Спосіб морфологічної діагностики туберкульозної інфекції

Реферат: Спосіб морфологічної діагностики туберкульозної інфекції, при якому виконують гістологічне дослідження біологічного матеріалу зі здійсненням його стандартної фіксації в 10 %-му нейтральному формаліні, приготування зрізів та їх обробку антитілом до Mycobacterium tuberculosis, мікроскопію отриманих зразків з визначенням антигенів Mycobacterium tuberculosis у легеневій тканині. Досліджують біоптати бронхів та/або фрагменти легеневої тканини, здійснюючи їх проводку у висхідних розчинах спиртів та заливку в парафінові блоки, проводять імуногістохімічне фарбування гістопрепаратів з використанням автостейнера з обробкою останніх промисловим поліклональним антитілом до Mycobacterium tuberculosis та наступним дозабарвленням зрізів вручну гематоксиліном і заключенням їх у бальзам, мікроскопічне дослідження отриманих гістопрепаратів проводять на світловому мікроскопі при збільшенні 100, 400 та 1000 і при визначенні інтенсивного жовто-коричневого або коричневого грудкового забарвлення цитоплазми у клітинах, позаклітинних скупчень таких грудочок та виявленні позаклітинних скупчень паличок світло-коричневого кольору з червоною опалесценцією - діагностують туберкульозну інфекцію, а при відсутності таких ознак чи при виявленні фонового забарвлення у вигляді жовтуватого кольору позаклітинної рідини, незначної кількості клітин із слабким жовтуватим дифузним однорідним забарвленням їх цитоплазми - відсутність туберкульозної інфекції. UA 118754 U (12) UA 118754 U UA 118754 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до фтизіатрії і патологічної анатомії, і може бути використана для морфологічної діагностики туберкульозної інфекції у біопсійному матеріалі, отриманому від пацієнта при малоінвазивних діагностичних дослідженнях, та в операційному матеріалі. Характерною рисою сучасної медицини є встановлений факт виразного патоморфозу як клінічних проявів, так і перебігу легеневого туберкульозу (ТБ). В останні десятиріччя у значній кількості випадків, особливо у дітей та людей літнього віку, осіб з порушеним імунітетом відмічаються нетипові клінічні ознаки захворювання, його розвиток часто має стерті прояви хвороби. Окрім цього зростає кількість випадків позалегеневого туберкульозу, діагноз якого потребує об'єктивної верифікації, особливо на тлі ВІЛ-інфекції (див. G.Т. Programme, Global Tuberculosis Control: WHO Report: Global Tuberculosis Programme / World Health Organization, 2010. [Електронний ресурс]. Режим доступу: http://reliefweb.int/sites/reliefweb.int/files/resources/F530290AD0279399C12577D8003E9D65Full_Report.pdf). Наразі проблема швидкої та своєчасної діагностики туберкульозної інфекції не втрачає своєї актуальності в усьому світі, про що свідчать сучасні численні публікації та патентні документи. Сучасна діагностика туберкульозу включає стандартне рентгенологічне дослідження у разі легеневого туберкульозу, широкий набір мікробіологічних методів дослідження наявного біологічного матеріалу (мікроскопія, культуральні дослідження на різних поживних середовищах), молекулярно-генетичні дослідження, імунологічні дослідження (див. Ryu, Y. J. Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis: Recent Advances and Diagnostic Algorithms [Текст] / Ryu, Y. J. // Tuberc. Respir. Dis. - 2015. - Vol. 78. - P. 64-71). За сучасним визначенням ВООЗ, лабораторна діагностика туберкульозу та визначення стійкості МБТ до протитуберкульозних препаратів є однією із головних складових у всесвітній програмі боротьби з туберкульозом. Вважають, що одним із найбільш ефективних методів виявлення мікобактерій є полімеразна ланцюгова реакція (ПНР) (див. Эллиниди В.