Спосіб моделювання мікробіомів ротової порожнини in vitro для визначення факторів вірулентності пародонтопатогенних мікроорганізмів

Реферат: Спосіб моделювання in vitro мікробіомів ротової порожнини для визначення факторів вірулентності пародонтопатогенних мікроорганізмів включає використання моделі твердої тканини зуба. У пробірці розміщують рідке середовище з факторами росту або антимікробними засобами, тверду фазу у вигляді розрізаного вздовж зуба людини, на котрому спірально фіксують нитку колагену, фазу з тканини печінки та створюють анаеробні умови для культивування шляхом внесення розплавленого парафіну на поверхню середовища з наступним дослідженням факторів вірулентності пародонтопатогенних мікроорганізмів, наприклад, активності колагенази, гемолізинів, лецитинази. UA 109350 U (54) СПОСІБ МОДЕЛЮВАННЯ МІКРОБІОМІВ РОТОВОЇ ПОРОЖНИНИ IN VITRO ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ФАКТОРІВ ВІРУЛЕНТНОСТІ ПАРОДОНТОПАТОГЕННИХ МІКРООРГАНІЗМІВ UA 109350 U UA 109350 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить медицині, зокрема мікробіології та стоматології, і може бути використана для дослідження факторів вірулентності мікробіомів пародонтопатогенних мікроорганізмів, до складу яких входять анаеробні та факультативно-анаеробні мікроорганізми, що виділяються при патологічних процесах ясен, пародонту та інших біотопів ротової порожнини. Відомий спосіб моделювання мікробіоценозу субгінгівальної зубної бляшки під назвою "Цюріхська модель", що включає середовище, в якому містяться епітеліальні клітини людини і диски з гідроокису апатиту, що моделюють тверду тканину зуба, куди вносять для вирощування основні види пародонтопатогенних мікроорганізмів [Bernhard Guggenheim, Rudolf Gmiir et al. In vitro modeling of host-parasite interactions: the 'subgingival' biofilm challenge of primary human epithelial cells. - BMC Microbiology. - 2009. - V.9-P. 280]. Таким способом вивчається динаміка формування та структура біоплівки мікроорганізмів та її вплив на епітеліальні клітини і мінеральні диски з гідроокису апатиту. Проте вказаний спосіб дає можливість моделювати тільки один з мікробіомів зубної бляшки - субгінгівальну біоплівку - і визначати один з факторів патогенності - цитотоксичність. Цей спосіб не дає можливості оцінювати один з найважливіших факторів патогенності мікробіоценозу - колагеназну активність. В основу корисної моделі поставлена задача створити спосіб моделювання аеробних і факультативно-анаеробних мікробіомів ротової порожнини, котрі розвиваються в планктонній, твердофазній та тканинній формах, що дасть можливість визначати кількісні параметри пародонтопатогенних факторів вірулентності, продукованих у мікробіомах, а також дію засобів, що пригнічують їхню активність. Поставлена задача вирішується тим, що у способі моделювання in vitro мікробіомів ротової порожнини для визначення факторів вірулентності пародонтопатогенних мікроорганізмів, що включає використання моделі твердої тканини зуба, згідно з корисною моделлю, у пробірці розміщують рідке середовище з факторами росту або антимікробними засобами, тверду фазу у вигляді розрізаного вздовж зуба людини, на котрому спірально фіксують нитку колагену, фазу з тканини печінки та створюють анаеробні умови для культивування шляхом внесення розплавленого парафіну на поверхню середовища з наступним дослідженням факторів вірулентності пародонтопатогенних мікроорганізмів, наприклад, активності колагенази, гемолізинів, лецитинази. У пропонованій корисній моделі для бактеріологічного посіву матеріалу з порожнини рота застосовують систему для вирощування мікробіомів різних біотопів ротової порожнини, яка містить у пробірці рідинну фазу на основі