Сполуки, що мають ауксинову дію, та спосіб їх одержання

1 Сполуки загальної формули (І) де R = Ri = H, метил або R = H, R-i = метил у 2 або З, або 4, або 6 положенні, п = 2, X = Zn(ranoreH)2, де галоген - СІ, І, що мають ауксинову дію 2 Спосіб одержання сполук формули (І) X де R = метил, Ri = Н, метил у 2 або 3, або 4, або 6 положенні, п = 2, X = Zn(ranoreH)2, де галоген - СІ, І, що включає реакцію сполуки формули (II) R О ,R1 X де R, Ri - як указано вище, з хлоридом або йодидом цинку (О (О ю Винахід належить до виробництва і застосування похідних N-окису піридину загальної формули, X 56161 4 де R = Ri = H, алкіл (СНз), або R = Н, Ri-алкіл солі ді (N-окису 4-метилпіридин)цинк(ІІ)йодиду, (СНз) у 2, 3, 4 або 2, 6 положеннях 1205см 1 (V N0 ), 8 3 5 С М 1 (pNO), 1035см 1 (VCN), 1625см 1 (Vc=c) Для ді (N-окису 4п= 2 метилпіридин)цинк(ІІ)хлориду, 1203см 1 (VNO), X = Zn (галоід)2 де галоїд = СІ, J, які мають ау835см 1 (pNO), 1015см 1 (VCN), 1 6 2 5 C M 1 (V C =C) ДЛЯ ксинову дію і можуть використовуватись у бютехДІ (N-окису 3-метилпіридин)цинк(ІІ)йодиду що занологм та інших галузях народного господарства свідчує на користь пропонованих структур В літературі описано тільки комплекс N-окису піридину з цинком хлористим, який був використаДля кращого розуміння винаходу наводимо ний для теоретичного вивчення структури цієї споконкретні приклади луки [1] Додаткових літературних даних про Приклад 1 Спосіб отримання ді (N-окис пірисинтез та використання вищезазначених сполук, дин)цинк(ІІ)хлориду які мають ауксинову активність не виявлено НайУ трьохгорлому реакторі, ємкістю 2л, оснащеближчими аналогами по дм в ному зворотнім холодильником, мішалкою і крапе1) 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота (еталонльною лійкою, розчиняють 190,2г (2М) N-окису 1) або и ПОХІДНІ солі, які рекомендовані для викопіридину у 400мл метанолу До розчину протягом ристання у сільському господарстві як гербіциди 8 хв додають, при ретельному перемішуванні і [2] або в біотехнологм [3] як стимулятори росту, температурі не вище 30°С, розчин 136,3г (1М) хлористого цинку у 450мл метанолу Реакційну 2) феніксиоцтова кислота (еталон-2), яка ремасу витримують при кімнатній температурі 25 хв, комендована як препарат, що мав ауксинову актиа потім кип'ятять 20 хв Розчинник упаровують на вність для використання у поживних середовищах 2/3 об'єму, охолоджують, а залишок фільтрують і у біотехнологм рослин [4] промивають 2 рази по 50мл ацетоном Вихід ді (NГоловними недоліками еталону-1 є окис піридин)цинк(ІІ)хлориду 316,7г (97%), темпе- можливість утворення у процесі синтезу надратура плавлення 160 - 161 °С (з метанолу) Знайто токсичних супровідних речовин, які суттєво задено, % С - 36,6, Н - 3,2, N - 5,7, СІ - 21,5, бруднюють навколишнє середовище і ШКІДЛИВІ ДЛЯ здоров'я людини, - використання еталону-1 у бютехнолопчних Підраховано, % С - 36,78, Н - 3,08, N - 8,58, СІ дослідах має значні обмеження у зв'язку з гербі-21,71 цидним впливом на регенераційні процеси, особПриклад 2 Спосіб отримання ді (N-окис піриливо у дводольних видів рослин і потребує додатдин)цинк(ІІ)йодиду кових трудоемких засобів по вилученню цього В умовах аналогічних попередньому досліду препарату зі складу поживних середовищ при ви(приклад 1) з 190,2г (2М) N-окису піридину і 319,2г рощуванні in vitro [5] (1М) цинку йодистого отримують 499,2г (98%) ді Еталон-2 на відміну від запропонованих спо(N-окису піридин)цинк(ІІ)йодиду з температурою лук виявив значно меншу ефективність, як стимуплавлення 139 - 140°С (з метанолу) Знайдено, % лятор ауксинової дії (Табл 2, Табл 4) при провеС - 23,3, Н - 2,1, N - 5,6, J - 