Спосіб одночасного визначення залишкових кількостей пестицидів в пробі води

Реферат: Спосіб одночасного визначення залишкових кількостей пестицидів в пробі води включає підготовку проби води до екстракції, проведення твердофазної екстракції, концентрування та хроматографічний аналіз екстрактів проб води методом високоефективної рідинної хроматографії. Спочатку здійснюють хроматографування розчину кожного з пестицидів для ідентифікації за часом утримування, потім проводять хроматографування розчину суміші пестицидів з отриманням чіткого розділення піків та визначають кількість кожного з пестицидів за градуювальною залежністю площі його хроматографічного піка від концентрацій в градуювальних розчинах суміші пестицидів. UA 119413 U (12) UA 119413 U UA 119413 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до виробничої токсикології, і може бути використана для одночасного визначення залишкових кількостей пестицидів в одній пробі води. Фунгіциди азоксистробін, димоксистробін, пікоксистробін, піраклостробін та інсектицид піметрозин належать до перспективних хімічних класів стробілуринів та піридинових азометинів відповідно, які активно використовуються в сільськогосподарській практиці. Абсолютна кількість пестицидних препаратів на основі азоксистробіну, що дозволені до використання, станом на 2016 рік становить 26, на основі димоксистробіну - 1, на основі пікоксистробіну - 2 та піраклостробіну - 13. Інсектицид піметрозин є новою речовиною, на основі якої зареєстровано один препарат для захисту ріпаку. Препарати на основі цих сполук задовольняють сучасним вимогам та рекомендовані в Україні для захисту більше ніж 20 основних культур [1]. З еколого-гігієнічних позицій потенційна небезпека застосування пестицидів та агрохімікатів тісно пов'язана з особливостями їх поведінки в навколишньому середовищі, зокрема із стійкістю у воді. Відомо, що піметрозин, пікоксистробін, азоксистробін та димоксистробін за стабільністю у воді належать до І класу небезпечності (високостійкі), піраклостробін - до II класу небезпечності (стійкий). Раніше для контролю за дотриманням гігієнічних нормативів досліджуваних сполук були розроблені аналітичні методики їх окремого визначення у воді: піметрозину, азоксистробіну, димоксистробіну та піраклостробіну - методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) та пікоксистробіну - газорідинної хроматографії (ГРХ) [2, 3, 4, 5, 6]. Пестицидні препарати на основі зазначених діючих речовин (д.р.) можуть використовуватись на широкому спектрі культур в одному регіоні, тому існує імовірність одночасного надходження їх в об'єкти навколишнього середовища. Враховуючи те, що дані пестициди можуть бути використані одночасно, а також їх стійкість у воді, актуальною стає розробка методу, який дозволив би одночасно визначати дані речовини в одній пробі. Така методика дозволила б значно прискорити швидкість одного визначення та зменшити витрати на його проведення. Такий метод має не лише економічне, а й біоетичне значення. Відомий спосіб визначення кількості піметрозину у воді методом ВЕРХ вибраний як прототип, в якому визначення проводять шляхом підготовки проб води до екстракції, проведення екстракції, концентрування та хроматографування методом ВЕРХ [2]. В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу одночасного визначення залишкових кількостей пестицидів в пробі води шляхом хроматографування попередньо підготовлених екстрактів проб води і визначення кількості пестицидів за градуювальною залежністю площі хроматографічного піка від концентрацій в градуювальних розчинах їх суміші, що дозволяє досягти прискорення визначення досліджуваних пестицидів та зменшення витрат на його проведення. Поставлена задача вирішується