Спосіб відбору субстанцій для цілеспрямованого пошуку оригінальних біологічно активних сполук з аналептичною активністю на моделі кетамінового наркозу

Реферат: Спосіб відбору субстанцій для цілеспрямованого пошуку оригінальних біологічно активних сполук з аналептичною активністю на моделі кетамінового наркозу включає відтворення стандартизованої моделі кетамінового наркозу на мишах, з подальшим введенням частині з них препарату порівняння, а іншій частині - субстанції, що досліджується. Для відтворення стандартизованої моделі кетамінового наркозу використовується внутрішньочеревинне введення кетаміну у дозі 150 мг/кг, як препарат порівняння може бути застосовано сульфокамфокаїн, нікетамід або інший класичний аналептик, який вводиться внутрішньочеревинно в оптимальній дозі (сульфокамфокаїн - 20 мг/кг; нікетамід - 63 мг/кг), досліджувана субстанція, як і препарат порівняння, підлягає внутрішньочеревинному введенню на піку наркозу (10-20 хвилина після прийняття твариною бокового положення) з подальшою фіксацією тривалості наркозу та динаміки частоти дихальних рухів за хвилину, а також візуальною оцінкою психоемоційного стану та фізіологічних функцій тварин після пробудження. UA 121609 U (12) UA 121609 U UA 121609 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до фармацевтичної промисловості, медицини, фармакології і може бути використана як стандарт для цілеспрямованого пошуку біологічно активних сполук з аналептичною активністю як основи для розширення актуальної але критично обмеженої групи лікарських препаратів. Аналептики - лікарські препарати, що чинять загальну стимулюючу дію на ЦНС (підсилюють процеси збудження шляхом полегшення синаптичної передачі або пригнічують гальмівні механізми). У терапевтичних дозах підвищують активність дихального та судинорухового центрів довгастого мозку, виявляють "пробуджувальний" ефект при наркозі [1, 2, 8]. Згідно статистики Всесвітньої Організації Охорони здоров'я, щорічно у світі проводиться близько 230 млн. хірургічних втручань. З них 3-16 % операцій супроводжуються постнаркозними ускладненнями, а 1-2 % закінчується інвалідністю. Смертність серед молодих пацієнтів становить 5,5 %, а серед літніх - 10,3 % [3, 4]. В Україні летальність, пов'язана з наркозом, декларується як 1 випадок на 2500 анестезій на рік [5], інші випадки післяопераційної смертності пояснюються геронтологічним фактором і наявністю супутніх системних захворювань [3, 4, 5, 6]. У світовій практиці анестезіології та реаніматології для пробудження пацієнта після наркозу використовують антагоністи наркозних препаратів - аналептики. Їх застосування спрямоване на зняття інтоксикації і зменшення побічних ефектів наркозу, пов'язаних з пригніченням ЦНС (запаморочення, головний біль, сплутаність свідомості, нудота, блювання та ін.) [4, 5, 9, 11, 12, 13]. Крім перерахованих вище випадків аналептики застосовуються також при шоку, колапсі, станах, пов'язаних з асфіксією, гіпоксією і бактеріальною інтоксикацією; при передозуванні наркотичними речовинами, отруєнні алкоголем, хімічними та лікарськими засобами, пригнічуючими функції ЦНС [4, 5, 6, 7, 8, 9, 11]. За останні 50 років арсенал аналептиків не поповнювався і налічує 6 препаратів: (бемегрид, сульфокамфокаїн, нікетамід, кофеїн, етимізол, коразол) [1, 2, 8, 9, 11, 12]. Однак, вибірковість впливу на певні структури мозку, ризик небажаних побічних ефектів, обмежена широта терапевтичної дії, досить висока токсичність різко обмежують коло їх застосування [8, 9, 11]. У реальній лікарській практиці України застосовуються тільки сульфокамфокаїн, кофеїн і нікетамід [9]. Таким чином, створення оригінальних універсальних нешкідливих аналептичних препаратів є досить актуальною проблемою хіміків, фармакологів та клініцистів [6-13]. Стихійні лиха, війни, техногенні катастрофи супроводжуються "травматичною" епідемією. При цьому різко зростає роль ургентної хірургії, ефективність якої визначається не тільки кваліфікацією хірургів, але й наявністю екстемпоральних лікарських засобів, необхідних під час операцій та реабілітаційних заходів. У польових умовах важливу роль відіграє тривалість операції, яка в значній мірі залежить не стільки від швидкості хірургічних маніпуляцій, скільки від тривалості наркозу, що дуже індивідуально і варіює в діапазоні від 30 хвилин до декількох годин. При обмеженості хірургічного та реабілітаційного персоналу це є фактором, який визначає ефективність рятувальних заходів. В арсеналі сучасної фармакології взагалі не має універсальних аналептиків широкого спектру дії, які здатні