цукрово-сироваткового бульйону з факторами росту або антимікробними засобами, тканинну фазу з кусочків печінки, яка має редукційні властивості, та тверду фазу у вигляді розрізаного вздовж зуба людини, на котрому спірально фіксована нитка колагену. Культивування в анаеробних умовах здійснюють шляхом внесення розплавленого парафіну на поверхню середовища з наступним дослідженням факторів вірулентності пародонтопатогенних мікроорганізмів, наприклад, активності колагенази, гемолізинів, лецитинази. Для створення анаеробіозу на поверхню рідини у пробірці наносять шар розплавленого парафіну, що створює умови для розвитку пародонтопатогенних мікроорганізмів і продукцію ними факторів вірулентності, котрі визначають за змінами нитки колагену або шляхом виявлення мембранотоксинів, наприклад, гемолізинів, фосфоліпаз, лейкотоксинів. Запропонований спосіб дає можливість вирощувати природні комплекси мікроорганізмів порожнини рота (мікробіоми, мікробіоценози), виявляти їхні особливості при різних патологічних станах, досліджувати продукцію факторів вірулентності, які мають потенційну пародонтопатогенну дію, а також вивчати дію антимікробних лікувальних засобів. Спосіб моделює основні елементи мікробіоценозу - планктонну (рідку) фазу, над'ясенну і під'ясенну біоплівку та біоплівку, що формується на твердих тканинах, дає можливість оцінити вплив мікробіоценозу на основну складову фіксуючого апарату зуба - колаген, а також вивчати активність різних факторів вірулентності (гемолізини, лецитиназу) в культуральній рідині в динаміці. Пропонований спосіб проілюстровано мікрофотографіями. На Фіг. 1 зображено нитку колагену, взяту з моделі після 72-годинної інкубації, наявні видимі порушення структури, розриви поверхні та деформації. На Фіг. 2 зображена нитку колагену (контроль), що не піддавалась дії мікроорганізмів. Спосіб моделювання мікробіомів ротової порожнини in vitro для визначення факторів вірулентності пародонтопатогенних мікроорганізмів здійснюють таким чином. 1 UA 109350 U 5 10 15 20 25 30 35 У пробірку із стерильним середовищем, яке містить цукрово-сироватковий бульйон, фактори росту або антимікробні препарати, кусочки печінки та поздовжньо розрізаний зуб людини з фіксованою на ньому ниткою колагену, вносять матеріал з досліджуваного біотопу ротової порожнини, після чого на поверхню бульйону для створення анаеробіозу наносять шар розплавленого парафіну. Після 72-годинної інкубації при 37 °C визначають склад мікробіому на структурах, що моделюють основні біотопи щелепи - вільну та кореневу поверхню зуба, м'які тканини, ясенну щілину та планктонну фазу росту мікроорганізмів, тобто мікроскопічному дослідженню підлягають мазки з поверхонь зуба, тканини печінки, поверхні колагенової нитки, із щілини між ниткою та поверхнею зуба та з бульйону. Фактори вірулентності досліджують наступним чином. Колагеназну активність визначають за мікроскопічними змінами структури колагенової нитки, а також за її механічним властивостями - стійкості до розриву, котру визначають динамометром. Присутність лецитинази в середовищі визначають на жовтковосольовому агарі шляхом внесення культуральної рідини у 5-міліметрові виїмки в агарі з наступним визначенням діаметру зони дії лецитинази. Гемолізини визначають шляхом внесення різних доз культуральної рідини в пробірки з наступним внесенням еритроцитів людини. Цитотоксичні властивості виявляють за дією на культуру клітин, а лейкотоксичні - за дією на лейкоцити людини. Оскільки герметизацію посівів у пробірці здійснюють за допомогою парафіну, культуральну рідину можна забирати в динаміці досліджень шприцом з голкою, після чого герметичність парафінового корка легко відновлюють. Для створення і підтвердження достовірності