Спосіб одночасного визначення залишкових кількостей флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану в одній пробі води

Реферат: Спосіб одночасного визначення залишкової кількості флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану в одній пробі води включає підготовку проби води до екстракції, проведення екстракції, концентрування та хроматографування. Обернено-фазове високоефективне рідинне хроматографування здійснюють з використанням ультрафіолетового детектування з можливістю чіткого розділення піків речовин. Після отримання хроматограм визначають площі піків речовин та їх кількість за градуювальною залежністю площі піка від концентрації в градуювальному розчині суміші цих речовин. UA 122557 U (12) UA 122557 U UA 122557 U 5 10 15 20 Корисна модель належить до медицини, а саме до виробничої токсикології, і може бути використана для одночасного визначення декількох фунгіцидів класу піразолкарбоксамідів (флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану) в одній пробі води санітарноепідеміологічними, екологічними, агрохімічними службами для контролю за вмістом токсикантів у воді. В останні декілька років на світовому ринку запропоновані фунгіцидні препарати на основі флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану. Зазначені діючі речовини за хімічною будовою належать до нового хімічного класу - піразолкарбоксамідів, за механізмом фунгіцидної активності є інгібіторами сукцинатдегідрогенази [1]. Загальні відомості про досліджувані діючі речовини наведені в табл. 1. Препарати на основі цих сполук задовольняють сучасним вимогам та рекомендовані у світі для захисту більше ніж 30 основних культур. Враховуючи широкий спектр культур, для обробки яких запропоновані ці препарати, та антирезистентну стратегію застосування пестицидів, яка передбачає використання сполук з новим механізмом дії і впровадження комбінованих препаратів на основі двох і більше діючих речовин, можливе активне застосування піразолкарбоксамідів в одному регіоні, а тому існує ймовірність їх одночасного надходження в об'єкти довкілля. Для контролю за дотриманням гігієнічних нормативів флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану у воді раніше були розроблені аналітичні способи визначення кожної речовини окремо методом високоефективної рідинної хроматографії. Таблиця 1 Характеристика флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану Діюча речовина Хімічна назва (IUPAC) Флуксапіроксад Пентіопірад (RS)-N-[2-(1,3диметилбутил)-3тієніл]-1-метил-3(трифторметил)піразол4-карбоксамід 1 Молекулярна маса 381,31 C16H20F3N3OS 3-(дифторметил)-1метил-N-(3',4',5'трифторбіфеніл-2іл)піразол-4карбоксамід Емпірична формула C18H12F5N3O Хімічна формула 359,4 UA 122557 U Продовження таблиці 1 суміш 2 син-ізомерів 3(дифторметил)-1метил-N-[(1RS, 4SR, 9RS)-1,2,3,4-тетрагідро9-ізопропіл-1,4метанонафтален-5іл]піразол-4карбоксамід та 2 антиІзопіразам ізомерів 3(дифторметил)-1метил-N-l(1RS, 4SR, 9SR)-1,2,3,4-тетрагідро9-ізопропіл-1,4метанонафтален-5іл]піразол-4карбоксамід 10 15 20 25 30 359,4 суміш 2 цис-ізомерів 2'[(1RS, 2RS)-1,1'біциклопроп-2-іл]-3(дифторметил)-1метилпіразол-4Седаксан карбоксамід та 2 трансізомерів 2'-[(1RS, 2SR)1,1'-біциклопроп-2-іл]-3(дифторметил)-1метилпіразол-4карбоксамід 5 C18H12F5N3O C20H23F2N3O 331,4 Відомі способи визначення цих діючих речовин у воді шляхом газорідинної хроматографії передбачають визначення тільки по одному фунгіциду: флуксапіроксаду [2], пентіопіраду [3], ізопіразаму [4], та седаксану [5], що є досить витратним (як з позиції часу, так і коштів). Відомий спосіб визначення речовин у воді [6], вибраний як прототип, згідно з яким визначення проводять шляхом підготовки проб води до екстракції, проведення екстракції та концентрування. Наявність речовин визначають за їх залишковими кількостями у воді хроматографічним методом. Однак такий підхід не дозволяє