Н. Иммуногистохимический метод в диагностике туберкулеза [Текст] / Эллиниди, В. Н. [и др.] // Архив патологии. - 2007. - № 5. - С. 36-38). Але цей метод потребує спеціально обладнаних приміщень, вартісного специфічного обладнання, вартісних розхідних матеріалів та належної кваліфікації дослідника. Окрім цього ні один із вищезгаданих діагностичних методів не забезпечує 100 % точності встановлення діагнозу. Гістологічна діагностика ТБ залишається певною мірою дискусійним питанням в загальній діагностиці туберкульозу. Враховуючи доведені обмеження рівнів чутливості та специфічності при забарвленні гістологічних зразків за Цілем-Нільсеном, необхідності визначення мікобактерій, реальних можливостей культуральних мікробіологічних досліджень та наявні молекулярні та серологічні технології, гістоморфологічний аналіз залишається єдиним можливим методом діагностики ТБ лише в окремих пацієнтів. Хоча, слід відмітити, що нещодавні дослідження показали, що результати ПЛР є прийнятними лише тоді, коли присутність М. tuberculosis (МБТ) можливо підтвердити в ураженій тканині гістологічним дослідженням (див. Ulrichs, T. Modified immunohistological staining allows detection of Ziehl-Neelsen-negative Mycobacterium tuberculosis organisms and their precise localization in human tissue [Text] / Ulrichs, T. [et al.] // J. Pathol. - 2005. - Vol. 205. - P. 633-640). Виявлення ланцюжків з бацил, які частіше спостерігаються в некротичних вогнищах при фарбуванні зразків тканини за Цілем-Нільсеном, вказує на асоціацію тканинної реакції з туберкульозною інфекцією. Але забарвлення за Цілем-Нільсеном виказує відносно низьку чутливість щодо виявлення МБТ, діапазон позитивних результатів становить 0-44 %. Більш цього необхідна присутність мінімум 10 одиниць збудника у одному зразку (або в 1 мл) для встановлення діагнозу. Натепер виявлення антигенів МБТ із застосуванням імуногістохімічного (ІГХ) дослідження є досить добре розробленою технологією з її переважним застосуванням у дослідницьких проектах. Базисом для таких досліджень стали відомості щодо продукції значної кількості поліклональних та моноклональних антитіл у специфічних тканинних реакціях за присутності М. tuberculosis. Низка проведених досліджень показала, що чутливість такого дослідження може складати від 64 до 100 % щодо виявлення МБТ при застосуванні різних специфічних антитіл до мікобактерій (див. Goel, М. М. Immunohistochemical localization of mycobacterium tuberculosis complex antigen with antibody to 38 kDa antigen versus Ziehl Neelsen staining in tissue granulomas of extrapulmonary tuberculosis [Text] / M. M. Goel, P. Budhwar // The Indian journal of tuberculosis. 2007. - Vol. 54, № 1. - P. 24-29). 8 Відомий спосіб діагностики туберкульозу (див. Пат. 2525428 Российская Федерация, МПК G01N 33/53. Способ диагностики туберкулеза [Текст] / Насыров Р. А. [и др.]; заявитель и патентовладелец Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический 1 UA 118754 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России). - № 2012147415/15; заявл. 07.11.12; опубл. 10.08.14, Бюл. № 22. - 1 с.), який полягає у проведенні імуноцитогістохімічного дослідження та виявленні експресії антигену мікобактерії туберкульозу. Спосіб характеризується тим, що досліджують біологічний матеріал, розміщений на предметне скельце, за допомогою модифікованого імуноцитогістохімічного методу, який має наступні етапи: отримання біологічного матеріалу мазків/шкребків, клітинних осадів біологічних рідин, фіксацію їх в ацетоні; обробку 1 % розчином біхромату калію з наступною обробкою 3 % розчином перекису водню, нанесення моноклональних антитіл до РАВ-антигену мікобактерії туберкульозу у розведенні 1:20; інкубацію при температурі 3-5 °C протягом 12 годин, нанесення системи детекції EnVision та інкубацію при кімнатній температурі, нанесення діамінобензидину; дофарбування гематоксиліном, заключення у бальзам чи інше середовище, мікроскопію і діагностику хвороби при виявленні антигену мікобактерії туберкульозу. Але недоліками запропонованого способу є: - дослідження потребує отримання окремих клітин, а не власне тканини як мультиклітинної структури. Слід