тим, що у способі одночасного визначення залишкових кількостей пестицидів в пробі води включає підготовку проб до екстракції, твердофазну екстракцію, концентрування та хроматографічний аналіз екстрактів проб води методом високоефективної рідинної хроматографії, і, згідно з корисною моделлю, здійснюють хроматографування розчину кожного з пестицидів для ідентифікації за часом утримування, потім проводять хроматографування розчину суміші пестицидів з отриманням чіткого розділення піків та визначають кількість кожного з пестицидів за градуювальною залежністю площі його хроматографічного піка від концентрацій в градуювальних розчинах суміші пестицидів. Спосіб здійснюють наступним чином: Спосіб ґрунтується на вилученні досліджуваних пестицидів (наприклад піметрозину, азоксистробіну, димоксистробіну, пікоксистробіну та піраклостробіну - представників найбільш перспективних хімічних класів піридинових азометинів та стробілуринових фунгіцидів) з проби води методом твердофазної екстракції за допомогою концентруючих картриджів С 18, елююванні піметрозину, азоксистробіну, димоксистробіну, пікоксистробіну та піраклостробіну з шару сорбенту ацетонітрилом та подальшому визначенні піметрозину, азоксистробіну, димоксистробіну, пікоксистробіну та піраклостробіну методом обернено-фазової ВЕРХ з ультрафіолетовим (УФ) детектуванням. Підготовка проби: 200 мл води вносять у конічну колбу місткістю 250 мл, додають 0,5 мл ацетонітрилу, 5 мл буферного розчину та ретельно перемішують. Розчин переносять в резервуар, приєднаний до картриджа С18, підключають вакуум і пропускають розчин зі швидкістю (3-5) мл/хв. Розчин, що пройшов через картридж, відкидають. Картридж висушують, пропускаючи повітря впродовж 1 1 UA 119413 U 5 10 15 20 25 хв. Елююють піметрозин, азоксистробін, димоксистробін, пікоксистробін та піраклостробін з картриджу 2 мл ацетонітрилу для ВЕРХ у грушоподібну колбу місткістю 10 мл. Розчинник випаровують на ротаційному випарнику при температурі водяної бані не вище 45 °C до об'єму (0,2-0,3) мл, потім до сухого залишку струменем сухого повітря. До сухого залишку у грушоподібну колбу місткістю 10 мл додають 1 мл ацетонітрилу для ВЕРХ, перемішують. Кінцевий об'єм екстракту проби - 1 мл. Аналогічно готують паралельну пробу. Підготовка та кондиціювання колонки для рідинної хроматографії: Колонку хроматографічну сталеву (2504,6) мм, заповнену Нуклеосилом С18 (100-5), стабілізують при температурі 30 °C та об'ємній витраті рухомої фази 0,8 мл/хв впродовж 30 хвилин. Включають детектор та чекають стабільності базової лінії (10-15) хвилин. Умови роботи хроматографа: рідинний хроматограф "Шимадзу" або подібний з УФ-детектором; колонка хроматографічна сталева (2504,6) мм, заповнена Нуклеосилом С18 (100-5); рухома фаза - суміш ацетонітрил+бідистильована вода+метанол (65+30+5, об+об+об); об'ємна витрата рухомої фази - 0,8 мл/хв; довжина хвилі ультрафіолетового детектора - 280 нм; температура термостата колонки - 30 °C; об'єм петлі інжектора рідинного хроматографа - 20 мкл. Час утримування за даних умов, хв: піметрозину - 3,7±0,1; азоксистробіну - 6,5±0,1; димоксистробіну - 8,2±0,1; пікоксистробіну - 9,1±0,1; піраклостробіну - 11,0±0,1. Етапи способу одночасного визначення досліджуваних пестицидів в одній пробі води узагальнені в таблиці. Таблиця Спосіб визначення досліджуваних пестицидів в одній пробі води Етапи визначення Підготовка до екстракції Екстракція Підсушування Концентрування Дії на даному етапі До 200 мл води додають 0,5 мл ацетонітрилу, 5 мл буферного розчину*, ретельно перемішують. *Приготування буферного розчину з рН 9: на технічних вагах зважують (4,77±0,01) г декагідрату тетраборату натрію, переносять у мірну колбу місткістю 1000 мл, змиваючи скельце для