одночасно визначити кожну діючу речовину при їх сумісній присутності в одній пробі. Саме тому, актуальною є розробка способу, який дозволить одночасно визначити декілька речовин класу піразолкарбоксамідів при їх сумісній присутності в пробі води. Така методика дозволяє значно прискорити швидкість визначення та зменшити витрати на його проведення. Такий спосіб має не тільки економічне, а й екологічне значення, оскільки може ефективно використовуватись для моніторингових досліджень навколишнього середовища. В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу одночасного визначення флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану в одній пробі води шляхом хроматографування попередньо підготовлених екстрактів проб води, їх екстракції та концентрування і визначення кількості речовин за площею їх хроматографічних піків залежно від концентрацій в розчинах їх суміші, що дозволяє, за градуювальники залежностями площ піків від концентрацій в розчинах їх суміші, чітко та одночасно визначній наявність та кількість цих речовин, досягти прискорення визначення досліджуваних речовин та знизити вартість виконання досліджень. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одночасного визначення залишкових кількостей флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану в одній пробі води включає підготовку проби води до екстракції, проведення екстракції, концентрування та хроматографування і, згідно з корисною моделлю, здійснюють обернено-фазове високоефективне рідинне хроматографування з використанням ультрафіолетового детектування для чіткого розділення піків речовин, після отримання хроматограм визначають 2 UA 122557 U 5 10 15 20 25 площі піків речовин та їх кількість за градуювальною залежністю площі піка від концентрації в градуювальному розчині суміші цих речовин. Спосіб базується на екстракції флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану із підготовлених проб води етилацетатом, висушуванні, концентруванні та одночасного визначення цих речовин методом обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії з використанням ультрафіолетового детектування. З отриманих хроматограм визначають площі піків речовин та їх кількість за градуювальною залежністю площі піка від концентрації в градуювальному розчині суміші цих речовин. Спосіб здійснюють наступним чином: Підготовка проби: 500 мл проби води поміщають у ділильну лійку місткістю 1000 мл та екстрагують флуксапіроксад, пентіопірад, ізопіразам та седаксан тричі порціями етилацетату по 70, 50 та 50 мл. Струшують лійку впродовж (1-2) хвилин і після розділення шарів збирають шар етилацетату в конічну колбу місткістю 250 мл. Об'єднаний екстракт сушать безводним сульфатом натрію (20-25 г) шляхом настоювання у конічній колбі місткістю 250 мл впродовж 30 хвилин. Екстракт переносять у грушоподібну колбу для відгону розчинників місткістю 250 мл і концентрують на ротаційному випарнику при температурі водяної бані не вище 45 °C до об'єму (0,2-0,3) мл. До сухого залишку випаровують розчинник на повітрі. Після підготовки проби сухий залишок екстракту розчиняють в ацетонітрилі (загальний об'єм проби 1 мл) і переносять у градуйовану пробірку місткістю 10 мл. Наступним етапом є визначення вмісту флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану методом обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії. Для ідентифікації та кількісного визначення діючих речовин у підготовлених екстрактах проб був використаний рідинний хроматограф LC-10ADvp фірми Шимадзу (Японія) з ультрафіолетовим детектором. Встановлені оптимальні умови розділення і визначення флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану: колонка хроматографічна сталева (250×4,6) мм, заповнена Нуклеосилом С 18 (100-5); передколонка хроматографічна сталева (4×3) мм, заповнена Нуклеосилом С18 (100-5); довжина хвилі ультрафіолетового детектора - 250 нм; температура термостата колонки - 30 °C; об'єм петлі інжектора рідинного хроматографа - 20 мкл; об'ємна витрата рухомої фази - 1,0 мл/хв.; склад рухомої фази наведений в таблиці 2. 