2-b-d-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2н)-он (6-азацитидин) як інгібітор вірусу епштейна-барр

Реферат: 2--D-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-он Епштейна-Барр. (6-азацитидин) як інгібітор вірусу UA 68403 U (12) UA 68403 U UA 68403 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області медицини і пропонується для отримання препарату з антивірусною дією відносно вірусу Епштейна-Барр, а саме до 2--D-рибофуранозил-5-аміно1,2,4-триазин-3(2Н)-ону (6-азацитидину), який виявляє властивості антивірусної дії проти вірусу Епштейна-Барр і може використовуватися за новим призначенням для лікування хвороб, спричинених цим вірусом. На сьогоднішній день в медичній практиці використовується широкий спектр антигерпетичних препаратів, з них речовини, яким притаманна антивірусна активність проти вірусу герпесу людини 4 типу (вірус Епштейна-Барр, ВЕБ) складають невеликий відсоток [3]. ВЕБ інфекція є актуальною проблемою для різних галузей медицини, оскільки доведено роль цього вірусу в етіології розвитку інфекційного мононуклеозу, лімфопроліферативних захворювань (лімфома Беркітта, неходжкінські лімфоми та ін.), патології центральної і периферійної нервової системи [14]. Лікарські препарати, призначені для використання в клініці проти ВЕБ, обмежуються ацикловіром і ганцикловіром, [3, 12] та їхнє застосування ускладнюється такими побічними ефектами як висока токсичність і набуття вірусом резистентності до препаратів. Крім того, що аналогам нуклеозидів властива антивірусна активність, вони ще є індукторами апоптозу [11, 13, 16, 17]. Механізм індукції апоптозу різний. Так, наприклад, цидофовір, ганцикловір запускають каспазний каскад апоптозу [11, 18], азидотимідин діє через інгібування ядерного фактора NF-В [13]. У ряді робіт [11, 16, 18] показано, що аналоги нуклеозидів індукують апоптоз лімфобластоїдних і епітеліальних пухлинних клітин, етіологію яких пов'язують з ВЕБ. Ацикловір вибраний при дослідженні як стандарт аналога по антивірусній активності 6азацитидину. В основу корисної моделі поставлена задача пошуку такого засобу, який ефективно інгібує реплікацію ВЕБ у порівнянні з ацикловіром і стимулює елімінацію пошкоджених клітин шляхом апоптозу. Ця задача вирішується застосуванням 2--D-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин3(2Н)-ону (6-азацитидину). 6-Азацитидин (2--D-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-он) з м. м. 244,2 представляє собою структурний аналог природного цитидину [1]. Механізм його дії полягає в інгібуванні реплікації вірусної ДНК, а також пригніченні синтезу структурних вірусних білків [5, 8]. У ряді робіт [2, 5, 9, 10] були проаналізовані даний аналог нуклеозиду і його похідні і показана їх інгібуюча дія на репродукцію аденовірусів серотипів 1, 2 та 5, вірусу простого герпесу 1 типу, цитомегаловірусу, вірусу грипу, але в літературі немає відомостей про його дію на вірус Епштейна-Барр. Інгібуючу активність 6-АЦ по відношенню до вірусу Епштейна-Барр вивчали в культурі клітин Rajі - В-лімфоцити людини, які одержано з Банку культур клітин Інституту вірусології РАМН (м. Москва). Культуру клітин Raji вирощували на ростовому середовищі, яке складалося з 90 % середовища RPMI 1640 ("Sigma", США), 10 % ембріональної сироватки теляти ("Sigma", США), пеніциліну (100 мкг/мл), стрептоміцину (100 мкг/мл), L-глютаміну (2 мМ), в термостаті при 37 °C з додаванням 5 % СО2. Як аналог по антивірусній активності використовували ацикловір (Acycloguanosine (lot 117F0756), м. м. 225,2, виробництва "Sigma", США. 6-АЦ та ацикловір розчиняли в середовищі RPMI-1640, фільтрували через стерилізуючі фільтри фірми "Sarstredt", Німеччина, з розміром пор 0,22 мкм. Робочі розведення 6-АЦ та ацикловіру готували на ростовому середовищі (90 % середовища RPMI-1640, 5 % сироватки ембріона теляти та антибіотики). Приклад 1. Визначення цитотоксичної дії препарату. Цитотоксичну дію препарату визначали в системі лімфобластоїдних клітин Raji з використанням