зважування 100 мл дистильованої води. Додають 400 мл дистильованої води та перемішують на апараті для струшування до повного розчинення солі. До розчину додають 0,14 мл концентрованої хлороводневої кислоти, доводять розчин до мітки дистильованою водою та ретельно перемішують. Пробу переносять в резервуар, приєднаний до картриджу С 18, підключають вакуум і пропускають розчин зі швидкістю (3-5) мл/хв. Розчин, що пройшов через картридж, відкидають. Картридж висушують, пропускаючи повітря впродовж 1 хв. Елююють піметрозин, азоксистробін, димоксистробін, пікоксистробін та піраклостробін з картриджу 2 мл ацетонітрилу для ВЕРХ у грушоподібну колбу місткістю 10 мл. Розчинник випаровують на ротаційному випарнику при температурі водяної бані не вище 45 °C до об'єму (0,2-0,3) мл, потім до сухого залишку струменем сухого повітря. Підготовка проби до вводу у Сухий залишок розчиняють в 1 мл ацетонітрилу для ВЕРХ. хроматограф 2 UA 119413 U Продовження таблиці Етапи визначення Хроматографування (умови) Дії на даному етапі Рідинний хроматограф "Шимадзу" або подібний з УФ детектором; колонка хроматографічна сталева (2504,6) мм, заповнена Нуклеосилом С18 (100-5); рухома фаза суміш ацетонітрил+бідистильована вода+метанол (65+30+5, об+об+об); об'ємна витрата рухомої фази - 0,8 мл/хв; температура термостата колонки - 30 °C; довжина хвилі ультрафіолетового детектора - 280 нм; об'єм петлі інжектора рідинного хроматографа - 20 мкл. Час утримування за даних умов, хв: піметрозин - 3,7±0,1; азоксистробін - 6,5±0,1; димоксистробін - 8,2±0,1; пікоксистробін - 9,1±0,1; піраклостробін - 11,0±0,1. 5 10 15 20 25 30 35 Кількісне визначення піметрозину, азоксистробіну, димоксистробіну, пікоксистробіну та піраклостробіну здійснюють методом абсолютного калібрування. Для цього необхідно для кожного пестициду побудувати градуювальну залежність площі його хроматографічного піка від масової концентрації в градуювальному розчині суміші цих пестицидів. Побудова градуювальних залежностей для піметрозину, азоксистробіну, димоксистробіну, пікоксистробіну та піраклостробіну: Готують 5 градуювальних розчинів суміші з масовими концентраціями піметрозину та піраклостробіну 0,02; 0,04; 0,08; 0,2; 0,4 мкг/мл; азоксистробіну, димоксистробіну та пікоксистробіну - 0,1; 0,2; 0,4; 1,0; 2,0 мкг/мл. Ці градуювальні розчини хроматографують тричі в умовах, наведених в таблиці. Спочатку проводять хроматографічний аналіз розчину кожного пестициду для подальшої ідентифікації його піка на хроматограмі суміші. Ідентифікацію піків піметрозину, азоксистробіну, димоксистробіну, пікоксистробіну та піраклостробіну в розчинах суміші проводять відповідно до часу утримування кожного з п'яти пестицидів (табл.). На хроматограмах за допомогою програмного забезпечення для обробки даних фіксують піки в області часу утримування піметрозину, азоксистробіну, димоксистробіну, пікоксистробіну та піраклостробіну і визначають площі відповідних піків. Обчислюють середнє значення площі піків кожного пестициду з 3 паралельних вимірювань. Отримані результати обробляють за методом найменших квадратів. Градуювальна залежність описується рівнянням [2]: Sгр  a  b  гр , де Sгр - площа піка піметрозину, азоксистробіну, димоксистробіну, пікоксистробіну та піраклостробіну, умовні одиниці (ум. од.); гр - масова концентрація піметрозину, азоксистробіну, димоксистробіну, пікоксистробіну та піраклостробіну в градуювальному розчині суміші, мкг/мл; a - масштабний коефіцієнт відповідної градуювальної залежності; b - коефіцієнт регресії. Градуювальну залежність вважають задовільною, якщо значення коефіцієнта кореляції знаходиться в межах від 0,8 до 1,0. Виконання вимірювань: Проби хроматографують тричі за умов, наведених в таблиці. Використовуючи