69,2, С ю Н ю ^ С ^ п ^ денні бютестів на відібраних рослинних об'єктах Підраховано, % С - 23,57, Н - 1,98, N - 5,49, J 69,45 Завданням цього винаходу є пошук нових сполук, що мають більш високу ауксинову активність Приклад 3 Спосіб отримання ді (N-окис 2 мена відміну від еталонних препаратів для використил піридин)цинк(ІІ)йод йду тання в біотехнологм та інших галузях народного В умовах аналогічних попередньому досліду господарства Вирішення цього завдання стає мо(приклад 1) з 218,3г (2М) N-окису 2 метилпіридину жливим за рахунок синтезу нових похідних N-окису і 319,2г (1М) цинку йодистого отримують 521,3г піридину, N-окису алкілпіридинів з солями цинку, а (97%) ді (N-окис 2-метилпіридин)цинк йодиду з також проведення ДОСЛІДІВ ПО вивченню їхньої температурою плавлення 146 - 147°С (з метаноауксинової дії Запропоновані сполуки СТІЙКІ при лу) Знайдено, % С - 26,6, Н - 2,7, N - 5,4, J - 47,4, збереженні, добре розчинюються у воді, не гігроскопічні і вибухобезпечні Підраховано, % С - 26,82, Н - 2,62, N - 5,21, J Структура запропонованих сполук підтвер47,22 джена елементним аналізом і ІЧ спектрами знятиПриклад 4 Спосіб отримання ді (N-окис 2,6ми на спектрофотометрі SPECORD М 80 диметилпіридин)цинк(ІІ)хлориду Присутність смуг поглинання у спектрах проВ умовах аналогічних попередньому досліду понованих сполук при 1210см 1 (VNO), 840СМ 1 (приклад 1) з 246,3г (2 М) N-окису 2,6(pNO), 1010см (VCN), 1 6 0 8 C M (V =C), 9 3 0 С М диметилпіридину і 136,3г (1М) цинку хлористого (рСНг) для ді (N-окису З метил піриотримують 374,9г (98%) ді (N-окис 2,6дин)цинк(ІІ)хлориду, 1203см 1 (V N0 ), 830см 1 (pNO), диметилпіридин)цинк(ІІ)хлориду в температурою 1028см (VCN), 1 6 1 5 C M (V =C), 9 2 2 C M (рСН ) для плавлення 251 - 253°С (з метанолу) Знайдено, % ді (N-окису 2,6-диметилпіридин)цинк(ІІ)хлориду, С-44,1, Н - 4,6, N-7,5, СІ-10,6, CuHie^C^ZnCh 1203см 1 (VN0), 8 5 0 С М 1 (pNO), 1035см 1 (VCN), Підраховано, % С - 43,95, Н - 4,74, N - 7,32, СІ 1618см 1 (Vc=c) Для ді (N-окису 2-10,53 метилпіридин)цинк(ІІ)йодиду, 1205см 1 (VNO), Приклад 5 Спосіб отримання ді (N-окис З840см 1 (pNO), 1035см 1 (VCN), 1 6 1 9 C M 1 (V C =C) ДЛЯ метилпіридин)цинк(ІІ)хлориду В умовах аналогіч1 ДІ (N-окису піридин)цинк(ІІ)хлориду, 1215см (VNO), них попередньому досліду (приклад 1) з 210,3г 835см 1 (pNO), 1025см 1 (VCN), 1 6 1 5 C M 1 (V C =C) ДЛЯ (2М) N-окис 3-метилпіридину і 136,3г (1М) цинку 1 ДІ (N-окису піридин)цинк(ІІ)йодиду, 1209см (VNO), хлористого отримують 343,9г (97%) ді (N-окис З1 1 1 835см (pNO), 1035см (VCN), 1 6 2 5 C M (VC=C) ДЛЯ метилпіридин)цинк(ІІ)хлориду з температурою 1 1 1 C 1 1 1 C 2 56161 плавлення 123 - 125°С Знайдено, % С - 40,8, Н 4,2, N - 8,0, СІ - 20,5, Ci 2 Hi 4 N 2 O 2 ZnCI 2 Підраховано, % С - 40,65, Н - 3,98, N - 7,90, СІ - 20,38 Приклад 6 Спосіб отримання ді (N-окис Зметилпіридин)цинк(ІІ)йодиду В умовах аналогічних попередньому досліду (приклад 1) з 210,3г (2М) N-окису 3-метилпіридину і 319,2г (1М) цинку йодистого отримують 532,0г (99%) ді (N-окис 3-метилпіридин)цинк(ІІ)йодиду з температурою плавлення 149 - 150 °С (з метанолу) Знайдено, % С - 26,9, Н - 2,5, N - 5,3, J - 47,1, Підраховано, % С - 26,82, Н - 2,62, N - 5,21, J 47,22 Приклад 7 Спосіб отримання ді (N-окис 4метилпіридин)цинк(ІІ)хлориду В умовах аналогічних попередньому досліду (приклад 1) з 109,3г Nокису 4-метилпіридину і 50,2г (0,5М) цинку хлористого отримують 171,9г (97%) ді (N-окис 4метилпіридин)цинк(ІІ)хлориду з температурою плавлення 198 - 201 °С (з метанолу) Знайдено, % С - 40,4, Н - 4,1, N - 7,8, СІ - 20,5, Ci 2 H u N 2 O 2 ZnCI 2 Підраховано, % С - 40,65, Н - 3,98, N - 7,90, СІ - 20,38 