Спосіб визначення трьох пестицидів та регулятора росту рослин в одній пробі води

Реферат: Спосіб визначення трьох пестицидів та регулятора росту рослин в одній пробі води включає підготовку проби води до екстракції, проведення екстракції, концентрування та хроматографування. Змінюють умови хроматографування для чіткого розходження піків речовин (піраклостробіну, боскаліду, тебуфенпіраду та прогексадіон-кальцію), що знаходяться в пробі води, після отримання хроматограм вивчають піки кожної речовини, ідентифікують їх за часом утримування і визначають їх кількість за градуювальною залежністю висоти піка кожної сполуки від концентрації в градуювальному розчині суміші сполук. UA 76331 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ТРЬОХ ПЕСТИЦИДІВ ТА РЕГУЛЯТОРА РОСТУ РОСЛИН В ОДНІЙ ПРОБІ ВОДИ UA 76331 U UA 76331 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме до виробничої токсикології, і може бути використана для одночасного визначення залишкових кількостей пестицидів та регулятора росту рослин в одній пробі води. Представлені пестициди належать до фунгіцидів (піраклостробін та боскалід) та інсектоакарицидів (тебуфенпірад) з різних перспективних хімічних класів, які останнім часом активно використовуються в сільськогосподарській практиці. Абсолютна кількість фунгіцидних препаратів на основі піраклостробіну, що дозволені до використання, за період з 2006 по 2012 роки збільшилась з 1 до 9 [1, 2], а препаратів на основі боскаліду (інша назва речовини нікобіфен) за період з 2008 по 2010 роки - збільшилась з 2 до 5 (2,3), що пов'язано з їх високою ефективністю при досить низьких, в порівнянні з іншими фунгіцидами, нормах витрат. Щодо досліджуваних інсекто-акарициду (тебуфенпіраду) та регулятора росту рослин (прогексадіонкальцію), то ці речовини є новими для нашої країни та, згідно з [2], на основі тебуфенпіраду та прогексадіон-кальцію для захисту яблуневих садів зареєстровано по одному препарату. Загальні відомості про досліджувані діючі речовини (піраклостробін, боскалід, тебуфенпірад і прогексадіон-кальцій) хімічних засобів захисту рослин наведені в таблиці 1. З еколого-гігієнічних позицій потенційна небезпека застосування пестицидів та агрохімікатів тісно пов'язана з особливостями їх поведінки в навколишньому середовищі, зокрема із стійкістю у воді. Відомо, що боскалід та тебуфенпірад за стабільністю у воді належать до І класу небезпечності (високостійкі), а піраклостробін та прогексадіон-кальцій - до II класу небезпечності (стійкі). Саме тому дуже важливо контролювати їх вміст у воді. На сьогоднішній день в сільськогосподарській практиці все більше використовують комбіновані препарати, що в своєму складі містять декілька діючих речовин. Так, достатньо часто поєднують піраклостробін та боскалід в одному фунгіцидному препараті (наприклад Сігнум, в.г. та Іншур Профі, ТН). Раніше для контролю за дотриманням гігієнічних нормативів цих речовин була розроблена аналітична методика їх сумісного визначення в одній пробі води та методики визначення у воді окремо прогексадіон-кальцію методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) [4, 5] та тебуфенпіраду - методом газорідинної хроматографії (ГРХ) [6]. Досліджувані діючі речовини входять до складу препаратів, які призначені для обробки яблуневих садів. А враховуючи те, що ці пестициди та агрохімікати можуть бути одночасно використані на яблунях в системі захисту, актуальною стає розробка методу, який дозволив би одночасно визначати дані речовини в одній пробі. Така методика дозволила б значно прискорити швидкість одного визначення та зменшити витрати на його проведення. Такий метод має не лише економічне, а й біоетичне значення. Відомий спосіб сумісного визначення боскаліду (нікобіфену) та піраклостробіну в одній пробі води та спосіб визначення прогексадіон-кальцію окремо шляхом ВЕРХ [4, 5], а також тебуфенпіраду - шляхом ГРХ [6]. Однак, дані способи мають наступні недоліки: не дозволяють одночасно