та ефективності пропонованого способу було проведено дослідження складу мікробіому у залежності від умов культивування. Посів від пацієнтів з запальними процесами м'яких тканин (ясна) з ясенної борозенки здійснювали у три пробірки із середовищем для культивування анаеробів. У першій пробірці містилось тільки середовище. У другу пробірку додавали гентаміцин до концентрації 20 мкг/мл: при цій концентрації пригнічується ріст факультативно-анаеробної мікрофлори (ФАМФ), але ростуть грамнегативні бактерії родів Bacterioides, Prevotella, Porfiromonas, Fusobacteria. У третій пробірці метронідазолом 20 мкг/мл затримували ріст анаеробної мікрофлори (АМФ); при цьому аеробна та ФАМФ мікрофлора розмножувались. Після 72 годин культивування готували мазки з рідкої (планктонної) фази, поверхні зуба, поверхні зуба під колагеновою ниткою та з поверхні кусочків печінки. Після фарбування за Грамом визначали морфотинкторіальні типи елементів мікробіому. Виділено 6 основних типів, які виявлялися при всіх дослідженнях. До типу "1" віднесено гармпозитивні коки скупченнями, ланцюжками, попарно чи поодинці. Цей тип включав стафілококи, стрептококи та грампозитивні диплококи. До типу "2" віднесені грамнегативні коки. Тип "3" складали грамнегативні паличкоподібні монобактерії, переважно ешеріхії та клебсієли. До типу "4" віднесено грамнегативні поліморфні палички, включно з веретеноподібними фузобактеріями. Тип "5" складали довгі ниткоподібні грамнегативні бактерії Leptotrix або лактобактерії. Дріжджеподібні гриби віднесено до типу "6". Таблиця 1 Морфологічні типи елементів мікробіому в залежності від умов культивування Складові моделі Умови культивування Без антибіотика 3 гентаміцином Морфотип Планктонна фаза 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 +++ + + + ++ ++ ++ ++ 2 Поверхня зуба під Поверхня зуба колагеновою ниткою ++++ + + + + +++ ++ ++ + + +++ ++++ + + Тканина печінки ++ + +++ ++ + +++ + UA 109350 U Продовження таблиці 1 3 метронідазолом 1 2 3 4 5 6 +++ + ++ +++ + + + ++++ + ++++ + + + Примітка: «++++» - морфоелемент одного типу, інші морофоелементи відсутні або поодинокі; «+++» - морфоелемент переважає; «++» - морфоелемент у меншості; «+» -морфоелемент як поодинокі клітини; «-» - морфоелемент відсутній. 5 10 15 20 Як видно з Табл. 1, на окремих складових запропонованої моделі розвиваються різні мікробіоценози в залежності від умов культивування. У планктонній фазі в анаеробних умовах розмножуються переважно ФАМФ - коки та дріжджеподібні гриби (морфотипи 1 та 6). На поверхні зуба розмножуються бактерії з вираженими адгезивними властивостями - морфотипи 1 та 5. Під колагеновою ниткою виявляються поліморфні грамнегативні бактерії - морфотип 4. У середовищі з гентаміцином, який пригнічує ріст ФАМФ, створюються умови для розмноження неклостридіальних анаеробів (морфотип 4), що переважають на поверхні зуба, під колагеновою ниткою, у тканині печінки, а кількість їх у планктонній фазі незначна. У середовищі з метронідазолом, який пригнічує ріст грамнегативних бактерій, всюди переважають грампозитивні коки. Морфотипи 2 та 3 у всіх складових моделі практично не зустрічались або зустрічались як поодинокі клітини. Таким чином, у запропонованій моделі створюються умови для розвитку різних мікробних угрупувань, які близькі до мікробіоценозів поверхні зуба та ясен. Для дослідження колагеназної активності проводили посіви за вказаною вище методикою від хворих з ураженнями м'яких тканини щелеп - гінгівітом та пародонтитом. Посів проводили у три пробірки запропонованої моделі: 1-ша без антибіотика, 2-га - з гентаміцином, 3-тя - з метронідазолом. У контрольну пробірку матеріал з мікроорганізмами не вносили. Усі пробірки містили