зазначити, що існують об'єктивні особливості морфологічних проявів туберкульозного запалення різних тканин і систем організму людини, зокрема залежно від тривалості його розвитку та будови конкретного враженого органу. При наявності дрібних біоптатів різних тканин вони не завжди містять мікобактерії навіть при істинному туберкульозному ураженні; - потребує наявності моноклональних антитіл до РАВ-антигену мікобактерії туберкульозу; - використовується нативний біологічний матеріал, а не загальновживані парафінові блоки з фіксованим матеріалом, який швидко псується і його можна використовувати лише протягом години з моменту отримання, а гістологічні блоки зберігаються роками; - оцінка результатів переважно базується на виявленні цілісних структур бактерій, але вони не завжди наявні у біологічному матеріалі. Як прототип вибраний спосіб імуногістохімічного виявлення М. tuberculosis у тканині легень хворих на туберкульоз із використанням лазерної скануючої мікроскопії (див. Иммуногистохимическое выявление Mycobacterium tuberculosis в ткани легких у больных туберкулезом с использованием лазерной сканирующей микроскопии [Текст] / М.В. Ерохина, Л.П. Незлин, В.Г. Авдиенко, Е.Е. Воронежская, Л.Н. Лепеха // Известия РАН. Серия биологическая. - 2016. - № 1. - С. 1-5.). При здійсненні зазначеного способу вирізані шматочки операційного матеріалу (сегмент, частка або ціла легеня) піддають фіксації у розчині 4 % параформальдегіду (Sigma, США) в 10 мМ сольовому фосфатному буфері (PBS) з рН=7,4 протягом 1 доби при 10° С, промивають тричі протягом 30 хв. в PBS, просякають 2 години у 30 % розчині сахарози з метою кріопротекції, поміщають у середовище "Jung tissue-freezing medium" та отримують зрізи товщиною 50-60 мкм на кріостаті CM 1900 (Leica, Німеччина). Далі оброблюють вільно плаваючі зрізи. З метою отримання поліклональних антитіл проводять імунізацію кроля суспензією опромінених М. tuberculosis штаму H37R.V в ад'юванті Фрейнда. Отриману сироватку афінно очищають методом хроматографії на сорбенті Separose CL6B з ковалентно-зв'язаними антигенами М. tuberculosis H37Rv, які попередньо піддають ультразвуковій обробці. Перехресну реакцію афінно-ізольованих імуноглобулінів пригнічують адсорбцією на такому ж сорбенті з антигенами М. tuberculosis fortuitum. Імуноглобуліни концентрують ультрафільтрацією та зберігають при -20 °C. Проводять демаскування антигену. Для цього зрізи інкубують у розчині метанолу в PBS, спочатку підвищуючи, а потім знижуючи концентрацію метанолу (30-50-70-50-30 %), тривалістю 10 хв при кімнатній температурі та відмивають в PBS тричі протягом 10 хв. Далі зрізи інкубують у розчині первинних антитіл (розведення 1:200 від початкової концентрації в PBS з 1 % Triton X100 (PBS-TX) і 0,25 % bovine serum albumin (BSA)) протягом 1 доби при 10 °C, з наступним відмиванням у PBS-TX тричі по 10 хв та інкубують у розчині goat-anti-rabbit-Alexa-488 або goat anti-rabbit-Alexa-555 IgG (номери за каталогом відповідно А-11008 та А-21428) (Molecular Probes, США). Далі зрізи знову промивають тричі по 10 хв в PBS та поміщають у 80 % гліцерин або TDE (1,1-Dichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane) (Sigma). У низці випадків у заключне середовище додають 3 мкг/мл DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole; D1306) (Molecular Probes) для маркування ядер клітин. Контролем є зразки приготування препаратів за вище представленою схемою, але без первинних антитіл, які заміняють на відповідну кількість нормальної кролячої сироватки. При цьому повністю зникає специфічне світіння. Використання двох різних вторинних антитіл, що були кон'юговані Аіеха-488 і Аіеха-555 не впливало на кінцевий результат. Препарати вивчали під лазерним скануючим мікроскопом TCS SPE (Leica), оснащеним відповідним набором збуджуючих лазерів та фільтрів. Отримані стопки оптичних зрізів 2 UA 118754 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 