Приклад 8 Спосіб отримання ді (N-окис 4метилпіридин)цинк(ІІ)йодиду В умовах аналогічних попередньому досліду (приклад 1) з 109,3г (1М) N-окису 4-метилпіридину і 159,6г (0,5М) цинку йодистого отримують 260,0г (98%) ді (N-окис 4-метилпіридин)цинк(ІІ)йодиду з температурою плавлення 192 - 194°С (з метанолу) Знайдено, % С - 26,7, Н - 2,7, N - 5,1, J - 47,4, Підраховано, % С - 26,82, Н - 2,62, N - 5,21, J 47,22 Приклад 9 Тестування препаратів на біологічну активність Приготування рослинного матеріалу і методика проведення досліду (біотестів) Ауксинова дія препаратів вивчалася у культурах тканини і клітин вищих рослин In vitro у зв'язку з дослідженнями морфогенетичних потенцій цих двох типів культур, як біологічних систем здатних до регенерації рослин Одна (перша) біологічна система пов'язана з використанням меристематичних тканин культури експлантів ппокотилів, інша (друга) система пов'язана з використанням соматичних клітин культури протопластів мезофіла листків Обидві біологічні системи дозволяють постадійно простежити процес детермінації стеблового морфогенезу і послідуючу реалізацію програми розвитку у сформованих de novo рослин регенерантів Як відомо, згідно запропонованих принципів гормональної регуляції у культурах тканини і клітин in vitro [6], будь-який морфогенетичний процес контролюється концентраційними співвідношеннями екзогенних фітогормонів ауксинів і ЦИТОКІНІНІВ у поживному середовищі У зв'язку з чим ауксинам відводиться регуляторна роль у процесах елонгації і поділу клітин [7] Елонгація клітин з надзвичайно швидкою реакцією рослин на обробку ауксинами і вже починається черев 10 - 15 хв [7] Окрім швидкої реакції існують більш тривалі за часом, які наступають після латентного періоду протягом від декілька годин до декілька діб Довго 6 тривалою реакцією є клітинний поділ, диференціровка і морфогенез [7] Згідно мети проведених досліджень, при тестуванні та статистичному аналізі результатів біотестів нами враховувались тільки довготривалі морфофізюлопчні наслідки впливу проаналізованих препаратів ВІДПОВІДНО З існуючими критеріями оцінки, які застосовуються відносно до ауксинів [7] Як об'єкти дослідження нами було відібрано чотири сорти капусти білоголової, які відрізняються різними морфогенетичними властивостями у культурі in vitro, а також строками вегетації у польових умовах Зокрема, три сорти пізньостиглої капусти Харківська зимова, Українська осінь і Ярославна селекції Інституту овочівництва і баштанництва УААІІ та один сорт ранньостиглої капусти Дітмаршер Фрюер (Dithmarscher Fruher) селекції фірми "Nunhems zaden" (Голландія) Спосіб статистичного обрахунку результатів, приготування рослинного матеріалу та гормональних поживних середовищ при проведенні біотестів у культурі експлантів ппокотилів Застосування у бютестах ппокотилів капусти обумовлено тим, що цей вид рослинної тканини вміщує у своїй структурі клітини латеральної меристеми, з якої під впливом як природного (зеатин), так і синтетичних екзогенних ЦИТОКІНІНІВ (БАП, кінетин та ш) формуються адвентивні пагони при культивуванні в асептичних умовах Тому у якості контролю використовувалось поживне середовище, що вміщувало 1мг/л БАП для індукції адвентивних пагонів ДОСЛІДНІ ПОЖИВНІ середовища відрізнялися від контрольного тим, що мали у своєму гормональному складі 1мг/л БАП та додатковий вміст аналізованих препаратів ауксинової дм у різних концентраціях Для приготування асептичної культури експлантів ппокотилів насіння вищевказаних сортів капусти спочатку поверхнево стерилізували послідовним зануренням у 70% розчин етанолу (1 хв), а потім у розчин ппохлориду кальцію з