швидко, ефективно і без шкоди переривати наркоз. Наведені вище аспекти використання аналептиків налічують багато посилань з прикладами їх якісної ефективності на фоні кетамінового наркозу і не містять узагальнених методик, спроможних кількісно (статистично-достовірно) оцінити як рівень активності, так і його механізм (саме частку аналептичної дії), що унеможливлює їх використання в дослідницькій практиці на етапі первинного фармакологічного відбору. Таким чином, відсутність загального дослідницького стандарту моделі скринінгу (дозотермінових шляхів застосування досліджуваних речовин і препаратів порівняння) унеможливлює і не дозволяє: - кількісно (статистично-достовірно) оцінити як рівень пробуджуючого ефекту в цілому, так і його механізм (саме долю аналептичної дії); - порівняти в однакових умовах і визначити перспективність та пріоритети подальшого вивчення субстанцій; - створити теоретичні основи цілеспрямованого пошуку аналептичних засобів; - оптимізувати наукові досліди (суттєво прискорити і зменшити витрати). Існуючий стан речей: - стримує розвиток цілої галузі - керованої анестезіології; - створив кризу наявності вельми актуальної групи препаратів, яка налічує 10 субстанцій, з яких тільки 3 мають реальне, але обмежене застосування в медичній практиці України [9, 11]; 1 UA 121609 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В основу корисної моделі поставлена задача створення стандарту фармакологічного скринінгу аналептиків. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб відбору субстанцій для цілеспрямованого пошуку оригінальних біологічно активних сполук з аналептичною активністю включає: відтворення стандартизованої моделі кетамінового наркозу на мишах; введення частині з них стандартної дози препарату порівняння (класичного аналептика) та іншій частині досліджуваної субстанції на піку наркозного сну з подальшою фіксацією довжини наркозу та динаміки частоти дихальних рухів, візуальної оцінки психоемоційного стану та фізіологічних функцій тварин в наркозі і після пробудження, за умов, що під час експерименту дотримано конкретних дозотермінових умов введення речовин (пропонуються оптимальні дози та шляхи застосування), в якому відповідно корисній моделі: - наркотизуючого препарату (внутрішньочеревинне введення кетаміну 150 мг/кг тварини); - препаратів порівняння (внутрішньочеревинне введення сульфокамфокаїну 20 мг/кг; нікетаміду 63 мг/кг або інших класичних аналептиків) в оптимальній дозі; - введення препаратів порівняння та досліджуваних субстанцій на піку наркозу (10-20 хвилини після прийняття твариною бокового положення). Запропонований спосіб (модель) фармакологічного скринінгу аналептиків здатен вирішити вищенаведені проблеми, має повну новизну (відсутність стандарту), оригінальність, економічні, екологічні та гуманістичні переваги: - зменшує кількість та вартість дослідів; кількість, травмування і утилізації лабораторних тварин; витрати часу; - збільшує інформативність експериментів; можливість якісного і кількісного статистичнодостовірного порівняння аналептичного та побічних ефектів; може суттєво прискорити цілеспрямований пошук оригінальних ефективних субстанцій та розширити критично обмежений арсенал препаратів актуальних для використання в екстремальних умовах життєзабезпечення. Суть корисної моделі пояснюється наступним прикладом. Оцінку антинаркозного (пробуджуючого) ефекту речовин проводили на самцях білих нелінійних мишей масою 20-30 г на моделі кетамінового наркозу. Препаратами порівняння служили класичні комбіновані аналептики - сульфокамфокаїн (СКК) та нікетамід, що стимулюють дихальний і судиноруховий центри довгастого мозку [9, 11]. Тварин утримували в стандартних умовах Центральної науково-дослідної лабораторії НФа У відповідності з санітарно-гігієнічними нормами (t=19-24 °C, вологість не більше 50 %, природний світловий режим "день-ніч") у пластикових клітках на стандартному раціоні харчування з вільним доступом до води [17]. Дослідження було виконано відповідно до вимог "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах", методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України про "Доклінічні дослідження лікарських засобів" та "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для експериментальних та інших наукових цілей" (Страсбург, 1985) [18]. Тварин розділили на 4 групи (n=5-23). Спочатку всім тваринам внутрішньочеревинно вводили кетамін (Кетамін-ЗН, Здоров'я народу, Україна) в дозі 150 мг / кг [8, 9, 11]. 