записували в комп'ютер та будували тривимірні зображення, які аналізували за допомогою програмних пакетів Leica LAS AF та Imaris (Bitplane, Швейцарія). Для ілюстрацій створювали плоску проекцію зі збільшеною глибиною фокусу (full focus), після чого зображення імпортували в програму Adobe PhotoShop (США). В отриманих зображеннях модифікували лише яскравість та контраст. Усі флуоресцентні зображення були представлені у вигляді негативів. Спектри флуоресценції об'єктів аналізу порівнювали зі спектром флуорохрома Alexa-488 (https://www.lifetech-nologies.com/ru/ru/home/life-science/cell-analysis/labelingchemistry/fluorescence-spectraviewer. html). Але основними недолікам способу можна вважати наступне: - вкрай трудомісткий повний цикл дослідження; - нестандартна методика проводки шматочків тканини, для здійснення якої потрібні спеціальні вартісні розчини, кріотом, спеціальна холодильна камера тощо; - необхідність як значної низки іноземних вартісних реактивів, так і різного високовартісного обладнання для обробки тканини, зокрема для хроматографії, і дуже дорогого мікроскопа для скануючого мікроскопічного аналізу препаратів. До того ж, первинні антитіла готують власноруч і при кожному новому їх приготуванні високо ймовірні незначні відхилення якості кінцевого продукту. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб морфологічної діагностики туберкульозної інфекції, в якому шляхом забарвлення окремих гістологічних структур та/або клітин з використанням автостейнера та обробкою їх промисловим поліклональним антитілом до Mycobacterium tuberculosis визначають наявність або відсутність антигенів Mycobacterium tuberculosis у легеневій тканині, що дозволяє стандартизувати та технологічно спростити гістологічне дослідження. Поставлена задача вирішується тим, що у способі морфологічної діагностики туберкульозної інфекції, який включає гістологічне дослідження біологічного матеріалу зі здійсненням його стандартної фіксації в 10 %-му нейтральному формаліні, приготування зрізів та їх обробку антитілом до Mycobacterium tuberculosis, мікроскопію отриманих зразків з визначенням антигенів Mycobacterium tuberculosis у легеневій тканині, згідно з корисною моделлю, досліджують біоптати бронхів та/або фрагменти легеневої тканини, здійснюючи їх проводку у висхідних розчинах спиртів та заливку в парафінові блоки, проводять імуногістохімічне фарбування гістопрепаратів з використанням автостейнера з обробкою останніх промисловим поліклональним антитілом до Mycobacterium tuberculosis та наступним дозабарвленням зрізів вручну гематоксиліном і заключенням їх у бальзам, мікроскопічне дослідження отриманих гістопрепаратів проводять на світловому мікроскопі при збільшенні х100, х400 та х1000 і при визначенні інтенсивного жовто-коричневого або коричневого грудкового забарвлення цитоплазми у клітинах, позаклітинних скупчень таких грудочок та виявленні позаклітинних скупчень паличок світло-коричневого кольору з червоною опалесценцією - діагностують туберкульозну інфекцію, а при відсутності таких ознак чи при виявленні фонового забарвлення у вигляді жовтуватого кольору позаклітинної рідини, незначної кількості клітин із слабким жовтуватим дифузним однорідним забарвленням їх цитоплазми відсутність туберкульозної інфекції. Спосіб здійснюють наступним чином. На етапі отримання біопсійного або хірургічного матеріалу (фрагментів бронхів та/або фрагментів легень), проводять традиційну вирізку матеріалу - вирізають шматочок легеневої тканини з найбільш візуально представленими патологічними змінами. Дрібні біоптати або вирізані шматочки фіксують у розчині забуференного нейтрального 10 %-го формаліну протягом 1-2 діб, а потім піддають стандартній проводці у висхідних розчинах спиртів, остаточно обезводнюють у хлороформі та заливають у парафінові блоки. З усіх парафінових блоків виготовляють по два серійні зрізи тканини товщиною 4-5 мкм, кожен з яких окремо