концентрацією ЗОг/л активного хлору (10 хв), що вміщував 0,1% Tween-20 Далі насіння тричі відмивали у стерильній дистильованій воді протягом 10 - 20 хв та висаджували на безгормональному поживному середовищі МС [8] і розміщували у темряві для пророщування при 25°С Протягом 7 - 9 діб культивування насіння проростало і формувало стерильні рослини з надмірно подовженими етюльованими ппокотилями Потім ГІПОКОТИЛІ З пророщеної розсади розрізали на сегменти довжиною 5 - 7мм і висаджували на агаризоване поживне середовище МС, доповнене аналізованими препаратами ауксинової дм у різних концентраціях Для одного варіанту досліду 15 експлантів ппокотилів одного сорту капусти розміщували на одну чашку Петрі з поживним середовищем Культивування експлантів проводили в умовах 16-годинного фотоперіоду на розсіяному СВІТЛІ З НИЗЬКОЮ інтенсивністю (500 люкс) і при ПОСТІЙНІЙ температурі повітря 25°С Фенологічні спостереження за розвитком культури проводились щодобово, а підрахунок КІЛЬКОСТІ сформованих адвентивних пагонів після 2-х МІСЯЦІВ культивування Для приготування гормональних поживних середовищ використовували заздалегідь приготов 56161 лені концентровані ВИХІДНІ розчини аналізованих препаратів Усі речовини розчиняли в універсальному розчиннику ДМСО (диметилсульфоксид) з розрахунку 1мг речовини на 1мл розчинника Додавання речовин у поживні середовища проводили в асептичних умовах після автоклавування і охолодження останніх до 40 - 50°С Для вивчення стимуляторної дії кожен аналізований препарат випробували у 4-х концентраціях 0,25, 0,5, 1 та Змг/л ВІДПОВІДНО За еталонні ауксини було прийнято фенольні стимулятори 2,4Д (2,4-дихдорфеноксиоцтова кислота) і ФОК (фенілоцтова кислота) Під час проведення тестових аналізів враховувався статистичний показник формування вегетативного потомства коефіцієнт розмноження (КР) - КІЛЬКІСТЬ утворених адвентивних пагонів на один культивований експлант ппокотилів Для підрахунку КР використовували статистичний спосіб оцінки результатів досліджень, який враховував дискретне варіювання цієї контрольованої ознаки [10] Для однієї аналізованої сполуки дослід проводили у трикратній повторності Спосіб статистичного обрахунку результатів, приготування рослинного матеріалу та гормональних поживних середовищ при проведенні бютестів у культурі мезофільних протопластів Для бютестів у культурі мезофільних протопластів використовували рослини сорту Дітмаршер Фрюер, які вирощували в умовах in vitro Для отримання мезофільних протопластів використовували листя 3 - 4 тижневих рослин Тканину листа розрізали на смуги 1мм завширшки та шкубували у ферментному розчині, що вміщував 0,5% Macerozyme ("Calbiochem", США), 0,5% Onozuka R-10 ("Jacult Biochemicals", Японія), 0,5М сахарози та 5мМ СаСЬ (рН 5,6) в темряві при 28°С протягом 16 - 18 год Ізольовані протопласти відокремлювали від залишків тканини шляхом фільтрування через металеві фільтри з діаметром пор 64мкм Фільтрат переносили в центрифужні пробірки на Юмл та центрифугували зі швидкістю 700 обертів/хв протягом 7 хв Кільце флотованих протопластів відбирали пастерівською піпеткою та відмивали не менше двох разів в середовищі W5 (Medgyesy et al 1980), осаджуючи їх кожного разу центрифугуванням протягом 5 хв при 700 обертів/хв Після ЦЬОГО відбирали надосадочну рідину та культивували протопласти в рідкому поживному середовищі з попередньою фіксацією в алпнатній ПЛІВЦІ ВІДПОВІДНО Damm and Willmitzer (1988) Для цього до протопластів додавали 0,5М манітолу так, щоб концентрація протопластів складала 80 х 104 клітин/мл Суспензію протопластів змішували з однаковим об'ємом 2,8%-ного розчину алпнату натрію