відповідну градуювальну залежність, обчислюють масову концентрацію 3 (n ) , мг/дм , піметрозину, азоксистробіну, димоксистробіну, пікоксистробіну та піраклостробіну для кожної з паралельних проб за формулою [2]: S  a Vпр n  n  b V де n - номер паралельної проби (n  12) ; , 3 UA 119413 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Sn - середнє значення площі піка піметрозину, азоксистробіну, пікоксистробіну та піраклостробіну в пробі, ум. од.; a - масштабний коефіцієнт відповідної градуювальної залежності; b - коефіцієнти регресії; Vпр - кінцевий об'єм екстракту проби, мл; димоксистробіну, V - об'єм проби води, мл. Результат обчислень заокруглюють до другої значущої цифри. Обробка результатів вимірювань: За результат вимірювань масової концентрації піметрозину, азоксистробіну, 3 димоксистробіну, пікоксистробіну та піраклостробіну в пробі () , мг/дм , приймають середнє значення двох паралельних визначень масової концентрації кожного пестициду. Запропонований спосіб дозволяє скоротити ряд операцій, має більш високу продуктивність у порівнянні з раніше розробленими способами, дозволяє прискорити, спростити виконання та знизити вартість дослідження вмісту пестицидів у воді. Розробка та апробація способу, що заявляється, проводились в Інституті гігієни та екології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця. Джерела інформації: 1. Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні. - Офіц. вид. - К.: Юнівест Медіа, 2016. - 1023 с. 2. Методичні вказівки з визначення піметрозину у воді методом високоефективної рідинної хроматографії: MB № 1446-2015, погоджено Т.в.о. головного державного санітарного лікаря України від 28.12.2015 № 04.03-08-6882/17, затверджено Міністерством екології та природних ресурсів України 26.01.2016, Наказ № 36. 3. Методичні вказівки по визначенню азоксистробіну у воді, ягодах винограду, виноградному вині і соку методом високоефективної рідинної хроматографії: MB № 230-2001 // Методичні вказівки з визначення мікрокількостей пестицидів в продуктах харчування, кормах та навколишньому середовищі. - К., 2004. - № 36. - С. 14-19. 4. Методичні вказівки з визначення дімоксистробіну у воді методом високоефективної рідинної хроматографії: MB № 839-2008 // Методичні вказівки з визначення мікрокількостей пестицидів в харчових продуктах, кормах та навколишньому середовищі. - К., 2011. - № 74. - С. 84-97. 5. Методичні вказівки з визначення пікоксистробіну у воді методом газорідинної хроматографії: MB № 1017-2010 // Методичні вказівки з визначення мікрокількостей пестицидів в харчових продуктах, кормах та навколишньому середовищі. - К., 2015. - № 90. - С. 180-193. 6. Методичні вказівки з визначення нікобіфену та піраклостробіну у воді методом високоефективної рідинної хроматографії: MB № 452-2003 // Методичні вказівки з визначення мікрокількостей пестицидів в продуктах харчування, кормах та навколишньому середовищі. - К., 2007 рік. - Збірка № 45. - С 104-116. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб одночасного визначення залишкових кількостей пестицидів в пробі води, що включає підготовку проби води до екстракції, проведення твердофазної екстракції, концентрування та хроматографічний аналіз екстрактів проб води методом високоефективної рідинної хроматографії, який відрізняється тим, що спочатку здійснюють хроматографування розчину кожного з пестицидів для ідентифікації за часом утримування, потім проводять хроматографування розчину суміші пестицидів з отриманням чіткого розділення піків та визначають кількість кожного з пестицидів за градуювальною залежністю площі його хроматографічного піка від концентрацій в градуювальних розчинах суміші пестицидів. 50 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4