визначити всі зазначені діючі речовини в одній пробі, вимагають більше часу і затрат реактивів. Відомий спосіб визначення боскаліду (нікобіфену) та піраклостробіну у воді методом ВЕРХ [5] вибраний як прототип, в якому визначення проводять шляхом підготовки проб води до екстракції, проведення екстракції, концентрування та хроматографування методом ВЕРХ. Задачею корисної моделі є одночасне визначення трьох пестицидів (піраклостробіну, боскаліду, тебуфенпіраду) та регулятора росту рослин (прогексадіон-кальцію) в одній пробі води. Технічний результат, отриманий після вирішення задачі, полягає в прискоренні визначення досліджуваних речовин (піраклостробіну, боскаліду, тебуфенпіраду і прогексадіон-кальцію) та зменшенні витрат на його проведення. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі визначення боскаліду (нікобіфену) та піраклостробіну у воді, який включає підготовку проб до екстракції, екстракцію, концентрування та хроматографування, згідно з корисною моделлю, змінюють умови екстракції та хроматографування для чіткого розходження піків речовин (піраклостробіну, боскаліду, тебуфенпіраду та прогексадіон-кальцію), що знаходяться в суміші проби, після отримання хроматограм вивчають піки кожної речовини, ідентифікують їх за часом утримування, а кількість визначають за градуювальною залежністю висоти піка кожної сполуки від концентрації в градуювальному розчині суміші сполук. Спосіб виконується наступним чином: Спосіб ґрунтується на вилученні досліджуваних речовин (піраклостробіну, боскаліду, тебуфенпіраду і прогексадіон-кальцію) з проби води сумішшю гексан-дихлорметан (1+1, об.+об.), після додавання ацетону та концентрованої хлороводневої кислоти, концентруванні 1 UA 76331 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 екстракту та подальшому визначенні піраклостробіну, боскаліду, тебуфенпіраду і прогексадіонкальцію методом обернено-фазової ВЕРХ з ультрафіолетовим (УФ) детектором. Підготовка проби: 500 мл води поміщають в конічну колбу місткістю 500 мл. Додають 50 мл ацетону та ретельно перемішують скляною паличкою. За допомогою концентрованої хлороводневої кислоти доводять рН отриманої суміші до 3 (контроль рН проводять за індикаторним папером). Далі вміст конічної колби переносять в ділильну лійку місткістю 1000 мл та екстрагують речовини тричі по 50 мл суміші гексан-дихлорметан (1+1, об.+об.). Струшують лійку впродовж (1-2) хвилин і після розділення шарів збирають верхній шар в конічну колбу місткістю 250 мл. Екстракт сушать безводним сульфатом натрію (близько 20 г) шляхом настоювання у конічній колбі місткістю 250 мл впродовж 30 хвилин. Екстракт переносять у грушоподібну колбу для відгону розчинників місткістю 250 мл і концентрують на ротаційному випарнику при температурі водяної бані не вище 40 °C до об'єму (0,2-0,3) мл. До сухого залишку розчинник випаровують струменем сухого повітря. Після підготовки проби до вимірювання сухий залишок кількісно переносять в градуйовану пробірку місткістю 5 мл за допомогою суміші ацетонітрил-0,1 % водний розчин ортофосфорної кислоти (50+50, об.+об.). Кінцевий об'єм екстракту проби 2 мл. Аналогічно готують паралельну пробу. Підготовка та кондиціювання колонки для рідинної хроматографії: Колонку хроматографічну сталеву (250 мм4,6 мм), заповнену Нуклеосилом Cig (100-5), стабілізують при температурі 30 °C при об'ємній витраті рухомої фази 0,8 мл/хв впродовж 30 хвилин. Вмикають детектор і чекають стабільності базової лінії 10-15 хвилин. Умови роботи хроматографа: рідинний хроматограф "Шимадзу" або подібний з УФ-детектором; х колонка хроматографічна сталева (250 мм 4,6 мм), заповнена Нуклеосилом C18 (100-5); рухома фаза - суміш ацетонітрил-0,1 % водний розчин ортофосфорної кислоти (50+50, об.