в 0,4М манітолі У подальшому 1мл суміші переносили в чашки Петрі діаметром 50мм з агаризованим середовищем, яке вміщувало 20мМ СаСЬ в 0,4М манітолі та розподіляли по поверхні середовища так, щоб внаслідок присутності ІОНІВ Са 2+ утворилась тонка алпнатна плівка з іммобілізованими в ній протопластами Після процедури фіксації в альпнатній ПЛІВЦІ культури переносили на рідке поживне середовище ТМНОд2 (Табл 1), що вміщувало препарати ауксинової та ЦИТОКІНІНОВОІ дій для стимуляції цитокшезу клітин Для подаль 8 шого формування калусної культури, утворенні мікроколонм клітин на стадії 3-го та 4-го мітотичних ЦИКЛІВ ПереНОСИЛИ На ріДКе СереДОВИЩе ТМнодЗ (Табл 1) для дорощування Середовище ТМНОдз повністю поновлювали кожні 10 днів і використовували до утворення колоній діаметром 0,5 1,5мм Після ЧОГО алпнатну плівку розчиняли за допомогою 0,ЗМ розчину цитрату натрію в 0,4М манітолу Потім КОЛОНІЇ КЛІТИН переносили на агаризоване регенераційне середовище ТМНОд4 (Табл 1) і вирощували при 25°С на СВІТЛІ інтенсивністю 5клкта фотоперіодом 16 год Калус пересаджували кожні два тижні на свіже поживне середовище ТМНод4 Рослини, що регенерували, переносили на безгормональне середовище МС для укорінення Протягом усього періоду культивування для визначення стимуляторної дії кожен аналізований препарат додавали у концентраціях 0,5мг/л у поживні середовища ТМНод2 і ТМнодз та 0,2мг/л у ТМ Н од4 Для підрахунку результатів бютестів враховували такі показники 1) час культивування ініціальних клітин до фази 1-го мітотичного циклу (в добах) на середовищі ТМ Н од2, 2) ефективність висіву протопластів (ЕВП) оцінювали у відсотках як співвідношення КІЛЬКОСТІ калусних колоній, що сформувалися на середовищі ТМнодз до загальної КІЛЬКОСТІ протопластів, 3) частоту регенерації (ЧР) визначали у відсотках як співвідношення КІЛЬКОСТІ калусних колоній, здатних до морфогенезу на середовищі ТМНОд4 до загальної КІЛЬКОСТІ отриманих колоній на середовищі ТМнодЗ При проведенні бютестів до складу поживних середовищ ТМНод2 і ТМнодз було введене нафтилоцтову кислоту (НОК), як препарат ауксинової дії, додавання якого у експериментально підібраному співвідношенні з еталонними фенольними ауксинами індукувало одночасні елонгацію і цитокшез клітин (Табл 3), що є необхідною передумовою росту мікроколоній клітин При чому, як свідчать результати попередніх ДОСЛІДІВ використання тільки однієї НОК разом з ЦИТОКІНІНОМ БАП викликає тільки елонгацію клітин без ініціації клітинного поділу протопластів (Табл 3) Тому тестування аналізованих препаратів проводилось з метою порівняльного аналізу з дією еталонних фенольних ауксинів на індукцію цитокшезу клітин у такому ж поєднанні з НОК Для однієї аналізованої сполуки дослід проводили у трикратній повторності Використані у бютестах БАП (бензиламшопурин), зеатин, НОК, 2,4-Дта ФОК виробництва компанії "Sigma" (США) Порівняльний аналіз еталонних і запропонованих препаратів на ауксинову дію у культурах експлантів ппокотилів і мезофільних протопластів Як свідчать результати досліджень на двох типах культур усі аналізовані препарати виявили притаманну ауксинам регуляторну дію, яка за своїм характером більше відповідає довготривалим фізіологічним реакціям рослинних об'єктів на обробку екзогенними ауксинами Зокрема, у культурі мезофільних протопластів (Табл 4) запропоновані сполуки виявили адекватну дію еталонним препа 56161 ратам по 1) ініціації 1-го мітотичного циклу клітин на поживному СереДОВИЩІ ТМнод2, 2) індукції фізюлопчнорівнополярного поділу клітин у сформованих калусних клонів на поживному СереДОВИЩІ ТМнодЗ, 3) стимуляції цитокшезу клітин при подальшому