розміщують на адгезивне скельце. Далі проводять автоматичну обробку зрізів. Імуногістохімічне дослідження проводять з використанням автостейнера AUTOSTAINER 360-2D виробництва компанії Thermo Fisher Scientific (США) та реактиву компанії Thermo Fisher Scientific Mycobacterium tuberculosis Antibody; робоче розведення 1:2500. Усі робочі розчини - також промислового виробництва (США). Розведення початкового розчину антитіла до М. tuberculosis підбиралося дослідним шляхом, згідно з рекомендаціями фірми-виробника. В роботі застосовували нову високочутливу систему візуалізації UltraVision Quanto на основі комбінації ферменту і мікрополімеру, виробництва компанії LabVision, яка дозволила використовувати вищезазначене розведення. Як контроль використовували серійні зрізи цих же випадків, але без додавання в процесі фарбування антитіла до М. tuberculosis. 3 UA 118754 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Протокол фарбування для автостейнера AUTOSTAINER 360-2D наступний: 1. Проводять демаскування зрізів - розміщення зрізів у PT-Module в буфері Dewax and HIER buffer з рН=6,0 (час нагріву 20 хвилин, початкова температура - 65 °C, кінцева - 98 °C), після чого скельця зі зрізами охолоджуються до початкової температури (65 °C), далі їх поміщають у TBST-буфер з рН=7,4 на 5 хвилин. 2. Зрізи переміщають в автостейнер AUTOSTAINER 360-2D, де і відбувається власне імуногістохімічне фарбування. 3. Проводять інкубацію зрізів з гідрогенпероксидним блоком (UltraVision Hydrogen Peroxide Block) протягом 10 хвилин. 4. Промивають у TBST-буфері з рН=7,4. 5. Проводять інкубацію зрізів протеїновим блоком (UltraVision Protein Block) протягом 5 хвилин. 6. Після цього обробляють поліклональним антитілом до Mycobacterium tuberculosis (робоче розведення 1:2500) лише один дослідний зріз, другий зріз (контроль) обробляють лише розчином для розведення антитіла (Antibody Diluent OP Quanto), після чого інкубують протягом 20 хвилин. 7. Промивають TBST-буфером з рН=7,4. 8. Оброблюють Primary Antibody Amplifier Quanto та інкубують протягом 10 хвилин. 9. Знову промивають у TBST-буфері з рН=7,4. 10. Обробляють HRP Polymer Quanto та інкубують протягом 10 хвилин. 11. Промивають TBST-буфером з рН=7,4 та дистильованою водою. 12. Змішують 30 мкл (1 крапля) DAB Quanto Chromogen з 1 мл DAB Quanto Substrate, і обробляють цим розчином тканину. Інкубують протягом 5 хвилин. 13. Промивають дистильованою водою. 14. Далі проводять дозабарвлення зрізу вручну гематоксиліном Харріса, проводку у висхідних спиртових розчинах та заключення у бальзам під покривне скельце. Здійснюють мікроскопічне дослідження отриманих гістопрепаратів на світловому мікроскопі при збільшенні 100, 400 і 1000. Результати ІГХ дослідження оцінювали, враховуючи відносну кількість (рівень експресії) антиген-позитивних клітин, з урахуванням типу клітин, зокрема виділяли типові макрофаги, моноцити, епітеліоїдні клітини та гігантські багатоядерні клітини, а також позаклітинне розміщення забарвленого субстрату. При чіткому визначенні інтенсивного жовто-коричневого або коричневого грудчастого забарвлення цитоплазми у клітинах, позаклітинних скупчень таких грудочок та виявленні позаклітинних скупчень паличок світло-коричневого кольору з червоною опалесценцією діагностують туберкульозну інфекцію, а при відсутності таких ознак чи при виявленні фонового забарвлення у вигляді жовтуватого кольору позаклітинної рідини, незначної кількості клітин із слабким жовтуватим дифузним однорідним забарвленням їх цитоплазми, відсутність туберкульозної інфекції, відповідно до подібних досліджень (див. Karimi, S. Histopathological findings in immunohistological staining of the granulomatous tissue reaction associated with tuberculosis / Karimi S. [et al.] // Tuberculosis Research and Treatment. - 2014. Article ID 858396, 6 pages. [Електронний ресурс]. Режим доступу: http://dx.doi.org/10.1155/2014/858396). У випадках присутності інтенсивного жовтогарячого забарвлення позаклітинних просторів або ж такого забарвлення масиву клітин, наявності коковидних форм мікроорганізмів висновок не робиться (характер змін не визначений). Контрольний зріз має бути без специфічного забарвлення. Наводимо конкретні приклади застосування способу. Приклад 1. Хворий С-к М.