колагенову нитку, фіксовану на зубі. Після 72-годинної інкубації проведено мікроскопічне дослідження колагенової нитки, а також визначення її міцності динамометром TIRA test 2200. Виявлено мікроскопічні зміни колагенової нитки, які полягали у порушенні структури, розривів поверхні та деформаціях (Фіг. 1). На нитці колагену (контроль), що не піддавалась дії мікроорганізмів, волокна щільні, поверхня без видимих порушень (Фіг. 2). Результати дослідження міцності на розрив показані в Табл. 2. Таблиця 2 Вплив модельних мікробіоценозів на міцність колагенової нитки Умови культивування Міцність на розрив, у ньютонах (Н) Без антибіотика 3 гентаміцином 3 метронідазолом Без мікроорганізмів (контроль) 6,68±0,2 15,21±0,9 35,51±1,4 50,13±1,2 25 30 35 Як видно з даних, представлених у Табл. 2, мікробіоценози, що розвивались в різних умовах культивування, спричиняли виражений вплив на структуру колагену, що проявилась у зменшенні міцності нитки. У змішаних мікробіоценозах, де розвивалась ФАМФ разом з АМФ, міцність нитки на розрив становила 6,68±0,2 Н, тобто у 7 раз нижчою, ніж у контролі, де вона становила 50,13±1,2 Н. В культурах з гентаміцином, де розвивались анаеробні мікроорганізми, міцність нитки становила15,21±0,9 Н, тобто зменшувалась у 3,2 рази. У культурах, де розвивались факультативно-анаеробні мікроорганізми, міцність нитки зменшувалась у 1,5 рази. Таким чином, проведені дослідження показують, що запропонована модель забезпечує розвиток мікробіоценозів, які мають колагеназну активність. Така активність є одним з найважливішим факторів вірулентності пародонтопатогенних мікроорганізмів [Румянцев В.А., 3 UA 109350 U 5 10 15 20 Жигулина В.В. Матриксные металлопротеиназы, их роль в развитии пародонтита // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. - 2014. - №. 8-1. - С.321-327.]. Одержані дані вказують, що найбільша колагеназна активність відмічається у змішаних культурах, у яких розвиваються факультативно-аеробні мікроорганізми кокової групи та анаероби, що відповідає сучасним даним про вплив мікробіомів ротової порожнини на тканини пародонту [Mariano Sanz, Arie Jan van Winkelhoff. Periodontal infections: Understanding the Complexity-Consensus of the Seventh European Workshop on Periodontology. - Journal of Clinical Periodontology. - 20011. - V.38-P. 3-6]. Досліджували також продукцію гемолізинів у експериментальних мікробіоценозах. Гемолізини продукуються багатьма видами бактерій, що входять до складу мікробіомів порожнини рота та зубної бляшки - стафілококів, стрептококів, деяких варіантів ешеріхій. Нами досліджувалось нагромадження гемолізинів у планктонній фазі при культивуванні мікроорганізмів зубної бляшки та пародонтальних кишень у запропонованій моделі. Культивування проводили в присутності гентаміцину або метронідазолу, а також - без антибіотиків. Проби культуральної рідини відбирали через 24, 48 та 72 години після посіву. Гемолітичну активність визначали щодо еритроцитів людини групи І(А). У пробірки вносили культуральну рідину від 0,1 до 1 мл, об'єм доводили до 1 мл ізотонічним розчином хлориду натрію, після чого вносили 1 мл 1 % суспензії еритроцитів. Гемолітичну активність визначали після одногодинного витримування в термостаті за 100 % гемолізом. Результати досліджень показані в Табл. З, приведені в ній цифрові показники оцінюються як зворотні показники активності гемолізинів, тобто більше числове значення вказує на нижчу активність гемолізинів. Таблиця 3 Гемолітична активність мікробіоценозів у експериментальній моделі Умови культивування Без антибіотиків 3 гентаміцином 3 метронідазолом 25 30 35 40 Мінімальна кількість рідини в мл, що викликає 100 (середній показник із 6 дослідів) 24 год. 48 год. 0,73±0,03 