нарощуванні калусних клонів до критичної маси, необхідної для пересіву на регенераційне поживне СереДОВИЩе ТМнод4 Додатково слід зауважити, що при вищезазначених стимуляторних діях застосування препаратів на регенераційному середовищі ТМНОд4 не виявило гербіцид ного впливу на проліферацію адвентивних пагонів на відміну від еталонного препарату 2,4-Д у випробуваній концентрації 0,2мг/л Відзначимо, також, значно кращі значення часу ініціації 1-го мітотичного циклу клітин, ЕВП та ЧР при застосуванні більшості аналізованих препаратів на відміну від еталонних (Табл 4) Як показали попередні досліди на двох типах культур застосовані препарати ауксинової дії, що є похідними нафтолу (це нафтилоцтова або ІНДОЛІЛОЦТОва кислоти (ІОК)) виявляють найбільший вплив на детермінацію меристематичних клітин корінців на відміну від досліджених фенольних сполук та похідних піридину Тому присутність НОК або ІОК у гормональному складі регенераційного поживного середовища для культури протопластів у випробуваній концентрації 0,2мг/л завжди стимулювало укорінення калусної тканини і знижувало и морфогенетичний потенціал що до утворення пагонів Культивування експлантів ппокотилів у присутності 0,2мг/л НОК або ІОК стимулювало одночасний розвиток пагонів та корінців тільки на ВІДПОВІДНИХ фізіологічних полюсах експлантів При такій одно 10 часній стимуляції ризогенезу у присутності вищезазначених ауксинів значно знижувалась КІЛЬКІСТЬ утворених адвентивних пагонів на двох типах культур (дані не наведені) і інколи навіть спонукало спонтанне повернення тканин до дедиференціального росту у культурі калусної тканини на середовищі ТМНод4 на відміну від аналізованих нами препаратів іншого синтетичного походження Морфогенетичні наслідки впливу аналізованих препаратів у культурі експлантів ппокотилів наведені у Таблиці 2 Як свідчать ці результати, додавання препаратів у концентраціях від 0,25 до 0,5мг/л, а інколи і до 1мг/л загалом підвищувало КІЛЬКІСТЬ утворених адвентивних пагонів у порівнянні з контролем (поживним середовищем, що вміщувало тільки екзогенний ЦИТОКІНІН) у декілька разів При цьому спостерігалась тенденція до пропорційного вростання показника КР ВІДПОВІДНО вмісту аналізованої сполуки Але при випробуванні високих концентрацій препаратів від 1 до Змг/л (для деяких препаратів тільки Змг/л) відбувалося зниження регенераційних властивостей меристематичних тканин, інколи до її повної відсутності при тестуванні окремих сполук Застосування еталонного препарату 2,4-Д виявило гербіцидний вплив цієї сполуки на регенерацію пагонів на всіх досліджених концентраціях Слід відзначити, що збільшення концентрації цитокінша ВАП більше, ніж 1мг/л не призводить до зростання показника КР, а навпаки пригнічує регенерацію рослин У попередніх дослідах по визначенню оптимального вмісту цитокініну було обрано контрольний варіант поживного середовища для бютестів саме з такою концентрацією ВАП Таблиця 1 Поживні середовища ДЛЯ культивування протопластів та регенерації рослин білоголової капусти Компоненти, мг/л* Макроелементи NH4NO3 KNO3 СаСІ 2 х2Н 2 О MgSO4 х 7Н2О КН2РО4 Fe-хелат №2ЭДТА FeSO4 х 7Н2О Мікроелементи НзВОз MnSO4 х 4Н2О ZnSO4 х 7Н2О Na 2 MoO 4 x2H 2 O KJ COSO4 х 5Н2О CuSO4 х 5Н2О Вітаміни та ш біологічно активні речовини мезошозит ТМ Н од2 ТМнодЗ ТМ Н од4 200 200 200 1500 1500 1500 440 440 440 370 370 370 170 170 170 37,3 37,3 37,3 27,8 27,8 27,8 3,0 0,025 ЗО 13,2 2,0 0,25 0,75 0,025 0,025 100 100 13,2 2,0 0,25 0,75 0,025 3,0 13,2 2,0 0,25 0,75 0,025 0,025 100 11 56161 12 Продовження таблиці 1 Компоненти, мг/л* ТМ Н од2 2 ТМнодЗ 2 ТМ Н од4 2 Ві 10 10 10 в6 1 1 1 1 1 1 150 500 500 