методу фарбування 0,4 % трипановим синім ("Sigma", США). Даний фарбник здатний проникати через мембрану мертвої клітини, при цьому живі клітини залишаються інтактними до нього. Особливу увагу приділяли стандартизації умов експериментів. Кожна концентрація аналізувалась в чотирьох повторах з обов'язковим включенням контрольних зразків без внесення речовини. В результаті вираховували цитотоксичну дозу (СД 50), тобто концентрацію препарату, яка знижує життєздатність культури клітин на 50 %. Було досліджено цитотоксичну дію 6-азацитидину в діапазоні концентрації від 0,8 до 1040 мкМ. В результаті спостерігали, що при збільшенні концентрацій 6-АЦ поступово зростає кількість мертвих клітин, тобто проявляється його цитотоксична дія на клітини. Одержані результати дозволили встановити, що при внесенні речовини в концентрації 520 мкМ кількість мертвих клітин перевищує 50 %. З метою визначення дози препарату, котра викликає 50 % зниження життєздатності клітин, був використаний регресійний аналіз. Визначали коефіцієнт кореляції, який становив - 0,99. Такий високий коефіцієнт свідчив про наявність тісного зв'язку між концентрацією препарату і рівнем його впливу на клітини, тобто підтверджується дозозалежна дія 6-азацитидину. Був визначений показник СД50, який склав 500 мкМ, що свідчить при низьку 1 UA 68403 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 токсичність досліджуваного препарату в системі лімфобластоїдної клітинної лінії Raji. Результати дослідження представлені на фіг. 1. Даним методом був проаналізований і препарат Ацикловір. Показано, що в діапазоні концентрацій 444-3300 мкМ йде зниження проліферативної активності клітин на 4 %, потім в концентрації 4400 мкМ він знижується ще на 4 %, що у порівнянні з контролем складає 17 %. Застосувавши рівняння лінійної регресії, обчислили показник CD50, який склав 22000 мкМ. Таким чином, визначені показники цитотоксичності 6-азацитидину та Ацикловіру та обчислені за допомогою лінійного регресійного аналізу CD 50. Для 6-азацитидину цей показник становить 500 мкМ, для Ацикловіру - 22000 мкМ. Приклад 2. Вивчення анти-ВЕБ активності препарату 6-азацитидин в культурі клітин Rajі. При дослідженні антивірусної дії 6-азацитидину було визначено ефективну дозу (ED 50), тобто концентрацію, яка знижує рівень репродукції вірусу на 50 %. Дослідження проводили з препаратом 6-азацитидин в концентраціях 0,4-520 мкМ. Кожну концентрацію досліджували в трьох повторах. Препарат залишався в середовищі протягом всього терміну дослідження. Як аналог по антивірусній активності використовували Ацикловір в концентраціях 2-1100 мкМ. Для визначення рівня репродукції вірусу Епштейна-Барр в досліджуваних клітинах застосовували метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Аналіз антивірусної дії препаратів здійснювали через 48 годин, оскільки дана часова точка є оптимальною як з точки зору динаміки росту клітинної лінії Rajі, так і репродуктивного циклу ВЕБ. Для цього відбирали по 350000 клітин, шляхом низькошвидкісного центрифугування осаджували їх та ресуспендували в 100 мкл ростового середовища без сироватки. Рівень пригнічення репродукції вірусу Епштейна-Барр в культурі клітин Rajі визначали методом ПЛР, використовуючи праймери та реагенти "AMPLY-Senc-100R" (Росія) з наступною обробкою результатів у програмі "Biotest А". В даному наборі як праймер використовували ділянку в 290 п. н., яка кодує капсидний антиген (VCA) ВЕБ. Аналіз проводили згідно з інструкцією виробника. Контролем були клітини, які після інфікування вірусом інкубували у ростовому середовищі без додавання речовини. Визначали відсоток інгібування рівня накопичення вірусної ДНК в оброблених досліджуваними речовинами зразках по відношенню до контрольного варіанту, значення якого приймали за 100 %. Результати наведено в таблиці. Була визначена ефективна концентрація, при якій препарат зменшував рівень накопичення вірусної ДНК на 50 %. Показано, що доза препарату, яка інгібує репродукцію ВЕБ на 50 % (ЕД50), для 6азацитидину становить 2 мкМ, для Ацикловіру - 975 мкМ. Таким чином, було досліджено цитотоксичну дію 6-азацитидину у широкому діапазоні концентрацій від 0,8 до 1040 мкМ в культурі лімфобластоїдних клітин. Зниження проліферативної активності в культурі клітин Raji на 50 % визначено при додаванні 500 мкМ речовини, що відповідало значенню показника CD 50. Для Ацикловіру CD50 становив 22000 мкМ. При вивченні антивірусної активності препаратів 6-АЦ і Ацикловір в культурі клітин Raji визначена їх ефективна доза ED50, тобто концентрація, яка знижує рівень репродукції вірусу Епштейна-Барр на 50 %. Показано, що ЕД50 для 2--D-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин3(2Н)-ону (6-азацитидину) становить 2 мкМ, для Ацикловіру - 975 мкМ. Хіміотерапевтичний індекс (ХТІ) або індекс селективності (SI) визначали по співвідношенню CD50 та ЕД50. SI 2--D-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-ону (6-азацитидину) становив 250, а Ацикловіру - 22,6. Таким чином, 2--D-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-он (6-азацитидин) має більш високу антивірусну активність проти ВЕБ у порівнянні з Ацикловіром і може бути перспективним препаратом для лікування хвороб, спричинених цим вірусом. Таблиця Рівень інгібування експресії ДНК ВЕБ в клітинах Rajі, оброблених 6-азацитидином Назва препарату Концентрація, мкМ 0,4 2 4 8 16 65 Відсоток інгібування накопичення ДНК ВЕБ 10 50 52 77 88 88 2 UA 68403 U Продовження таблиці Рівень інгібування експресії ДНК ВЕБ в клітинах Rajі, оброблених 6-азацитидином Назва препарату 130 260 520 Відсоток інгібування накопичення ДНК ВЕБ 87 88 91 * Примітка: * стандартна помилка ±0,05 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 За 100 % прийнято рівень репродукції ВЕБ у культурі Raji, не обробленій 6-АЦ, що оцінювали методом ПЛР. Приклад 3. Вивчення апоптозстимулюючої активності препарату 6-азацитидин в культурі клітин Rajі. Розвиток процесу апоптозу в інфікованих і неінфікованих ВЕБ клітинах, оброблених препаратом в концентрації 100 мкг/мл, досліджували за допомогою методу цитоморфологічного фарбування клітин, використовуючи флуоресцентний барвник Hoechst 33342 ("Sigma", США). Цей ДНК-тропний барвник інтеркалює в ДНК клітин в місцях А-Т-пар, дозволяючи виявляти в люмінесцентному мікроскопі стан хроматину клітин. Нормальні живі клітини мають рівномірне темно-зелене забарвлення ядер, а для апоптичних клітин характерні конденсація хроматину і фрагментація ядра - "апоптичні тільця" яскраво-зеленого кольору. Для проведення аналізу 5 клітини (5×10 ) відмивали фосфатно-сольовим буфером (ФСБ), рН 7,2, і центрифугували при 1500 об/хв. 5 хв. Далі проводили інкубування клітин з 100 мкл Hoechst 333422 (0,1 мг/мл) протягом 30 хв. при 37 °C. Відмиті у ФСБ клітини ресуспендували в 50 % розчині гліцерину з 4 % параформальдегіду і наносили на предметне скло. Аналіз наявності апоптичних клітин у препаратах проводили, використовуючи люмінесцентний мікроскоп МЛ-2 (Росія) при збільшенні ×900. В результаті проведених досліджень по вивченню апоптозстимулюючого впливу 6-АЦ в культурі клітин Rajі неінфікованих ВЕБ виявили індукуючу дію препарату, яка призводила до загибелі 15-20 % клітинної популяції шляхом апоптозу. При інфікуванні клітин вірусом з подальшою обробкою їх 6-АЦ спостерігали збільшення відсотка апоптичних клітин через 24 години на 12 % у порівнянні з неінфікованими (фіг. 2). Літична інфекція та антивірусна дія препарату в інфікованих ВЕБ клітинах збільшують відсоток апоптичних клітин, тобто, інгібування репродукції вірусу стимулює елімінацію заражених клітин шляхом апоптозу, що узгоджується з літературними даними. Джерела інформації: 1. Патент на винахід України № 32901. Алексеева І.В., Пальчиковська Л.Г. Спосіб одержання 2--D-рибофуранозиду 5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-ону (6-азацитидину). Бюлетень № 1 від 15.01.2003. 2. Абдуллаева М.В., Фролов А.Ф., Алексеева И.В., Пальчиковская Л.И., Федорова Н.