза 4В [3], висота - 25 см, об'єм - 480 мл). Колонку промивають 0,05 М фосфатним буфером з 3 % NaCl із швидкістю 5 мл/хв до тих пір, поки рівень екстинції (А280) в елюаті не знизиться нижче 0,1. Лектин, адсорбований на колонці, знімають 4 М розчином N-ацетил-D-глюкозміну, розчиненим у попередньому буфері (Фіг. 1). Фракції, які містять білок, об'єднують, і очищений лектин висолюють сульфатом амонію при 560 г/л солі. Осад розчиняють у воді і після короткочасного діалізу проти води (2-3 год.) фільтрують і наносять на колонку сефадексу G-75, урівноважену 0,1 М ацетатним буферним розчином, рН 6,0-6,4 (Фіг. 2). Розміри колонки підбирають таким чином, щоб рідини, призначеної для очистки на колонці, було менше за 1/20 об'єму колонки. Виявлення білків у фракціях, що витікають з колонки, здійснюють шляхом вимірювання екстинції при 280 нм, а виявлення лектину у фракціях, що витікають з колонки, здійснюють шляхом визначення титру 1 UA 108685 U 5 10 15 20 25 30 35 геаглютинації з еритроцитами голуба. Фракції, які містять лектин, об'єднують і висолюють сульфатом амонію при 560 г/л солі. Після висолювання лектин концентрують центрифугуванням, розчиняють у воді і після обезсолювання діалізом ліофільно висушують. Вихід ліофільно висушеного лектину складає 7-8 мг з 500 г ікри (14-16 мг/кг ікри). Спосіб одержання лектину ікри коропа (Cyprinus carpio L.) за пропонованою корисною моделлю здійснюють таким чином. Свіжезібрану ікру (560 г) поміщають в міксер і гомогенізують з 1,8 л 1 % розчину хлориду натрію протягом 5 хв. Одержаний гомогенат центрифугують при 6000 g протягом 10 хв., і рН освітленого супернатанту доводять до рН 4,5. Після видалення осаду центрифугуванням при 6000 g протягом 10 хв, рН надосадової рідини доводять до 7,0. Після цього знову центрифугують 20 хв при 6000 g. Надосадову рідину, одержану після цієї стадії, наносять на колонку афінного сорбенту (поперечнозшитий овомукоїд [3], висота - 25 см, об'єм - 480 мл). Колонку промивають 0,05 М фосфатним буфером з 3 % NaCl із швидкістю 5 мл/хв до тих пір, поки рівень екстинції (А280) в елюаті не знизиться нижче 0,1. Елюцію адсорбованого на колонці лектину здійснюють за допомогою 2 % розчину лактози, розчиненої у попередньому буфері в діапазоні температур +20 - +55 °C (Фіг. 3). Фракції, які містять білок, об'єднують, і очищений лектин висолюють сульфатом амонію при 560 г/л солі. Одержаний розчин далі очищають афінною хроматографією на співполімері полівінілового спирту і групоспецифічної речовини крові людини [4]. Для цього на колонку висотою 8 см і об'ємом 50 мл, яку попередньо промито 0,05 М фосфатним буфером з 3 % NaCl, наносять 12 мл концентрованого розчину лектину, одержаного на попередній стадії очистки. Колонку промивають 0,05 М фосфатним буфером з 3 % NaCl із швидкістю 1,5 мл/хв до тих пір, поки рівень екстинції (А280) у елюаті не знизиться нижче 0,1. Елюцію адсорбованого на колонці лектину здійснюють за допомогою 2 % розчину лактози, розчиненої у попередньому буфері в діапазоні температур +20 - +55 °C (Фіг. 4). Фракції, які містять білок, об'єднують, і очищений лектин висолюють сульфатом амонію при 560 г/л солі. Після висолювання лектин концентрують центрифугуванням, розчиняють у воді і після обезсолювання діалізом ліофільно висушують. З використанням пропонованого способу після очистки з 560 г ікри було одержано 23 мг лектину (приблизно 42 мг/кг). Одержаний лектин доволі термостабільний, витримує нагрівання протягом 15 хв до +75 °C без помітної втрати гемаглютинуючої активності. Лектин витримує осадження етанолом. При осадженні двома об'ємами етанолу при кімнатній температурі і наступним розчиненням утвореного осаду в 1 % розчині NaCl титр гемаглютинації знижується лише приблизно на 10 %. Лектин виявляє неоднакову чутливість до еритроцитів різних видів (Табл. 1) Таблиця 1 Мінімальна концентрація лектину ікри коропа, що аглютинує еритроцити різних видів Мінімальна концентрація лектину, що аглютинує еритроцити (мкг/мл) 1,25 10,7 10,7 43,0 43,0 -(> 1000 мкг/мл) -(> 1000 мкг/мл) -(> 1000 мкг/мл) -(> 1000 мкг/мл) -(> 1000 мкг/мл) Тип еритроцитів 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 40 Голуб Кролик Собака Людина, група А Щур Миша Коза Корова Короп Жаба Кращими інгібіторами активності лектину були вуглеводи групи D-галактози, зокрема, Nацетил-D-галактозамін, однак, лектин слабко взаємодіяв з манозою і деякими дисахаридами, що містять глюкозу (табл. 2), що свідчить лектин має вищу афінність до олігосахаридних структур складнішої будови. 