500 500 ГЛІЦИН рр гідролізат казеїну глутамш ксилоза гормони НОК (нафти л-оцтова кислота) АС** БАП (бензил-амшопурин) зеатин сахара сахароза глюкоза РН 125 250 1,0 0,1 0,5 05 0,5 0,5 0,2 0,5 1 0 72000 (0,4М) 5,8 27000 (0,15М) 5,8 40000 90100 (0,5М) 5,8 * Примітка для культивування мезофільних протопластів сорту капусти Дітмаршер Фрюер було використано модифікований варіант поживного середовищ Шахіна ТМ-2 (Shahin, 1985) [8], зокрема для ініціації ЦИТОКІНезу КЛІТИН - ТМ Н од2, ДЛЯ НарОЩуваННЯ МІКрО КОЛОНІЙ - ТМнодЗ, ДЛЯ р е г е н е р а ц і ї РОСЛИН - ТМ Н О д4 ** Примітка АС - аналізовані сполуки, що додавалися у середовища для культивування протопластів з метою тестування їхньої ауксинової дії Таблиця 2 Вплив препаратів ауксинової дії на індукцію адвентивних пагонів досліджених сортів капусти у культурі експлантів ппокотилів Назва препарату бензиламшо-пурин (контроль) 2,4-дихлорфеноксиоцтова лота (еталон-1) феноксиоцтова лота (еталон-2) кис кис ді (N-окис 4метилпіридин) цинк(ІІ) хлорид ді (N-окис 2,6д и метил піридин) цинк(ІІ) хлорид ді (N-окис Зметилпіридин) цинк(ІІ) йодид ді (N-окис Зметилпіридин) цинк(ІІ) хлорид Концентрація препарату (мг/л) Значення статистичного показника коефіцієнта розмноження (КР) для досліджених сортів капусти для сорту Яродля сорту Харківська для сорту Українська славна зимова ОСІНЬ 1,0 1,12 + 0,47 1,05 + 0,23 0,80 + 0,56 0,25 0,5 1,0 3,0 0,25 0,5 1,0 3,0 0,25 0,5 1,0 3,0 0,25 0,5 1,0 3,0 0,25 0,5 1,0 3,0 0,25 0,5 1,0 3,0 0,0 0,0 0,0 0,0 3,60 ± 0,95 2,40 ± 0,68 0,80 ± 0,49 0,0 1,90 ±0,79 1,60 ±0,57 0,90 ± 0,57 1,10 ±0,66 2,50 ± 0,96 2,90 ±1,19 0,80 ± 0,76 0,0 4,60 ± 0,72 3,10 ±0,71 2,70 ± 0,43 1,70 ±0,63 4,90 ±1,99 5,30 ±1,64 6,50 ± 2,60 0,20 ±0,13 0,0 0,0 0,0 0,0 3,40 ± 0,79 4,56 ± 0,97 3,90 ±1,19 0,50 ± 0,47 2,10 ±0,82 2,87 ± 0,69 1,40 ±0,57 1,40 ±0,57 2,00 ± 0,74 2,50 ± 0,56 0,91 ±0,73 0,0 3,50 ± 0,79 3,10 ±0,75 2,40 ± 0,84 1,50 ±0,65 4,37 ± 2,07 4,66 ±1,14 4,10 ±0,87 0,39 ±0,12 0,0 0,0 0,0 0,0 1,60 ± 0 , 9 2 1,67 ± 1 , 0 2 0,20 ± 0 , 1 8 0,0 1,20 ± 1 , 0 7 3,40 ± 0,78 0,50 ± 0,46 0,20 ± 0 , 1 8 1,40 ± 0 , 5 9 0,80 ± 0,43 0,20 ± 0 , 1 4 0,0 2,00 ± 0,85 1,40 ± 0 , 7 8 1,00 ± 0 , 6 9 0,34 ± 0,43 3,50 ± 0,46 3,57 ± 0,29 2,50 ± 0,99 0,11 ± 0 , 2 1 13 56161 14 Продовження таблиці 2 Назва препарату Концентрація препарату (мг/л) 0,25 ді (N-окис піридин) цинк(ІІ) йодид 0,5 1,0 3,0 0,25 ді (N-окис 4метилпіридин) цинк(ІІ) йодид 0,5 1,0 3,0 0,25 ді (N-окис 2метилпіридин) цинк(ІІ) йодид 0,5 1,0 3,0 6,18 1,60 3,80 6,40 4,00 3,00 0,25 ді (N-окис піридин) цинк(ІІ) хлорид Значення статистичного показника коефіцієнта розмноження (КР) для досліджених сортів капусти для сорту Яродля сорту Харківська для сорту Українська славна зимова ОСІНЬ 4,90 ±1,81 4,60 ± 0,94 3,10 ± 0 , 8 7 11,10 ± 2, 63 9,70 ± 2,65 3,13 ± 1 , 3 8 2,20 ± 0,90 2,70 ± 0,68 1,90 ± 1 , 4 0 1,70 ±0,57 1,34 ± 0 , 4 1 1,00 ± 0 , 3 6 6,90 ± 2,06 5,10 ± 2 , 7 7 3,60 ± 1 , 9 8 9,40 ± 2,55 9,53 ± 1 , 7 4 2,80 ± 1 , 0 0 8,40 ± 2,03 8,60 ± 0 , 4 1 2,45 ± 0,23 3,22 ±1,65 2,54 ± 1 , 3 1 1,40 ± 0 , 6 4 2,60 ±1,17 2,40 ± 0,56 1,00 ± 0 , 3 5 6,50 ±1,67 4,80 ± 1 , 3 9 0,75 ± 0,65 0,5 1,0 3,0 3,70 2,18 2,98 5,34 4,02 1,67 ± 1,61 ±0,90 ±1,60 ±1,74 ±1,61 ± 2,05 ± 0,66 ±0,23 ±1,44 ± 0,92 ± 0,75 ±0,11 0,25 ± 0,22 0,25 ± 0,22 3,50 ± 1 , 5 2 1,20 ± 0 , 5 2 0,75 ± 0,65 0,20 ± 0 , 1 8 Таблиця З Вплив комбінованої дії ауксинових препаратів різного синтетичного походження на одночасні стимуляції елонгації, цитокінезута росту мікроколоніи клітин у культурі протопластів сорту капусти Дітмаршер Фрюер (за результатами роботи з еталонними препаратами) Досліджені комбінації гормонів поживних