Е. Ингибирующее действие 6-азацитидина на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной системе // Биополимеры и клетка. - 2004. - 20, № 4. - С. 337-342. 3. Дяченко Н.С. Актуальні вірусні інфекції: принципи та нові шляхи до хіміопрофілактики. Інфекції, спричинені вірусами з родини Herpesviridae // Пociбник з хіміотерапії вірусних інфекцій під ред. Дзюблик І.В. К.: Київська медична академія післядипломної освіти, 2004. - С. 107-124. 4. Лопач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel.// K.: Морион, 2001. - 320 с. 5. Носач Л.Н., Дяченко Н.С, Шаламай А.С., Алексеева И.В., Кушко Л.Я., Озвинчук И.И., Жовноватая В.Л., Бутенко С.И., Петровская И.А., Дранник Г.Н. Антиаденовирусное и иммуностимулирующее действие 6-азацитидина // Биополимеры и клетка. - 1996. - 12, № 1. С. 75-85. 6. Пальчиковська Л.И., Гарманчук Л.В., Алексєєва И.В., Усенко Л.С., Шестакова Т.С, Соляник Г.І., Швед А.Д., Чехун В.Ф. N1-глікозидні аналоги 6-азацитидину. Цитотоксична дія та вплив на транскрипцію in vitro // Біополімери і клітина.-2005. - 21, № 5. - С. 433-439. 7. Уоллз Э., Крофорд Д. Культивирование клеток В95-8 // Лимфоциты. Методы - М.: Мир, 1990. - С. 230-249. 8. Щербинська A.M., Дяченко Н.С, Рибалко С.Л. та ін. Вивчення антивірусної дії потенційних лікарських засобів // Доклінічні дослідження лікарських засобів (методичні рекомендації) // К.: Видавничий дім "Авіцена", 2001. - С. 371-390. 3 UA 68403 U 5 10 15 20 25 30 9. Alexeeva I., Palchikovskaya L., Shalamay A., Nosach L., Zhovnovataya V., Povnitsa О., Dyachenko N.N4-Amino-acid derivates of 6-azacytidine: Structure-activity relationship // Acta Biochim. Pol. - 2000. - 47, N 1. - P. 95-101. 10. Alexeeva I., Dyachenko N., Nosach L., Zhovnovataya V., Rybalko S., Lozitskaya R., Fedchuk A., Lozitsky V., Gridina Т., Shalamay A., Palchikovskaya L., Povnitsa O. 6-AZACYTIDINECOMPOUND WITH WIDE SPECTRUM OF ANTIVIRAL ACTIVITY // Nucleosides, Nucleotides and Nucl. Acids. - 2001. - 20, N 4-7. - P. 1147-1152. 11. Eun J.J., You M.L., Byung L.L., Mee S.Ch., Woo H.K. Lytic induction and apoptosis of EpsteinBarr virus-associated gastric cancer cell line with epigenetic modifiers and ganciclovir // Cancer Letters.-2007. - 247, N 1. - P. 77-83. 12. Humar A., Hebert D., Davies H.D., Humar A., Stephens D., O'Doherty В., Allen U.A randomized trial of ganciclovir versus ganciclovir plus immune globulin for prophylaxis against Epstein-Barr virus related posttransplant lymphoproliferative disorder // Transplantation. - 2006. - 81, N 6. - P. 856-861. 13. Kurokawa M., Ghosh S.K., Ramos J.C., Mian A.M., Toomey N.L., Cabral L., Whitby D., Barber G.N. Azidothymidine inhibits NF-B and induces Epstein-Barr virus gene expression in Burkitt lymphoma // Blood. - 2005. - N 106. - P. 235-240. 14. Kutok J.L., Wang E. Spectrum of Epstein-Barr Virus-Associated Diseases // Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis.-2006. - N 1. - P. 375-404. 15. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxity assays // J. Immunol. Methods. - 1983. - N 65. -P. 55-63. 16. Мurоnо Sh., Raab-Traub N., Pagano J.S. Prevention and Inhibition of Nasopharyngeal Carcinoma Growth by Antiviral Phosphonated Nucleoside Analogs // Cancer Research. - 2001. - N 61. - P. 7875-7877. 17. Tomicic M.T., Bey E., Wutzler P, Thust R., Kaina B. Comparative analysis of DNA breakage, chromosomal aberrations and apoptosis induces by the anti-herpes purine nucleoside analogues aciclovir, ganciclovir and penciclovir // Mutation Research.-2002. - 71, N 1-2. - P. 1-11. 18. Wakisaka N., Yoshizaka Т., Raab-Traub N., Pagano J.S. Ribonucleotide reductase inhibitors enhance cidofovir-induced apoptosis in EBV-positive nasopharyngeal carcinoma xenografts // Int. J. Cancer. 2005. - N 116. - P. 640-645. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 2--D-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-он Епштейна-Барр. 4 (6-азацитидин) як інгібітор вірусу UA 68403 U 5 UA 68403 U Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6