О., 8 років, історія хвороби № 1103-2015, госпіталізований до відділення туберкульозу органів дихання у дітей ДУ "Національний інститут фтизіатрії і пульмонології ім. Ф. Г. Яновського НАМН України" із діагнозом - ВДТБ (27.01.2015) обох легень, дисемінований. ВГЛВ зліва. Дестр. (-), МБТ (-), М (-), К (-), МГ (-), Рез (0), Гіст. (0), Кат. 1, Ког. 1 (2015). У ході обстеження дитини, а саме - під час проведення діагностично-лікувальної фібробронхоскопії (ФБС), виявлений інфільтрат лівого нижньо-дольового бронху, отриманий біопсійний матеріал. Після проведення традиційного гістологічного дослідження матеріалу зроблений висновок гострий продуктивний запальний процес, підозра на туберкульозну етіологію процесу. Згідно із запропонованим способом, здійснили ІГХ дослідження серійного зрізу біопсії. При цьому в матеріалі були виявлені значних розмірів грубі гранулярні скупчення коричнево-жовтого кольору на тлі некротизованої тканини та клітин запального ряду. При збільшенні мікроскопа х1000 з імерсією виявлені скупчення паличкоподібних мікроорганізмів світло-коричневого кольору з 4 UA 118754 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 червоною опалесценцією. Заключний діагноз: туберкульозна інфекція. Активний запальний процес. Заключний клінічний діагноз: ВДТБ (27.01.2015) обох легень, дисемінований. Дестр. (-), МБТ (-), М (-), К (-), МГ (-), Рез (0), Гіст. (+), Кат. 1, Ког. 1 (2015). Інфільтративний туберкульоз лівого нижньо-дольового бронху. Приклад 2. Хвора А-а Л. А., 60 років, історія хвороби № 5315-2015, госпіталізована до відділення інтерстиціальних та обструктивних захворювань легень у хворих на туберкульоз ДУ "Національний інститут фтизіатрії і пульмонології ім. Ф. Г. Яновського НАМН України" з діагнозом - дисемінований процес у легенях неясної етіології. Проведення діагностики включало виконання діагностичної ФБС з біопсією. Після проведення традиційного гістологічного дослідження біопсійного матеріалу виявлені морфологічні ознаки, характерні для саркоїдозу. Згідно із запропонованим способом, за результатами ІГХ дослідження в легеневій тканині чіткої експресії антигенів МБТ не виявлено. Мало місце слабке фонове забарвлення ексудату. Заключний діагноз: туберкульозна інфекція відсутня. Заключний клінічний діагноз: Саркоїдоз органів дихання, III ст., вперше виявлений. ЛН 0 ст. Принципово важливим у клінічній практиці є визначення мікобактеріальної інфекції ще на етапі діагностичної ФБС з біопсією, оскільки це малоінвазивна методика, яка може проводитися широкому загалу пацієнтів різного віку (має вузький спектр обмежень щодо застосування). Зокрема цей метод прийнятний і для дітей, у яких дуже важко отримати біологічний матеріал для дослідження іншим шляхом. Всього було обстежено 36 пацієнтів. При гістологічному дослідженні препаратів біопсій, отриманих при діагностичній ФБС, та з ІГХ дослідженням, серед усіх 36 випадків у 6 випадках (7,9 %) мав місце клінічний діагноз туберкульозу легень, у 6 випадках - не туберкульозний процес та у 21 випадку - проводилася диференційна діагностика, у тому числі - з туберкульозним процесом. При ІГХ дослідженні серійних зрізів тканини біопсій цих випадків у 6 випадках з попереднім діагнозом "туберкульоз" та у позитивному контролі підтверджено наявність туберкульозної інфекції, в 6 випадках з попереднім діагнозом не туберкульозної етіології та у 2-х контрольних спостереженнях підтверджена відсутність інфекції, та ще у 13 випадках диференційної діагностики - в 11 випадках визначена присутність туберкульозної інфекції та у 2-х випадках - її відсутність. У 8 випадках