30 Таблиця 2 Час, хв. 0 1 9 12 18 35 40 45 50 Елюент А 35 35 45 35 35 Склад рухомої фази, % Елюент В 35 35 45 35 35 Елюент С 30 30 10 30 30 Кількісне визначення флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану проводять методом абсолютного калібрування шляхом побудови для кожної речовини градуювальної залежності площі її хроматографічного піка від масової концентрації в градуювальному розчині суміші цих речовин. Для побудови градуювальник залежностей для флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану змішуванням та послідовним розведенням вихідних розчинів кожної з досліджуваних речовин, що містили 100 мкг сполуки в 1 мл ацетонітрилу, готують 5 робочих градуювальних розчинів суміші досліджуваних речовин з масовою концентрацією кожної сполуки 5; 2; 1; 0,5 та 0,25 мкг/мл та контрольний розчин суміші з масовою концентрацією кожної сполуки 2,5 мкг/мл. Проводять хроматографічний аналіз розчину кожної речовини для подальшої ідентифікації піку конкретної сполуки на хроматограмі суміші. Після вибору оптимальних умов розділення флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану хроматографування кожного градуювального розчину суміші проводять 5 разів для побудови графіків залежності площі хроматографічного піку кожної сполуки від концентрації. Ідентифікацію флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану в екстрактах проб води проводять за часом утримування кожної з чотирьох сполук в градуювальних розчинах суміші, кількісне визначення - за відповідною залежністю площі хроматографічного піку речовини від концентрації в градуювальному розчині, яку встановлювали на підставі кореляційного та регресійного аналізів. 3 UA 122557 U 5 У встановлених умовах хроматографування час утримування складає: флуксапіроксаду 6,8±0,1 хвилина; транс-седаксану - 7,4±0,1 хвилина; цис-седаксану - 8,2±0,1 хвилина; пентіопіраду - 9,3±0,1 хвилина та ізопіразаму - 11,0±0,1 хвилина. Використовуючи відповідну градуювальну залежність, обчислюють масову концентрацію 3 ( n ), мг/дм , флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму або седаксану для кожної з паралельних проб за формулою: n  10 15 Sn  a Vnp ,  b V де n - номер паралельної проби (n=1, 2); Sn - середнє значення площі піка флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму або сума площ діастереоізомерів седаксану, ум. од.; a, b - коефіцієнти регресії у рівнянні відповідної градуювальної залежності; Vnp - кінцевий об'єм екстракту проби, мл; V - об'єм проби води, мл. Результат обчислень заокруглюють до другої значущої цифри. За результат вимірювання масової концентрації флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму або седаксану в пробі води (ρ), 3 мг/дм , приймають середнє значення двох паралельних визначень масової концентрації кожної сполуки. Етапи способу одночасного визначення залишкових кількостей флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану в одній пробі води наведено в табл. 3. 20 Таблиця 3 І Етап Підготовка до екстракції II Екстракція III Висушування IV Концентрування Процедура на даному етапі 500±0,1 мл проби води поміщають у ділильну лійку місткістю 1000 мл. Тричі по 70, 50 та 50 мл етилацетату. Струшують лійку впродовж (1-2) хвилини і після розділення шарів збирають шар етилацетату в конічну колбу місткістю 250 мл. Об'єднаний екстракт сушать безводним сульфатом натрію (20-25 г) шляхом настоювання у конічній колбі місткістю 250 мл впродовж 30 хвилин. Екстракт переносять у грушоподібну колбу для відгону розчинників місткістю 250 мл і концентрують на ротаційному випарнику при температурі водяної бані не вище 45 °C до об'єму (0,2-0,3) мл. До сухого залишку упарюють розчинник на повітрі. 