+об.); об'ємна витрата рухомої фази - 0,8 мл/хв; температура термостата колонки - 30 °C; довжина хвилі ультрафіолетового детектора - 250 нм; об'єм петлі інжектора рідинного хроматографа - 20 мкл. Час утримування за даних умов, хв: прогексадіон-кальцію - 3,8±0,1; боскаліду - 9,5±0,1; піраклостробіну - 11, 1±0,1; тебуфенпіраду - 12,8±0,1. Етапи способу одночасного визначення трьох пестицидів та регулятора росту рослин в одній пробі води узагальнені в табл. 2. Кількісне визначення прогексадіон-кальцію, боскаліду, піраклостробіну та тебуфенпіраду здійснюють методом абсолютного калібрування. Для цього необхідно для кожної речовини окремо побудувати градуювальну залежність площі її хроматографічного піка від масової концентрації в градуювальному розчині суміші цих речовин. Побудова градуювальних залежностей для прогексадіон-кальцію, боскаліду, піраклостробіну та тебуфенпіраду: Готують 5 градуювальних розчинів суміші прогексадіон-кальцію, боскаліду, піраклостробіну та тебуфенпіраду з масовими концентраціями кожної сполуки 0,5; 1; 2; 5 та 10мкг/мл. Ці градуювальні розчини хроматографують тричі в умовах, наведених в табл. 2. Спочатку проводили хроматографічний аналіз розчину кожної речовини для подальшої ідентифікації піку конкретної сполуки на хроматограмі суміші. Ідентифікацію піків прогексадіон-кальцію, боскаліду, піраклостробіну та тебуфенпіраду в розчинах суміші проводять відповідно до часу утримування кожної з чотирьох сполук (табл. 2). На хроматограмах за допомогою програмного забезпечення для обробки даних фіксують піки в області часу утримування прогексадіон-кальцію, боскаліду, піраклостробіну та тебуфенпіраду і визначають площі відповідних піків. Обчислюють середнє значення площі піків кожної сполуки з 3 паралельних вимірювань. Отримані результати обробляють за методом найменших квадратів. Градуювальна залежність описується рівнянням: Sгр    b  гр де: Sгр - площа піку прогексадіон-кальцію, боскаліду, піраклостробіну та тебуфенпіраду, умовні одиниці (ум.од.); гр - масова концентрація прогексадіон-кальцію, боскаліду, піраклостробіну та тебуфенпіраду в градуювальному розчині, мкг/мл; 2 UA 76331 U 5 10 15 20 a - масштабний коефіцієнт; b - коефіцієнт регресії. Градуювальну залежність вважають задовільною, якщо значення коефіцієнта кореляції знаходиться в межах від 0,8 до 1,0. Виконання вимірювань: Проби хроматографують тричі за умов, наведених в таблиці 2. Використовуючи відповідну градуювальну залежність, обчислюють масову концентрацію n, 3 мг/дм , прогексадіон-кальцію, боскаліду, піраклостробіну та тебуфенпіраду для кожної з паралельних проб за формулою: Snp  ` Vnp , де n   b V n - номер паралельної проби (n=1, 2); Snp - площа піку прогексадіон-кальцію, боскаліду, піраклостробіну та тебуфенпіраду (середнє з трьох спостережень) в аліквоті проби, що введена в хроматограф, ум.од.;  - масштабний коефіцієнт; b - коефіцієнт регресії у рівнянні відповідної градуювальної залежності; Vnp - кінцевий об'єм екстракту проби, мл; V - об'єм проби води, мл. Результат обчислень заокруглюють до другої значущої цифри. Обробка результатів вимірювання: За результат вимірювання масової концентрації прогексадіон-кальцію, боскаліду, 3 піраклостробіну та тебуфенпіраду в пробі (), мг/дм , приймають середнє значення двох паралельних визначень масової концентрації кожної сполуки. 3 UA 76331 U Таблиця 1 Загальні відомості про досліджувані речовини Назва Хімічна назва за IUPAC метил N-{2-[1-(4хлорофеніл)-1НПіраклостробін піразол-3-ілоксиметил] феніл }(Nметокси)карбамат Молекулярна маса C19H18ClN3O4 387,8 C18H12C12N2O 343,2 C18H24ClN3O 333,9 С10Н12О5Са 250,3 O N Cl N O N O O N Боскалід Емпірична формула Хімічна формула Cl C 2-хлоро-N-(4'хлоробіфеніл-2іл)нікотинамід O N H Cl CH3 H3C C CH3 N-(4-трет-бутилбензил)4-хлор-3-етил-1Тебуфенпірад метилпіразол-5карбоксамід CH2 N CH3 O C N N H Cl CH2 CH3 O кальцію 3-оксидо-5Прогексадіон- оксо-4-пропіоніл-3кальцій циклогексанкарбо ксилат O O C C CH2 O O CH3 4 Ca 2+ UA 76331 U Таблиця 2 Спосіб визначення досліджуваних речовин в одній пробі води Етап визначення Дії на даному етапі Підготовка до екстракції До 500 мл води додають 50 мл ацетону, ретельно перемішують та підкислюють концентрованою хлороводневою кислотою до рН 3 (контроль рН проводять за індикаторним папером). Екстиакція Вміст конічної колби переносять в ділильну лійку місткістю 1000 мл та екстрагують речовини тричі по 50 мл суміші гексан-дихлорметан (1+1, об.