1-а - група служила контролем. Досліджувані речовини і препарати порівняння також вводилися внутрішньочеревинно на 15-й хвилині після входження тварин у третю фазу наркозу (знерухомлене бічне положення з рівномірним уповільненим диханням) [14, 15]. Група 2 отримувала Гетерозид-21 в дозі 1,0 мг/кг. Група 3 - сульфокамфокаїн 20 мг/кг, 4-а група нікетамід в дозі 63 мг/кг [6, 11, 12, 14, 15]. Ефективність досліджуваних речовин оцінювали за тривалістю наркозу (ТН). Вплив на дихальний центр визначався одночасно по частоті дихальних рухів за хвилину (ЧДР/хв) в різних фазах наркозу до та після введення пробуджуючих препаратів. Контролем служили показники ТН і ЧДР/хв. першої групи. ЧДР враховувалася протягом 60 секунд, починаючи з прийняття мишами бокового положення (ЧДР 1), ЧДР 2 на 7-ій, ЧДР 3 - на 14-ій хвилинах наркозного сну, ЧДР 4 заміряли (на 15-ій хвилині) моментально після введення Гетерозиду-21 або СКК. Подальший облік ЧДР проводили в період пробудження тварин: на 20-ій (ЧДР 5), 25-ій (ЧДР 6) і 30-ій (ЧДР 7) хвилинах відповідно. Останній вимір (ЧДР 8) здійснювали після прийняття положення на чотирьох лапах (повного пробудження) [14-15]. З цього моменту оцінювали психомоторний стан тварин (дезорієнтованість або цілеспрямованість руху); рівень їх постнаркозної адаптації (загальмованість, гіперактивність, цікавість до їжі та води); фізіологічні реакції (гіперсалівація, сечовиділення, дефекація) та інші. Достовірність отриманих результатів оцінювалася за критеріями Ньюмана-Кейлса та Манна Уітні за допомогою програми Statistica 10.0 [16]. 2 UA 121609 U 5 10 В ході проведених досліджень було підтверджено, що оптимальна глибина і тривалість наркозу досягалася при внутрішньочеревинному введенні 150 мг/кг кетаміну [11]. Результати наведені в таблиці 1. При цьому Гетерозид-21 виявляв виражену пробуджуючу дію. Максимальна ефективність (11,83 %), достовірно досягалася Гетерозидом-21 в дозі 1 мг/кг, в той час як оптимальна доза СКК (20 мг/кг) прискорювала пробудження тварин на 13 %, а нікетамид показав активність у 7,02 %. Таким чином, Гетерозид-21 в концентрації в 20 разів менше, ніж у СКК виявляв активність лише на 1,2 % меншу за результат традиційного аналептика. У порівнянні з нікетамідом дозування субстанції Гетерозиду-21 була в 63 рази менше, але в 1,7 разів ефективніше. Оскільки, нікетамід істотно поступався СКК, як в дозі, так і в ефективності, як препарат порівняння був вибраний лише останній. Таблиця 1 Дозозалежність пробуджуючого ефекту досліджуваних субстанцій на моделі кетамінового наркозу Групи Середня тривалість бокового положення по групах Середня тривалість наркозу Пробуджуючий ефект, % 33 хв. 37 сек. (2017,96±110,25) 0 88,17 % 11,83 29 хв. 28 сек. (1767,66±51,74*) 87 % 13 31 хв. 16 сек. (1876,33±21,57) Кетамін + Гетерозид - 21 1,0 мг/кг (n=10) Кетамін + 2 хв. 58 сек. (178,76±11,83) Сульфокамфокаїн 20 мг/кг (n=10) Кетамін + Кордіамин 63 мг/кг (n=5) Р 0,1747 100 % 29 хв. 39 сек (1779,33±288,04) Кетамін (n=23) 92,98 % 7,02 0,0000 Примітки: р - рівень статістичної значущості при порівнянні вибірок за допомогою дисперстного аналізу ANOVA, * - рівень статистичної значущості при порівнянні вибірок досліджуваних груп з групою контролю за допомогою критерію Ньюмана-Кейлса, n - кількість мишей в групі. 15 20 25 30 Кількісні характеристики експерименту були адекватні поведінковим реакціям тварин. Так група Гетерозиду-21 після пробудження характеризувалася доброю координацією рухів (переміщення по прямій лінії в швидкому темпі), активним вживанням води та їжі, посиленим діурезом. Миші з групи, яка отримувала СКК, після повного пробудження переміщалися повільніше з частими падіннями, найчастіше по периметру клітини, без особливої цікавості до води та їжі, сечовипускання було рідким, а потім вони зовсім впадали у сплячку (тривалістю близько 1-єї години). Тварини контрольної групи після кетаміновго наркозу тривалий час (33 хв. 37 сек.) були загальмовані і дезорієнтовані (завмирали або повільно переміщалися, падали з одного боку на інший, здійснювали кругові рухи, у них повністю був відсутній інтерес до води та їжі) і через деякий час вони впадали в тривалий сон (1-2 години), що повністю збігається з класичним симптомокомплексом постнаркозної (кетамінової) інтоксикації [16]. Для визначення механізму пробуджуючої дії Гетерозиду-21 динаміку зміни ЧДР тварин під його дією вивчали паралельно з СКК - класичним аналептиком, який впливає на дихальний і судиноруховий центри довгастого мозку. Порівняння результатів вимірювання ЧДР в різних фазах кетамінвого наркозу з ТН (табл. 2, креслення) показало, що після введення кетаміну ЧДР 1 - ЧДР 4 достовірно (р