4 UA 122557 U Продовження таблиці 3 V Хроматографування (умови) Хроматограф рідинний LC-10ADvp фірми Шимадзу (Японія) або подібний з ультрафіолетовим детектором. Колонка хроматографічна сталева (250×4,6) мм, заповнена Нуклеосилом С18 (100-5). Передколонка хроматографічна сталева (4×3) мм, заповнена Нуклеосилом С18 (100-5). Рухома фаза: Склад рухомої фази, % Час, хв. Елюент А Елюент В Елюент С 0 35 35 30 1 35 35 30 9 45 45 10 12 35 35 30 18 35 35 30 Об'ємна витрата рухомої фази - 1,0 мл/хв. Довжина хвилі ультрафіолетового детектора - 250 нм. Температура термостата колонки - 30 °C. Об'єм петлі інжектора рідинного хроматографа - 20 мкл. Час утримання за даних умов, хвилини: флуксапіроксад - 6,8±0,1; транс-сетксан - 7,4±0,1; цис-седаксан - 8,2±0,1; пентіопірад - 9,3±0,1; ізопіразам - 11,0±0,1. Час аналізу - 18 хвилин. Використовуючи відповідну градуювальну залежність, обчислюють 3 масову концентрацію (  n ), мг/дм , флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму або седаксану для кожної з паралельних проб за формулою: n  VI Sn  a Vnp ,  b V де n - номер паралельної проби (n=1,2); Sn - середнє значення площі піка флуксапіроксаду, пентіопіраду, Обчислення масової ізопіразаму або сума площ діастереоізомерів седаксану, ум. од.; 3 концентрації (ρ), мг/дм a,b - коефіцієнти регресії у рівнянні відповідної градуювальної залежності; Vnp - кінцевий об'єм екстракту проби, мл; V - об'єм проби води, мл. Результат обчислень заокруглюють до другої значущої цифри. За результат вимірювання масової концентрації флуксапіроксаду, 3 пентіопіраду, ізопіразаму або седаксану в пробі води (ρ), мг/дм , приймають середнє значення двох паралельних визначень масової концентрації кожної сполуки. 5 10 Розроблений спосіб дозволяє одночасно, швидко визначати у воді флуксапіроксад, пентіопірад, ізопіразам та седаксан на рівні нижче встановлених гігієнічних нормативів. Розробка та апробація способу одночасного визначення флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану в пробі води проводились в Інституті гігієни та екології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця. Джерела інформації: 1. Mode of Action of Fungicides: FRAC Fungicide Resistance Action Committee. - http://www.frac.info. 2. Методичні вказівки з визначення флуксапіроксаду у воді методом високоефективної рідинної хроматографії, № 1209-2012 // Наказ № 30 від 08.01.2013 Міністерства екології та природних ресурсів України. 5 UA 122557 U 5 10 3. Методичні вказівки з визначення пентіопіраду у воді методом високоефективної рідинної хроматографії, № 1374-2015 // Наказ № 155 від 18.05.2015 Міністерства екології та природних ресурсів України. 4. Методичні вказівки з визначення ізопіразаму у воді методом високоефективної рідинної хроматографії, № 1334-2015 // Наказ № 97 від 26.03.2015 Міністерства екології та природних ресурсів України. 5. Методичні вказівки з визначення седаксану у воді методом високоефективної рідинної хроматографії, № 1417-2015 // Наказ № 156 від 18.05.2015 Міністерства екології та природних ресурсів України. 6. Санитарно-гигиенические методы исследования пищевых продуктов и воды / Под ред. проф. Г.С. Яцулы. - К.: "Здоровье", 1991. - 288 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб одночасного визначення залишкової кількості флуксапіроксаду, пентіопіраду, ізопіразаму та седаксану в одній пробі води, що включає підготовку проби води до екстракції, проведення екстракції, концентрування та хроматографування, який відрізняється тим, що здійснюють обернено-фазове високоефективне рідинне хроматографування з використанням ультрафіолетового детектування для чіткого розділення піків речовин, після отримання хроматограм визначають площі піків речовин та їх кількість за градуювальною залежністю площі піка від концентрації в градуювальному розчині суміші цих речовин. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6