+об.). Струшують лійку впродовж (1-2) хвилин і після розділення шарів збирають верхній шар в конічну колбу місткістю 250 мл. Підсушування Концентрування Хроматографування (умови) 5 10 Екстракт сушать безводним сульфатом натрію (близько 20 г) шляхом настоювання у конічній колбі місткістю 250 мл протягом 30 хвилин. Екстракт переносять у грушоподібну колбу для відгону розчинників місткістю 250 мл і концентрують на ротаційному випарнику при температурі водяної бані не вище 40 °C до об'єму (0,2-0,3) мл. До сухого залишку розчинник випаровують струменем сухого повітря. Сухий залишок розчиняють в 2 мл суміші ацетонітрил-0,1 % водний розчин ортофосфорної кислоти (50+50, об.+об.). рідинний хроматограм "Шимадзу" або подібний з УФ-детектором; колонка хроматографічна сталева (250 мм4,6 мм, заповнена Нуклеосилом С18 (100-5); рухома фаза: Співвідношення компонентів рухомої фази, % Час ацетонітрил 0,1 % водний хроматографічного розчин аналізу, хв ортофосфорної кислоти 0-4,5 50 50 4,5-7,0  до 80  до 20 7,0-15,0 80 20 15,0-20,0  до 50  до 50 об'ємна витрата рухомої фази - 0,8 мл/хв; температура термостата колонки - 30 °C; довжина хвилі ультрафіолетового детектора-250 нм об'єм петлі інжектора рідинного хроматографа 20 мкл. Час утримування за даних умов, хв: прогексадіон-кальцію - 3,8±0,1; боскаліду - 9,5±0,1; піраклостробіну -11,1±0,1; тебуфенпіраду - 12,8±0,1. Запропонований спосіб відрізняється тим, що в результаті скорочення ряду операцій має більш високу продуктивність у порівнянні з раніше розробленими способами, дозволить прискорити, спростити виконання та знизити вартість дослідження вмісту пестицидів у воді. Розробка та апробація способу, що заявляється, проводились в Інституті гігієни та екології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця. Джерела інформації: 1. Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні. - Офіц. вид. Дніпропетровськ: АРТ-ПРЕС, 2006.-311 с. 5 UA 76331 U 5 10 15 2. Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні. - Офіц. вид. - К.: Юнівест Медіа, 2012.-832 с. 3. Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні. - Офіц. вид. - К.: Юнівест Медіа, 2008.-448 с. 4. Методичні вказівки з визначення нікобіфену та піраклостробіну у воді методом високоефективної рідинної хроматографії: MB № 452-2003 // Методичні вказівки з визначення мікрокількостей пестицидів в продуктах харчування, кормах та навколишньому середовищі. - К., 2007 рік. - Збірка № 45. - С. 104-116. 5. Методичні вказівки з визначення прогексадіон-кальцію (кислоти) у воді методом високоефективної рідинної хроматографії: MB № 976-2010 // Погоджено МОЗ 26.02.2010, Постанова № 7, затверджено Міністерством охорони навколишнього природного середовища 11.06.2010, Наказ № 239. 6. Методичні вказівки з визначення тебуфенпіраду у воді методом газорідинної хроматографії: MB № 1078-2011 // Погоджено МОЗ 01.03.2011, Постанова № 6, затверджено Міністерством охорони навколишнього природного середовища 25.03.2011, Наказ № 95. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб визначення трьох пестицидів та регулятора росту рослин в одній пробі води, що включає підготовку проби води до екстракції, проведення екстракції, концентрування та хроматографування, який відрізняється тим, що змінюють умови хроматографування для чіткого розходження піків речовин (піраклостробіну, боскаліду, тебуфенпіраду та прогексадіонкальцію), що знаходяться в пробі води, після отримання хроматограм вивчають піки кожної речовини, ідентифікують їх за часом утримування і визначають їх кількість за градуювальною залежністю висоти піка кожної сполуки від концентрації в градуювальному розчині суміші сполук. Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6