середовищ (мг/л) 2,4-Д ФОК НОК БАП 1,0 1,0 0,2 0,2 1,0 10 0,2 0,2 0,2 0,2 1,0 0,1 0,1 Морфофізюлопчні реакції клітин на застосованих поживних середовищах для культивування ТМ Н од2 ТМнодЗ ркв ркв ел ркв ркв ел ел, цтк, рмк ел, цтк, рмк 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 ел, цтк, рмк ел, цтк, рмк ел, цтк, рмк* ел, цтк, рмк* ркв ркв Умовні позначення до Таблиці 3 ркв - реакція клітин відсутня, ел - елонгація, цтк - цитокшез, рмк - ріст мікроколоніи клітин * Примітка вищезазначені морфофізюлопчні реакції спостерігались після пересіву сформованих мікроколоній на середовище ТМНОдз в середовища ТМНОд2, що мало такі гормональні співвідношення для ініціації елонгації та цитокшезу клітин 1,0мг/л НОК, 0,5мг/л БАП, 0,2мг/л 2,4 Д або 1,0мг/л НОК, 0,5мг/л БАП, 0,2мг/л ФОК Таблиця 4 Вплив аналізованих та еталонних препаратів ауксинової дії на ініціацію цитокінезута ріст мікроколоніи клітин на рівних стадіях культури мезофільних протопластів сорту капусти Дітмаршер Фрюер Назва препарату 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота (еталон-1) феноксиоцтова кислота (еталон-2) Значення застосованих показників стану культури протопластів на рівних стадіях культивування час культивування до ініціації ефективність висіву частота регенерації на 1-го мітотичного циклу на се- протопластів на серед Серед ТМНОд4 (ЧР, %) ред ТМНОд2 (У добах) ТМНодз (ЕВП, %) 7-8 5,57 ± 0,79 0,0 9-Ю 0,67 ±0,21 15,8 ± 1,19 15 56161 16 Продовження таблиці 4 Назва препарату ді (N-окис 4метил піридин) цинк(ІІ) хлорид ді (N-окис 2метил піридин) цинк(ІІ) йодид ді (N-окис Зметил піридин) цинк(ІІ) хлорид ді (N-окис 2,6д и метил піридин) цинк(ІІ) хлорид ді (N-окис піридин) цинк(ІІ) йодид ді (N-окис 4метил піридин) цинк(ІІ) йодид ді (N-окис 2метил піридин) цинк(ІІ) йодид ді (N-окис піридин) цинк(ІІ) хлорид N-окис піридину N-окис 2-метилпіридину N-окис 3-метилпіридину N-окис 4-метилпіридину N-окис 2,6диметилпіридину Значення застосованих показників стану культури протопластів на рівних стадіях культивування час культивування до ініціації ефективність висіву частота регенерації на 1-го мітотичного циклу на се- протопластів на серед Серед ТМмод4 (ЧР, %) ред ТМНОд2 (У добах) ТМмодз (ЕВП, %) 5-7 3,14 ± 1 , 5 6 23,6 ± 0,77 5-7 3,56 ± 2 , 5 1 42,8 ± 2,34 5-6 5,34 ± 0,35 47,2 ± 0 , 2 1 3-4 10,83 ± 0 , 5 4 65,0 ± 0,43 10-11 2,30 ± 0,56 7,3 ± 0 , 5 6 5-8 6,11 ± 0 , 2 8 57,8 ± 1 , 7 3 3-4 9,93 ± 1 , 4 7 68,6 ± 0,65 5-6 7,21 ± 0 , 6 4 44,7 ± 1 , 7 3 0 0 0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0 0,0 0,0 Література 1 Kida S , Quaghano J V Walmsley J A , Tyrel S V Spectrochimica Acta, 1963, vol 19, p 189-199 2 Мельников H H Пестициды М "Химия", 1987 229c 3 Dudits D , Gyorgyey J , Bogre L , Bako L Molecular Biology of Somatic Embryogenesis T A Thorpe (ed) In Vitro Embryogenesis in Plants, P 267 - 308 1995 Kluwer Academic Publishers Dordrecht Printed in the Hetherlands 4 Уоринт Ф , Филипс И Рост растений и дифференцировка М "Мир", 1984 512с 5 Дрейпер Дж Генная инженерия растений Лабораторное руководство М "Мир", 1991 408с 6 Skoog F , Miller W Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro, Symp Soc Biol 1957, 11, P 118 7 Theologis A Rapid gene regulation by auxin Rev Plant Physiol 1986 V 37, P 407 - 438 8 Murashige T , Skoog F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture Physiol plant 1962 V 15, P 473-497 9 Shahm E A Totipotency of tomato protoplast Theor Appl Genet 1985 V 69, P 235 - 240 10 Дегтярьова Н І Лабораторний і польовий практикум з генетики Київ, 1973 272с Підписано до друку 05 06 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24