2 UA 108685 U Таблиця 2 Взаємодія лектину ікри коропа з деякими моно- та дисахаридами № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 5 Мінімальна конц. вуглеводу, що пригнічує активність 4 од. лектину (в мМ) 100 25 6,25 6,25 0,2 0,78 12,5 12,5 6,25 Вуглевод D-маноза α-метил-D-манопіранозид Мелібіоза (Ga1α1,6G1c) Лактоза (Ga1β1,4G1c) N-ацетил-D-галактозамін α-метил-D галактопіранозид β-метил-D галактопіранозид L-арабіноза L-рамноза Примітки: лектин не взаємодіяв D-глюкозою, N-ацетил-D-глюкозаміном, D-ксилозою, Dфруктозою, L-фукозою в концентрації 100 мМ. Ефективність запропонованої корисної моделі представлено в Табл. 3 і Табл. 4. Таблиця 3 Контроль за очисткою лектину за стадіями № Стадії 1 2 3 4 1 2 3 4 10 15 20 Загальний Загальна Вихід лектину (в %) по активності білок* (VC) активність* (VU) Очистка лектину за найближчим аналогом Початковий екстракт 49 950 10800 100 Освітлення шляхом зміни рН 15480 10320 95,6 Афінна хроматографія на 52,8 1584 14,4 сефарозі 4В Гель-хроматографія 7,18 1280 11,9 Очистка лектину за пропонованою корисною моделлю Початковий екстракт 59280 12160 100 Освітлення шляхом зміни рН 18720 11520 94,7 Афінна хроматографія на 530,4 3264 71,1 поперечно-зшитому овомукоїді Афінна хроматографія на 23,76 1408 57,9 співполімері Стадія очистки лектину *Примітки: Загальний білок виражений в мг, це - добуток концентрації білка, визначеного за методом Лоурі в мг/мл на об'єм екстракту в мл; загальна активність виражена в гемаглютинуючих одиницях, це добуток об'єму екстракту в мл на титр аглютинації еритроцитів голуба. Дослідження електрофоретичної чистоти лектину ікри коропа було проведено в 15 % поліакриламідному гелі з 0,1 % додецилсульфату натрію в лужній буферній системі (рН 8,6) і результати представлені на Фіг.5. На фіг.5 показано положення лектину ікри коропа, очищеного за пропонованою корисною моделлю за відсутності (трек №2) та у присутності 1 % βмеркаптоетанолу (трек №3). Очевидно, що поліпептидні ланцюги лектину зв'язані дисульфідними зв'язками і мають молекулярну масу близько 16 кДа. За відсутності βмеркаптоетанолу поліпептидні ланцюги лектину показують молекулярну масу близько 62 кДа без домішки інших поліпептидів. Лектин, очищений за найближчим аналогом, показує крім поліпектиду в 62 кДа, домішку щонайменше двох поліпептидів з молекулярною масою 40-42 кДа, кількість якої складає понад 50 %. 3 UA 108685 U Таблиця 4 Основні технічні характеристики одержаного продукту Показники Вихід кінцевого продукту (в мг/кг) За найближчим аналогом 14 5 10 За корисною моделлю 42 Чистота (за даними електрофорезу в ПААГ) За найближчим За корисною аналогом моделлю Понад 90 % Менше 50 % Мінімальна концентрація кінцевого продукту, що аглютинує еритроцити голуба За найближчим аналогом За корисною моделлю 4 мкг/мл 1,25 мкг/мл Джерела інформації: 1. Dong Cai-Hua, Yang Shu-Ting, Yang Zhong-An, Zhang Lei, Gui Jian-Fang A C-type lectin associated and translocated with cortical granules during oocyte maturation and egg fertilization in fish // Developmental Biology. - 2004. - V. 265, N 2. - P. 341-354. 2. Galliano M., Minchiotti L., Campagnoli M., Sala A., Visai L., Amorsano A., Pussi P., Casbarra A., Causi M., Perduca M., Monaco H. L. Structural and biochemical characterization of a new type of lectin isolated from carp eggs //Biochem. J. - 2003. - V. 376. - P. 433-440. 3. A.C. СССР № 1554961, опубл. 7.04.90 г., Б.И. № 13. 4. Патент України на корисну модель № 22036, МПК B01J 20/22, C12N 11/00, опубл. 10.04.2007 р., бюл. № 4. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб одержання лектину ікри коропа (Cyprinus carpio L.), який включає гомогенізацію ікри у блендері, центрифугування і фільтрування супернатанту та очистку лектину афінною хроматографією, який відрізняється тим, що здійснюють гомогенізацію ікри у блендері з 1 %ним розчином хлориду натрію, видаляють баластні білки після підкислення до рН 4,5 центрифугуванням і проводять очистку афінною хроматографією на поперечнозшитому овомукоїді та на співполімері полівінілового спирту і групоспецифічних речовин крові людини, а елюцію адсорбованого лектину здійснюють за допомогою 2 % розчину лактози в діапазоні температур +20 - +55 °С. 4 UA 108685 U 5 UA 108685 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6