0,31±0,05 0,81±0,03 0,40±0,05 % гемоліз 72 год. 0,17±0,01 0,82±0,07 0,23±0,02 Приведені в Табл. 3 дані вказують, що в рідкій фазі середовище, де культивувались мікроорганізми з ясенної щілини та зубної бляшки, нагромаджувались гемолізини. Через 24 години культивування 100 % гемоліз викликала доза 0,73 мл, яка одержана з культур, вирощених без антибіотиків. У середовищі з гентаміцином, де ФАМФ не розвивалась, гемолітичної активності не виявлено. У середовищі з метронідазолом, у якому затримувався ріст анаеробної мікрофлори, активність гемолізинів була дещо нижчою: 100 % гемоліз забезпечувався дозою 0,81 мл. Через 48 годин активність гемолізинів наростала, повний гемоліз забезпечувала доза в 2-2,3 рази менша. Через 72 годин повний гемоліз забезпечувався дозою в 3 рази нижчою, ніж після 24- годинного культивування. Одержані дані вказують, що гемолітична активність мікробіоценозів у запропонованій моделі залежить від ФАМФ, ріст якої затримується гентаміцином. Мікробний фермент лецитиназа належить до фосфоліпаз і відноситься до факторів вірулентності з цитотоксичними властивостями, що продукуються аеробними, ФАМФ та АМФ [Юрченко Л.А. Новые методические подходы к определению гемолитической и лецитиназной активности бактерий рода Proteus II Вестник Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина. Серия "Медицина". - 2011. - № 21. - С. 9-15]. Для виявлення лецитиназної активності культуральну рідину з планктонної фази експериментальних мікробіоценозів вносили до виїмок діаметром 5 мм у жовтково-сольовому агарі - середовищі, яке використовується для визначення лецитиназної активності. Після 24 годин інкубації визначали радіус зони просвітлення середовища від краю виїмки до кільця із зниженою прозорістю. Результати показані в Табл. 4. 45 4 UA 109350 U Таблиця 4 Лецитиназна активність у культуральній рідині мікробіоценозів Умови культивування Без антибіотиків 3 гентаміцином 3 метронідазолом 5 10 Лецитиназна активність у культуральній рідині (Радіус зони активності в мм) 24 год. 48 год. 72 год. 3,4±0,3 4,1±0,6 6,3±0,7 2,1±0,1 3,0±0,3 4,8±0,4 1,9±0,1 3,0±0,3 4,4±0,4 Одержані результати показують, що лецитиназна активність виявляється у всіх експериментальних мікробіоценозах, проте найвища активність відмічена у системі без антибіотиків, де розмножувалась ФАМФ і АМФ. При дослідженні через 24 і 72 годин лецитиназна активність зростала від 3,4±0,3 мм до 4,8±0,6 мм і 6,3±0,7 мм відповідно. Наростання лецитиназної активності в 1,4-4,2 рази відмічено в системі, де розвивались анаеробні мікроорганізми. У середовищі, в якому розмножувались аеробні мікроорганізми, лецитиназна активність на 24-тій годині культивування становила 1,9±0,1 мм і зростала в 1,4-2,3 рази. Отже, в експериментальних мікробіоценозах, що розвивались після посіву матеріалу з м'яких тканин та зубної бляшки, виявлялась лецитиназна активність, яка є показником вірулентності мікрофлори. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб моделювання in vitro мікробіомів ротової порожнини для визначення факторів вірулентності пародонтопатогенних мікроорганізмів, що включає використання моделі твердої тканини зуба, який відрізняється тим, що у пробірці розміщують рідке середовище з факторами росту або антимікробними засобами, тверду фазу у вигляді розрізаного вздовж зуба людини, на котрому спірально фіксують нитку колагену, фазу з тканини печінки та створюють анаеробні умови для культивування шляхом внесення розплавленого парафіну на поверхню середовища з наступним дослідженням факторів вірулентності пародонтопатогенних мікроорганізмів, наприклад, активності колагенази, гемолізинів, лецитинази. 5 UA 109350 U Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6