кінцевий результат був невизначений, зокрема внаслідок дуже малої кількості матеріалу біопсії або ж її не інформативності. Морфологічні ознаки наявності антигенів М. tuberculosis у легеневій тканині, при забарвленні зрізів тканини за вищепредставленою методикою, уточнені дослідним шляхом при дослідженні гістопрепаратів 7 випадків туберкульозу легень, з мікробіологічною верифікацією діагнозу в цих випадках. Отримані наступні показники стандарту діагностики: чутливість дослідження склала 90,0 %, специфічність - 60,0 %, діагностична цінність - 75,0 % та загальна ефективність діагностики 77,78 %. Отримані показники цілком співставні з найкращими значеннями сучасних аналогічних показників (див. Kumar, R. Role of bronchoscopy in evaluation of cases with sputum smear negative pulmonary tuberculosis, interstitial lung disease and lung malignancy: A retrospective study of 712 cases [Text] / R. Kumar, N. Gupta // Indian J. Tuberculosis. - 2015. - Vol. 62. - P. 36 2). У порівнянні із прототипом спосіб, що заявляється, дозволяє: - досліджувати дрібні біоптати, отримані при малоінвазивних діагностичних процедурах, зокрема при фібробронхоскопії з біопсією бронхів та/або легені; - використовувати традиційні фіксацію та проводку біологічного матеріалу у висхідних розчинах спиртів та/або використовувати загальновживані готові парафінові блоки з біологічним матеріалом для дослідження; - стандартизувати власне процедуру фарбування шляхом застосування автостейнера та промислового антитіла до М. tuberculosis; - технологічно спростити гістологічне дослідження за рахунок виключення етапу виготовлення первинного антитіла, вартісного обладнання та великої кількості вартісних розхідних матеріалів; - спростити процедуру мікроскопічного дослідження гістопрепаратів, використовуючи найбільш розповсюджені світлові мікроскопи різного рівня. Спосіб, що заявляється, є сучасним методом гістологічної верифікації наявності туберкульозної інфекції у тканині легень людини та є доцільним для застосування у високоспеціалізованих медичних закладах фтизіо-пульмонологічного профілю, де наявні ендоскопічні відділення та/або хірургічні підрозділи (відділення) і є патоморфологічні 5 UA 118754 U лабораторії або ж патологоанатомічні відділення з відповідним оснащенням (обладнанням та реактивами для імуногістохімічного дослідження). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 20 Спосіб морфологічної діагностики туберкульозної інфекції, при якому виконують гістологічне дослідження біологічного матеріалу зі здійсненням його стандартної фіксації в 10 %-му нейтральному формаліні, приготування зрізів та їх обробку антитілом до Mycobacterium tuberculosis, мікроскопію отриманих зразків з визначенням антигенів Mycobacterium tuberculosis у легеневій тканині, який відрізняється тим, що досліджують біоптати бронхів та/або фрагменти легеневої тканини, здійснюючи їх проводку у висхідних розчинах спиртів та заливку в парафінові блоки, проводять імуногістохімічне фарбування гістопрепаратів з використанням автостейнера з обробкою останніх промисловим поліклональним антитілом до Mycobacterium tuberculosis та наступним дозабарвленням зрізів вручну гематоксиліном і заключенням їх у бальзам, мікроскопічне дослідження отриманих гістопрепаратів проводять на світловому мікроскопі при збільшенні 100, 400 та 1000 і при визначенні інтенсивного жовто-коричневого або коричневого грудкового забарвлення цитоплазми у клітинах, позаклітинних скупчень таких грудочок та виявленні позаклітинних скупчень паличок світло-коричневого кольору з червоною опалесценцією - діагностують туберкульозну інфекцію, а при відсутності таких ознак чи при виявленні фонового забарвлення у вигляді жовтуватого кольору позаклітинної рідини, незначної кількості клітин із слабким жовтуватим дифузним однорідним забарвленням їх цитоплазми відсутність туберкульозної інфекції. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6